ES2874347T3

ES2874347T3 - Ensayo de amplificación de ácido nucleico múltiple

Info

Publication number: ES2874347T3
Application number: ES18728084T
Authority: ES
Inventors: Stephen Gordon Will
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2021-11-04
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: EP3631007A1; CA3064500A1; JP7198225B2; JP2020520664A; CA3064500C; EP3631007B1; CN110621783A; WO2018215640A1; US20190093155A1

Abstract

Un procedimiento para la detección de una pluralidad de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de muestra que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene una pluralidad de ácidos nucleicos diana con (i) un primer conjunto de cebador/sonda que incluye una primera sonda marcada y un primer cebador, y (ii) un segundo conjunto de cebador/sonda que incluye una segunda sonda marcada y un segundo cebador, en el que dicho primer cebador se hibrida con un ácido nucleico diana de dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana a una primera temperatura y dicho segundo cebador se hibrida con un ácido nucleico adicional de dicha pluralidad de dichos ácidos nucleicos diana a una segunda temperatura y dicha primera temperatura es más alta que dicha segunda temperatura; (b) amplificar dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana en la muestra en una reacción de amplificación que incluye al menos un perfil de temperaturas de hibridación/alargamiento de dos etapas que incluye una primera etapa que comprende dicha primera temperatura y una segunda etapa que comprende dicha segunda temperatura; (c) detectar, secuencialmente, sobre al menos una parte de dicho perfil de temperaturas de hibridación/alargamiento (i) una primera señal detectable durante dicha primera etapa, que resulta de la hibridación/alargamiento del primer cebador y que corresponde a la señal emitida por dicho primer marcador; (ii) una segunda señal detectable durante dicha segunda etapa, que resulta de la hibridación/alargamiento del primer y segundo cebadores y que corresponde a la señal emitida por dicho primer y dicho segundo marcador; y (iii) restar dicha primera señal detectable de dicha segunda señal detectable para identificar la señal detectable emitida por dicho segundo marcador; y (d) medir una cantidad relativa de cada ácido nucleico diana en dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo de amplificación de ácido nucleico múltiple

Campo de la divulgación

La divulgación se refiere, en general, a la amplificación y detección in vitro de ácidos nucleicos. Específicamente, la divulgación se refiere a un ensayo múltiple en un único tubo, que puede amplificar y detectar simultáneamente múltiples dianas de ácido nucleico, usando múltiples conjuntos de cebadores y sondas de hibridación, en el que las sondas están marcadas con el mismo marcador indicador. El ensayo se puede multiplexar además con el uso de varios indicadores.

Antecedentes de la divulgación

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en una herramienta ubicua de investigación biomédica, supervisión y diagnóstico de enfermedades. La amplificación de secuencias de ácido nucleico por PCR se describe en las patentes de EE. UU. n.os 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188. La PCR es ahora bien conocida en la técnica y se ha descrito ampliamente en la literatura científica. Véanse PCR Applications, ((1999) Innis et al., eds., Academic Press, San Diego), PCR Strategies, ((1995) Innis et al., eds., Academic Press, San Diego); PCR Protocols, ((1990) Innis et al, eds., Academic Press, San Diego), y PCR Technology, ((1989) Erlich, ed., Stockton Press, New York). Un ensayo de PCR "ultrarrápida" puede amplificar y detectar y cuantificar simultáneamente la cantidad inicial de la secuencia diana. El ensayo de PCR ultrarrápida TaqMan básico que usa la actividad nucleasa de la ADN polimerasa se describe en Holland et al, (1991) Proc. Nath Acad. Sci. 88:7276-7280 y la patente de EE. UU. n.° 5.210.015. La PCR ultrarrápida sin la actividad nucleasa (un ensayo sin nucleasa) se ha descrito en una solicitud de EE. UU. con n.° de serie 12/330.694 presentada el 9 de diciembre de 2008. El uso de sondas fluorescentes en PCR ultrarrápida se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.538.848. Los procedimientos de detección de sonda para diana se divulgan además en los documentos EP2228454 A1, WO96/15270 A1 y WO2010/068576 A1.

Un protocolo de PCR ultrarrápida típico implica el uso de una sonda marcada, específica para cada secuencia diana. La sonda se marca preferentemente con uno o más restos fluorescentes, que emiten luz de una longitud de onda detectable. Tras la hibridación con la secuencia diana o su amplicón, la sonda presenta un cambio detectable en la emisión fluorescente.

Sin embargo, el mayor desafío del ensayo ultrarrápido sigue siendo la capacidad de analizar numerosas dianas en un único tubo. En prácticamente todos los campos de la medicina y el diagnóstico, el número de locus de interés se incrementa rápidamente. Por ejemplo, se deben analizar múltiples locus en la elaboración de perfiles de ADN forense, detección de microorganismos patógenos, cribado de enfermedades genéticas de múltiples locus y estudios de expresión de múltiples genes, por nombrar unos pocos. Con los procedimientos actuales, la capacidad de multiplexar un ensayo está limitada por los instrumentos de detección. Específicamente, el uso de múltiples sondas en la misma reacción requiere el uso de distintos marcadores fluorescentes. Para detectar simultáneamente múltiples sondas, un instrumento debe poder distinguir las señales lumínicas emitidas por cada sonda. La tecnología actual no permite la detección de más de cuatro longitudes de onda separadas en el mismo recipiente de reacción. Por ejemplo, Bell et al. ("Real-time quantitative PCR in parasitology", Trends in Parasitol. (2002) 18(8):337-342,) estudiaron recientemente termocicladores de PCR cuantitativa ultrarrápida disponibles e informaron de que ninguno tiene más de cuatro canales de detección óptica. Por lo tanto, usando una sonda marcada de forma única por diana, no se pueden detectar más de cuatro dianas separadas en el mismo recipiente. En la práctica, al menos una diana es normalmente un ácido nucleico de control. En consecuencia, en la práctica, no se pueden detectar más de tres dianas experimentales en el mismo tubo. Puesto que el equipo óptico puede ofrecer como máximo una pequeña mejora incremental, la capacidad de multiplexar un ensayo no se mantendrá a la altura de las necesidades clínicas, a menos que se realicen cambios radicales en la estrategia de amplificación y detección.

