ES2868954T3 - Empobrecimiento de marcadores de superficie celular en un dispositivo de procesamiento de muestras - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de realización de un análisis cuantitativo de una muestra de sangre completa para determinar la carga vírica o tumoral, en el que dicha muestra de sangre completa comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie celular para un virus o tumor, comprendiendo dicho procedimiento a. añadir dicha muestra de sangre completa a un dispositivo que comprende un tubo que define un canal de flujo de fluido que comprende, situado en el mismo, un primer conjunto de segmentos que forman un compartimento de pretratamiento de muestra y un segundo conjunto de segmentos, comprendiendo dicho compartimento de pretratamiento de muestra en uno o más segmentos de dicho primer conjunto de segmentos una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie celular inmovilizados y en el que dicho compartimento de pretratamiento de muestra no incluye un filtro; b. mezclar, dentro del compartimento de pretratamiento de muestra, dicha superficie y muestra en dicho dispositivo para formar una muestra empobrecida, en el que dicha muestra empobrecida comprende < 5 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular y dicha etapa de mezcla se realiza sin un filtro en el canal de flujo y en condiciones que no lisan las células en dicha muestra; y c. medir, en dicho dispositivo, la carga vírica o tumoral en dicha muestra empobrecida usando una técnica de amplificación de ácido nucleico, en el que dicho dispositivo comprende además una pluralidad de miembros de compresión conectados de forma funcional con dicho primer y segundo conjunto de segmentos; en el que dicho primer conjunto de segmentos que forman el compartimento de pretratamiento de muestra situado dentro del canal de flujo de fluido comprende, desde un extremo proximal a uno distal, un primer segmento flanqueante, un segmento interior y un segundo segmento flanqueante, y dicha etapa de mezcla comprende comprimir selectivamente uno o más segmentos de dicho compartimento de pretratamiento de muestra por al menos un miembro de compresión de dicha pluralidad de miembros de compresión para formar un canal de flujo en el compartimento de pretratamiento de muestra de modo que el diámetro del canal de flujo en el segmento interior sea menor que el diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes; y en el que dicho dispositivo comprende un segundo conjunto de segmentos en dicho canal de flujo de fluido que define una región de análisis de ácido nucleico contigua a dicho compartimento de pretratamiento de muestra, comprendiendo dicha región de análisis de ácido nucleico uno o más segmentos adicionales, cada uno configurado para realizar una o más etapas de un análisis de ácido nucleico, que comprende preparación de reactivos, enriquecimiento de dianas, retirada de inhibidores, extracción, amplificación y detección en tiempo real de ácido nucleico.

Description

DESCRIPCIÓN
Empobrecimiento de marcadores de superficie celular en un dispositivo de procesamiento de muestras
Campo de la divulgación
La presente divulgación se refiere a un dispositivo de procesamiento de muestras que incluye una pluralidad de segmentos y al menos un segmento configurado para realizar una etapa de empobrecimiento de marcadores de superficie celular de una muestra de sangre completa.
Antecedentes
Actualmente, la cuantificación del VIH-1 por pruebas de carga vírica en entornos con recursos limitados se realiza en laboratorios centralizados por procedimientos basados en PCR usando muestras de plasma. Se han empleado gotas de sangre seca como un tipo de muestra alternativa, y, aunque dichas alternativas pueden ser beneficiosas por diversos motivos, la idoneidad de las muestras de sangre seca para las pruebas de carga vírica es cuestionable y, dependiendo del ensayo usado, el ADN provírico y ARN vírico intracelular presentes en las gotas de sangre seca interfieren en la cuantificación de ARN.
En entornos con recursos limitados u otras pruebas basadas en campo con acceso poco fiable o sin él a equipos de extracción de sangre o de laboratorio, la obtención y procesamiento de plasma son complejos o imposibles. Las pruebas de diagnóstico inmediato son una alternativa que tiene el potencial de facilitar la atención al mayor número de pacientes y se pueden usar los dispositivos de diagnóstico inmediato para analizar muestras de sangre completa obtenidas fácilmente usando punción del dedo o talón y procesamiento sin instrumentación adicional. Sin embargo, existe una escasa correlación en las cargas víricas del VIH medidas por RT-PCR para muestras de sangre completa frente a plasma. La subpoblación de linfocitos T de glóbulos blancos en sangre completa tiene ADN provírico, ARNm y viriones asociados a células del VIH. De ahí que la cuantificación con sangre completa a menudo sea mayor que con plasma, especialmente en valores bajos. Esto puede dar lugar a lo que de otro modo sería una carga vírica por debajo del umbral clínico de 1e3 copias/ml a más de 1e3 copias/ml. Estos resultados se han observado con sangre completa roja y congelada, así como con gotas de sangre seca.
El documento WO2010080978 divulga un dispositivo microfluídico y procedimientos para usar el mismo, teniendo el dispositivo microfluídico microcanales paralelos para empobrecer previamente leucocitos en una muestra de sangre completa al unirse a leucocitos dentro de los microcanales sin unirse a células diana. Después del empobrecimiento previo en un primer dispositivo microfluídico, la muestra se transfiere a (al menos) un segundo dispositivo microfluídico para unirse a células diana y contar las mismas. De ahí que no exista ninguna divulgación de que el empobrecimiento y el procesamiento y análisis posteriores se puedan realizar en un dispositivo microfluídico.
El documento WO 2000/43551 divulga un procedimiento para detectar la carga vírica del VIH en pacientes con una carga vírica baja. El procedimiento implica el empobrecimiento de linfocitos T CD4+ y CD8+ de la muestra para llevar a cabo la cuantificación (al medir los niveles de ADN vírico) solo sobre linfocitos T víricos CD4-/CD8-. Los linfocitos T CD4+/CD8+ se retiran de la muestra usando anticuerpos específicos para un marcador de superficie celular adecuado. Sin embargo, el empobrecimiento y la cuantificación no se llevan a cabo en el mismo dispositivo.
El documento EP 2574400 divulga un dispositivo que comprende un túbulo de procesamiento de muestras que comprende al menos tres segmentos definidos dentro del túbulo, aislados de forma fluídica entre sí por un sello rompible y que contienen reactivos. Se describe que el dispositivo es adecuado para aislar ácidos nucleicos de muestras biológicas y realizar la amplificación y detección de un ácido nucleico diana en la muestra biológica. Sin embargo, no existe ninguna divulgación sobre el empobrecimiento de una muestra de sangre completa y utilizar además la muestra empobrecida para su procesamiento adicional (es decir, preparación de la muestra de ácido nucleico y amplificación/detección de un ácido nucleico diana) en el mismo dispositivo.
Debido a las dificultades con la obtención de muestras de plasma en entornos con recursos limitados, es deseable encontrar una solución para una prueba de carga vírica de diagnóstico inmediato molecular que dé resultados cuantitativos comparables al plasma.
Sumario
El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
Los procedimientos descritos en el presente documento se usan para realizar un análisis cuantitativo de una muestra de sangre completa para determinar la carga vírica o tumoral. La muestra de sangre completa usada en el procedimiento comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie de célula vírica o tumoral, y el procedimiento comprende: (a) añadir la muestra de sangre completa a un dispositivo o un componente del mismo que no incluye un filtro, en el que el dispositivo o componente incluye una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie de célula vírica o tumoral inmovilizados; (b) mezclar la superficie y la muestra en el dispositivo para formar una muestra empobrecida, en la que la muestra empobrecida comprende < 5 % de células que incluyen el marcador de superficie celular y la etapa de mezcla se realiza en condiciones que no lisan las células en la muestra; y (c) medir, en el dispositivo, la carga vírica o tumoral en la muestra empobrecida.
En un aspecto, se proporciona un procedimiento de realización de un análisis cuantitativo de una muestra de sangre completa para determinar un ácido nucleico diana, en el que dicha muestra de sangre completa comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie celular asociado con el ácido nucleico diana, comprendiendo dicho procedimiento (a) añadir dicha muestra de sangre completa a un dispositivo que comprende un tubo que define un canal de flujo de fluido y que comprende una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie celular inmovilizados; (b) mezclar dicha superficie y muestra en dicho dispositivo para formar una muestra empobrecida, en el que dicha muestra empobrecida comprende < 5 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular y dicha etapa de mezcla se realiza sin un filtro en el canal de flujo y en condiciones que no lisan las células en dicha muestra; y (c) medir, en dicho dispositivo, el ácido nucleico diana en dicha muestra empobrecida.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de realización de un análisis cuantitativo de una muestra de sangre completa para determinar la carga tumoral, en el que dicha muestra de sangre completa comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie de célula tumoral, y el procedimiento comprende: (a) añadir la muestra de sangre completa a un dispositivo o un componente del mismo que no incluye un filtro, en el que el dispositivo o componente incluye una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie de célula tumoral inmovilizados; (b) mezclar la superficie y la muestra en el dispositivo para formar una muestra empobrecida, en la que la muestra empobrecida comprende < 5 % de células que incluyen el marcador de superficie celular y la etapa de mezcla se realiza en condiciones que no lisan las células en la muestra; y (c) medir, en el dispositivo, la carga tumoral en la muestra empobrecida.
Aún en otro aspecto, se proporciona un procedimiento de realización de un análisis cuantitativo de una muestra de sangre completa para determinar la carga vírica, en el que dicha muestra de sangre completa comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie de célula vírica, y el procedimiento comprende: (a) añadir la muestra de sangre completa a un dispositivo o un componente del mismo que no incluye un filtro, en el que el dispositivo o componente incluye una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie de célula vírica inmovilizados; (b) mezclar la superficie y la muestra en el dispositivo para formar una muestra empobrecida, en la que la muestra empobrecida comprende < 5 % de células que incluyen el marcador de superficie celular y la etapa de mezcla se realiza en condiciones que no lisan las células en la muestra; y (c) medir, en el dispositivo, la carga vírica en la muestra empobrecida.
En un otro aspecto, se proporciona un procedimiento de realización de un análisis cuantitativo de una muestra de sangre completa para determinar la carga vírica o tumoral, en el que dicha muestra de sangre completa comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie celular para un virus o tumor, comprendiendo dicho procedimiento: (a) añadir dicha muestra de sangre completa a un dispositivo que comprende un tubo que define un canal de flujo de fluido que comprende una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie celular inmovilizados; (b) mezclar dicha superficie y muestra en dicho dispositivo para formar una muestra empobrecida, en la que dicha muestra empobrecida comprende < 5 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular y dicha etapa de mezcla se realiza sin un filtro en el canal de flujo y en condiciones que no lisan las células en dicha muestra; y (c) medir, en dicho dispositivo, la carga vírica o tumoral en dicha muestra empobrecida.
En un modo de realización, dicho dispositivo comprende un compartimento de pretratamiento de muestra situado en el mismo, comprendiendo dicho compartimento de pretratamiento de muestra, desde un extremo proximal a uno distal, un primer segmento flanqueante, un segmento interior y un segundo segmento flanqueante, y dicha etapa de mezcla comprende comprimir selectivamente uno o más segmentos de dicho compartimento de pretratamiento de muestra para formar un canal de flujo en el compartimento de pretratamiento de muestra de modo que el diámetro del canal de flujo en el segmento interior sea menor que el diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes. En un modo de realización, dicho diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de entre un 25-50 % del diámetro del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes. En un modo de realización, dicho diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de aproximadamente un 33 % del diámetro del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes. En un modo de realización, dicho dispositivo comprende un compartimento de pretratamiento de muestra y dicha superficie es una pared interior de dicho compartimento de pretratamiento. En un modo de realización, dicha muestra empobrecida comprende < 2,5 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular. En otro modo de realización, dicha muestra empobrecida comprende < 1 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular. En un modo de realización, el procedimiento comprende además separar, en dicho dispositivo, dicha muestra empobrecida de la superficie inmovilizada con células de marcador de superficie celular tras la etapa (b). En un modo de realización, dicho procedimiento logra un límite de detección de < 100 copias/ml de virus o tumor. En un modo de realización, dicho marcador de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD4, CD45, beta-microglobulina o mezclas de los mismos. En determinados modos de realización, dicho marcador de superficie celular es CD4. En un modo de realización, dicha medición de la carga vírica o tumoral se relaciona linealmente con una medición de la carga vírica o tumoral, respectivamente, en una muestra de plasma tomada de un paciente que proporciona dicha muestra de sangre completa.
