ES2665465T3 - Ensayo para detectar serotipos estrechamente relacionados del papilomavirus humano (HPV) - Google Patents
Ensayo para detectar serotipos estrechamente relacionados del papilomavirus humano (HPV) Download PDFInfo
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Abstract
Un ensayo múltiplex para detectar la presencia o ausencia de múltiples serotipos de un organismo papilomavirus humano (HPV) en una muestra biológica, en donde el ensayo detecta más serotipos que canales hay para la detección, que comprende: poner en contacto una muestra biológica con al menos tres conjuntos de cebadores/sondas, cada uno de los cuales comprende al menos una sonda de oligonucleótido que está marcada de forma detectable y tiene una secuencia de nucleótidos de longitud de 10 a 50 y al menos dos cebadores de oligonucleótidos cada uno de los cuales tiene una secuencia de unión a la diana que tiene una secuencia de nucleótidos de longitud de 10 a 25, en condiciones de modo que las sondas y cebadores se reasocian con una secuencia diana y en donde cada conjunto de cebadores/sondas es al menos preferiblemente para un serotipo específico de HPV, en donde el primer y segundo conjuntos de cebadores/sondas son degenerados uno respecto a otro y en donde las sondas degeneradas tienen cada una un resto señal que emite señal que es detectable en el mismo canal y en donde el tercer conjunto de cebadores/sondas no es degenerado con respecto a los otros dos conjuntos de cebadores/sondas y discrimina un tercer serotipo que no es los serotipos con los que se reasocian con preferencia los conjuntos de cebadores/sondas degenerados, en donde el tercer conjunto de cebadores/sondas tiene un resto señal que emite señal a una longitud de onda que es la misma o diferente de la longitud de onda emitida por el resto señal de las sondas degeneradas, y en donde la diana para los conjuntos de cebadores/sondas degenerados se selecciona del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 36-38; amplificar, si está presente, la secuencia diana; y vigilar la detección del marcador como una indicación de la hibridación del conjunto de sondas con la secuencia diana, que indica así la presencia o ausencia de al menos uno de los serotipos de HPV.
Description
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fluorescencia (FRET), la luz emitida del fluoróforo puede excitar una segunda molécula cuyo espectro de excitación solapa con el espectro de emisión del fluoróforo. La transferencia de energía de emisión del fluoróforo a otra molécula amortigua la emisión del fluoróforo. La segunda molécula se conoce como una molécula amortiguadora. El término “fluoróforo” se usa de forma intercambiable en la presente memoria con el término “indicador fluorescente”.
Como se usa en la presente memoria, “amortiguador” o “molécula amortiguadora” se refiere a una molécula que, cuando está unida a una sonda fluorescente que comprende un fluoróforo, es capaz de aceptar la energía emitida por el fluoróforo, amortiguando así la emisión del fluoróforo. Un amortiguador puede ser fluorescente, que libera la energía aceptada en forma de luz, o no fluorescente, que libera la energía aceptada en forma de calor, y puede estar unido en cualquier sitio a lo largo de la longitud de la sonda.
Como se usa en la presente memoria, “amortiguador oscuro” se refiere a un amortiguador no fluorescente.
Como se usa en la presente memoria, “sonda” se refiere a un oligonucleótido que es capaz de formar una estructura doble con una secuencia en un ácido nucleico diana, debido a la complementariedad de al menos una secuencia de la sonda con una secuencia en la región diana, o región que se va a detectar. El término “sonda” incluye un oligonucleótido como se ha descrito antes, con o sin un fluoróforo y una molécula amortiguadora unidos. La expresión “sonda fluorescente” se refiere a una sonda que comprende un fluoróforo y una molécula amortiguadora.
Como se usa en la presente memoria, “FAM” se refiere al fluoróforo 6-carboxifluoresceína.
Otras realizaciones de la descripción usan diferentes secuencias de oligonucleótidos para unirse a la región de genes E6/E7 del HPV. Los oligonucleótidos descritos en la presente memoria tienen una secuencia que es capaz de unirse a la secuencia de ácido nucleico diana (y su cadena complementaria). Los oligonucleótidos descritos en la presente memoria también se pueden usar, sea solo o en combinación, para facilitar la detección a través de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico de genes E6/E7 del HPV. En una realización, las sondas de diseñan para llevar a cabo un ensayo de PCR en tiempo real de Taq-Man® en la parte diana del gen. Los ejemplos de tres conjuntos de sondas degenerados usados para los ensayos de PCR en tiempo real de Taq-Man®, descritos en términos de sus secuencias de oligonucleótidos, se describen a continuación.
