JP2019516377A - 試料処理デバイス内での細胞表面マーカーの枯渇 - Google Patents
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Abstract
Description
a)全血試料を試料前処理室に加えること、
b)試料中の細胞を溶解させない条件下で表面及び試料を混合するのに十分な条件で試料前処理室を処理して、ウイルス又は腫瘍細胞表面マーカーを含有する5%未満の細胞を含む枯渇試料、及び細胞表面マーカーの細胞結合表面を生成すること、
c)枯渇試料を表面から分離すること、
d)枯渇試料をデバイス内の試料前処理室から核酸分析領域に移すこと、
e)デバイス内で枯渇試料の核酸分析を実施すること、及び
f)枯渇試料中の1つ以上の標的オリゴヌクレオチドをデバイス内で検出すること、かつ
g)検出工程f)に基づいてウイルス量又は腫瘍量を計算することを含む。
a)全血試料を試料前処理室に加えること、
b)試料中の細胞を溶解させない条件下で表面及び試料を混合するのに十分な条件で試料前処理室を処理して、ウイルス細胞表面マーカーを含有する5%未満の細胞を含む枯渇試料及び細胞表面マーカーの細胞結合表面を生成すること、
c)枯渇試料を表面から分離すること、
d)枯渇試料をデバイス内の試料前処理室から核酸分析領域に移すこと、
e)前記デバイス内で枯渇試料の核酸分析を実施すること、及び
f)枯渇試料中の1つ以上のウイルス標的オリゴヌクレオチドをデバイス内で検出すること、かつ
g)検出工程f)に基づいてウイルス量を計算することを含む。
a)全血試料を試料前処理室に加えること、
b)試料中の細胞を溶解させない条件下で表面及び試料を混合するのに十分な条件で試料前処理室を処理して、ウイルス細胞表面マーカーを含有する5%未満の細胞を含む枯渇試料及び細胞表面マーカーの細胞結合表面を生成すること、
c)枯渇試料を表面から分離すること、
d)枯渇試料をデバイス内の試料前処理室から核酸分析領域に移すこと、
e)デバイス内で枯渇試料の核酸分析を実施すること、及び
f)枯渇試料中の1つ以上の腫瘍標的オリゴヌクレオチドをデバイス内で検出すること、かつ
g)検出工程f)に基づいてウイルス量を計算することを含む。
本明細書において他に定義のない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を持つものとする。さらに、文脈によって特に要求のない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数も含むものとする。「a」及び「an」の冠詞は、本明細書では、その冠詞の文法的な対象である1つ又は1つより多い(すなわち、少なくとも1つ)ことを指すように使用される。例として、「要素(an element)」は、1つの要素又は2つ以上の要素を意味する。
方法
a)固定された抗細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含むデバイスに全血試料を加える工程、
b)試料中の細胞を溶解させない条件で表面及び試料をデバイス内で混合して、細胞表面マーカーを含有する5%未満の細胞を含む枯渇試料を生成する工程、及び
c)枯渇試料中の標的核酸配列の量をデバイス内で測定する工程
を含む。
本明細書に記載の方法は、核酸増幅技術を実施する試料処理デバイス内で実行される。生体試料から抽出された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写媒介増幅(TMA)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、及び鎖置換増幅反応(SDAR)の典型的な手法のうちの少なくとも一つを使用する核酸の増幅によって、さらに処理されてもよい。いくつかの態様において、生物から抽出された核酸は、リボ核酸(RNA)であり、それらの処理は、TthポリメラーゼとTaqポリメラーゼ又は逆転写酵素とTaqポリメラーゼなどの酵素の組合せを用いる結合型逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を含んでもよい。いくつかの態様において、刻み目付き環状核酸プローブは、T4DNAリガーゼ又はAmpligaseTMを用いて環状化でき、DNA標的やRNA標的のような核酸を誘導でき、続いて体外での選択工程後に閉環状プローブの生成を検出する。この検出は、当業者に周知の酵素を用いてPCR、TMA、RCA、LCR、NASBA又はSDARを介して実施できる。典型的な態様において、核酸の増幅は、核酸増幅中の蛍光の増大を検出する蛍光標識核酸プローブ又はDNA挿入色素、ならびに分子分析器内の光度計又は電荷結合デバイスを使用して即時に検出することができる。これらの蛍光標識されたプローブは、当業者に周知の検出方式(すなわち、TaqManTM、molecular beaconsTM、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)プローブ、scorpionTMプローブ)を使用し、蛍光の消光ならびに消光時の放出、又は一方のレポーターから他方のレポーターへの蛍光エネルギー移動を通常は使用して、特定の核酸の合成又は存在を検出する。