En un modo de realización específico, el procedimiento se realiza en un dispositivo configurado para realizar un análisis de ácido nucleico de una o más secuencias de oligonucleótidos diana víricos o asociados a tumor, en el que el dispositivo comprende un compartimento de pretratamiento de muestra que carece de un filtro y que comprende una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie de célula vírica o tumoral inmovilizados, comprendiendo el procedimiento
a. añadir la muestra de sangre completa al compartimento de pretratamiento de muestra;
b. someter el compartimento de pretratamiento de muestra a condiciones suficientes para mezclar la superficie y la muestra para formar una muestra empobrecida y una superficie unida a células de marcador de superficie celular, en la que la muestra empobrecida comprende < 5 % de células que incluyen el marcador de superficie de célula vírica o tumoral, y la mezcla se realiza en condiciones que no lisan las células en la muestra;
c. separar la muestra empobrecida de la superficie;
d. transferir la muestra empobrecida del compartimento de pretratamiento de muestra a una región de análisis de ácido nucleico en el dispositivo;
e. someter la muestra empobrecida al análisis de ácido nucleico en el dispositivo; y
f. detectar, en el dispositivo, el uno o más oligonucleótidos diana en la muestra empobrecida; y g. calcular la carga vírica o tumoral en base a la etapa de detección (f).
En un modo de realización, se proporciona un procedimiento realizado en un dispositivo configurado para realizar un análisis de ácido nucleico de una o más secuencias de oligonucleótidos diana víricos, en el que el dispositivo comprende un compartimento de pretratamiento de muestra que carece de un filtro y que comprende una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie de célula vírica inmovilizados, comprendiendo el procedimiento
a. añadir la muestra de sangre completa al compartimento de pretratamiento de muestra;
b. someter el compartimento de pretratamiento de muestra a condiciones suficientes para mezclar la superficie y la muestra para formar una muestra empobrecida y una superficie unida a células de marcador de superficie celular, en la que la muestra empobrecida comprende < 5 % de células que incluyen el marcador de superficie de célula vírica, y la mezcla se realiza en condiciones que no lisan las células en la muestra;
c. separar la muestra empobrecida de la superficie;
d. transferir la muestra empobrecida del compartimento de pretratamiento de muestra a una región de análisis de ácido nucleico en el dispositivo;
e. someter la muestra empobrecida al análisis de ácido nucleico en el dispositivo; y
f. detectar, en el dispositivo, el uno o más oligonucleótidos diana víricos en la muestra empobrecida; y g. calcular la carga vírica en base a la etapa de detección (f).
En un modo de realización, se proporciona un procedimiento realizado en un dispositivo configurado para realizar un análisis de ácido nucleico de una o más secuencias de oligonucleótidos diana tumorales, en el que el dispositivo comprende un compartimento de pretratamiento de muestra que carece de un filtro y que comprende una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie de célula tumoral inmovilizados, comprendiendo el procedimiento
a. añadir la muestra de sangre completa al compartimento de pretratamiento de muestra;
b. someter el compartimento de pretratamiento de muestra a condiciones suficientes para mezclar la superficie y la muestra para formar una muestra empobrecida y una superficie unida a células de marcador de superficie celular, en la que la muestra empobrecida comprende <5 % de células que incluyen el marcador de superficie de célula vírica, y la mezcla se realiza en condiciones que no lisan las células en la muestra;
c. separar la muestra empobrecida de la superficie;
d. transferir la muestra empobrecida del compartimento de pretratamiento de muestra a una región de análisis de ácido nucleico en el dispositivo;
e. someter la muestra empobrecida al análisis de ácido nucleico en el dispositivo; y
f. detectar, en el dispositivo, el uno o más oligonucleótidos diana tumorales en la muestra empobrecida; y
h. calcular la carga tumoral en base a la etapa de detección (f).
En otro aspecto, se proporciona un dispositivo configurado para realizar un análisis de ácido nucleico cuantitativo de una o más secuencias de oligonucleótidos diana en una muestra de sangre completa que comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie celular, comprendiendo el dispositivo (a) un compartimento de pretratamiento de muestra que carece de un filtro y que comprende partículas magnéticas que incluyen anticuerpos para marcador de superficie celular inmovilizados; y (b) una región de análisis de ácido nucleico que comprende uno o más compartimentos adicionales, cada uno configurado para realizar una o más etapas de dicho análisis de ácido nucleico, que comprende preparación de reactivos, enriquecimiento de dianas, retirada de inhibidores, extracción, amplificación y detección en tiempo real de ácido nucleico; en el que el compartimento de pretratamiento de muestra está configurado para generar una muestra empobrecida que comprenda < 5 % de células que incluyen el marcador de superficie celular.
En un modo de realización, se proporciona un dispositivo configurado para realizar un análisis por PCR cuantitativo de una o más secuencias de oligonucleótidos diana en una muestra de sangre completa que comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie celular, comprendiendo dicho dispositivo un tubo que define un canal de flujo de fluido y una pluralidad de segmentos situados en el mismo, incluyendo dicho dispositivo: (a) un primer conjunto de segmentos en dicho canal de flujo de fluido que define un compartimento de pretratamiento de muestra que comprende, desde un extremo proximal a uno distal, un primer segmento flanqueante, un segmento interior y un segundo segmento flanqueante, y anticuerpos anti marcador de superficie celular inmovilizados en uno o más de dichos segmentos, en el que dicho compartimento de pretratamiento de muestra no incluye un filtro; (b) un segundo conjunto de segmentos en dicho canal de flujo de fluido que define una región de análisis por PCR contigua a dicho compartimento de pretratamiento de muestra, comprendiendo dicha región de análisis por PCR uno o más segmentos adicionales, cada uno configurado para realizar una o más etapas de dicho análisis por PCR, que comprende preparación de reactivos, enriquecimiento de dianas, retirada de inhibidores, extracción, amplificación y detección en tiempo real de ácido nucleico; y (c) una pluralidad de miembros de compresión conectados de forma funcional con dicha pluralidad de segmentos y configurados para comprimir selectivamente uno o más segmentos de dicho compartimento de pretratamiento de muestra para formar un canal de flujo en el compartimento de pretratamiento de muestra de modo que el diámetro del canal de flujo en el segmento interior sea menor que el diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes; en el que dicho dispositivo está configurado para generar una muestra empobrecida en el compartimento de pretratamiento de muestra que comprenda < 5 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular. En un modo de realización específico, el dispositivo comprende un compartimento de pretratamiento de muestra situado en el mismo, comprendiendo dicho compartimento de pretratamiento de muestra, desde un extremo proximal a uno distal, un primer segmento flanqueante, un segmento interior y un segundo segmento flanqueante, y dicha etapa de mezcla comprende comprimir selectivamente uno o más segmentos de dicho compartimento de pretratamiento de muestra para formar un canal de flujo en el compartimento de pretratamiento de muestra de modo que el diámetro del canal de flujo en el segmento interior sea menor que el diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes. En un modo de realización particular, el diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de entre un 25-50 % del diámetro del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes, y más específicamente, el diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de aproximadamente un 33 % del diámetro del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes.
En un modo de realización, el dispositivo configurado para realizar un análisis por PCR cuantitativo de una o más secuencias de oligonucleótidos diana víricos o tumorales en una muestra de sangre completa que comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie celular para un virus o tumor, comprendiendo dicho dispositivo un tubo que define un canal de flujo de fluido y una pluralidad de segmentos situados en el mismo, incluyendo dicho dispositivo: (a) un primer conjunto de segmentos en dicho canal de flujo de fluido que define un compartimento de pretratamiento de muestra que comprende, desde un extremo proximal a uno distal, un primer segmento flanqueante, un segmento interior y un segundo segmento flanqueante, y anticuerpos anti marcador de superficie celular inmovilizados en uno o más de dichos segmentos, en el que dicho compartimento de pretratamiento de muestra no incluye un filtro; (b) un segundo conjunto de segmentos en dicho canal de flujo de fluido que define una región de análisis por PCR contigua a dicho compartimento de pretratamiento de muestra, comprendiendo dicha región de análisis por PCR uno o más segmentos adicionales, cada uno configurado para realizar una o más etapas de dicho análisis por PCR, que comprende preparación de reactivos, enriquecimiento de dianas, retirada de inhibidores, extracción, amplificación y detección en tiempo real de ácido nucleico; y (c) una pluralidad de miembros de compresión conectados de forma funcional con dicha pluralidad de segmentos y configurados para comprimir selectivamente uno o más segmentos de dicho compartimento de pretratamiento de muestra para formar un canal de flujo en el compartimento de pretratamiento de muestra de modo que el diámetro del canal de flujo en el segmento interior sea menor que el diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes; en el que dicho dispositivo está configurado para generar una muestra empobrecida en el compartimento de pretratamiento de muestra que comprenda < 5 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular. En un modo de realización del dispositivo, dicho diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de entre un 25-50 % del diámetro del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes. En un modo de realización, dicho diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de aproximadamente un 33 % del diámetro del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes. En un modo de realización, dicho dispositivo tiene un límite de detección de < 100 copias/ml de virus o tumor. En un modo de realización, dicho marcador de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD4, CD45, beta-microglobulina o mezclas de los mismos. En determinados modos de realización, dicho marcador de superficie celular es CD4.
En modos de realización específicos de los procedimientos y dispositivos divulgados en el presente documento, la pluralidad de células incluye monocitos y linfocitos T y dicha superficie se une al marcador de superficie celular en dichos monocitos y linfocitos T. La muestra empobrecida puede comprender < 2,5 % de células y más específicamente < 1 % de células que incluyen el marcador de superficie celular. El procedimiento puede lograr un límite de detección de < 200 y, más en particular, < 100 copias/ml de diana. El marcador de superficie celular se puede seleccionar del grupo que consiste en CD4, CD45, beta-microglobulina o mezclas de los mismos, y la superficie puede ser una partícula, por ejemplo, una partícula magnética, o una pared interior de un compartimento de pretratamiento del dispositivo. Los dispositivos y procedimientos se pueden usar para evaluar la cantidad de un ácido nucleico diana, incluyendo, pero sin limitarse a, la carga vírica del VIH en una muestra, así como la carga vírica de otros virus, incluyendo, pero sin limitarse a, hepatitis (por ejemplo, hepatitis A (VHA), B (VHB), C (VHC) y E (VHE), y, en particular, hepatitis B y C), Epstein-Barr (VEB), virus del Nilo Occidental (VNO), citomegalovirus (CMV), encefalitis japonesa (VEJ), chicungunya (CHIK), dengue, virus BK, Zika, Babesia y combinaciones de los mismos. En un modo de realización específico, los dispositivos y procedimientos se usan para evaluar la carga vírica del VIH, VHB o VHC.
Breve descripción de las figuras
La fig. 1 muestra un dispositivo de procesamiento de muestras ejemplar.
Las figs. 2A-2B muestran el intervalo dinámico del ensayo cuantitativo para VIH con cobas® LIAT® en plasma.
Las figs. 3A-3B muestran el intervalo dinámico del ensayo cuantitativo para VIH con cobas® LIAT® en sangre completa.
La fig. 4 muestra los límites de detección (LD) del ensayo cuantitativo para VIH con cobas® LIAT® en plasma y sangre completa.
La fig. 5 muestra mediciones de la carga vírica del VIH de cinco muestras de pacientes, incluyendo plasma, sangre completa (SC) y sangre completa tratada con partículas de anticuerpo para CD4 (SC/partículas). El tratamiento con partículas de anticuerpo para CD4 mejoró la correlación en las cargas víricas de dos muestras (números 3 y 5).
Las figs. 6A-6B muestran cómo el pretratamiento con partículas de anticuerpo para CD4 mejora la correlación en las cargas víricas para sangre completa y plasma. En la fig. 6A, se muestra la correlación en las cargas víricas antes del tratamiento con partículas de anticuerpo para CD4, y en la fig. 6B, se muestra la correlación en las cargas víricas después del pretratamiento con anticuerpo para CD4.