Sumario de la divulgación

En el presente documento se proporciona un procedimiento para la detección de una pluralidad de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de muestra que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene una pluralidad de ácidos nucleicos diana con (i) un primer conjunto de cebador/sonda que incluye una primera sonda marcada y un primer cebador, y (ii) un segundo conjunto de cebador/sonda que incluye una segunda sonda marcada y un segundo cebador, en el que el primer cebador se hibrida con un ácido nucleico diana de la pluralidad de ácidos nucleicos diana a una primera temperatura y el segundo cebador se hibrida con un ácido nucleico adicional de la pluralidad de ácidos nucleicos diana a una segunda temperatura y la primera temperatura es más alta que la segunda temperatura; (b) amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos diana en la muestra en una reacción de amplificación que incluye al menos un perfil de temperaturas de hibridación/alargamiento de dos etapas que incluye una primera etapa que comprende la primera temperatura y una segunda etapa que comprende la segunda temperatura; (c) detectar, secuencialmente, una señal detectable del primer y segundo marcadores, respectivamente, sobre al menos una parte del perfil de temperaturas de hibridación/alargamiento; y (d) medir una cantidad relativa de cada ácido nucleico diana en la pluralidad de ácidos nucleicos diana. En algunos modos de realización, dichas primera y segunda sondas marcadas están marcadas cada una con el mismo resto indicador. En determinados modos de realización, dicho resto indicador es fluorescente. En algunos modos de realización, dichas primera y segunda sondas marcadas se marcan cada una con un resto indicador y un resto extintor. En determinados modos de realización, dicho resto indicador y dicho resto extintor son fluoróforos. En algunos modos de realización, dicho resto indicador es un fluoróforo y dicho resto extintor es un extintor oscuro. En algunos modos de realización, dicha etapa de detección comprende además (i) detectar una primera señal durante dicha primera etapa que corresponde a la señal emitida por dicho primer marcador, (ii) detectar una segunda señal durante dicha segunda etapa, y (iii) restar dicha primera señal de dicha segunda señal para identificar la señal detectable emitida por dicho segundo marcador. En algunos modos de realización, dichas primera y segunda etapas, respectivamente, se mantienen durante al menos 10 segundos. En determinados modos de realización, dichas primera y segunda etapas, respectivamente, se mantienen durante entre 5-10 segundos. En el presente documento, cada una de la etapa de hibridación y/o la etapa de extensión se pueden mantener a una temperatura constante durante el período de tiempo indicado. En determinados modos de realización, cada una de la etapa de hibridación y/o la etapa de extensión se puede mantener a una temperatura constante durante al menos 10 segundos, durante al menos 15 segundos, durante al menos 20 segundos o entre 5-10 segundos. En algunos modos de realización, la amplificación de la pluralidad de ácidos nucleicos diana en la muestra incluye una primera etapa que comprende mantener la reacción a una primera temperatura constante durante al menos 5-10 segundos y posteriormente mantener la reacción a una segunda temperatura constante durante al menos 5-10 segundos. En determinados modos de realización, cada una de la primera y/o la segunda temperatura se mantiene durante al menos 10 segundos, durante al menos 15 segundos, durante al menos 20 segundos o entre 5-10 segundos. En algunos modos de realización, la primera y segunda temperaturas están separadas al menos 15 grados, en particular, separadas al menos 12 grados y separadas al menos aproximadamente 10 grados. Además, en algunos modos de realización, la primera y segunda sondas marcadas se marcan cada una con el mismo resto indicador y la etapa de detección comprende además (i) detectar una primera señal durante dicha primera etapa que corresponde a la señal emitida por dicho primer marcador, (ii) detectar una segunda señal durante dicha segunda etapa, y (iii) restar dicha primera señal de dicha segunda señal para identificar la señal detectable emitida por dicho segundo marcador. En algunos modos de realización, dicha reacción de amplificación se realiza en presencia de una mezcla de ADN polimerasas.

También se divulga un kit para la detección de una pluralidad de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de muestra que comprende, en recipientes, frascos o compartimentos separados, (i) un primer conjunto de cebador/sonda que incluye una primera sonda marcada y un primer cebador, y (ii) un segundo conjunto de cebador/sonda que incluye una segunda sonda marcada y un segundo cebador, en el que dicho primer cebador se hibrida con un ácido nucleico diana de la pluralidad de ácidos nucleicos diana a una primera temperatura y el segundo cebador se hibrida con un ácido nucleico adicional de dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana a una segunda temperatura y la primera temperatura es más alta que la segunda temperatura. El kit puede incluir además los reactivos necesarios para la amplificación de ácidos nucleicos diana, que opcionalmente comprenden un ácido nucleico de control de concentración conocida. En algunos modos de realización, dichas primera y segunda sondas marcadas están marcadas cada una con el mismo resto indicador. En determinados modos de realización, dicho resto indicador es fluorescente. En algunos modos de realización, dichas primera y segunda sondas marcadas se marcan cada una con un resto indicador y un resto extintor. En determinados modos de realización, dicho resto indicador y dicho resto extintor son fluoróforos. En determinados modos de realización, dicho resto indicador es un fluoróforo y dicho resto extintor es un extintor oscuro. En algunos modos de realización, el kit comprende además un ácido nucleico de control de concentración conocida. En algunos modos de realización, el único recipiente de muestra comprende un túbulo de procesamiento de muestra que incluye un tubo que define un canal de flujo de fluido y una pluralidad de segmentos situados en el mismo, en el que al menos un segmento del tubo comprende dichos primer y segundo conjuntos de cebador/sonda. En el presente documento, dicho tubo puede comprender además uno o más segmentos adicionales que incluyen los reactivos necesarios para la amplificación de los ácidos nucleicos diana. En algunos modos de realización, dichos reactivos comprenden una mezcla de ADN polimerasas.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 es una representación gráfica del perfil de amplificación de dos secuencias diana en una muestra usando cebador/sonda A y cebador/sonda B usando un perfil de temperaturas de hibridación/alargamiento de cebador de dos etapas.

La fig. 2 muestra la fluorescencia relativa resultante de la amplificación de dos secuencias diana en una muestra usando dos conjuntos separados de cebadores y sondas, cebador/sonda A y cebador/sonda B, en el que el procedimiento de amplificación incluye un perfil de temperaturas de hibridación/alargamiento de cebador de dos etapas.

Descripción detallada de la divulgación

Definiciones

A menos que se defina de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente divulgación tendrán los significados que se entienden comúnmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera de otro modo por contexto, los términos en singular incluirán el plural y los términos en plural incluirán el singular. Los artículos "un/uno" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" quiere decir un elemento o más de un elemento.

Los términos "detectar", "que detecta", "detección" y términos similares se usan en la presente solicitud para referirse ampliamente a un procedimiento o descubrir o determinar la presencia o ausencia, así como un grado, cantidad o nivel, o probabilidad de aparición de algo. Por ejemplo, el término "que detecta" cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico diana, puede indicar el descubrimiento o determinación de la presencia, ausencia, nivel o cantidad, así como una probabilidad o posibilidad de la presencia o ausencia de la secuencia. Se ha de entender que las expresiones "que detecta la presencia o ausencia", "detección de la presencia o ausencia" y expresiones relacionadas incluyen detección cualitativa y cuantitativa. Por ejemplo, la detección cuantitativa incluye la determinación del nivel, la magnitud o las cantidades de secuencias de ácido nucleico asociadas al VIH en una muestra.

Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) e incluyen ácidos nucleicos naturales (adenosina, guanidina, citosina, uracilo y timidina), no naturales y modificados. El término no está limitado por la longitud (por ejemplo, número de monómeros) del polímero. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario y en general contendrá enlaces fosfodiéster 5'-3', aunque en algunos casos, los análogos nucleotídicos pueden tener otras uniones. Los monómeros se denominan típicamente nucleótidos. El término "nucleótido no natural" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que contiene una base nitrogenada, glúcido o grupo fosfato modificado, o que incorpora un resto no natural en su estructura. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen didesoxinucleótidos, nucleótidos biotinilados, aminados, desaminados, alquilados, bencilados y marcados con fluoróforo.

El término "cebador" se refiere a un ácido nucleico corto (un oligonucleótido) que actúa como un punto de inicio de la síntesis de cadenas polinucleotídicas por una ácido nucleico polimerasa en condiciones adecuadas. Las reacciones de síntesis y amplificación de polinucleótidos incluyen típicamente un tampón apropiado, dNTP y/o rNTP, y uno o más cofactores opcionales, y se llevan a cabo a una temperatura adecuada. Un cebador incluye típicamente al menos una región hibridada a la diana que es al menos sustancialmente complementaria a la secuencia diana. Esta región tiene típicamente una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos. Un "par de cebadores" se refiere a un cebador directo y un cebador inverso (a veces llamados cebadores 5' y 3') que son complementarios a las cadenas opuestas de una secuencia diana y se diseñan para amplificar la secuencia diana. Los cebadores directo e inverso se disponen dentro de una distancia amplificable entre sí en la secuencia diana, por ejemplo, aproximadamente 10-5000 nucleótidos, o aproximadamente 25-500 nucleótidos.

Como se usa en el presente documento, "sonda" quiere decir cualquier molécula que se puede unir selectivamente a una biomolécula diana específicamente destinada, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de interés que se va a unir, capturar o hibridar por la sonda.

Las palabras "complementario" o "complementariedad" se refieren a la capacidad de un ácido nucleico en un polinucleótido para formar un par de bases con otro ácido nucleico en un segundo polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia 5'-A-G-T-3' (5-A-G-U-3' para ARN) es complementaria a la secuencia 3'-T-C-A-5' (3-U-C-A-5' para ARN). La complementariedad puede ser parcial, en la que solo algunos de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases, o completa, donde todos los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases. Una sonda o cebador se considera "específico para" una secuencia diana si es al menos parcialmente complementario a la secuencia diana. Dependiendo de las condiciones, el grado de complementariedad de la secuencia diana es típicamente mayor para un ácido nucleico más corto tal como un cebador (por ejemplo, más de un 80 %, 90 %, 95 % o mayor) que para una secuencia más larga.

El término "condiciones de amplificación" o expresiones similares se refieren a condiciones en una reacción de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, amplificación por PCR) que permiten la hibridación y la extensión dependiente del molde de los cebadores. El término "amplicón" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene toda o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico diana y que se forma como el producto de una amplificación in vitro por cualquier procedimiento de amplificación adecuado. Diversas condiciones de PCR se describen en PCR Strategies (Innis et al., 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Academic Press, NY, 1990) El término "ácido nucleico polimerasa termoestable" o "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa, que es relativamente estable a temperaturas elevadas en comparación, por ejemplo, con polimerasas de E. coli. Una polimerasa termoestable es adecuada para su uso en condiciones de termociclado típicas de la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). Las polimerasas termoestables ejemplares incluyen las de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. Z05 (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.674.738) y mutantes de Thermus sp. Z05 polimerasa, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. spsl7, Deinococcus radiodurans, familia B de fuentes de aguas termales/clon 7, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana y Thermosipho africanus, y versiones modificadas de las mismas.

El término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a cualquier composición que contiene o que se sospecha que contiene ácido nucleico de un individuo. El término incluye componentes purificados o separados de células, tejidos o sangre, por ejemplo, ADN, ARN, proteínas, partes sin células o lisados celulares. En un modo de realización específico, el análisis se lleva a cabo en muestras de sangre completa. Como se usa en el presente documento, una "muestra de sangre completa" incluye sangre extraída del cuerpo de la que no se ha retirado ningún constituyente, tal como plasma o plaquetas. En general, la muestra no se modifica excepto por la presencia de un anticoagulante. Una muestra también se puede referir a otros tipos de muestras biológicas, por ejemplo, plasma, suero, componentes sanguíneos (capa leucocitaria) y manchas de sangre seca. Las muestras también pueden incluir constituyentes y componentes de cultivos in vitro de células obtenidas de un individuo, incluyendo líneas celulares.

El término "kit" se refiere a cualquier fabricación (por ejemplo, un envase o un recipiente) que incluye al menos un dispositivo que comprende un soporte sólido, como se describe en el presente documento, para amplificar, capturar, marcar/convertir o detectar específicamente una secuencia de ácido nucleico diana como se describe en el presente documento. El kit puede incluir además instrucciones de uso, reactivos complementarios y/o componentes o módulos usados en el procedimiento descrito en el presente documento o una etapa del mismo.

Un "fluoróforo" es un compuesto o un resto unido, por ejemplo, a un ácido nucleico, que puede emitir radiación lumínica cuando se excita con una luz de una longitud de onda adecuada. Los tintes fluorescentes típicos incluyen tintes de rodamina, tintes de cianina, tintes de fluoresceína y tintes BODIPY®. Un fluoróforo es un cromóforo fluorescente.

"FRET" o "transferencia de energía de resonancia fluorescente" o "transferencia de energía de resonancia de Foerster" es una transferencia de energía entre al menos dos cromóforos, un cromóforo donante y un cromóforo aceptor (denominado extintor). El donante típicamente transfiere la energía al aceptor cuando se excita el donante por radiación lumínica con una longitud de onda adecuada. El aceptor típicamente reemite la energía transferida en forma de radiación lumínica con una longitud de onda diferente. Cuando el aceptor es un extintor "oscuro", disipa la energía transferida en una forma distinta de la luz. Que un fluoróforo particular actúe como donante o como aceptor depende de las propiedades del otro miembro del par de FRET. Los pares donante-aceptor usados comúnmente incluyen el par FAM-TAMRA. Los extintores usados comúnmente son DABCYL y TAMRA. Los extintores oscuros usados comúnmente son BlackHole Quenchers™ (BHQ), Biosearch Technologies, Inc., (Novato, Cal.), lowa Black™, Integrated DNA Tech., Inc., (Coralville, lowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), Berry & Assoc., (Dexter, Mich.). Los pares donante-extintor usados comúnmente incluyen el par FAM-BHQ.

La "hibridación" es una interacción entre dos ácidos nucleicos normalmente monocatenarios o al menos parcialmente monocatenarios. La hibridación se produce como resultado del emparejamiento de bases entre nucleobases e implica procesos fisicoquímicos tales como enlaces de hidrógeno, exclusión de disolvente, apilamiento de bases y similares. La hibridación se puede producir entre hebras de ácido nucleico totalmente complementarias o parcialmente complementarias. La capacidad de los ácidos nucleicos para hibridar está influenciada por la temperatura y otras condiciones de hibridación, que se pueden manipular para que se produzca la hibridación de ácidos nucleicos incluso parcialmente complementarios. La hibridación de ácidos nucleicos es bien conocida en la técnica y se ha descrito ampliamente en Ausubel (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, v. I, II y III (1997).