Específicamente, en la primera realización donde el primer conjunto de cebadores/sondas degenerado es para los tipos de HPV 39 y 68, el conjunto de cebadores/sondas que prefiere el HPV de tipo 39 son los SEQ ID NO: 1, 3 y 5. El conjunto de cebadores/sondas que prefiere el HPV de tipo 68 son los SEQ ID NO: 2, 4 y 6. Los SEQ ID NO: 1 y 2 son ambos cebadores directos Taq-Man y son degenerados entre sí. Los SEQ ID NO: 3 y 4 son ambos cebadores inversos Taq-Man y son degenerados entre sí. Los SEQ ID NO: 5 y 6 son ambos sondas Taq-Man y son degeneradas entre sí. Los conjuntos de cebadores/sondas degenerados para los HPV de tipos 33 y 58 son de SEQ ID NO: 7-16, que incluyen dos secuencias de cebadores inversos alternativas, siendo preferidos los SEQ ID NO: 13 y 14. Los conjuntos de cebadores/sondas degenerados para los HPV de tipo 56 y 66 son los SEQ ID NO: 17-23. Las secuencias de cebadores/sondas que seleccionan o discriminan el serotipo de HPV 51 son los SEQ ID NO: 24-29. Las secuencias de cebadores/sondas que seleccionan o discriminan el HPV de tipo 59 son los SEQ ID NO: 30-35. Todas las secuencias a las que se ha hecho referencia antes están indicadas en la siguiente tabla 1. En la siguiente tabla, “D” es detector, “FP” es cebador directo y “RP” es cebador inverso.
Tabla 1
- SEQ ID NO
- Nombre Descripción Secuencia del oligonucleótido: 5'-3'
- SEQ ID NO: 1
- GR39_68E6 FP2 (39) HPV 39 E6 Taq-Man Cebador directo CCACTAGCTGCATGCCAATC
- SEQ ID NO: 2
- GR39_68E6 FP2 (68) HPV 68 E6 Taq-Man Cebador directo CCATTAGCTGCATGCCAATC
- SEQ ID NO: 3
- GR39_68E6 RP4 (39) HPV 39 E6 Taq-Man Cebador inverso CTAATGTAGTTGCATACACCGA
- SEQ ID NO: 4
- GR39_68E6 RP4 (68) HPV 68 E6 Taq-Man Cebador inverso CTAATGTTGTTGCATACACCGA
- SEQ ID NO: 5
- GR39_68D5 (39) HPV 39 E6 Taq-Man Sonda GAGTAATATCGTAGCTCCCGTATTTT
- SEQ ID NO: 6
- GR39_68D5 (68) HPV 68 E6 Taq-Man Sonda GAGTAATATCGTAGTTCCCGTATTTT
- SEQ ID NO: 7
- GR33_58FP2 (33) HPV 33 E6 Taq-Man Cebador directo TGTGCCAAGCATTGGAGACA
- SEQ ID NO
- Nombre Descripción Secuencia del oligonucleótido: 5'-3'
- SEQ ID NO: 8
- GR33_58FP2 (58) HPV 58 E6 Taq-Man Cebador directo TGTGTCAGGCGTTGGAGACA
- SEQ ID NO: 9
- GR33_58RP2 (33) HPV 33 E6 Taq-Man Cebador inverso CAAATGGATTTCCCTCTCTATA
- SEQ ID NO: 10
- GR33_58RP2 (58) HPV 58 E6 Taq-Man Cebador inverso CAAATGGATTTCCATCTCTATA
- SEQ ID NO: 11
- GR33_58RP3 (33) HPV 33 E6 Taq-Man Cebador inverso CCTCTCTATATACAACTGTTAAA
- SEQ ID NO: 12
- GR33_58RP3 (58) HPV 58 E6 Taq-Man Cebador inverso CCATCTCTATACACTATTCTTAAA
- SEQ ID NO: 13
- GR33_58RP4 (33) HPV 33 E6 Taq-Man Cebador inverso AAATGGATTTCCCTCTCTATATAC
- SEQ ID NO: 14
- GR33_58RP4 (58) HPV 58 E6 Taq-Man Cebador inverso AAATGGATTTCCATCTCTATACAC
- SEQ ID NO: 15
- GR33_58D1 (33) HPV 33 E6 Taq-Man Sonda TCATATACCTCAGATCGTTGCAAAG
- SEQ ID NO: 16
- GR33_58D1 (58) HPV 58 E6 Taq-Man Sonda TCATATACCTCAGATCGCTGCAAAG
- SEQ ID NO: 17
- MP56_66FP (56) HPV 56 E7 Taq-Man Cebador directo ACCTAATACACGTACCTTGTT
- SEQ ID NO: 18
- MP56_66FP (66) HPV 66 E7 Taq-Man Cebador directo ACCTAATTCACGTACCTTGTT
- SEQ ID NO: 19
- MP56_66RP (56) HPV 56 E7 Taq-Man Cebador inverso ACACGCAGGTCCTCTTTGGT
- SEQ ID NO: 20
- MP56_66RP (66) HPV 66 E7 Taq-Man Cebador inverso ACACGTAGCTCCTCTTTGGT
- SEQ ID NO: 21
- MP56_66D (56) HPV 56 E7 Taq-Man Sonda TGTAAGTTTGTGGTGCAGTTGGACA
- SEQ ID NO: 22
- MP56_66D (66.1) HPV 66 E7 Taq-Man Sonda TGTGAGCTTGTGGTGCAGTTGGACA
- SEQ ID NO: 23
- MP56_66D (66.2) HPV 66 E7 Taq-Man Sonda TGTGAGTTGGTGGTGCAGTTGGACA
- SEQ ID NO: 24
- 51E6 FP HPV 51 E6 Cebador directo GCAGTATGCAAACAATGTTCAC
- SEQ ID NO: 25
- 51E6 RP HPV 51 E6 Cebador inverso TAGTAATTGCCTCTAATGTAGTA
- SEQ ID NO: 26
- 51E6 D HPV 51 E6 Taq-Man Sonda CCTGCTATAACGTCTATACTCTCTA
- SEQ ID NO: 27
- 51E7 FP HPV 51 E7 Cebador directo CTCAGAGGAGGAGGATGAAG
- SEQ ID NO: 28
- 51E7 RP HPV 51 E7 Cebador inverso TGAACACCTGCAACACGGAG
- SEQ ID NO: 29
- 51E7 D HPV 51 E7 Taq-Man Sonda CTACCAGAAAGACGGGCTGGAC
- SEQ ID NO: 30
- 59E6 FP HPV 59 E6 Cebador directo GGAGAAACATTAGAGGCTGAA
- SEQ ID NO: 31
- 59E6 RP HPV 59 E6 Cebador inverso ATAGAGGTTTTAGGCATCTATAA
- SEQ ID NO: 32
- 59E6 D HPV 59 E6 Taq-Man Sonda ACCGTTACATGAGCTGCTGATACG
- SEQ ID NO
- Nombre Descripción Secuencia del oligonucleótido: 5'-3'
- SEQ ID NO: 33
- 59E7 FP HPV 59 E7 Cebador directo GAAGTTGACCTTGTGTGCTAC
- SEQ ID NO: 34