Las figs. 7A-7D muestran la configuración del compartimento de pretratamiento de muestra de un dispositivo de procesamiento de muestras (fig. 7A) configurado para realizar lisis convencional (fig. 7B), lisis severa (fig.
1C) y empobrecimiento de células (fig. 7D).
Las figs. 8A-8B muestran la velocidad del motor del miembro de compresión usada en lisis convencional y severa (fig. 8A) frente a la usada en el empobrecimiento de células (fig. 8B).
Descripción detallada
Definiciones
A menos que se defina de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente divulgación tendrán los significados que se entienden comúnmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera de otro modo por el contexto, los términos en singular incluirán plurales y los términos en plural incluirán el singular. Los artículos "un/uno" y "una" se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Los términos "detectar", "detección" y términos similares se usan en la presente solicitud para referirse ampliamente a un procedimiento o descubrimiento o determinación de la presencia o ausencia, así como un grado, cantidad o nivel, o probabilidad de aparición de algo. Por ejemplo, el término "detectar", cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico diana, puede indicar el descubrimiento o determinación de la presencia, ausencia, nivel o cantidad, así como una probabilidad o posibilidad de la presencia o ausencia de la secuencia. Se debe entender que las expresiones "detectar la presencia o ausencia", "detección de la presencia o ausencia" y expresiones relacionadas incluyen la detección cualitativa y cuantitativa. Por ejemplo, la detección cuantitativa incluye la determinación del nivel, cantidad o cantidades de secuencias de ácido nucleico asociado al VIH en una muestra.
Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) e incluyen ácidos nucleicos naturales (adenosina, guanidina, citosina, uracilo y timidina), no naturales y modificados. El término no está limitado por la longitud (por ejemplo, el número de monómeros) del polímero. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario y, en general, contendrá enlaces fosfodiéster 5'-3', aunque, en algunos casos, los análogos nucleotídicos pueden tener otras uniones. Los monómeros típicamente se denominan nucleótidos. El término "nucleótido no natural" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que contiene una base nitrogenada, glúcido o grupo fosfato modificado, o que incorpora un resto no natural en su estructura. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen didesoxinucleótidos, nucleótidos biotinilados, aminados, desaminados, alquilados, bencilados y marcados con fluoróforo.
El término "cebador" se refiere a un ácido nucleico corto (un oligonucleótido) que actúa como un punto de inicio de la síntesis de hebras de polinucleótido por una ácido nucleico polimerasa en condiciones adecuadas. Las reacciones de síntesis y amplificación de polinucleótidos típicamente incluyen un tampón apropiado, dNTP y/o rNTP, y uno o más cofactores opcionales, y se llevan a cabo a una temperatura adecuada. Un cebador típicamente incluye al menos una región hibridada a diana que es al menos sustancialmente complementaria a la secuencia diana. Esta región típicamente tiene una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos. Un "par de cebadores" se refiere a un cebador directo y cebador inverso (a veces llamados cebadores 5' y 3') que son complementarios a hebras opuestas de una secuencia diana y están diseñados para amplificar la secuencia diana. Los cebadores directo e inverso se disponen dentro de una distancia amplificable entre sí en la secuencia diana, por ejemplo, aproximadamente 10-5000 nucleótidos o aproximadamente 25­ 500 nucleótidos.
Como se usa en el presente documento, "sonda" significa cualquier molécula que se puede unir selectivamente a una biomolécula diana específicamente pretendida, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de interés que se vaya a unir, capturar o hibridar por la sonda.
Las palabras "complementario" o "complementariedad" se refieren a la capacidad de un ácido nucleico en un polinucleótido de formar un par de bases con otro ácido nucleico en un segundo polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia 5'-A-G-T-3' (5'-A-G-U-3' para ARN) es complementaria a la secuencia 3'-T-C-A-5' (3'-U-C-A-5' para ARN). La complementariedad puede ser parcial, en la que solo algunos de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases, o completa, donde todos los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases. Una sonda o cebador se considera "específico para" una secuencia diana si es al menos parcialmente complementario a la secuencia diana. Dependiendo de las condiciones, el grado de complementariedad con respecto a la secuencia diana típicamente es mayor para un ácido nucleico más corto, tal como un cebador (por ejemplo, más de un 80 %, 90 %, 95 % o mayor), que para una secuencia más larga.
El término "condiciones de amplificación" o expresiones similares se refieren a las condiciones en una reacción de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, amplificación por PCR) que permiten la hibridación y extensión de los cebadores dependiente del molde. El término "amplicón" se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene toda o un fragmento de la secuencia de ácido nucleico diana y que se forma como producto de la amplificación in vitro por cualquier procedimiento de amplificación adecuado. Se describen diversas condiciones de PCR en PCR Strategies (Innis et al., 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Academic Press, NY, 1990). El término "ácido nucleico polimerasa termoestable" o "polimerasa termoestable" se refiere a una enzima polimerasa, que es relativamente estable a temperaturas elevadas cuando se compara, por ejemplo, con polimerasas de E. coli. Una polimerasa termoestable es adecuada para su uso en condiciones de termociclado típicas de la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). Las polimerasas termoestables ejemplares incluyen las de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Z05 de Thermus sp. (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.674.738) y mutantes de polimerasa Z05 de Thermus sp., Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, sps17 de Thermus sp., Deinococcus radiodurans, familia de fuente de aguas termales B/clon 7, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana y Thermosipho africanus, y versiones modificadas de las mismas.
El término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a cualquier composición que contiene o se sospecha que contiene ácido nucleico de un individuo. El término incluye componentes purificados o separados de células, tejidos o sangre, por ejemplo, ADN, ARN, proteínas, porciones libres de células o lisados celulares. En un modo de realización específico, se realiza el análisis en muestras de sangre completa. Como se usa en el presente documento, una "muestra de sangre completa" incluye sangre extraída del cuerpo de la que no se ha retirado ningún constituyente, tal como plasma o plaquetas. En general, la muestra no está modificada excepto por la presencia de un anticoagulante. Una muestra también se puede referir a otros tipos de muestras biológicas, por ejemplo, plasma, suero, hemoderivados (capa leucoplaquetaria) y gotas de sangre seca. Las muestras también pueden incluir constituyentes y componentes de cultivos in vitro de células obtenidas de un individuo, incluyendo líneas celulares.
El término "kit" se refiere a cualquier fabricación (por ejemplo, un envase o un recipiente) que incluye al menos un dispositivo que comprende un soporte sólido, como se describe en el presente documento para amplificar, capturar, marcar/convertir o detectar específicamente una secuencia de ácido nucleico diana como se describe en el presente documento. El kit puede incluir además instrucciones de uso, reactivos complementarios y/o componentes o módulos usados en el procedimiento descrito en el presente documento o una etapa del mismo.
Procedimientos
La presente divulgación proporciona un procedimiento de realización de un análisis cuantitativo de una muestra de sangre completa para determinar una secuencia de ácido nucleico diana, en el que la muestra comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie celular. En un modo de realización particular, la secuencia de ácido nucleico diana es vírica y el marcador de superficie celular es un marcador de superficie de célula vírica. El procedimiento incluye las siguientes etapas:
a. añadir la muestra de sangre completa a un dispositivo que comprende una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie celular inmovilizados;
b. mezclar la superficie y la muestra en el dispositivo para formar una muestra empobrecida, en la que la muestra empobrecida comprende <5 % de células que incluyen el marcador de superficie celular y la etapa de mezcla se realiza en condiciones que no lisan las células en la muestra; y
c. medir, en el dispositivo, la cantidad de secuencia de ácido nucleico diana en la muestra empobrecida.
Si la secuencia de ácido nucleico diana es vírica, la cantidad de secuencia de ácido nucleico diana en la muestra empobrecida se correlaciona con la carga vírica en la muestra. De forma alternativa, si la secuencia de ácido nucleico diana se asocia con un tumor, se usa un anticuerpo anti marcador de superficie de célula tumoral en la superficie en la etapa (a), y la cantidad de secuencia de ácido nucleico diana en la muestra empobrecida se correlaciona con la carga tumoral en la muestra.
En un modo de realización particular, la etapa de mezcla se realiza sin filtrar los marcadores de superficie celular de la muestra.
Las muestras de sangre completa sometidas a prueba en los procedimientos descritos en el presente documento comprenden una pluralidad de tipos celulares que incluyen un marcador de superficie celular, incluyendo, pero sin limitarse a, monocitos y linfocitos T, así como macrófagos y células dendríticas. En un modo de realización específico, la pluralidad de células incluye monocitos y linfocitos T.
En un modo de realización específico, los procedimientos y dispositivos descritos en el presente documento se usan para analizar la carga vírica del VIH y el marcador celular de infección por VIH usado en los procedimientos descritos en el presente documento puede ser CD4, CD45, beta-microglobulina o combinaciones de los mismos. En un modo de realización específico, el marcador celular de infección por VIH es CD4. Se pueden incluir marcadores de infección por VIH adicionales, pero no se limitan a, CD27, TNFR-II, IL-12 y/o CD38. Los dispositivos y procedimientos se usan para evaluar la carga vírica del VIH, así como otros virus, incluyendo, pero sin limitarse a, hepatitis (por ejemplo, hepatitis A (VHA), B (VHB), C (VHC) y E (VHE), y, en particular, hepatitis B y C), Epstein-Barr (VEB), virus del Nilo Occidental (VNO), citomegalovirus (CMV), encefalitis japonesa (VEJ), chicungunya (CHIK), dengue, virus BK, Zika, Babesia y combinaciones de los mismos. En un modo de realización específico, el dispositivo y el procedimiento se usan para evaluar la carga vírica del VIH, VHB o VHC. Además, los dispositivos y procedimientos descritos en el presente documento también se pueden usar para evaluar la cantidad de cualquier secuencia de ácido nucleico diana, en los que la presencia de la secuencia diana se asocia con un marcador de superficie celular dado. Un marcador de superficie celular es una proteína expresada en la superficie de las células que sirve como marcador de tipos celulares específicos característicos de una enfermedad o afección particular en un paciente. Por ejemplo, un marcador de superficie de célula vírica es un marcador de una infección vírica y, del mismo modo, los marcadores de célula tumoral son marcadores de diferentes formas de cáncer. Si un marcador de célula vírica está en evaluación, se evalúa la carga vírica en la muestra, mientras que si un marcador de célula tumoral está en evaluación, se evalúa la carga tumoral en la muestra. Los marcadores tumorales comunes incluyen, pero no se limitan a: las mutaciones ALK, AFP, B2M, beta-hCG, BRCA1, BRCA2, BCR-ABL, BRAF V600, C-kit/CD117, CA15-3/CA27.29, CA19-9, CA-125, calcitonina, CEA, CD20, CgA, células tumorales circulantes de origen epitelial, fragmento de citoqueratina 21-1, EGFR, ER, PR, fibrina, fibrinógeno, HE4, HER2/neu, IgG, KRAS, lactato deshidrogenasa, NSE, proteína de la matriz nuclear 22, PD-L1, PSA, tiroglobulina, uPA y combinaciones de los mismos. Además, también se pueden analizar otras características de marcadores celulares de una enfermedad o afección dada usando los procedimientos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se pueden detectar marcadores genéticos fetales en el plasma materno usando los procedimientos y dispositivos descritos en el presente documento.
Los procedimientos y dispositivos descritos en el presente documento pueden emplear anticuerpos u otros reactivos de unión específicos para un receptor de superficie celular de un virus. El término "anticuerpo" incluye moléculas de anticuerpo intacto (incluyendo anticuerpos híbridos ensamblados por reasociación in vitro de subunidades de anticuerpo), fragmentos de anticuerpo y construcciones de proteínas recombinantes que comprenden un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo (como se describe, por ejemplo, en Porter, R. R. y Weir, R. C. J. Cell Physiol., 67 (supl); 51-64 (1966) y Hochman, l. Inbar, D. y Givol, D. Biochemistry 12: 1130 (1973)), así como construcciones de anticuerpos que se han modificado químicamente. Los anticuerpos usados en el presente documento pueden ser monoclonales o policlonales. En un modo de realización específico, los anticuerpos son monoclonales. Adicionalmente o de forma alternativa, los procedimientos y dispositivos pueden emplear otros reactivos de unión que tengan especificidad de unión por un receptor de superficie de célula vírica. Los reactivos de unión se pueden derivar de forma natural, pueden ser completa o parcialmente sintéticos, e incluyen, sin limitación, un ligando, enzima, oligonucleótido o aptámero.