Un "marcador" se refiere a un resto unido (covalente o no covalentemente) a una molécula, pudiendo este resto proporcionar información sobre la molécula. Los marcadores ejemplares incluyen marcadores fluorescentes, marcadores radioactivos y grupos modificadores de masa.

La "temperatura de hibridación" se refiere a la temperatura a la que la mitad de una población de moléculas de ácido nucleico monocatenario complementarias se hibridan para obtener unas homodúplex o heterodúplex. La temperatura de hibridación se puede basar en la temperatura de fusión (Tf), es decir, la temperatura a la que se disocia la mitad de una población de moléculas de ácido nucleico bicatenario. La temperatura de hibridación se ve afectada por la fuerza iónica y el pH de la solución, así como por la concentración, la composición de bases y la estructura secundaria. La temperatura de hibridación de un par de ácidos nucleicos complementarios en condiciones dadas se puede determinar experimentalmente o predecir con la ayuda de un programa informático comercial, tal como Visual OMP™ (DNA Software, Inc., Ann Arbor, Mich.).

Procedimientos

La presente divulgación proporciona un procedimiento de detección múltiple simultánea de dianas de ácido nucleico. En un modo de realización, el procedimiento utiliza múltiples sondas marcadas con el mismo resto indicador, conjuntamente con múltiples cebadores, teniendo cada uno una temperatura de hibridación única con una secuencia diana dada. Debido a que los cebadores se pueden identificar por sus respectivas temperaturas de hibridación, se pueden usar los mismos fluoróforos para generar una señal detectable para cada cebador. El ensayo se puede multiplexar además usando varios conjuntos de cebadores/sondas, incluyendo cada conjunto una sonda marcada con un resto indicador separado, hasta el número de restos distinguibles por el instrumento de detección.

Los procedimientos descritos en el presente documento incluyen la detección de señales producidas por cada conjunto de cebadores durante cada fase de hibridación y alargamiento de cebadores. El procedimiento se ilustra, por ejemplo, en la fig. 1. Una muestra que incluye una pluralidad de secuencias de ácido nucleico diana se mezcla con (i) un primer conjunto de cebador/sonda que incluye una primera sonda marcada y un primer cebador (sonda A y cebador A en la fig. 1), y (ii) un segundo conjunto de cebador/sonda que incluye una segunda sonda marcada y un segundo cebador (sonda B y cebador B en la fig. 1), en el que el primer cebador se diseña para hibridarse con un ácido nucleico diana en la muestra, si está presente, a una primera temperatura y el segundo cebador se diseña para hibridarse con un ácido nucleico adicional en la muestra, si está presente, a una segunda temperatura, y la primera temperatura es más alta que la segunda temperatura. Las secuencias de ácido nucleico diana en la mezcla se desnaturalizan, por ejemplo, a 95 °C (panel A), y la temperatura se reduce gradualmente, por ejemplo, hasta 70 °C, para permitir que las sondas se hibriden con sus respectivas secuencias diana (panel B). La temperatura de la mezcla disminuye gradualmente hasta una primera temperatura en un perfil de hibridación/alargamiento de cebador de múltiples etapas, por ejemplo, 62 °C (panel C), para permitir que el cebador A se hibride con la secuencia diana (panel C(i)) y se alargue (panel C(ii)). A medida que se alarga el cebador A, se hidroliza la sonda A, generando una señal detectable. En este punto del procedimiento, debido a que solo el cebador A se ha hibridado con la diana, la señal detectable se atribuye únicamente a la hibridación/alargamiento del cebador A y su respectiva secuencia diana.

A continuación, la temperatura se reduce una vez más hasta la segunda temperatura del perfil de hibridación/alargamiento del cebador, por ejemplo, 50 °C (panel D), punto en el que el cebador B se hibrida con la secuencia diana (panel D(i)) y se alarga (panel D(ii)), finalmente hibridando la sonda B y generando una señal detectable complementaria. La señal detectable de la hibridación/alargamiento del cebador A no se extingue cuando la temperatura se reduce hasta la segunda temperatura y, por lo tanto, la señal detectable acumulativa a la segunda temperatura corresponde a la señal asociada con la hibridación y alargamiento del cebador A y el cebador B. La señal detectable asociada con el cebador B se puede calcular restando la señal detectable a la segunda temperatura de la observada a la primera temperatura. El procedimiento también se ilustra en la fig. 2, en la que la temperatura se representa frente a la fluorescencia. A medida que disminuye la temperatura, se incrementa la señal de fluorescencia relativa.

Se entenderá que, si bien el procedimiento se ilustra en las figuras y se describe anteriormente usando dos conjuntos de cebador/sonda, se pueden mezclar múltiples conjuntos de cebador/sonda con la muestra simultáneamente para lograr un mayor nivel de multiplexación, siempre que la temperatura de hibridación de cada secuencia de cebador y diana en un perfil de amplificación sea distinta de la de las otras secuencias de cebador/diana en la muestra. En un modo de realización, las temperaturas de hibridación de cada secuencia de cebador/diana están separadas al menos 15 grados, en particular, separadas al menos 12 grados y separadas al menos aproximadamente 10 grados.

Las sondas se pueden marcar con el mismo resto indicador. El resto indicador puede ser un cromóforo, por ejemplo, un fluoróforo, y si se usan dos cromóforos como resto indicador, uno es típicamente un cromóforo indicador y el otro es un extintor. Ambos cromóforos pueden ser fluoróforos o uno de los cromóforos puede ser un extintor no fluorescente. Los ejemplos de fluoróforos adecuados incluyen tintes de la familia de las fluoresceínas (FAM, HEX, TET, JOE, nAn y ZOE), la familia de las rodaminas (Texas Red, ROX, R110, R6G y TAMRA), la familia de las cianinas (Cy2, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5 y Cy7) la familia de las cumarinas, la familia de las oxacinas, la familia de las tiacinas, la familia de las escuaraínas y otras familias de tintes fluorescentes adecuados para el marcaje y detección de ácidos nucleicos. El segundo cromóforo se puede incorporar en el mismo oligonucleótido de sonda o en un oligonucleótido de sonda separado. Los extintores oscuros usados comúnmente incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ) (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa) y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

En algunos modos de realización, cada sonda se marca con dos cromóforos que forman un par de FRET. En algunos modos de realización, ambos cromóforos son fluoróforos. En otros modos de realización, un cromóforo es un extintor no fluorescente. Los cromóforos que forman el par de FRET se pueden conjugar con la misma o con moléculas de sonda separadas. El uso de sondas de FRET en un ensayo de fusión se ha descrito en la patente de EE. UU. n.° 6.174.670 y en De Silva et al., (1998) "Rapid genotyping and quantification on the LightCycler™ with hybridization probes", Biochemica, 2:12-15. En otros modos de realización, la sonda se marca con un único cromóforo que interactúa con un segundo cromóforo conjugado con o bien intercalado en el ácido nucleico diana. Véase la patente de EE. UU. n.° 5.871.908.