- 59E7 RP HPV 59 E7 Cebador inverso ATTAACTCCATCTGGTTCATCTT
- SEQ ID NO: 35
- 59E7 D HPV 59 E7 Taq-Man Sonda ATTACCTGACTCCGACTCCGAGAA
- SEQ ID NO: 36
-
Región diana para conjuntos de cebadores/sondas degenerados para HPV de tipos 39 y 68
91 nucleótidos Región diana
imagen5
- SEQ ID NO: 37
- Región diana para conjuntos de cebadores/sondas degenerados para HPV tipos 33 y 58 138 nucleótidos Región diana
- SEQ ID NO: 38
-
Región diana para conjuntos de cebadores/sondas degenerados para HPV tipos 56 y 66
79 nucleótido Región diana
imagen6
Las ubicaciones de las regiones diana para los conjuntos de cebadores/sondas descritos en la tabla anterior se describen en la siguiente tabla 1A:
Tabla 1A: Ubicación de las regiones diana
- Genotipo
- Nº de acceso en GenBank Coordenadas de la región diana
- 39
- M62849 287-377
- 68
- EU918769 181-271
- 33
- M12732 152-288
- 58
- D90400 153-289
- 56
- X74483 747-825
- 66
- EF177190 747-825
5 Aunque hay una homología de secuencia entre las regiones diana para los conjuntos de cebadores/sondas degenerados, las coordenadas de estas regiones dependen del genotipo.
En una realización adicional, el método incluye tratar una muestra usando al menos un conjunto de
cebadores/sondas degenerado para seleccionar dos tipos de HPV estrechamente relacionados y un conjunto de 10 cebadores/sondas que discrimina un tercer tipo de HPV, donde el resto señal para las sondas degeneradas emite
una señal de la misma longitud de onda y, preferiblemente, es el mismo resto de señalización para las dos sondas
degeneradas. El resto de señalización del conjunto de cebadores/sondas que discrimina el tercer tipo de HPV emite
señal a una longitud de onda que es diferente, y por lo tanto detectable por separado, de la longitud de onda emitida
por los restos de señalización para las sondas degeneradas. Estos conjuntos de cebadores/sondas se usan en una 15 reacción de amplificación de ácido nucleico para detectar la presencia o ausencia del producto de ácido nucleico
amplificado.
En otra realización, se proporciona un kit para la detección del HPV. El kit incluye al menos un conjunto de
cebadores/sondas degenerado que selecciona dos tipos de HPV diferentes pero estrechamente relacionados y un
conjunto de cebadores/sondas que discrimina un tercer tipo de HPV, donde el resto señal para las sondas 20 degeneradas emite una señal a la misma longitud de onda y, preferiblemente, es el mismo resto de señalización
para las dos sondas degeneradas. El resto de señalización del conjunto de cebadores/sondas que discrimina el
tercer tipo de HPV emite señal a una longitud de onda que es diferente, y por lo tanto detectable por separado, de la
longitud de onda emitida por los restos de señalización para las sondas degeneradas. Los conjuntos de
cebadores/sondas son capaces de amplificar una secuencia diana que se puede usar para la detección de ese 25 organismo. El kit está provisto de uno o más de los oligonucleótidos y de reactivos de tamponamiento para llevar a
cabo los ensayos de amplificación.
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En otro aspecto más del kit, se pueden proporcionar los oligonucleótidos y reactivos para los fines de PCR de Taq-Man. En este aspecto, se proporcionan tres oligonucleótidos. Dos de los tres son cebadores de amplificación y el tercer oligonucleótido está configurado como un detector.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra la región diana del gen E6 para el HPV de tipo 68, y esquemáticamente la degeneración de esta secuencia diana entre diferentes mutaciones del HPV de tipo 68, HPV de tipo 39 y mutaciones del HPV de tipo 39 junto con el conjunto de cebadores/sondas degenerado para los HPV de tipos 39 y 68;
La figura 2A-B ilustra la región diana del gen E6 para el HPV de tipo 33, y esquemáticamente la degeneración de esta secuencia diana entre diferentes mutaciones del HPV de tipo 33, HPV de tipo 58 y mutaciones del HPV de tipo 33 junto con el conjunto de cebadores/sondas degenerado para los HPV de tipos 33 y 58; y
La figura 3 ilustra la región diana del gen E7 para el HPV de tipo 66, y esquemáticamente la degeneración de esta secuencia diana entre diferentes mutaciones del HPV de tipo 66, HPV de tipo 56 y mutaciones del HPV de tipo 56 junto con el conjunto de cebadores/sondas degenerado para los HPV de tipos 56 y 66.