En consecuencia, las superficies descritas en el presente documento incluyen una pluralidad de reactivos de unión para un marcador de superficie celular. En un modo de realización, el marcador de superficie celular es un marcador celular de infección por VIH, incluyendo, pero sin limitarse a, un anti-CD4, anti-CD45, anti-betamicroglobulina, anti-CD27, anti-TNFR-II, anti-IL-12 y/o anti-CD38. En otro modo de realización ejemplar, el marcador de superficie celular es un marcador tumoral, incluyendo, pero sin limitarse a, las mutaciones anti-ALK, anti-AFP, anti-B2M, anti-beta-hCG, anti-BRCA1, anti-BRCA2, anti-BCR-ABL, anti-BRAF V600, anti-C-kit/CD117, anti-CA15-3/CA27.29, anti-CA19-9, anti-CA-125, anticalcitonina, anti-CEA, anti-CD20, anti-CgA, anti células tumorales circulantes de origen epitelial, anti fragmento de citoqueratina 21 -1, anti-EGFR, anti-ER, anti-PR, antifibrina, antifibrinógeno, anti-HE4, anti-HER2/neu, anti-IgG, anti-KRAS, anti lactato deshidrogenasa, anti-NSE, anti proteína de la matriz nuclear 22, anti-PD-L1, anti-PSA, antitiroglobulina o anti-uPA. En un modo de realización específico, las partículas incluyen una pluralidad de, por ejemplo, dos o más, marcadores celulares diferentes, por ejemplo, dos o más de los siguientes: anti-CD4, anti-CD45, anti-beta-microglobulina, anti-CD27, anti-TNFR-II, anti-IL-12 y/o anti-CD38; o dos o más de los siguientes: las mutaciones anti-ALK, anti-AFP, anti-B2M, anti-beta-hCG, anti-BRCA1, anti-BRCA2, anti-BCR-ABL, anti-BRAF V600, anti-C-kit/CD117, anti-CA15-3/CA27.29, anti-CA19-9, anti-CA-125, anticalcitonina, anti-CEA, anti-CD20, anti-CgA, anti células tumorales circulantes de origen epitelial, anti fragmento de citoqueratina 21-1, anti-EGFR, anti-ER, anti-PR, antifibrina, antifibrinógeno, anti-HE4, anti-HER2/neu, anti-IgG, anti-KRAS, anti lactato deshidrogenasa, anti-NSE, anti proteína de la matriz nuclear 22, anti-PD-L1, anti-PSA, antitiroglobulina o anti-uPA.
Más específicamente, la superficie incluye una pluralidad de dos o más de los siguientes: anti-CD4, anti-CD45 y/o anti-beta-microglobulina. De forma alternativa, la superficie incluye una población uniforme de anti marcadores celulares de infección por VIH. En un modo de realización particular, la superficie incluye una pluralidad de anticuerpos anti-CD4; o una pluralidad de anticuerpos anti-CD45; o una pluralidad de anticuerpos anti-beta-microglobulina.
Las superficies adecuadas incluyen microesferas o partículas, así como superficies de unión situadas en la pared interior orientada hacia la solución de un compartimento, por ejemplo, un compartimento de pretratamiento, de un dispositivo en el que se realiza el procedimiento. En un modo de realización, la superficie incluye microesferas o partículas, tales como partículas (incluyendo, pero sin limitarse a, coloides o microesferas) comúnmente usadas en otros tipos de ensayos basados en partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, de polipropileno y de látex, materiales típicamente usados en síntesis en fase sólida, por ejemplo, partículas de poliestireno y poliacrilamida, y materiales típicamente usados en aplicaciones cromatográficas, por ejemplo, sílice, alúmina, poliacrilamida, poliestireno. Los materiales también pueden ser una fibra, tal como una fibrilla de carbono. Las partículas pueden ser inanimadas o, de forma alternativa, pueden incluir entidades biológicas animadas, tales como células, virus, bacterias y similares.
Las partículas usadas en el presente procedimiento pueden estar compuestas por cualquier material adecuado para su fijación a uno o más reactivos de unión, y que se puedan obtener, por ejemplo, por medio de centrifugación, gravedad, filtración u obtención magnética. Una amplia variedad de diferentes tipos de partículas que se pueden fijar a reactivos de unión se venden comercialmente para su uso en ensayos de unión. Estos incluyen partículas no magnéticas, así como partículas que comprenden materiales magnetizables que permiten que las partículas se obtengan con un campo magnético. En un modo de realización, las partículas están compuestas por un material conductor y/o semiconductor, por ejemplo, partículas de oro coloidal.
Las partículas pueden tener una amplia variedad de tamaños y conformaciones. A modo de ejemplo y no de limitación, las partículas pueden ser de entre 5 nanómetros y 100 micrómetros. Por ejemplo, las partículas tienen tamaños de entre 20 nm y 10 micrómetros. En un modo de realización particular, las partículas son de 0,1 um a 10 um, y más específicamente, de hasta 5 um. Por ejemplo, las partículas son de entre 1-5 um.
Las partículas pueden ser esféricas, oblongas, bastoniformes, etc., o pueden tener una conformación irregular.
En un modo de realización alternativo, el dispositivo usado para realizar el procedimiento descrito en el presente documento incluye una superficie que se ha modificado para que incluya una pluralidad de reactivos de unión inmovilizados para un marcador de superficie vírico. En este modo de realización, el procedimiento comprende añadir una muestra de sangre completa a un compartimento de pretratamiento de muestra que comprende una pared interior orientada hacia la muestra que tiene una pluralidad de reactivos de unión para un marcador de superficie celular de infección vírica inmovilizado sobre la misma. A continuación, el compartimento de pretratamiento se somete a condiciones suficientes para formar una muestra empobrecida y una superficie que comprenda células de marcador de superficie víricas inmovilizadas, de modo que la muestra empobrecida comprenda <5 % de células que incluyen el marcador de superficie de célula vírica. En un modo de realización específico, la etapa de sometimiento se realiza en condiciones que no lisan las células en la muestra. A continuación, la muestra empobrecida se separa del compartimento de pretratamiento y se transfiere a una región de análisis de ácido nucleico, como se describe con más detalle a continuación.
Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para analizar cualquier cepa patógena del VIH, incluyendo VIH-1 y VIH-2, y cualquier grupo o subtipo de los mismos. Por ejemplo, se pueden usar los procedimientos para analizar el/los grupo(s) del VIH-1 M, N, O, P y combinaciones de los mismos. En un ejemplo específico, se usan los procedimientos para analizar el grupo del VIH-1 M y/u O y opcionalmente uno o más grupos del VIH-1 adicionales. Los procedimientos también se pueden usar para analizar uno o más subtipos del VIH-1, incluyendo, pero sin limitarse a, los subtipos A, A1, A2, CRF19, B, C, D, F, G, CRF02_AG, H, CRF04_cpx, J, K y combinaciones de los mismos. Además, también se pueden usar los procedimientos para detectar los grupos del VIH-2 A-H y, en particular, los grupos del VIH-2 A y B. Además, también se pueden usar los procedimientos para detectar hepatitis B, hepatitis C o CMV.
En un modo de realización específico, los procedimientos descritos en el presente documento están diseñados para producir una muestra empobrecida que comprenda < 10 % de células que tienen el marcador de superficie celular. Más en particular, la muestra empobrecida comprende < 5 % de células que tienen el marcador de superficie celular, más específicamente < 3 % de células, e incluso más en particular, < 1 % de células que tienen el marcador de superficie celular. En otro modo de realización específico, los procedimientos descritos en el presente documento pueden lograr una carga vírica y/o tumoral para sangre completa menor que 1e3 copias/ml.
Dispositivo de procesamiento de muestras
Los procedimientos descritos en el presente documento se implementan en un dispositivo de procesamiento de muestras configurado para realizar una técnica de amplificación de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos extraídos de las muestras biológicas se pueden procesar adicionalmente amplificando los ácidos nucleicos usando al menos uno de los siguientes procedimientos ejemplares: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por círculo rodante (RCA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) y reacción de amplificación por desplazamiento de hebra (SDAR). En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos extraídos del organismo pueden ser ácidos ribonucleicos (ARN) y su procesamiento puede incluir una reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCR) acoplada usando combinaciones de enzimas, tales como polimerasa Tth y polimerasa Taq o retrotranscriptasa y polimerasa Taq. En algunos modos de realización, las sondas de ácido nucleico circular con muescas se pueden circularizar usando ADN ligasa T4 o Ampligase™ y ácidos nucleicos guía, tales como dianas de ADN o ARN, seguido de detección de la formación de las sondas circularizadas cerradas después de un procedimiento de selección in vitro. Dicha detección puede ser a través de PCR, TMA, RCA, LCR, NASBA o SDAR usando enzimas conocidas por los familiarizados con la técnica. En modos de realización ejemplares, la amplificación de los ácidos nucleicos se puede detectar en tiempo real usando sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescente o tintes intercalantes de ADN, así como un fotómetro o dispositivo de carga acoplada en el analizador molecular para detectar el incremento de fluorescencia durante la amplificación de ácido nucleico. Estas sondas marcadas de forma fluorescente usan sistemas de detección bien conocidos por los familiarizados con la técnica (es decir, TaqMan™, Molecular Beacons™, sondas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), sondas Scorpion™) y, en general, usan extinción de fluorescencia, así como la liberación de extinción o transferencia de energía de fluorescencia de un indicador a otro para detectar la síntesis o presencia de ácidos nucleicos específicos.
En un modo de realización, los procedimientos divulgados en el presente documento se implementan en un dispositivo que comprende canales, cámaras, depósitos, regiones de detección y procesamiento independientes de microescala a macroescala. El dispositivo puede ser un cartucho, dispositivo, recipiente o bolsa, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE. UU. n.os 6.440.725; 6.783.934; 6.818.185; 6.979.424; 8.580.559; y 8.940.526, así como dispositivos, tales como los disponibles de Cepheid Corp., Idaho Technology, Inc. y/o Biofire Diagnostics, Inc.
Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden implementar en una bolsa de análisis de ácido nucleico independiente que incluya una zona de lisis celular, una zona de preparación de ácido nucleico, una zona de amplificación de primera fase, una zona de amplificación de segunda fase, como se muestra en la fig. 1 de la publicación de EE. UU. n.° 201000056383. La bolsa comprende una variedad de canales y cavidades de diversos tamaños y se dispone de modo que la muestra fluya a través del sistema y diversas zonas y se procese en consecuencia. El procesamiento de muestras se produce en diversas cavidades localizadas dentro de la bolsa. Se proporcionan numerosos canales para mover la muestra dentro de y entre las zonas de procesamiento, mientras que se proporcionan otros canales para suministrar fluidos y reactivos a la muestra o para retirar dichos fluidos y reactivos de la muestra. El líquido dentro de la bolsa se mueve entre las cavidades por presión, por ejemplo, presión neumática. En un modo de realización específico, la etapa de empobrecimiento de células descrita en el presente documento se realiza en una zona que precede a la zona de lisis celular.
En un ejemplo alternativo, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden implementar en un cartucho de análisis de ácido nucleico independiente como se muestra en las figs. 3-5 y 9 de la patente de EE. UU. n.° 9.322.052. El cartucho incluye, entre otros, múltiples cámaras que comprenden una cámara de muestra para contener una muestra de fluido introducida a través del orificio de entrada, una cámara de lavado para contener una solución de lavado, una cámara de reactivo para contener un reactivo de lisis, una cámara de lisis, una cámara de residuos para recibir la muestra y solución de lavado usadas, una cámara de neutralizador para contener un neutralizador y una cámara de mezcla maestra para contener una mezcla maestra (por ejemplo, reactivos de amplificación y sondas fluorescentes) y para mezclar los reactivos y sondas con el analito separado de la muestra de fluido, un recipiente de reacción y una cámara de detección. En este modo de realización particular, la etapa de empobrecimiento de células descrita en el presente documento se realiza en una cámara que precede a la cámara de lisis.