De forma alternativa, para lograr un grado incluso mayor de multiplexación, se pueden usar dos o más restos indicadores o un conjunto de restos indicadores. Por ejemplo, se usa un primer resto indicador con los dos primeros cebadores, teniendo cada cebador una temperatura de hibridación diferente pero detectados con el mismo tipo de señal detectable, y se puede usar un segundo resto indicador con dos cebadores adicionales, teniendo cada cebador las mismas temperaturas de hibridación que los dos primeros cebadores, pero debido a que están marcados con un segundo tipo de señal detectable, son detectables por separado de los dos primeros cebadores. Por ejemplo, en referencia a una extensión del experimento representado en las figs.

1A-1D, cada uno de los conjuntos de cebador/sonda A y B usan el mismo primer resto indicador, y un par adicional de conjuntos de cebador/sonda, por ejemplo, los conjuntos C y D (no mostrados), incluyen un segundo resto indicador, en el que el primer y segundo restos indicadores generan cada uno una señal detectable diferente. Por lo tanto, cada una de las secuencias diana individuales se puede detectar usando la temperatura de hibridación y/o el resto indicador. En este ejemplo, A se distingue de B porque se hibridan con la diana a diferentes temperaturas aunque estén marcados con el mismo resto indicador; pero A se distingue de C y D al menos porque la amplificación de A se detecta usando un resto indicador diferente al observado durante la amplificación de C y D. En los ejemplos descritos anteriormente en el presente documento e ilustrados en las figuras, se usa una etapa de hibridación/alargamiento de cebador de dos conjuntos, pero se entenderá por el experto en la técnica que si se usan conjuntos de cebador/sonda adicionales y se desean mayores niveles de multiplexación, se pueden incluir etapas de cebador/hibridación/alargamiento adicionales en el procedimiento.

La selección de las temperaturas apropiadas para las etapas de hibridación/alargamiento del cebador depende de la polimerasa termoestable seleccionada usada. En los ejemplos no limitantes proporcionados en el presente documento, la etapa de desnaturalización se lleva a cabo a una temperatura entre 94-98 °C durante 20-30 segundos, por ejemplo, a 95 °C; la etapa de hibridación de sonda se realiza a 70-75 °C durante al menos 10 segundos, por ejemplo, 70 °C; la primera etapa de hibridación/extensión del cebador se realiza a 62-67 °C durante al menos 10 segundos, por ejemplo, 62 °C; y la segunda etapa de hibridación/extensión del cebador se realiza a 50-55 °C durante al menos 10 segundos, por ejemplo, 50 °C. En un modo de realización alternativo, la etapa de desnaturalización se lleva a cabo a una temperatura de entre 94-98 °C durante 20-30 segundos, por ejemplo, a 95 °C; la etapa de hibridación de sonda se realiza a 70-75 °C durante al menos 10 segundos, por ejemplo, 72 °C; la primera etapa de hibridación/extensión del cebador se realiza a 62-67 °C durante al menos 10 segundos, por ejemplo, 67 °C; y la segunda etapa de hibridación/extensión del cebador se realiza a 60-65 °C durante al menos 10 segundos, por ejemplo, 62 °C. Cada una de las etapas de hibridación/extensión se puede mantener a una temperatura constante durante al menos 20 segundos, por ejemplo, al menos 15 segundos, entre 5-10 segundos, y en un modo de realización, al menos 10 segundos.

Son conocidas en la técnica diversas ácido nucleico polimerasas termoestables que se pueden seleccionar para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento. En un modo de realización, se usa una polimerasa Z05 o mutante de la misma. De forma alternativa, se usa una polimerasa rTth o un mutante de la misma. A veces es ventajoso usar una polimerasa que carece de actividad nucleasa 5'-3'. A veces es deseable usar una polimerasa sin la actividad de corrección de errores (3'-5'-exonucleasa). Además, se puede usar una mezcla de polimerasas, por ejemplo, una primera polimerasa adecuada para la amplificación de un primer conjunto de cebador/sonda, y una segunda polimerasa adecuada para la amplificación de un segundo conjunto de cebador/sonda.

La secuencia de ácido nucleico diana detectada por el procedimiento de la presente divulgación puede tener cualquier longitud. Típicamente, el ácido nucleico diana tiene una longitud de entre 100 y 1000 nucleótidos. Sin embargo, también se pueden usar secuencias diana más largas (varios miles de nucleótidos) y más cortas (entre 50 y 100 nucleótidos) en algunos modos de realización de la presente divulgación. Una secuencia de ácido nucleico diana puede estar contenida dentro de una molécula de ácido nucleico más grande, aislada de una fuente de muestra natural o derivada de laboratorio.

Si bien la presente divulgación se refiere en general a un procedimiento en el que están presentes múltiples dianas en la muestra, se apreciará que en algunos modos de realización sólo existe una secuencia diana presente en una muestra. En un modo de realización típico de la presente divulgación, se realiza una reacción "múltiple" donde se detectan al menos dos y hasta doce o más subsecuencias o locus diana diferentes. Estos modos de realización en general, pero no siempre, implican el uso de un cebador de amplificación separado y una sonda separada para cada subsecuencia o locus diana. Sin embargo, en algunos modos de realización, el mismo ácido nucleico, que se amplifica usando el mismo cebador, se puede detectar con más de una sonda. Esto es ventajoso cuando una única secuencia contiene varias dianas o locus de interés, por ejemplo, varios sitios de mutación potenciales. Cada conjunto de cebador/sonda podrá detectar la mutación en cada sitio.

Los cebadores de amplificación de la presente divulgación son oligonucleótidos al menos parcialmente complementarios a al menos una de las variantes existentes de la secuencia diana. La longitud del cebador puede oscilar entre 6 y 100 nucleótidos, aunque la mayoría de los cebadores oscilan típicamente entre 15 y 35 nucleótidos. Los procedimientos de optimización de los cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos se han descrito, por ejemplo, en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., (1990) Academic Press. Típicamente, los cebadores son oligonucleótidos sintéticos, compuestos por nucleótidos A, C, G y T. Sin embargo, nucleótidos de bases no convencionales que se pueden incorporar a los ácidos nucleicos también se pueden usar en los cebadores. Por ejemplo, es conocido que determinadas bases modificadas incrementan la especificidad de la amplificación, véase la patente de EE. UU. n.° 6.001.011.

El diseño de sondas de hibridación es conocido en la técnica. En algunos modos de realización de la presente divulgación, puede estar presente más de una sonda en la mezcla de reacción sometida a un ensayo. Un experto en la técnica reconocería inmediatamente los criterios de diseño aplicables a las sondas útiles en ensayos múltiples. Específicamente, las sondas que se pueden usar en la misma mezcla de reacción se deben diseñar para que tengan una temperatura de hibridación de híbrido distinta con sus correspondientes secuencias diana.