Descripción detallada de la invención
Las sondas y conjuntos de sondas de oligonucleótidos descritos en la presente memoria se diseñan específicamente para seleccionar o discriminar entre tipos de HPV. Específicamente, se combinan conjuntos de cebadores/sondas degenerados que son algo selectivos para uno de dos tipos de HPV estrechamente relacionados, con al menos otro conjunto de cebadores/sondas que discrimina un tercer tipo más de HPV que es diferente de los tipos de HPV estrechamente relacionados.
Los conjuntos de cebadores/sondas proporcionan una señal detectable cuando el tipo específico de HPV está presente en la muestra.
En las realizaciones preferidas, se usa el método de detección de PCR (p. ej., PCR de Taq-Man) aunque también están contemplados otros métodos (p. ej., TMA y LCR). Además, se describe un kit para detectar más tipos de HPV que canales de detección hay.
En relación con la figura 1, los conjuntos de cebadores/sondas degenerados específicos para tipos de HPV se describen en términos de su alineamiento con la región diana ilustrada del gen E6. La figura 1 ilustra la región de cebador directo 10, la región de detección Taq-Man 20 y la región de cebador inverso 30. La figura 1 también ilustra los cebadores directos degenerados 11, 12, cebadores inversos degenerados 31, 32, y sondas degeneradas 21 y 22 en relación con su correspondiente región en la secuencia diana 40. Solo las variaciones en la secuencia diana 40 con respecto a la región de cebador directo, región de cebador inverso y regiones de detector se ilustran en los recuadros 60, 70 y 80. Se indica la degeneración de secuencia entre estas regiones y a partir de esto se puede observar que estas regiones son menos deseables debido a la mayor variación de secuencia en estas regiones.
Por ejemplo, en el recuadro 60 obsérvese que hay polimorfismos de un solo nucleótido (T, C) entre la parte de la secuencia diana 40 delimitada por el recuadro 60 y la misma parte de E6 de una diana de HPV de tipo 39. Los recuadros 60, 70 y 80 ilustran los polimorfismos de nucleótido con respecto a la diana para diferentes cepas de HPV de tipos 68 y 39. Estas cepas diferentes y el número y situación de los polimorfismos de nucleótido (con respecto a la diana) se dan en la tabla 2.
Tabla 2: Polimorfismos ilustrados en la figura 1 con respecto a la diana
- Tipo/cepa
- Número de polimorfismos (sitio desde 5')
- Tipo 68
- 68_A7_High_45240-DQ80079. seq
- 3 [T(en 6); G(en 66); T(en 84)]
- 68_A7_High_45240-EU918769.seq
- Ninguno
- BD115-68 900bp.seq
- 3 [C(en 21); A(en 46); C(en 81)]
- BD-637-68 900 bp.seq
- 1 [G(en 31)]
- T276-68 900bp.seq
- Ninguno
- T1177-68 900bp.seq
- 3 [T o C (en 6); C(en 81); T o T(en 84)
- T1610-68 900bp 071309.seq
- 2 [G(en 53); C(en 81)]
- Tipo 39
- 23, A7, High, 10568, M62849.seq
- 6 [C(en 4); A(en 27) ; G (en 51) G(en 66); C(en 69); T(en 84)]
- S492-39 900bp.seq
- 8 [T(en 3) ; C(en 4) ; A(en 27) ; G(en 51) G(en 66) ; C(en 69); G(en 80) ; T(en 84)]
- T296-39 900bp.seq
- 7[C(en 4) ; A(en 27) ; G(en 51) ; C(en 57); G(en 66); C(en 69); T(en 84)]
El cebador directo 11 para HPV 39 tiene un polimorfismo de un solo nucleótido y por lo tanto está degenerado con respecto al cebador directo 12 para HPV 68. El cebador directo 11 es el SEQ ID NO: 1 y el cebador directo 12 es el SEQ ID NO: 2. La degeneración entre las dos secuencias se observa fácilmente:
CCATTAGCTGCATGCCAATC
La respectiva degeneración está indicada por subrayado.
La degeneración hace que el cebador directo prefiera unirse al HPV de tipo 39 y el cebador directo 12 prefiera unirse al HPV de tipo 68. Los conjuntos de cebadores/sondas degenerados prefieren unirse a la diana de un tipo de HPV 10 frente al otro tipo, pero no discriminan. En términos de figuras, los conjuntos de cebadores/sondas se describen en relación con la diana. Los recuadros 60, 70 y 80 contienen información sobre la degeneración entre HPV de tipos 39 y 68 con respecto a la región diana 40 delimitada por los recuadros 60, 70 y 80. Esto es una referencia de situación y no una referencia de hibridación. Específicamente, los cebadores inversos 31 y 32 (SEQ ID NO: 3 y 4) tienen secuencias que son el complemento inverso de la secuencia en su correspondiente sitio en la diana 40. De forma
15 similar, las sondas detectoras 21 y 22 (SEQ ID NO: 5 y 6) son el complemento inverso de la secuencia en su sitio correspondiente en la diana 40. Los cebadores directos 11 y 12 (SEQ ID NO: 1 y 2) son homólogos a la secuencia en su correspondiente sitio en la diana 40.