En un modo de realización específico, los procedimientos descritos en el presente documento se realizan en un dispositivo de procesamiento de muestras, tal como el descrito en la patente de EE. UU. n.° 7.718.421. Los dispositivos segmentados, tales como los descritos en la patente de eE. UU. n.° 7.718.421, proporcionan un recipiente conveniente para recibir, almacenar, procesar y/o analizar una muestra biológica. En determinados modos de realización, el dispositivo segmentado facilita los protocolos de procesamiento de muestras que implican múltiples etapas de procesamiento. En determinados modos de realización, se puede obtener una muestra en un dispositivo de muestra, y, a continuación, el dispositivo se sitúa en un analizador que manipula el dispositivo y su contenido para procesar la muestra.
Un modo de realización particular incluye un dispositivo flexible que se ha segmentado en compartimentos por sellos rompibles. Los segmentos individuales pueden contener diversos reactivos y tampones para procesar una muestra. Se pueden aplicar pinzas y accionadores al dispositivo en diversas combinaciones y con diversos tiempos para dirigir el movimiento del fluido y para provocar que los sellos rompibles estallen. Este estallido de los sellos rompibles puede dejar una superficie de dispositivo interior que esté sustancialmente libre de obstrucciones al flujo de fluido. En un modo de realización, el flujo de la muestra biológica se puede dirigir hacia el extremo distal del dispositivo a medida que avanza el procesamiento, mientras que se puede obligar a que el flujo de residuos se mueva en el sentido opuesto, hacia la abertura del dispositivo donde se introdujo inicialmente la muestra. Esta entrada de muestra puede estar sellada, posiblemente de forma permanente, por una tapa con un mecanismo de bloqueo, y se puede localizar una cámara de residuos en la tapa para recibir los residuos para su almacenamiento. Un beneficio significativo de este enfoque es que la muestra procesada no entra en contacto con superficies que se hayan tocado por la muestra no procesada. En consecuencia, es menos probable que las cantidades mínimas de inhibidores de reacción presentes en la muestra no procesada que podrían recubrir las paredes del dispositivo contaminen la muestra procesada.
El dispositivo de procesamiento de muestras se muestra en la fig. 1 y puede incluir un dispositivo flexible 10 transparente que se puede configurar en una pluralidad de segmentos, tales como 16, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 y/o 190, y que están sustancialmente aplanados por compresión. En un modo de realización, un dispositivo puede tener al menos dos segmentos. En un modo de realización, un dispositivo puede tener al menos tres segmentos. El dispositivo flexible puede proporcionar una funcionalidad de funcionamiento entre aproximadamente los 2-105 °C, compatibilidad con muestras, dianas y reactivos, permeabilidad a los gases baja, propiedades de fluorescencia mínima y/o resiliencia durante ciclos de compresión y flexión repetidos. El dispositivo puede estar fabricado de una variedad de materiales, incluyendo sus ejemplos, pero sin limitarse a: poliolefinas, tales como polipropileno o polietileno, poliuretano, copolímeros de poliolefina y/u otros materiales que proporcionan características adecuadas.
En un modo de realización adicional, se puede incrustar un filtro en un segmento del dispositivo. En un modo de realización, se puede formar un filtro apilando múltiples capas de material de filtro flexible. La capa superior del filtro que entra en contacto directamente con una muestra puede tener un tamaño de poro seleccionado para la filtración; la capa inferior del filtro puede incluir un material con un tamaño de poro mucho mayor para proporcionar una estructura de soporte para la capa superior cuando se aplica una presión durante la filtración. En este modo de realización preferente, el filtro se puede plegar para formar una bolsa, con los bordes de su extremo abierto fijados firmemente a la pared del dispositivo. El segmento con la bolsa de filtro se puede aplanar sustancialmente comprimiendo el exterior del dispositivo.
En un modo de realización específico, el compartimento de pretratamiento de muestra no incluye un filtro.
Además, la entrada de muestra del dispositivo se puede adaptar para que reciba un módulo de empobrecimiento de células que incluye una matriz o medios de inmovilización de marcador celular de infección vírica que se une a marcadores de célula vírica en la muestra, lo que permite que una muestra empobrecida fluya a través de la matriz o medios y fluya en la entrada de muestra del dispositivo. Un módulo de este tipo se puede usar para llevar a cabo el procedimiento de empobrecimiento de células con mezcla manual de los medios/muestra.
En modos de realización ejemplares, uno o más reactivos se pueden almacenar como sustancia seca y/o bien como soluciones líquidas en segmentos del dispositivo. En modos de realización donde los reactivos se pueden almacenar en formato seco, las soluciones líquidas se pueden almacenar en segmentos colindantes para facilitar la reconstitución de la solución de reactivo. Los ejemplos de reactivos típicos incluyen: reactivo de lisis, tampón de elución, tampón de lavado, inhibidor de DNasa, inhibidor de RNasa, inhibidor de proteinasa, agente quelante, reactivo neutralizante, solución de sal caotrópica, detergente, tensioactivo, anticoagulante, solución germinante, isopropanol, solución de etanol, anticuerpo, sondas de ácido nucleico, sondas de ácido peptidonucleico y sondas de ácido nucleico con fosfotioato. En modos de realización donde uno de los reactivos es una solución de sal caotrópica, un componente preferente es isocianato de guanidinio o clorhidrato de guanidinio o una combinación de los mismos. En algunos modos de realización, el orden en el que se pueden almacenar los reactivos en el dispositivo en relación con la abertura a través de la que se introduce una muestra refleja el orden en el que se pueden usar los reactivos en los procedimientos que utilizan el tubo. En modos de realización preferentes, un reactivo incluye una sustancia que se puede unir específicamente a un componente preseleccionado de una muestra. Por ejemplo, una sustancia se puede unir específicamente a un ácido nucleico, o una sonda de ácido nucleico se puede unir específicamente a ácidos nucleicos que tengan secuencias de bases particulares.
En un modo de realización específico, además de las superficies de empobrecimiento analizadas anteriormente, el dispositivo también puede incluir un sustrato, tal como una partícula o una pluralidad de partículas para facilitar la adsorción selectiva de ácidos nucleicos. Las partículas, por ejemplo, son partículas de sílice, partículas magnéticas, partículas magnéticas de sílice, partículas de vidrio, partículas coloidales de nitrocelulosa y partículas coloidales de nitrocelulosa magnetizadas. En algunos modos de realización donde las partículas pueden ser paramagnéticas, las partículas se pueden capturar por un campo magnético. Los ejemplos de reactivos que pueden permitir la adsorción selectiva de moléculas de ácido nucleico en una superficie recubierta con grupos funcionales se describen, por ejemplo, en las pat. de EE. UU. n.os 5.705.628; 5.898.071; y 6.534.262. La separación se puede lograr manipulando la fuerza iónica y la concentración de polialquilenglicol de la solución para precipitar selectivamente, y adsorber de forma reversible, los ácidos nucleicos en una superficie en fase sólida. Cuando estas superficies en fase sólida son micropartículas paramagnéticas, las partículas magnéticas, en las que se han adsorbido las moléculas de ácido nucleico diana, se pueden lavar en condiciones que retengan los ácidos nucleicos, pero no otras moléculas. Las moléculas de ácido nucleico aisladas a través de este procedimiento son adecuadas para: electroforesis capilar, secuenciación de nucleótidos, retrotranscripción, clonación, transfección, transducción, microinyección de células de mamífero, protocolos de tratamiento génico, síntesis in vitro de sondas de ARN, construcción de colecciones de ADNc y la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Varias empresas ofrecen sistemas de purificación con base magnética, tales como MagAttract™ de QIAGEN, MagaZorb™ de Cortex Biochem y MagNA Pure LC™ de Roche Life Science. Estos productos usan partículas cargadas de forma negativa y manipulan las condiciones del tampón para unir selectivamente una variedad de ácidos nucleicos a las partículas, lavar las partículas y eluir las partículas en tampones acuosos. Muchos de los productos usados por estas empresas usan sales caotrópicas para ayudar a la precipitación de los ácidos nucleicos sobre las partículas magnéticas. Se describen ejemplos en las pat. de EE. UU. n.os 4.427.580; 4.483.920; y 5.234.809.
Los modos de realización ejemplares preferentes pueden incluir una disposición lineal de 2 o más segmentos del dispositivo 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 y/o 190 (fig. 1). Una disposición lineal facilita el movimiento de la muestra y los residuos y diana resultantes a través del tubo de manera controlada. Se puede introducir una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre completa, a través de una primera abertura 12 en un primer segmento 110 del dispositivo. Después de esto, los residuos de una muestra procesada se pueden mover, de nuevo, hacia la primera abertura mientras que se empuja la diana hacia el extremo opuesto, de este modo, minimizando la contaminación de la diana por los inhibidores de reacción que se pueden haber fijado a la pared del dispositivo y confinando la diana en un segmento limpio del dispositivo que puede contener reactivos adecuados para otras operaciones de la diana. Algunos modos de realización pueden usar una pluralidad de segmentos, conteniendo cada uno al menos un reactivo. En algunos modos de realización, estos segmentos pueden contener reactivos en el siguiente orden: el segundo segmento puede incluir partículas de empobrecimiento y/o una superficie que comprende un reactivo de unión inmovilizado y un tampón de dilución; el tercer segmento se puede dividir en dos subsecciones, la primera incluyendo proteinasa K y la segunda incluyendo microesferas magnéticas de sílice u otra partícula adecuada; el reactivo en el cuarto segmento puede ser igualmente un reactivo de lisis; el reactivo en el quinto segmento puede ser igualmente un tampón de lavado; el reactivo en los segmentos sexto-octavo puede ser un tampón de lavado, un reactivo de neutralización, un tampón de suspensión, un reactivo de elución o reactivos de amplificación y detección de ácido nucleico. En algunos modos de realización, los segmentos se pueden disponer de forma continua, mientras que en otros modos de realización, estos segmentos se pueden separar por otro segmento o segmentos entremedias.
En algunos modos de realización, se contempla un procedimiento de extracción de ácidos nucleicos de muestras biológicas usando el aparato descrito en los párrafos previos. En determinados modos de realización, la secuencia de acontecimientos en una prueba de este tipo puede incluir: 1) una muestra biológica obtenida con una herramienta de obtención, 2) un dispositivo flexible, que puede incluir una pluralidad de segmentos que pueden contener los reactivos requeridos durante la prueba, y en los que se puede colocar la muestra obtenida usando una primera abertura en el dispositivo, 3) al menos un sustrato que se pueda establecer a una temperatura controlada y/u otras condiciones para capturar organismos o ácidos nucleicos diana durante un periodo de incubación establecido, 4) organismos o moléculas, en la muestra no procesada, que se pueden no unir al sustrato y, por tanto, se podrían retirar transfiriendo líquido a un depósito de residuos, 5) almacenar residuos, en un depósito de residuos, que se pueden segregar de la diana por una pinza y/o accionador comprimido contra el dispositivo, 6) un tampón de lavado, liberado de otro segmento del dispositivo, que puede retirar los inhibidores de reacción, 7) un reactivo de elución, de otro segmento, que puede liberar la diana unida al sustrato después de la incubación a una temperatura controlada y 8) ácidos nucleicos que se puedan detectar por técnicas bien conocidas por los familiarizados con la técnica u obtenidos a través de una segunda abertura en el dispositivo. En modos de realización ejemplares, el flujo de la muestra puede ser de la primera abertura hacia el extremo distal del dispositivo a medida que avanza la prueba, mientras que el flujo de residuos puede ser hacia la abertura de introducción de muestra cerrada del dispositivo, donde una cámara de residuos en la tapa del dispositivo recibe los residuos para su almacenamiento. En consecuencia, se evita el contacto no deseable entre una muestra procesada y las superficies en un recipiente de reacción que se hayan tocado por la muestra no procesada, previniendo, de este modo, la inhibición de la reacción debida a cantidades mínimas de inhibidores de reacción presentes en la muestra no procesada y que podrían recubrir las paredes del recipiente de reacción.