Dispositivo de procesamiento de muestras

Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden implementar en un dispositivo de procesamiento de muestras configurado para realizar una técnica de amplificación de ácidos nucleicos.

En un modo de realización, los procedimientos divulgados en el presente documento se implementan en un dispositivo que comprende canales, cámaras, depósitos, regiones de detección y procesamiento autónomos de microescala a macroescala. El dispositivo puede ser un cartucho, dispositivo, recipiente o bolsa, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE. UU. n.os 6.440.725; 6.783.934; 6.818.185; 6.979.424; 8.580.559; y 8.940.526, así como dispositivos tales como los disponibles de Cepheid Corp., Idaho Technology, Inc. y/o Biofire Diagnostics, Inc.

Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden implementar en una bolsa de análisis de ácido nucleico autónoma que incluye una zona de lisis celular, una zona de preparación de ácido nucleico, una zona de amplificación de primera fase, una zona de amplificación de segunda fase, como se muestra en la fig. 1 de la publicación de solicitud de EE. UU. n.° 201000056383. La bolsa comprende una variedad de canales y ampollas de diversos tamaños y se dispone de modo que la muestra fluya a través del sistema y diversas zonas y se procese en consecuencia. El procesamiento de la muestra se produce en diversas ampollas localizadas dentro de la bolsa. Se proporcionan numerosos canales para mover la muestra dentro y entre las zonas de procesamiento, mientras que se proporcionan otros canales para suministrar fluidos y reactivos a la muestra o para retirar dichos fluidos y reactivos de la muestra. El líquido dentro de la bolsa se mueve entre ampollas por presión, por ejemplo, presión neumática.

En un ejemplo alternativo, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden implementar en un cartucho de análisis de ácido nucleico autónomo como se muestra en las figs. 3-5 y 9 de la patente de EE. UU. n.° 9.322.052. El cartucho incluye, entre otros, múltiples cámaras que comprenden una cámara de muestra para contener una muestra de fluido introducida a través del puerto de entrada, una cámara de lavado para contener una solución de lavado, una cámara de reactivo para contener un reactivo de lisis, una cámara de lisis, una cámara de residuos para recibir la muestra usada y la solución de lavado, una cámara de neutralizador para contener un neutralizador y una cámara de mezcla maestra para contener una mezcla maestra (por ejemplo, reactivos de amplificación y sondas fluorescentes) y para mezclar los reactivos y las sondas con el analito separado de la muestra de fluido, un recipiente de reacción y una cámara de detección.

En un modo de realización específica, los procedimientos descritos en el presente documento se llevan a cabo en un dispositivo de procesamiento de muestras tal como el descrito en la patente de EE. UU. n.° 7.718.421. Los dispositivos segmentados, tales como los descritos en la patente de e E. UU. n.° 7.718.421, proporcionan un recipiente práctico para recibir, almacenar, procesar y/o analizar una muestra biológica. En determinados modos de realización, el dispositivo segmentado facilita protocolos de procesamiento de muestras que implican múltiples etapas de procesamiento. En determinados modos de realización, se puede recoger una muestra en un dispositivo de muestra, y a continuación el dispositivo se sitúa en un analizador que manipula el dispositivo y su contenido para procesar la muestra.

Un modo de realización particular incluye un dispositivo flexible que se ha segmentado en compartimentos por precintos rompibles. Los segmentos individuales pueden contener diversos reactivos y tampones para procesar una muestra. Se pueden aplicar abrazaderas y accionadores al dispositivo en diversas combinaciones y con diversas programaciones temporales para dirigir el movimiento del fluido y para provocar que los precintos rompibles estallen. Este estallido de los precintos rompibles puede dejar una superficie de dispositivo interior que está sustancialmente libre de obstrucciones para el flujo de fluido. En un modo de realización, el flujo de la muestra biológica se puede dirigir hacia el extremo distal del dispositivo a medida que avanza el procesamiento, mientras que el flujo de residuo se puede ver obligado a moverse en el sentido opuesto, hacia la abertura del dispositivo donde se colocó inicialmente la muestra. Esta entrada de muestra se puede sellar, posiblemente de forma permanente, por una tapa con un mecanismo de cierre, y se puede localizar una cámara de residuos en la tapa para recibir el residuo para su almacenamiento. Un beneficio significativo de este enfoque es que la muestra procesada no entra en contacto con superficies que se han tocado por la muestra sin procesar. En consecuencia, es menos probable que cantidades mínimas de inhibidores de reacción presentes en la muestra sin procesar que podrían revestir las paredes del dispositivo contaminen la muestra procesada.

El dispositivo de procesamiento de muestras se muestra en la fig. 1 de la patente de EE. UU. n.° 7.718.421 y puede incluir un dispositivo flexible transparente que se puede configurar en una pluralidad de segmentos y aplanarse sustancialmente por compresión. En un modo de realización, un dispositivo puede tener al menos dos segmentos. En un modo de realización, un dispositivo puede tener al menos tres segmentos. El dispositivo flexible puede proporcionar funcionalidad operativa entre aproximadamente 2-105 °C, compatibilidad con muestras, dianas y reactivos, baja permeabilidad a los gases, propiedades mínimas de fluorescencia y/o elasticidad durante ciclos repetidos de compresión y flexión. El dispositivo se puede fabricar de una variedad de materiales, de los que sus ejemplos incluyen, pero no se limitan a: poliolefinas tales como polipropileno o polietileno, poliuretano, copolímeros de poliolefina y/u otros materiales que proporcionan características adecuadas.

En modos de realización ejemplares, uno o más reactivos se pueden almacenar como sustancia seca y/o bien como soluciones líquidas en segmentos del dispositivo. En modos de realización donde los reactivos se pueden almacenar en formato seco, las soluciones líquidas se pueden almacenar en segmentos contiguos para facilitar la reconstitución de la solución de reactivo. Los ejemplos de reactivos típicos incluyen: reactivo de lisis, tampón de elución, tampón de lavado, inhibidor de DNasa, inhibidor de RNasa, inhibidor de proteinasa, agente quelante, reactivo neutralizante, solución salina caotrópica, detergente, tensioactivo, anticoagulante, solución germinante, isopropanol, solución etanólica, anticuerpo, sondas de ácido nucleico, sondas de ácido peptidonucleico y sondas de ácido nucleico con fosfotioato. En modos de realización donde uno de los reactivos es una solución de sal caotrópica, un componente preferente es isocianato de guanidinio o clorhidrato de guanidinio o una combinación de los mismos. En algunos modos de realización, el orden en el que se pueden almacenar los reactivos en el dispositivo con respecto a la abertura a través de la que se introduce una muestra, refleja el orden en el que se pueden usar los reactivos en los procedimientos utilizando el tubo. En modos de realización preferentes, un reactivo incluye una sustancia que se puede unir específicamente a un componente preseleccionado de una muestra. Por ejemplo, una sustancia se puede unir específicamente a un ácido nucleico, o una sonda de ácido nucleico se puede unir específicamente a ácidos nucleicos que tienen secuencias de bases particulares.