Las figuras 2A-B son similares a la figura 1, pero para los conjuntos de cebadores/sondas degenerados que seleccionan HPV de tipos 33 y 58. Los recuadros 160, 170 y 180 ilustran los polimorfismos de nucleótidos con
20 respecto a la diana para diferentes cepas de HPV de tipos 33 y 58. Estas cepas diferentes y el número y sitio de los polimorfismos de nucleótido (respecto a la diana) se dan en la tabla 3. El sitio de los polimorfismos se ilustra en la figura 2.
Tabla 3: Polimorfismos ilustrados en las figuras 2A-B con respecto a la diana
- Tipo/Cepa
- Número de polimorfismos
- Tipo 33
- 33_A9 High_10586 EF422125.seq
- 3 [C(en 30); A(en 62) ; C(en 63)]
- 33_A9_High_10586 EF422126.seq
- 3 [C(en 62); C(en 63) ; T(en 52)]
- 33_A9_High_10586 EF566920.seq
- 3 [C(en 62) ; C(en 63) ; A(en 99)]
- 33_A9_High_10586 EF566921.seq
- 2 [C(en 62) ; C(en 63)]
- 33_A9_High_10586 EF918766.seq
- 4 [G(en 58);C(en 62);C(en 63); G(en 122)]
- 33_A9_High_10586 G0374550.seq
- 1 [A(en 62)]
- 33_A9_High_10586 GO374551.seq
- 2 [G(en 54) ; A(en 62)]
- 33_A9_High_10586 GO374552.seq
- 2 [T(en 10) ; A(en 62)]
- 33_A9_High_10586 M12732.seq
- 2 [A(en 62) ; C(en 63)]
- BD670 grp33 900bp.seq
- 1 [A(en 62)]
- BD783-33 900bp.seq
- 3 [C(en 62); C(en 63); C(en 92)]
- BD783-33 clone 900bp.seq
- 2 [C(en 62); C(en 63)]
- TI093-33 900bp.seq
- 2 [G(en 54) ; A(en 62)]
- Tipo 58
- HPV_58 D60400.seq
- 23 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- T-275-58 900bp.seq
- 22 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- T-276-58 900bp.seq
- 24 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- T-817-58 clone 900bp.seq
- 23 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- 58_A9 High E6 10598 AF478160
- 23 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- 58_A9 High E6 10598 AF478167
- 22 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- 58_A9 High E6 10598 AF234531
- 23 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- 58_A9 High E6 10598 AF478157
- 23 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- 58_A9 High E6 10598 EU080239
- 25 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- 58_A9 High E6 10598 FJ407192
- 24 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- 58_A9 High E6 10598 GO248229
- 23 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
- 58_A9 High E6 10598 GO248253
- 22 [Véase las figuras 2A-B para el sitio]
Las figuras 2A-B ilustran la región de cebador directo 110, la región de detección Taq-Man 120 y la región de cebador inverso 130. Las figuras 2A-B también ilustran los cebadores directos degenerados 111, 112, cebadores inversos degenerados 131, 132 y sondas degeneradas 121 y 122 en relación con su región correspondiente en la
5 secuencia diana 140. Solo se ilustran las variaciones en la secuencia diana 140 con respecto a la región de cebador directo, región de cebador inverso y regiones de detector en los recuadros 160 (fig. 2A), 170 y 180 (fig. 2B).
Por ejemplo, en el recuadro 160 obsérvese que hay polimorfismos de un solo nucleótido (T, G, G) entre la parte de la secuencia diana 140 delimitada por el recuadro 60 y la misma parte de E6 de una diana de HPV de tipo 33. Sin embargo, el cebador directo 112 para HPV 58 tiene tres polimorfismos de un solo nucleótido y por lo tanto es
10 degenerado con respecto al cebador directo 111 para HPV 33. El cebador directo 111 es el SEQ ID NO: 7 y el cebador directo 112 es el SEQ ID NO: 8. La degeneración entre las dos secuencias se observa fácilmente:
TGTGCCAAGCATTGGAGACA
TGTGTCAGGCGTTGGAGACA
La degeneración respectiva se indica por subrayado.
15 La degeneración hace que el cebador directo 111 prefiera unirse al HPV de tipo 33 y el cebador directo 112 prefiera unirse al HPV de tipo 58. Los conjuntos de cebadores/sondas degenerados prefieren unirse a la diana de un tipo de HPV respecto al otro tipo pero no discriminan. En términos de las figuras, los conjuntos de cebadores/sondas se describen en relación con la diana. Los recuadros 160, 170 y 180 contienen información sobre la degeneración entre los HPV de tipos 33 y 58 con respecto a la región diana 140 delimitada por los recuadros 160, 170 y 180. Esto es
20 una referencia de sitio y no referencia de hibridación. Específicamente, los cebadores inversos 131 y 132 (p. ej., SEQ ID NO: 13 y 14) tienen secuencias que son el complemento inverso de la secuencia en su correspondiente sitio en la diana 140. De forma similar, las sondas inversas 121 y 122 (SEQ ID NO: 15 y 16) son el complemento inverso de la secuencia en su sitio correspondiente en la diana 140. Los cebadores directos 111 y 112 (SEQ ID NO: 7 y 8) son homólogos a la secuencia en su correspondiente sitio en la diana 140.