Algunos modos de realización pueden incorporar el uso de un tubo de ensayo 1, con un dispositivo flexible 10 dividido en una pluralidad de segmentos, tales como los segmentos 16, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 y/o 190, que pueden ser transversales al eje longitudinal del dispositivo, y que pueden contener reactivos, tales como los reactivos 210, 221, 222, 230, 240, 250, 260, 270, 280 y/o 290; así como un analizador, que puede tener una pluralidad de miembros de compresión, tales como los accionadores 312, 322, 332, 342, 352, 362, 372, 382 y/o 392, pinzas, tales como las pinzas 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 y/o 390, y bloques, por ejemplo 314, 344 y/o 394 (otros sin numerar por simplicidad); que se oponen a los accionadores y pinzas, para procesar una muestra. Se pueden usar diversas combinaciones de estos accionadores, pinzas y/o bloques para sujetar eficazmente el dispositivo cerrado, segregando, de este modo, fluido. En modos de realización ejemplares, al menos uno de los accionadores o bloques puede tener un elemento de control térmico para controlar la temperatura de un segmento del dispositivo para el procesamiento de muestras. El aparato de procesamiento de muestras puede tener además al menos una fuente de campo magnético 430 que puede aplicar un campo magnético a un segmento. El aparato de procesamiento de muestras puede tener además un dispositivo de detección 492, tal como un fotómetro o un DCA, para supervisar una reacción que tiene lugar o finaliza dentro del dispositivo.
El fluido se puede impulsar a través de un canal de flujo comprimiendo el dispositivo con un accionador situado en el centro y sus pinzas flanqueantes, si las hubiera, para formar un canal de flujo con un espacio de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 um, preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 um a través de cada segmento. Los accionadores contiguos comprimen suavemente los segmentos contiguos en comunicación líquida con el canal de flujo para generar una presión interna compensada para garantizar un espacio sustancialmente uniforme del canal de flujo. A continuación, los dos accionadores flanqueantes, de forma alternativa, se pueden comprimir y liberar presión en el dispositivo sobre sus respectivos segmentos para generar un flujo a un caudal controlado. Se pueden incorporar sensores de flujo, presión y/o fuerza opcionales para posibilitar el control de bucle cerrado del comportamiento del flujo. El procedimiento del canal de flujo se puede usar en el lavado, lo que potencia la eficacia de unión al sustrato, y la detección.
Se puede usar un procedimiento de inmovilización y resuspensión de partículas para separar las partículas del líquido de muestra. El campo magnético generado por una fuente magnética 430 (FIG. 1) se puede aplicar a un segmento que contiene una suspensión de partículas magnéticas para capturar e inmovilizar las partículas en la pared del tubo. Se puede usar un procedimiento de agitación durante el procedimiento de captura. En otro modo de realización, se puede formar un canal de flujo en el segmento con el campo magnético aplicado, y las partículas magnéticas se pueden capturar en el flujo para incrementar la eficacia de captura. Para resuspender las partículas inmovilizadas, se puede cortar o retirar el campo magnético, y se puede usar un procedimiento de agitación o de canal de flujo para la resuspensión.
En determinados modos de realización, los ácidos nucleicos extraídos de las muestras biológicas se pueden procesar adicionalmente amplificando los ácidos nucleicos usando al menos un procedimiento del grupo: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por círculo rodante (RCA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) y reacción de amplificación por desplazamiento de hebra (SDAR). En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos extraídos del organismo pueden ser ácidos ribonucleicos (ARN) y su procesamiento puede incluir una reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCR) acoplada usando combinaciones de enzimas, tales como polimerasa Tth y polimerasa Taq o retrotranscriptasa y polimerasa Taq. En algunos modos de realización, las sondas de ácido nucleico circular con muescas se pueden circularizar usando ADN ligasa T4 o Ampligase™ y ácidos nucleicos guía, tales como dianas de ADN o ARN, seguido de detección de la formación de las sondas circularizadas cerradas después de un procedimiento de selección in vitro. Dicha detección puede ser a través de PCR, TMA, RCA, LCR, NASBA o SDAR usando enzimas conocidas por los familiarizados con la técnica. En modos de realización ejemplares, la amplificación de los ácidos nucleicos se puede detectar en tiempo real usando sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescente o tintes intercalantes de ADN, así como un fotómetro o dispositivo de carga acoplada en el analizador molecular para detectar el incremento de fluorescencia durante la amplificación de ácido nucleico. Estas sondas marcadas de forma fluorescente usan sistemas de detección bien conocidos por los familiarizados con la técnica (es decir, TaqMan™, Molecular Beacons™, sondas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), sondas Scorpion™) y, en general, usan extinción de fluorescencia, así como la liberación de extinción o transferencia de energía de fluorescencia de un indicador a otro para detectar la síntesis o presencia de ácidos nucleicos específicos.
Se puede lograr una detección en tiempo real de una señal de un segmento del dispositivo usando un sensor 492 (FIG. 1), tal como un fotómetro, un espectrómetro, un DCA, conectado a un bloque, tal como el bloque 490. En modos de realización ejemplares, se puede aplicar presión por un accionador 392 sobre el segmento del dispositivo 190 para definir adecuadamente la conformación del segmento del dispositivo. El formato de la señal puede ser una intensidad de una luz a determinada longitud de onda, tal como una luz fluorescente, un espectro y/o una imagen, tal como una imagen de células o elementos artificiales, tales como puntos cuánticos. Para la detección por fluorescencia, se puede usar una excitación de luz del sistema óptico para iluminar una reacción y se puede detectar la luz de emisión por el fotómetro. Para detectar una pluralidad de señales que tengan longitudes de onda específicas, se pueden detectar señales de diferentes longitudes de onda en serie o en paralelo por canales de detección especializados o un espectrómetro.
Kits
En algunos modos de realización, se incluyen en un kit reactivos, materiales y dispositivos para llevar a cabo los procedimientos divulgados actualmente. En algunos modos de realización, el kit incluye componentes para obtener, almacenar y/o preparar una muestra. Dichos componentes incluyen, por ejemplo, agujas y jeringas estériles, módulos de empobrecimiento, tubos revestidos con EDTA, tampones (por ejemplo, para la unión de ácido nucleico a y elución de una matriz), inhibidores de RNasa y/o DNasa, etc.
Además, el kit incluye un dispositivo de procesamiento de ensayo, tal como el descrito anteriormente y opcionalmente uno o más componentes para obtener, almacenar y/o preparar la muestra, incluyendo, pero sin limitarse a, un módulo de empobrecimiento como se describe anteriormente en el presente documento. En un modo de realización específico, el dispositivo de procesamiento de ensayo incluye diversos reactivos requeridos para realizar los procedimientos divulgados en el presente documento almacenados dentro de uno o más segmentos del dispositivo.
El kit puede incluir además controles, por ejemplo, un polinucleótido que sea natural en la secuencia que se va a detectar, o un polinucleótido que incluya la secuencia que se va a detectar.
El kit también puede incluir dispositivos adicionales, tales como tubos de muestra o frascos; recipientes de reacción (por ejemplo, tubos, placas de múltiples pocillos, chips o cámaras de microfluídica, etc.), así como instrucciones de uso o referencia a un sitio web.
Ejemplos
Ejemplo 1. Aislamiento y detección de ARN vírico a partir de sangre completa
Se pueden lograr el aislamiento de ARN y la detección de la secuencia de ARN en un tubo 1 (FIG. 1), incluyendo un dispositivo flexible que tiene nueve segmentos separados por sellos desprendibles y que contienen reactivos preenvasados, y una tapa, que tiene un depósito de residuos alojado en la misma. El flujo de fluido de un segmento o subsección del dispositivo a otro se controla como se describe en el presente documento por el acoplamiento selectivo de uno o más accionadores y pinzas conectados de forma funcional dentro de uno o más segmentos o subsecciones del dispositivo. El primer segmento del dispositivo puede recibir la muestra de sangre completa. El segundo segmento contiene 560 ug de Dynal Particles™ (Dynal Biotech) conjugadas con anticuerpos anti-CD4 suspendidos en tampón de dilución que tiene 100 ul de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 4,3 mM, KH2PO4 1,4 mM, pH 7,3). El 3.er segmento contiene el patrón de cuantificación. El 4.° segmento se divide en dos subsecciones, la 1.a subsección, que contiene 200 ug de proteinasa K, y la 2.a subsección, que incluye 250 ug de partículas magnéticas de sílice, en el que las subsecciones están separadas por un sello desprendible. El 5.° segmento contiene 200 ul de tampón de lisis que comprende sales caotrópicas que contienen clorhidrato de guanidinio 4,7 M, urea 10 mM, Tris 10 mM-HCl, pH 5,7, y tritón X-100 al 2 %. El 6.° segmento contiene 80 ul de tampón de lavado (incluyendo, por ejemplo, etanol al 50 %, NaCl 20 mM, Tris 10 mM-HCl, pH 7,5). El 7.° segmento contiene 80 ul de tampón ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) 20 mM, pH 5,3. El pH del tampón MES se ajusta de modo que pueda ser lo suficientemente bajo como para evitar la elución de ADN de las partículas. El 8.° segmento contiene 40 ul de tampón de elución (por ejemplo, Tris 10 mM-HCl, pH 8,5, o cualquier tampón adecuado para PCR). El pH del tampón de elución se ajusta de modo que pueda ser lo suficientemente alto como para eluir el ADN de la superficie de las partículas en el tampón. El 9.° segmento contiene reactivos de PCR (que pueden contener 10 nmol de cada uno de: dATP, dCTP y dGTP; 20 nmol de dUTP, 2,5 mmol de KCl, 200 nmol de MgCb, 1-5 unidades de ADN polimerasa Taq, 1-5 unidades de ADN polimerasa Tth, 20-100 pmol de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos y 6-25 pmol de sonda TaqMan). El 10.° segmento puede contener un cofactor de metal divalente, tal como MgCb. El extremo del 9.° (o 10.°) segmento puede estar sellado de forma permanente o contener una compuerta de presión para obtener los productos de la reacción de amplificación para confirmar los resultados de una prueba de genotipado por secuenciación de ADN o alguna otra prueba conocida por los expertos en la técnica.
Para el aislamiento y detección de ARN vírico, se cargan 100 ul de sangre completa en el 1.er segmento. A continuación, el dispositivo se puede cerrar con una tapa e insertar en un analizador. El procesamiento de muestras puede incluir las siguientes etapas.
(a) Empobrecimiento de células y lisis de las muestras. Todas las pinzas, excepto la primera pinza, se cierran sobre el dispositivo. El accionador conectado de forma funcional con el 1.er segmento se usa para ajustar el volumen de sangre para que retenga aproximadamente 100 ul en el segmento, y, a continuación, el 1.er segmento se cierra usando la pinza de segmento asociada. El accionador conectado de forma funcional con el 2.° segmento comprime, completamente o en parte, la primera subsección del 2.° segmento para romper los sellos desprendibles entre los 1.er, 2.° y 3.er segmentos y mezclar las partículas anti-CD4 con la muestra y el patrón de cuantificación. Los accionadores conectados de forma funcional con la primera subsección pueden comprimir de forma alterna la subsección para mezclar las partículas con la muestra. A continuación, se puede generar un campo magnético por una fuente magnética cerca del 3.er segmento para capturar las partículas. Al acoplar los accionadores y pinzas asociados en ese segmento/subsección, la muestra empobrecida de células se mueve al 4.° segmento, se cierra una pinza por encima del 4.° segmento para prevenir que las células empobrecidas se mezclen con la muestra empobrecida corriente abajo, y, a continuación, se mueve al 5.° segmento para mezclar el tampón de lisis con la muestra empobrecida de células. La mezcla se incuba en los 4.° y 5.° segmentos a 50 °C durante 2 minutos.
(b) Captura de ácido nucleico. Después de la incubación en la lisis, los accionadores comprimen de forma alterna sus respectivos segmentos para agitar e incubar la mezcla durante 2 minutos a temperatura ambiente para facilitar la unión del ADN a las partículas. A continuación, se genera un campo magnético por una fuente magnética cerca del segmento para capturar las partículas en suspensión. Los accionadores pueden comprimir de forma alterna el segmento para capturar las partículas. Los accionadores y pinzas se abren y cierran secuencialmente para mover la muestra no unida y los residuos al depósito de residuos.