En un modo de realización específico, el dispositivo también puede incluir un sustrato tal como una partícula o una pluralidad de partículas para facilitar la adsorción selectiva de ácidos nucleicos. Las partículas son, por ejemplo, partículas de sílice, partículas magnéticas, partículas magnéticas de sílice, partículas de vidrio, partículas coloidales de nitrocelulosa y partículas coloidales de nitrocelulosa magnetizadas. En algunos modos de realización donde las partículas pueden ser paramagnéticas, las partículas se pueden capturar por un campo magnético. Se describen los ejemplos de reactivos que pueden permitir la adsorción selectiva de moléculas de ácido nucleico a una superficie revestida con un grupo funcional, por ejemplo, en las pat. de EE. UU. n.os 5.705.628; 5.898.071; y 6.534.262. La separación se puede lograr manipulando la fuerza iónica y la concentración de polialquilenglicol de la solución para precipitar selectivamente, y adsorber reversiblemente, los ácidos nucleicos a una superficie de fase sólida. Cuando estas superficies de fase sólida son micropartículas paramagnéticas, las partículas magnéticas, a las que se han adsorbido las moléculas de ácido nucleico diana, se pueden lavar en condiciones que retienen los ácidos nucleicos pero no otras moléculas. Varias empresas ofrecen sistemas de purificación de base magnética, tales como MagAttract™ de QIAGEN, MagaZorb™ de Cortex Biochem y MagNA Pure LC™ de Roche Life Science. Estos productos usan partículas cargadas negativamente y manipulan las condiciones del tampón para unir selectivamente una variedad de ácidos nucleicos a las partículas, lavar las partículas y eluir las partículas en tampones acuosos. Muchos de los productos usados por estas empresas usan sales caotrópicas para ayudar en la precipitación de ácidos nucleicos sobre las partículas magnéticas. Se describen los ejemplos en las pat. de EE. Uu . n.os 4.427.580; 4.483.920; y 5.234.809.

Los modos de realización ejemplares preferentes pueden incluir una disposición lineal de 2 o más segmentos de dispositivo (fig. 1 de la patente de EE. UU. n.° 7.718.421). Una disposición lineal facilita el movimiento de la muestra y el residuo y la diana resultantes a través del tubo de manera controlada. Se puede introducir una muestra, por ejemplo, una muestra, a través de una primera abertura en un primer segmento del dispositivo. Después de esto, el residuo de una muestra procesada puede regresar hacia la primera abertura mientras que la diana se empuja hacia el extremo opuesto, minimizando de este modo la contaminación de la diana por inhibidores de reacción que se pueden haber adherido a la pared del dispositivo, y confinando la diana a un segmento limpio del dispositivo que puede contener reactivos adecuados para operaciones adicionales de la diana. Algunos modos de realización pueden usar una pluralidad de segmentos, conteniendo cada uno al menos un reactivo. En algunos modos de realización, estos segmentos pueden contener reactivos en el siguiente orden: el segundo segmento puede incluir una superficie que comprende un reactivo de unión inmovilizado y un tampón de dilución; el tercer segmento se puede dividir en dos subsecciones, incluyendo la primera proteinasa K e incluyendo la segunda microesferas magnéticas de sílice u otra partícula adecuada; el reactivo en el cuarto segmento puede ser un reactivo de lisis cualquiera; el reactivo en el quinto segmento puede ser un tampón de lavado; el reactivo en los segmentos sexto-octavo puede ser un tampón de lavado, un reactivo de neutralización, un tampón de suspensión, un reactivo de elución o reactivos de amplificación y detección de ácidos nucleicos. En algunos modos de realización, los segmentos se pueden disponer de forma continua, mientras que en otros modos de realización, estos segmentos pueden estar separados por otro segmento o segmentos intermedios.

En determinados modos de realización, la secuencia de acontecimientos en una prueba de este tipo puede incluir: 1) una muestra biológica recogida con una herramienta de recogida, 2) un dispositivo flexible, que puede incluir una pluralidad de segmentos que pueden contener los reactivos requeridos durante la prueba, y en los que la muestra recogida se puede colocar usando una primera abertura en el dispositivo, 3) al menos un sustrato que se puede establecer a una temperatura controlada y/u otras condiciones para capturar organismos o ácidos nucleicos diana durante un período de incubación establecido, 4) organismos o moléculas, en la muestra sin procesar, que pueden no unirse al sustrato y, por tanto, se podrían retirar transfiriendo líquido a un depósito de residuos, 5) almacenar el residuo, en un depósito de residuos, que se puede separar de la diana por una abrazadera y/o un accionador comprimido contra el dispositivo, 6) un tampón de lavado, liberado desde otro segmento del dispositivo, que puede retirar inhibidores de reacción, 7) un reactivo de elución, desde otro segmento, que puede liberar la diana unida al sustrato después de la incubación a una temperatura controlada, y 8) ácidos nucleicos que se pueden detectar por técnicas bien conocidas por los que están familiarizados con la técnica o recogidos a través de una segunda abertura en el dispositivo. En modos de realización ejemplares, el flujo de la muestra puede ser desde la primera abertura hacia el extremo distal del dispositivo a medida que avanza la prueba, mientras que el flujo de residuo puede ser hacia la abertura de entrada de muestra cerrada del dispositivo, donde una cámara de residuos en la tapa del dispositivo recibe el residuo para su almacenamiento. En consecuencia, se evita el contacto indeseable entre una muestra procesada y las superficies en un recipiente de reacción que se han tocado por la muestra sin procesar, impidiendo de este modo la inhibición de la reacción debido a cantidades mínimas de inhibidores de reacción presentes en la muestra sin procesar y que podrían revestir las paredes del recipiente de reacción.

Algunos modos de realización pueden incorporar el uso de un dispositivo flexible dividido en una pluralidad de segmentos que pueden ser transversales al eje longitudinal del dispositivo, y que pueden contener reactivos; así como un analizador que puede tener una pluralidad de miembros de compresión, tales como accionadores y/o abrazaderas, y bloques, opuestos a los accionadores y abrazaderas, para procesar una muestra. Se pueden usar diversas combinaciones de estos accionadores, abrazaderas y/o bloques para sujetar eficazmente el dispositivo para cerrarlo, separando de este modo el fluido. En modos de realización ejemplares, al menos uno de los accionadores o bloques puede tener un elemento de control térmico para controlar la temperatura de un segmento de dispositivo para el procesamiento de muestras. El aparato de procesamiento de muestras puede tener además al menos una fuente de campo magnético que puede aplicar un campo magnético a un segmento. El aparato de procesamiento de muestras puede tener además un dispositivo de detección, tal como un fotómetro o un CCD, para supervisar una reacción que tiene lugar o se completa dentro del dispositivo.