25 La figura 3 es similar a las figuras 1 y 2, salvo por los conjuntos de cebadores/sondas degenerados para los HPV de tipos 56 y 66. La figura 3 ilustra la región del cebador directo 210, la región de detección Taq-Man 220 y la región de cebador inverso 230. Los recuadros 260, 270 y 280 ilustran los polimorfismos de nucleótido con respecto a la diana para diferentes cepas de HPV de tipos 66 y 56. Estas cepas diferentes y el número y sitio de los polimorfismos de nucleótido (con respecto a la diana) se describen en la tabla 2.
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Tabla 4: Polimorfismos ilustrados en la figura 3 respecto a la diana
- Tipo/Cepa
- Número de polimorfismos (sitio desde 5')
- Tipo 66
- 66_A6_High_37119-EF177191
- 6 [T(en 8); A(en 24); G(en 30) C(en 33); G(en 71); A(en 74)]
- 66_A6_High_37119-EF177188
- 7 [T(en 8); T(en 9); A(en 24); G(en 30) C(en 33); G(en 71); A(en 74)]
- 66_A6_High_37119-EF177186
- 6 [T(en 8); A(en 24); G(en 30) G(en 35); G(en 71); A(en 74)]
- Tipo 56
- 56_A6_High_37119-EF177176
- 2 [G(en 24); C(en 56)]
- 56_A6_High 37119-EF177178
- 3 [C(en 20); C(en 23); C(en 24)]
- 56 A6_High 37119-EF177179
- 1 [C(en 24)]
- 56_A6_High 37119-EF177180
- 1 [G(en 24)]
- BD616grp56 E7
- 3 [G(en 24);T(en 54); C(en 56)]
- T1631-56 E7
- 1 [A(en 24)]
La figura 3 también ilustra los cebadores directos degenerados 211, 212, cebadores inversos degenerados 231, 232 y sondas degeneradas 221 y 222 con respecto a su región correspondiente en la secuencia diana 240. Solo se ilustran las variaciones en la secuencia diana 240 con respecto a la región de cebador directo, región de cebador inverso y regiones de detector en los recuadros 260, 270 y 280.
Por ejemplo, en el recuadro 260 obsérvese que hay dos polimorfismos de un solo nucleótido (T, C) entre la parte de la secuencia diana 240 delimitada por el recuadro 260 y entre la diana de HPV 66 y una diana de HPV 56. Sin embargo, el cebador directo 2112 para HPV 56 tiene un polimorfismo de un solo nucleótido y por lo tanto es degenerado con respecto al cebador directo 211 para HPV 66. El cebador directo 211 es el SEQ ID NO: 17 y el cebador directo 212 es el SEQ ID NO: 18. La degeneración entras las dos secuencias se observa fácilmente:
ACCTAATACACGTACCTTGTT
ACCTAATTCACGTACCTTGTT
La degeneración respectiva se indica por subrayado.
La degeneración hace que el cebador directo 211 prefiera unirse al HPV de tipo 56 y el cebador directo 212 prefiera unirse al HPV de tipo 66. Los conjuntos de cebadores/sondas degenerados prefieren unirse a la diana de un tipo de HPV respecto al otro tipo pero no discriminan. En términos de las figuras, los conjuntos de cebadores/sondas se describen en relación con la diana. Los recuadros 260, 270 y 280 contienen información sobre la degeneración entre los HPV de tipos 56 y 66 con respecto a la región diana 240 delimitada por los recuadros 260, 270 y 280. Esto es una referencia de sitio y no referencia de hibridación. Específicamente, los cebadores inversos 231 y 232 (SEQ ID NO: 19 y 20) tienen secuencias que son el complemento inverso de la secuencia en su correspondiente sitio en la diana 240. De forma similar, las sondas 221 y 222 (SEQ ID NO: 22 y 23) son el complemento inverso de la secuencia en su sitio correspondiente en la diana 240. Los cebadores directos 211 y 212 (SEQ ID NO: 17 y 18) son homólogos a la secuencia en su correspondiente sitio en la diana 140. Aunque no se describe específicamente, la degeneración entre los cebadores inversos y sondas en los conjuntos de cebadores y sondas degenerados se observa fácilmente.
Además de los ejemplos de conjuntos de cebadores/sondas degenerados descritos en la presente memoria, el experto en la técnica, basado en la descripción de la presente memoria y las figuras que acompañan, podría identificar otras regiones diana de serotipos estrechamente relacionados para los que se podrían diseñar conjuntos de cebadores/sondas degenerados. Como se observa fácilmente por las figuras, las regiones diana deseables tendrán pocos polimorfismos entre los serotipos individuales. Aquellos polimorfismos que están presentes se pueden abordar en el diseño del conjunto de cebadores/sondas degenerados de acuerdo con la forma descrita en la presente memoria.