(c) Lavado. Un procedimiento de lavado sigue al procedimiento de captura para retirar los restos residuales y los inhibidores de reacción de las partículas y los segmentos que se usarían para el procesamiento de muestras adicional. Se usa un lavado basado en dilución con el tampón de lavado de etanol y se usa un lavado basado en flujo con el tampón de lavado MES. Las pinzas y accionador se abren en primer lugar, y, a continuación, el accionador se cierra para mover el tampón de etanol al 6.° segmento, seguido del cierre de la pinza. Se retira el campo magnético; el accionador y al menos un accionador contiguo se comprimen de forma alterna contra sus respectivos segmentos para generar flujo para resuspender las partículas. A continuación, se crea el campo magnético para capturar sustancialmente todas las partículas y el líquido se mueve a un depósito de residuos. Después de finalizar el primer lavado, el tampón de lavado MES se mueve de un segmento a otro y el tampón se manipula usando la aplicación y liberación secuenciales de los accionadores y pinzas correspondientes para garantizar un flujo esencialmente laminar del tampón de lavado a través del canal de flujo. Cuando finaliza el lavado, los accionadores y pinzas se cierran y sustancialmente todos los residuos se mueven al depósito de residuos.
(d) Elución de ácido nucleico. El tampón de elución se mueve del 8.° segmento usando un procedimiento similar como se menciona antes. El campo magnético se puede retirar y las partículas se resuspenden en el tampón de elución bajo flujo entre los cuarto y quinto segmentos. La suspensión de partículas se incuba a 95 °C en condiciones de flujo estacionario o de agitación durante 2 minutos. Se crea el campo magnético y sustancialmente todas las partículas se inmovilizan, y la solución de ácido nucleico eluido se puede mover al 8.° segmento abriendo y cerrando secuencialmente los accionadores y pinzas. Los accionadores pueden comprimir el 8.° segmento para ajustar el volumen de la solución de ácido nucleico eluido a 40 ul y, a continuación, una pinza se puede cerrar contra el dispositivo para finalizar el procedimiento de extracción de ADN.
(e) Amplificación y detección de ácido nucleico. A continuación, la solución de ácido nucleico se puede transferir al 9.° segmento, mezclar e incubar con UNG 280 a 37 °C durante 1 minuto para degradar cualquier producto de PCR de contaminante que pueda estar presente en la muestra biológica. Después de la incubación, la temperatura se puede incrementar a 95 °C para desnaturalizar los ácidos nucleicos y UNG durante 2 minutos. A continuación, la solución de ácido nucleico se puede transferir al 10.° segmento y mezclar con reactivos de RT-PCR a 65 °C durante 10 minutos, seguido de incubación a 60 °C para iniciar la PCR de inicio en caliente. Se puede realizar un típico ensayo de amplificación de 50 ciclos a dos temperaturas de 95 °C durante 2 segundos y 60 °C durante 15 segundos estableciendo el 8.° segmento a 95 °C y el 9.° segmento a 60 °C, y transfiriendo, de forma alterna, la mezcla de reacción entre los segmentos cerrando y abriendo los accionadores asociados. Se puede realizar un típico ensayo de amplificación de 50 ciclos a tres temperaturas de 95 °C durante 2 segundos, 60 °C durante 10 segundos y 72 ° C durante 10 segundos estableciendo el 8.° segmento a 95 °C, el 9.° segmento a 12 °C y el 10.° segmento a 60 °C, y transfiriendo, de forma alterna, la mezcla de reacción entre los segmentos cerrando y abriendo los accionadores asociados. Un sensor de detección, tal como un fotómetro, conectado ópticamente a la 9.a cámara puede supervisar la emisión de fluorescencia en tiempo real del tinte indicador a través de una porción de la pared del dispositivo. Después de que un ensayo finaliza, se informa de los resultados de la prueba.
Ejemplo 2. Empobrecimiento de CD4 y análisis sin conexión
Se determinó el intervalo dinámico en plasma usando un panel de calibración para la cuantificación del VIH con cobas® 6800/8800 de Roche. Los componentes del panel se proporcionan en la tabla 1 a continuación.
Tabla 1. Panel de calibración para la cuantificación del VIH-1 de Roche
Figure imgf000017_0001
Se sometieron a prueba tres réplicas en un analizador cobas® LIAT® para cada miembro del panel de Roche. Para efectuar las pruebas en el analizador cobas® LIAT®, se mezclaron 100 ul de cada material de miembro del panel con 100 ul de tampón de dilución (1x PBS, BSA al 0,1 %, acida de sodio al 0,1 %), y, a continuación, el material diluido se añadió a un dispositivo cobas® LIAT® preenvasado con reactivos de ensayo como se describe a continuación. El dispositivo se analizó en un analizador cobas® LIAT® y, tras la finalización del ensayo, se usaron Ct y los niveles de introducción de diana para el análisis de regresión en el intervalo dinámico. Los resultados se muestran en las figs. 2A-2B, que muestran una linealidad de 6 en escala logarítmica en plasma y ninguna inhibición del VIH sobre el rendimiento del ensayo con patrón de cuantificación.
Para el intervalo dinámico en sangre completa, los miembros del panel de calibración para la cuantificación del VIH-1 de Roche (véase la tabla 2) se enriquecieron con sangre completa con EDTA humana normal combinada en una proporción de 1:20. Por ejemplo, para preparar 1 ml de muestra de sangre completa enriquecida con VIH-1, se combinaron 50 ul de un miembro del panel con 950 ul de sangre completa humana normal (Bioreclamation IVT, n.° de cat.: HMWBEDTA2), mezclados por pipeteo. Se prepararon cuatro muestras de prueba para el intervalo dinámico en sangre completa como se muestra en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2. Muestras de prueba para el intervalo dinámico en sangre completa
Figure imgf000017_0002
Se sometieron a prueba tres réplicas en el analizador cobas® LIAT® para cada muestra. Para efectuar las pruebas en el analizador cobas® LIAT®, se mezclaron 100 ul de una muestra de sangre completa con 100 pl de tampón de dilución y, a continuación, se cargaron en un dispositivo cobas® LIAT® preenvasado con otros reactivos de ensayo envasados. El dispositivo se analizó en un analizador cobas® LIAT® y, tras la finalización del ensayo, se usaron Ct y los niveles de introducción de diana para el análisis de regresión en el intervalo dinámico. Los resultados se muestran en las figs. 3A-3B, que muestran al menos una linealidad de 4 en escala logarítmica en sangre completa y ninguna inhibición del VIH sobre el rendimiento del ensayo con patrón de cuantificación. Además, los límites de detección (LD) del ensayo en plasma frente a sangre completa se muestran en la fig. 4.
Para cada muestra de sangre de pacientes, se evaluaron las cargas víricas en plasma y sangre completa, así como se determinó la carga vírica en sangre completa después del empobrecimiento de células de anticuerpo para CD4.
Para separar plasma de sangre completa, se centrifugaron 10 ml de sangre completa en el tubo de extracción de sangre Vacutainer Lavender a 1200 g durante 10 min en una centrifugadora Sorvall a temperatura ambiente. El sobrenadante (plasma) se transfirió a un tubo de centrifugadora de 50 ml marcado. En un tubo Eppendorf, se añadieron 80 ul de tampón de dilución seguido de la adición de 100 ul de muestra de sangre completa. Antes de añadir la muestra de sangre al tubo Eppendorf, se mezcló la muestra de sangre completa invirtiendo el tubo de muestra hasta que la sangre se volviera homogénea, seguido de pipeteo 3-5 veces. La sangre y el tampón de dilución se mezclaron por pipeteo 6 veces.
Las partículas de anticuerpo para CD4 se agitaron en vórtex durante 15 segundos para resuspender las partículas y, a continuación, se añadieron veinte (20) ul de anticuerpo para CD4 con Dynabeads al tubo Eppendorf (de 100 a 500 ug, depende del tipo de partículas de anticuerpo para CD4). La mezcla se agitó en vórtex 2 veces (1 segundo/vez) para mezclar la muestra con las partículas. El tubo se carga en el rotador y se incuba a temperatura ambiente con rotación durante 10 minutos (se estableció el rotador a una inclinación de 60° y 10 rpm). El tubo se colocó en una rejilla magnética durante 1 minuto y, a continuación, todo el líquido (~200 ul) se transfirió a un dispositivo cobas® Liat®. Se logró el aislamiento de ARN y la detección de la secuencia en la muestra empobrecida en un tubo como se describe en el ejemplo 1, excepto que el tubo no incluía partículas en el segundo segmento. En cambio, el segundo segmento incluía el patrón de cuantificación.
Para cada muestra de pacientes, se cargaron 100 ul de plasma mezclado con 100 ul de tampón de dilución, 100 ul de sangre completa con EDTA mezclada con 100 ul de tampón de dilución y 100 ul de sangre completa con EDTA con empobrecimiento de células de anticuerpo para CD4 en el dispositivo cobas® LIAT® y se sometieron a prueba en un analizador cobas® LIAT®. Se obtuvieron los datos después de que terminaran las rondas de pruebas. La carga vírica de cada tipo de muestra se calculó usando ecuaciones generadas en regresión en el intervalo dinámico para plasma o sangre completa. Se evaluó la correlación en las cargas víricas entre plasma y sangre completa, o plasma y sangre completa con empobrecimiento de células CD4.
Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, una tanda de unión con partículas magnéticas para CD4 pudo empobrecer un 96 % de las células positivas para CD4 de las muestras de sangre completa no congeladas. Los resultados se muestran en la tabla 3 y las figs. 5 y 6A-6B. La fig. 5 muestra que el tratamiento de empobrecimiento de CD4 mejoró la correlación en las cargas víricas en las muestras 3 y 5. La fig. 6A muestra la correlación en las cargas víricas antes del empobrecimiento de CD4 y la fig. 6B muestra la correlación en las cargas víricas después del tratamiento.
Tabla 3. Valores de medición de la carga vírica de 5 muestras de sangre de pacientes
Figure imgf000018_0001
De las cinco muestras de pacientes sometidas a prueba, las mediciones de la carga vírica para plasma de dos muestras fueron menores que 1e3 copias/ml y la medición de la carga vírica para sangre completa directa de las dos muestras de pacientes fue mayor que 1e3 copias/ml. El pretratamiento de las dos muestras de sangre completa de pacientes con partículas de anticuerpo para CD4 mejoró la correlación en las cargas víricas para sangre completa y plasma. Tras el pretratamiento con partículas anti-CD4, la carga vírica para sangre completa de las dos mismas muestras estudiadas previamente fue menor que 1e3 copias/ml.
Ejemplo 3. Condiciones optimizadas para el empobrecimiento de CD4 en un dispositivo cobas® LIAT®
Se evaluaron diversos mecanismos de impulsión del flujo de fluido en un tubo en base al grado deseado de lisis celular. Como se describe anteriormente, en general, el flujo de fluido se controla en el dispositivo mostrado en la FIG. 1 comprimiendo segmentos seleccionados del tubo con un accionador situado en el centro y sus pinzas flanqueantes para formar un canal de flujo en el dispositivo con un espacio (es decir, el diámetro del canal de flujo) de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 um (0,001 - 0,5 mm), por ejemplo, de aproximadamente 5 a 500 um (0,005 - 0,5 mm).
Los accionadores contiguos comprimen suavemente los segmentos contiguos en comunicación líquida con el canal de flujo para generar una presión interna compensada para garantizar un espacio sustancialmente uniforme del canal de flujo. Se descubrió que el grado de lisis celular se puede modificar variando el espacio en un tramo más corto del compartimento de pretratamiento en relación con el usado para lograr la lisis celular completa. Por lo tanto, usando este procedimiento, se podría lograr el empobrecimiento de células sin lisis celular sin el uso de un filtro situado en el compartimento de pretratamiento de muestra.
Se diseñaron tres mecanismos de flujo de fluido diferentes para su uso en el compartimento de pretratamiento de muestra (es decir, la porción del dispositivo situada entre el orificio de introducción de muestra y el segmento usado para la captura de ácido nucleico):
a) flujo de fluido de lisis convencional: mezcla de baja cizalladura con lisis celular;
b) flujo de fluido de lisis severa: mezcla de alta cizalladura con lisis celular; y
c) flujo de fluido de empobrecimiento de células: mezcla de baja cizalladura sin lisis celular.