El fluido se puede conducir a través de un canal de flujo comprimiendo el dispositivo con un accionador situado en el centro y sus abrazaderas flanqueantes, si las hay, para formar un canal de flujo con un hueco de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 um, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 um a través de cada segmento. Los accionadores contiguos comprimen suavemente los segmentos contiguos en comunicación líquida con el canal de flujo para generar una presión interior compensada para garantizar un hueco sustancialmente uniforme del canal de flujo. A continuación, los dos accionadores flanqueantes pueden, de forma alternativa, comprimir y liberar presión sobre el dispositivo en sus respectivos segmentos para generar flujo a un caudal controlado. Se pueden incorporar sensores opcionales de flujo, presión y/o fuerza para posibilitar el control de bucle cerrado del comportamiento del flujo. El procedimiento de canal de flujo se puede usar en el lavado, potenciando la eficacia de unión del sustrato y la detección.

Se puede usar un procedimiento de resuspensión e inmovilización de partículas para separar las partículas del líquido de muestra. El campo magnético generado por una fuente magnética se puede aplicar a un segmento que contiene una suspensión de partículas magnéticas para capturar e inmovilizar las partículas en la pared del tubo. Se puede usar un procedimiento de agitación durante el procedimiento de captura. En otro modo de realización, se puede formar un canal de flujo en el segmento con el campo magnético aplicado, y las partículas magnéticas se pueden capturar en el flujo para incrementar la eficacia de captura. Para resuspender partículas inmovilizadas, el campo magnético se puede apagar o retirar, y se puede usar un procedimiento de agitación o canal de flujo para la resuspensión.

Se puede lograr una detección ultrarrápida de una señal desde un segmento de dispositivo usando un sensor, tal como un fotómetro, un espectrómetro, un CCD, conectado a un bloque. En modos de realización ejemplares, se puede aplicar presión por un accionador sobre el segmento de dispositivo para definir adecuadamente la conformación del segmento de dispositivo. El formato de señal puede ser la intensidad de una luz a determinada longitud de onda, tal como una luz fluorescente, un espectro y/o una imagen, tal como una imagen de células o elementos artificiales tales como los puntos cuánticos. Para la detección de fluorescencia, se puede usar una excitación de luz del sistema óptico para iluminar una reacción, y se puede detectar la luz de emisión por el fotómetro. Para detectar una pluralidad de señales que tienen longitudes de onda específicas, se pueden detectar señales de diferentes longitudes de onda en serie o en paralelo por canales de detección especializados o un espectrómetro.

Kits

En algunos modos de realización, se incluyen en un kit reactivos, materiales y dispositivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados actualmente. En algunos modos de realización, el kit incluye componentes, en recipientes, frascos o compartimentos separados, que incluyen (i) un primer conjunto de cebador/sonda que incluye una primera sonda marcada y un primer cebador, y (ii) un segundo conjunto de cebador/sonda que incluye un segunda sonda marcada y un segundo cebador, en el que el primer cebador se hibrida con un ácido nucleico diana de la pluralidad de ácidos nucleicos diana a una primera temperatura y el segundo cebador se hibrida con un ácido nucleico adicional de la pluralidad de dichos ácidos nucleicos diana a una segunda temperatura y la primera temperatura es más alta que dicha segunda temperatura. El kit puede incluir además, en uno o más recipientes, frascos o compartimentos separados, reactivos necesarios para la amplificación de ácidos nucleicos diana, incluyendo pero sin limitarse a, ADN polimerasa, dNTP, tampón de lisis y/o lavado, una superficie, por ejemplo, una partícula, que comprende un reactivo de unión inmovilizado, un tampón de dilución, proteinasa K, microesferas magnéticas de sílice u otra partícula adecuada, reactivo de lisis (S), un reactivo de neutralización, un tampón de suspensión, un reactivo de elución, etc., así como reactivos para obtener, almacenar y/o preparar muestras para su análisis.

Además, el kit incluye un dispositivo de procesamiento de ensayo tal como el descrito anteriormente y en un modo de realización específico, el dispositivo de procesamiento de ensayo incluye diversos reactivos requeridos para realizar los procedimientos divulgados en el presente documento almacenados dentro de uno o más segmentos del dispositivo.

El kit puede incluir además controles, por ejemplo, un polinucleótido que es natural en la secuencia que se va a detectar, o un polinucleótido que incluye la secuencia que se va a detectar.

El kit también puede incluir dispositivos adicionales tales como tubos o frascos de muestra; recipientes de reacción (por ejemplo, tubos, placas de pocillos múltiples, dispositivos o cámaras microfluídicos, etc.), así como instrucciones de uso o referencia a un sitio web.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la detección de una pluralidad de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de muestra que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene una pluralidad de ácidos nucleicos diana con (i) un primer conjunto de cebador/sonda que incluye una primera sonda marcada y un primer cebador, y (ii) un segundo conjunto de cebador/sonda que incluye una segunda sonda marcada y un segundo cebador, en el que dicho primer cebador se hibrida con un ácido nucleico diana de dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana a una primera temperatura y dicho segundo cebador se hibrida con un ácido nucleico adicional de dicha pluralidad de dichos ácidos nucleicos diana a una segunda temperatura y dicha primera temperatura es más alta que dicha segunda temperatura;

(b) amplificar dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana en la muestra en una reacción de amplificación que incluye al menos un perfil de temperaturas de hibridación/alargamiento de dos etapas que incluye una primera etapa que comprende dicha primera temperatura y una segunda etapa que comprende dicha segunda temperatura;

(c) detectar, secuencialmente, sobre al menos una parte de dicho perfil de temperaturas de hibridación/alargamiento

(i) una primera señal detectable durante dicha primera etapa, que resulta de la hibridación/alargamiento del primer cebador y que corresponde a la señal emitida por dicho primer marcador;

(ii) una segunda señal detectable durante dicha segunda etapa, que resulta de la hibridación/alargamiento del primer y segundo cebadores y que corresponde a la señal emitida por dicho primer y dicho segundo marcador; y

(iii) restar dicha primera señal detectable de dicha segunda señal detectable para identificar la señal detectable emitida por dicho segundo marcador; y

(d) medir una cantidad relativa de cada ácido nucleico diana en dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas primera y segunda sondas marcadas se marcan cada una con el mismo resto indicador.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho resto indicador es fluorescente.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas primera y segunda sondas marcadas se marcan cada una con un resto indicador y un resto extintor.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho resto indicador y dicho resto extintor son fluoróforos.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en el que dicho resto indicador es un fluoróforo y dicho resto extintor es un extintor oscuro.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichas primera y segunda etapas, respectivamente, se mantienen durante al menos 10 segundos.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha reacción de amplificación se realiza en presencia de una mezcla de ADN polimerasas.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la primera y segunda temperaturas están separadas al menos 10 grados.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la primera y segunda temperaturas están separadas al menos 15 grados.