Como se describe a continuación, los cebadores y sondas pueden unirse a secuencias diana incluso aunque sean menos de 100% complementarias con esas regiones. El grado de complementariedad necesario depende de una variedad de factores que incluyen las condiciones restrictivas de la unión. Dependiendo de las condiciones
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de fluorescencia tal como la intensidad, que sirve como una indicación de la amplificación de la diana.
El cambio en la fluorescencia que da como resultado el desplegado o la linearización de los oligonucleótidos detectores, se puede detectar en un punto final seleccionado en la reacción. Sin embargo, debido a que se producen estructuras secundarias linearizadas simultáneamente con la hibridación o extensión del cebador, también se puede vigilar el cambio en la fluorescencia a medida que ocurre la reacción, es decir, en “tiempo real”. Este formato de ensayo en tiempo real, homogéneo, se puede usar para proporcionar información semicuantitativa o cuantitativa sobre la cantidad inicial de diana presente. Cuando están presentes más copias iniciales de la secuencia diana, la fluorescencia del donador alcanza más rápidamente un valor umbral seleccionado (p. ej., tiempo más corto para positividad). La disminución en la fluorescencia del aceptor presenta de forma similar un tiempo más corto para la positividad, detectado como el tiempo necesario para alcanzar un valor mínimo seleccionado. Además, la velocidad de cambio de los parámetros de fluorescencia durante el curso de la reacción es más rápido en muestras que contienen cantidades iniciales mayores de diana que en muestras que contienen cantidades iniciales menores de diana (es decir, mayor pendiente de la curva de fluorescencia). Se pueden hacer estas u otras mediciones como se conoce en la técnica como una indicación de la presencia de diana o como una indicación de la amplificación de la diana. La cantidad inicial de diana típicamente se determina por comparación de los resultados experimentales con los resultados para cantidades conocidas de diana.
Los ensayos para la presencia de una secuencia diana seleccionada de acuerdo con los métodos de la invención, se pueden llevar a cabo en solución o en una fase sólida. Los ensayos homogéneos en tiempo real o de punto final en los que el oligonucleótido detector funciona como un cebador se llevan a cabo típicamente en solución. También se pueden llevar a cabo ensayos de hibridación usando oligonucleótidos detectores de la invención en solución (p. ej., como ensayos en tiempo real homogéneos) pero también son particularmente adecuados los ensayos en fase sólida para la detección en tiempo real o de punto final de la diana. En un ensayo en fase sólida, los oligonucleótidos detectores se pueden inmovilizar en la fase sólida (p. ej., perlas, membranas o el recipiente de reacción) mediante marcadores internos o terminales usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un oligonucleótido detector marcado con biotina se puede inmovilizar en una fase sólida modificada con avidina donde producirá un cambio en la fluorescencia cuando se expone a la diana en las condiciones de hibridación adecuadas. La captura de la diana de esta forma facilita la separación de la diana de la muestra y permite la eliminación de sustancias en la muestra que pueden interferir con la detección de la señal u otros aspectos del ensayo.
Por conveniencia comercial, los oligonucleótidos útiles para la detección e identificación específica de ácidos nucleicos de HPV se pueden envasar en forma de un kit. Típicamente, dicho kit contiene al menos un oligonucleótido descrito en la presente memoria. Los reactivos para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico también se pueden incluir con los oligonucleótidos específicos para el HPV. Por ejemplo, se pueden incluir tampones, otros oligonucleótidos, trifosfatos de nucleótidos, enzimas, etc. Los componentes del kit se pueden envasar juntos en un recipiente común. Opcionalmente se pueden incluir instrucciones que ilustren una realización descrita para llevar a cabo una realización específica de los métodos de la invención. También se pueden incluir otros componentes opcionales en el kit, p. ej., un oligonucleótido marcado con un marcador adecuado para usar como una sonda de ensayo y/o reactivos o medios para detectar el marcador.
Además, el kit puede incluir oligonucleótidos y reactivos en formato seco o líquido. Los componentes del kit pueden ser más estables y se pueden manipular más fácilmente cuando están en formato seco. Los componentes secos del kit se pueden añadir a o pretratar en una fase sólida tal como una placa de microvaloración, micromatriz u otro receptáculo adecuado, donde solo es necesario añadir la muestra y el tampón. Este formato facilita el ensayo de múltiples muestras simultáneamente y es útil en los métodos de alta capacidad. Se pueden usar los instrumentos BD ProbeTec™ y Viper™ XTR.
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones específicas de la invención descrita en la presente memoria. Como será evidente para los expertos en la técnica, son posibles diferentes cambios y modificaciones, y están contemplados dentro del alcance de la invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
A continuación se describe con más detalle un sistema de PCR de Taq-Man para la detección del HPV, usando los conjuntos de cebadores/sondas de la tabla 1 como ejemplo. Los conjuntos de cebadores de los cebadores/sondas descritos en la tabla 1 anterior se diseñaron para llevar a cabo la PCR de Taq-Man para los HPV de tipos 39 y 68 y
51. Específicamente, en la primera realización donde el primer conjunto de cebadores/sondas degenerado es para el HPV de tipos 39 y 68, el conjunto de cebadores/sondas que prefiere el HPV de tipo 39 son los SEQ ID NO: 1, 3 y 5. El conjunto de cebadores/sondas que prefiere el HPV de tipo 68 son los SEQ ID NO: 2, 4 y 6.