El compartimento de pretratamiento de muestra incluye una pluralidad de segmentos, por ejemplo, hasta 5 segmentos, y para la lisis convencional y la lisis severa, se usó cada uno de los segmentos del compartimento de modo que la mezcla de fluidos se realizara en la longitud completa del canal de flujo de fluido en el compartimento. Por el contrario, para lograr el empobrecimiento de células y la posterior extracción de ácido nucleico de la muestra empobrecida de células, se puede usar un subconjunto de los segmentos en el compartimento, por ejemplo, se pueden usar tan solo 3 de los 5 segmentos o hasta todos los segmentos del compartimento. Se descubrió que el mecanismo de flujo de fluido se podría realizar en menos segmentos y el diámetro del canal de flujo en y entre los segmentos durante el procedimiento de mezcla/lisis se modificó en relación con la lisis convencional y severa. Las condiciones optimizadas para la lisis convencional, la lisis severa y el empobrecimiento de células se muestran a continuación:
Tabla 4. Posición del accionador relativa, tipo de lisis y espacio del canal de flujo
Figure imgf000019_0001
Para lograr la lisis convencional (mostrada en la columna 2 de la tabla), los accionadores y pinzas se acoplaron/desacoplaron selectivamente para mover el líquido en el canal de flujo por todo el compartimento de pretratamiento. Para lograr la lisis severa, el segmento más interior del canal de flujo (P2) se mantuvo en un espacio fijo más estrecho en relación con los espacios que flanqueaban el segmento interior, sometiendo, de este modo, el fluido en ese segmento interior de la trayectoria de flujo a fuerzas de cizalladura que generaron condiciones de lisis relativamente severas. El espacio del segmento más interior se redujo sustancialmente y se mantuvo fijo en relación con el de los segmentos flanqueantes, es decir, 0,15 mm en P2 frente a hasta 3 mm en P0-P1 y P3-P4. Por el contrario, para lograr el empobrecimiento de células sin lisis celular, toda la etapa de mezcla se pudo realizar en un canal de flujo de fluido más corto que incluía menos segmentos del dispositivo (por ejemplo, P0-P2), y el segmento más interior se comprimió a un espacio de hasta 1,1 mm, que es aproximadamente un tercio del tamaño del espacio en los segmentos flanqueantes, logrando, de este modo, una mezcla suave que no da como resultado la lisis celular. En un modo de realización, el espacio se puede reducir en un 25-50 % del diámetro del canal en los segmentos flanqueantes, por ejemplo, un 33 % del diámetro.
El procedimiento se ilustra en las figs. 7A-7D. Una porción del dispositivo de procesamiento de muestras se ilustra en la fig. 7A, en la que el tubo 701 incluye un compartimento de pretratamiento de muestra 702 que comprende una pluralidad de segmentos 703-707 en comunicación fluida con el resto de los segmentos en el dispositivo de procesamiento de muestras 708. Un canal de flujo de fluido 709 atraviesa el compartimento de pretratamiento en el resto de los segmentos del dispositivo de procesamiento de muestras. Cuando los accionadores (P0-P4) y pinzas (C0-C5) en comunicación con el compartimento de pretratamiento no se acoplan con el tubo, el canal de flujo de fluido tiene un diámetro de aproximadamente 5 mm, pero cuando el tubo se sitúa en el dispositivo, los motores (no mostrados) que controlan la posición de los accionadores y pinzas impulsan los accionadores y pinzas contra las paredes exteriores del tubo, comprimiendo ligeramente el tubo, de modo que el canal de flujo de fluido tenga un diámetro de aproximadamente 3 mm, que se designa como la posición completamente abierta del compartimento. La fig. 7B muestra las dimensiones relativas del canal de flujo de fluido durante la lisis convencional; el canal de flujo de fluido atraviesa P0-P5 y el canal tiene un diámetro de hasta 3 mm. La fig. 7C muestra las dimensiones relativas del canal de flujo de fluido durante la lisis severa; el canal de flujo de fluido atraviesa P0-P5, con el segmento más interior, P2, reducido a un diámetro de hasta 0,15 mm. Por lo tanto, durante la lisis severa, el flujo de fluido se somete a presión alta en P2 en relación con los segmentos flanqueantes, lo que introduce altas fuerzas de cizalladura que dan lugar a la lisis celular severa.
Por el contrario, la fig. 7D muestra las dimensiones relativas del canal de flujo de fluido durante el empobrecimiento de células; el canal de flujo de fluido atraviesa P0-P2, reduciéndose el diámetro del canal en el segmento más interior, P1, de hasta 3 mm (en P0 y P2) a hasta 1,1 mm. El canal más interior no se comprime en el mismo grado que durante la lisis severa, lo que da como resultado un ciclo de mezcla más suave que no lisa las células en el fluido.
Además del mecanismo de flujo de fluido alterado, se ajustó la velocidad de los motores conectados de forma funcional con cada uno de los accionadores y pinzas para evitar la lisis celular durante el empobrecimiento de células. Durante la lisis convencional y severa, cada uno de los motores acoplados con los accionadores y pinzas se acopla y desacopla rápidamente con los accionadores y pinzas a la misma velocidad. Sin embargo, para lograr el empobrecimiento de células sin lisis celular, la velocidad del motor durante el desacoplamiento se ajustó de modo que el motor se desacelere logarítmicamente en relación con la tasa de aceleración. Esto se ilustra en las figs. 8A-8B, en las que la fig. 8A muestra el movimiento del motor durante la lisis convencional y severa y la fig. 8B muestra el movimiento del motor durante el empobrecimiento de células.
Los procedimientos descritos en el presente documento y en el ejemplo 1 se usaron para evaluar la carga vírica de muestras de pacientes en un dispositivo de procesamiento de muestras y los resultados se muestran a continuación:
Tabla 5. Pruebas de carga vírica en un dispositivo configurado para realizar el empobrecimiento de células
Figure imgf000020_0001
Los resultados mostrados en la tabla 5 son similares a los logrados usando el procesamiento sin conexión, descrito en el ejemplo 2.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de realización de un análisis cuantitativo de una muestra de sangre completa para determinar la carga vírica o tumoral, en el que dicha muestra de sangre completa comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie celular para un virus o tumor, comprendiendo dicho procedimiento
a. añadir dicha muestra de sangre completa a un dispositivo que comprende un tubo que define un canal de flujo de fluido que comprende, situado en el mismo, un primer conjunto de segmentos que forman un compartimento de pretratamiento de muestra y un segundo conjunto de segmentos, comprendiendo dicho compartimento de pretratamiento de muestra en uno o más segmentos de dicho primer conjunto de segmentos una superficie que incluye anticuerpos anti marcador de superficie celular inmovilizados y en el que dicho compartimento de pretratamiento de muestra no incluye un filtro;
b. mezclar, dentro del compartimento de pretratamiento de muestra, dicha superficie y muestra en dicho dispositivo para formar una muestra empobrecida, en el que dicha muestra empobrecida comprende < 5 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular y dicha etapa de mezcla se realiza sin un filtro en el canal de flujo y en condiciones que no lisan las células en dicha muestra; y
c. medir, en dicho dispositivo, la carga vírica o tumoral en dicha muestra empobrecida usando una técnica de amplificación de ácido nucleico,
en el que dicho dispositivo comprende además una pluralidad de miembros de compresión conectados de forma funcional con dicho primer y segundo conjunto de segmentos;
en el que dicho primer conjunto de segmentos que forman el compartimento de pretratamiento de muestra situado dentro del canal de flujo de fluido comprende, desde un extremo proximal a uno distal, un primer segmento flanqueante, un segmento interior y un segundo segmento flanqueante, y dicha etapa de mezcla comprende comprimir selectivamente uno o más segmentos de dicho compartimento de pretratamiento de muestra por al menos un miembro de compresión de dicha pluralidad de miembros de compresión para formar un canal de flujo en el compartimento de pretratamiento de muestra de modo que el diámetro del canal de flujo en el segmento interior sea menor que el diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes; y
en el que dicho dispositivo comprende un segundo conjunto de segmentos en dicho canal de flujo de fluido que define una región de análisis de ácido nucleico contigua a dicho compartimento de pretratamiento de muestra, comprendiendo dicha región de análisis de ácido nucleico uno o más segmentos adicionales, cada uno configurado para realizar una o más etapas de un análisis de ácido nucleico, que comprende preparación de reactivos, enriquecimiento de dianas, retirada de inhibidores, extracción, amplificación y detección en tiempo real de ácido nucleico.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de entre un 25-50 % del diámetro del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes.
3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de aproximadamente un 33 % del diámetro del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha superficie comprendida en dicho compartimento de pretratamiento de muestra incluye microesferas, partículas o una pared interior de dicho compartimento de pretratamiento.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra empobrecida comprende < 2,5 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha muestra empobrecida comprende < 1 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además separar, en dicho dispositivo, dicha muestra empobrecida de la superficie inmovilizada con células de marcador de superficie celular tras la etapa (b).
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho marcador de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD4, CD45, beta-microglobulina o mezclas de los mismos.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha medición de la carga vírica o tumoral se relaciona linealmente con una medición de la carga vírica o tumoral, respectivamente, en una muestra de plasma tomada de un paciente que proporciona dicha muestra de sangre completa.
10. Un dispositivo configurado para realizar un análisis por PCR cuantitativo de una o más secuencias de oligonucleótidos diana víricos o tumorales en una muestra de sangre completa que comprende una pluralidad de células que incluyen un marcador de superficie celular para un virus o tumor, comprendiendo dicho dispositivo un tubo que define un canal de flujo de fluido y una pluralidad de segmentos situados en el mismo, incluyendo dicho dispositivo
a. un primer conjunto de segmentos en dicho canal de flujo de fluido que define un compartimento de pretratamiento de muestra para generar una muestra empobrecida a partir de dicha muestra de sangre completa que comprende, desde un extremo proximal a uno distal, un primer segmento flanqueante, un segmento interior y un segundo segmento flanqueante, y anticuerpos anti marcador de superficie celular inmovilizados sobre una superficie en uno o más de dichos segmentos, en el que dicho compartimento de pretratamiento de muestra no incluye un filtro;
b. un segundo conjunto de segmentos en dicho canal de flujo de fluido configurado para realizar el análisis por PCR cuantitativo definiendo una región de análisis por PCR contigua a dicho compartimento de pretratamiento de muestra para realizar el análisis por PCR cuantitativo usando la muestra empobrecida generada en el compartimento de pretratamiento de muestra, comprendiendo dicha región de análisis por PCR uno o más segmentos adicionales, cada uno configurado para realizar una o más etapas de dicho análisis por PCR, que comprende preparación de reactivos, enriquecimiento de dianas, retirada de inhibidores, extracción, amplificación y detección en tiempo real de ácido nucleico; y
c. una pluralidad de miembros de compresión conectados de forma funcional con dicha pluralidad de segmentos y configurados para comprimir selectivamente uno o más segmentos de dicho compartimento de pretratamiento de muestra para formar un canal de flujo en el compartimento de pretratamiento de muestra de modo que el diámetro del canal de flujo en el segmento interior sea menor que el diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes;
en el que dicho dispositivo está configurado para generar una muestra empobrecida sometiendo el compartimento de pretratamiento de muestra a condiciones suficientes para formar, a partir de una muestra de sangre completa, una muestra empobrecida, mientras que dicha superficie comprende células de marcador de superficie celular inmovilizadas, de modo que la muestra empobrecida comprenda < 5 % de células que incluyen dicho marcador de superficie celular.
11. El dispositivo de la reivindicación 10, en el que dicho diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de entre un 25-50 % del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes.
12. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que dicho diámetro del canal de flujo en el segmento interior es de aproximadamente un 33 % del diámetro del canal de flujo en los primer y segundo segmentos flanqueantes.
13. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicho dispositivo tiene un límite de detección de < 100 copias/ml de virus o tumor.
14. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho marcador de superficie celular se selecciona del grupo que consiste en CD4, CD45, beta-microglobulina o mezclas de los mismos.
15. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que dicha superficie en uno o más de dichos segmentos de dicho compartimento de pretratamiento de muestra incluye microesferas, partículas o una pared interior de dicho compartimento de pretratamiento.
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