La PCR en tiempo real de Taq-Man es un tipo de PCR cuantitativa. Taq-Man usa una sonda fluorgénica que es un oligonucleótido monocatenario de 20-26 nucleótidos y está diseñado para unirse solo a la secuencia de ADN entre los dos cebadores de la PCR. En Taq-Man, los colorantes indicadores y los colorantes amortiguadores están unidos a la sonda. La sonda se reasocia con el ADN alternando la temperatura para desnaturalizar y reasociar el ADN. La polimerasa Taq añade nucleótidos al ADN diana y esto separa la sonda Taq-Man del ADN molde. Cuando el colorante indicador se separa del colorante amortiguador, el colorante indicador emite energía que es detectable. La energía es cuantificada por un ordenador, que proporciona una señal que indica que se ha detectado la diana. Solo el producto de la PCR específico puede generar la señal fluorescente en la PCR de Taq-Man.
En el ejemplo de la presente memoria, está contemplado el ciclo térmico. Después de una etapa de desnaturalización inicial a 95ºC durante 15 minutos, la mezcla de la PCR de conjuntos de cebadores/sondas y muestra para la detección de la presencia o ausencia de diana, se somete al ciclo térmico de 55ºC durante 1 minuto seguido de 95ºC durante 30 segundos durante cuarenta ciclos.
5 Para llevar a cabo la PCR de Taq-Man, se usan dos cebadores de PCR con un tamaño de producto preferido de 50150 pares de bases y una sonda con un indicador fluorescente o fluoróforo (p. ej., 6-carboxifluoresceína (FAM) y tetraclorofluoresceína (TET)) y un amortiguador tal como tetrametilrodamina (TAMRA) o un amortiguador oscuro tal como se ha descrito previamente que se unen covalentemente a sus extremos 5’ y 3’. Los indicadores fluorescentes y fluoróforos adecuados son bien conocidos y no se describen con detalle en la presente memoria.
10 Tabla 5: Ejemplos de conjuntos de sondas de PCR de Taq-Man para el ensayo Taq-Man de HPV de tipo 39, 68 y 51
- SEQ ID NO:
- Descripción de la sonda Oligonucleótido secuencia 5' -3' Sitio en ORF (pb) Acceso en Genbank en ()
- SEQ ID NO: 1
- HPV 39 E6 Taq-Man Cebador directo CCACTAGCTGCATGCCAATC 287-306 (M62849)
- SEQ ID NO: 2
- HPV 68 E6 Taq-Man Cebador directo CCATTAGCTGCATGCCAATC 181-200 (EU918769)
- SEQ ID NO: 3
- HPV 39 E6 Taq-Man Cebador inverso CTAATGTAGTTGCATACACCGA 356-377 (M62849)
- SEQ ID NO: 4
- HPV 68 E6 Taq-Man Cebador inverso CTAATGTTGTTGCATACACCGA 250-271 (EU918769)
- SEQ ID NO: 5
- HPV 39 E6 Taq-Man Sonda GAGTAATATCGTAGCTCCCGTATTTT 326-351 (M62849)
- SEQ ID NO: 6
- HPV 68 E6 Taq-Man Sonda GAGTAATATCGTAGTTCCCGTATTTT 220-245 (EU918769)
- SEQ ID NO: 24
- HPV 51 E6 Cebador directo GCAGTATGCAAACAATGTTCAC 277-298 (M62877)
- SEQ ID NO: 25
- HPV 51 E6 Cebador inverso TAGTAATTGCCTCTAATGTAGTA 351-373 (M62877)
- SEQ ID NO: 26
- HPV 51 E6 Taq-Man Sonda CCTGCTATAACGTCTATACTCTCTA 315-339 (M62877)
- SEQ ID NO: 27
- HPV 51 E7 Cebador directo CTCAGAGGAGGAGGATGAAG 652-671 (M62877)
- SEQ ID NO: 28
- HPV 51 E7 Cebador inverso TGAACACCTGCAACACGGAG 738-757 (M62877)
- SEQ ID NO: 29
- HPV 51 E7 Taq-Man Sonda CTACCAGAAAGACGGGCTGGAC 692-713 (M62877)
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| CA2399364A1 (fr) * | 2000-02-08 | 2001-08-16 | Aventis Pharma S.A. | Procede de detection et de quantification d'adenovirus |
| ES2276948T3 (es) * | 2001-08-23 | 2007-07-01 | MERCK & CO., INC. | Ensayos pcr de hp multiplex fluorescente que usan fluoforos multiples. |
| SE0202897D0 (sv) * | 2002-10-01 | 2002-10-01 | Quantovir Ab | Method and kit for quantitative and qualitative determination of human papillomavirus |
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| US20060257894A1 (en) * | 2003-09-16 | 2006-11-16 | Michel Doumith | Molecular typing of listeria monocytogenes, hybridization supports and kits for said molecular typing |
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| EP1997914A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-03 | Università Degli Studi Di Milano - Bicocca | Identification and quantification of oncogenic HPV nucleic acids by means of real-time PCR assays |
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