いくつかの態様において、本開示の方法を実施する試薬、材料、及びデバイスが、キット内に含まれる。いくつかの態様において、このキットは、試料を入手し、保存し、及び/又は調製する構成要素を含む。この構成要素には、例えば、無菌針及びシリンジ、枯渇モジュール、EDTA被覆チューブ、(例えば、核酸を基質に結合させ、基質から溶出する)緩衝液、RNA分解酵素阻害剤、及び/又はDNA分解酵素などが含まれる。
RNA単離及びRNA配列検出は、管1(図1)内で実施でき、この管は、剥離可能なシールによって分離され、予め充填された試薬を含む9つの区画を備える可撓性デバイス、及びその内部に収容された廃物貯蔵部を備えるキャップを含む。デバイスの1つの区画又は副区画から他の区画又は副区画への流体の流れは、デバイスの1つ以上の区画又は副区画内に動作可能に接続された1つ以上のアクチュエータ及び締め具の選択的な係合によって本明細書に記載されるように制御される。このデバイスの第1の区画は、全血試料を受入れることができる。第2の区画は、100μLのリン酸緩衝食塩水(PBS)(137mMのNaCl、2.7mMのKCl、4.3mMのNa2HPO4、1.4mMのKH2PO4、pH7.3)を含む希釈緩衝液中に懸濁した抗CD4抗体に結合した560μgのDynal ParticlesTM(Dynal Biotech)を含有する。第3の区画は、定量標準を含有する。第4の区画は、2つの副区画に分割され、第1の副区画は200μgのタンパク質分解酵素Kを含み、第2の副区画は250μgのシリカ磁性粒子を含み、これら副区画は剥離可能なシールによって分離されている。第5の区画は、4.7Mの塩酸グアニジニウムを含有するカオトロピック塩、10mMの尿素、10mMのトリス塩酸、pH5.7、及び2%のトリトンX−100を含む200μLの溶解緩衝液を含有する。第6の区画は、(例えば、50%エタノール、20mMのNaCl、10mMのトリス塩酸、pH7.5を含む)80μLの洗浄緩衝液を含有する。第7の区画は、80μLの20mMの2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝液をpH5.3で含有する。MES緩衝液は、粒子からのDNA溶出を回避するのに十分な低いpHに調整される。第8の区画は、40μLの溶出緩衝液(例えば、10mMのトリス塩酸、pH8.5、又はPCRに適した任意の緩衝液)を含有する。溶出緩衝液は、粒子の表面から緩衝液中にDNAを溶出させるのに十分な高いpHに調整される。第9の区画は、PCR試薬を含有する(その試薬は、それぞれ10nmolのdATP、dCTP及びdGTP、20nmolのdUTP、2.5mmolのKCl、200nmolのMgCl2、1〜5単位のTaqDNAポリメラーゼ、1〜5単位のTthDNAポリメラーゼ、それぞれ20〜100pmolの各オリゴヌクレオチドプライマー、及び6〜25pmolのTaqManプローブ)。第10の区画は、MgCl2などの二価の金属補因子を含んでもよい。第9(又は第10)の区画の端部は、増幅反応の生成物を回収するために恒久的に密封され、又は圧力ゲートを備えて、DNA配列決定又は当業者に周知のいくつかの他の試験による遺伝子型判定試験の結果を確認する。
(a)細胞の枯渇及び試料の溶解: 第1の締め具を除くすべての締め具を、デバイスの上から閉じる。第1の区画に作動可能に接続されたアクチュエータを、血液量を調節するように使用し、区画内に約100μLを保持し、次いで第1の区画を対応する区画締め具を用いて閉じる。第2の区画に動作可能に接続されたアクチュエータは、全体的に又は部分的に、第2の区画の第1の副区画を圧縮して第1、第2及び第3の区画間の剥離可能なシールを破壊し、抗CD4粒子を試料及び定量標準と混合する。第1の副区画に動作可能に接続されたアクチュエータを、この副区画を交互に圧縮して、粒子を試料と混合できる。次に第3の区画の近傍の磁気源によって磁場を発生させて粒子を捕捉できる。その区画/副区画内の対応するアクチュエータ及び締め具を係合させて、細胞枯渇試料を第4の区画に移動させ、第4の区画上の締め具を閉じて、枯渇細胞が下流の枯渇試料と混合しないようにし、次に第5の区画に移動させて溶解緩衝液と細胞枯渇試料とを混合する。第4及び第5の区画内の混合物を50℃で2分間培養する。
(b)核酸捕捉: 溶解液の培養後に、アクチュエータは、それらの各区画を交互に圧縮し、混合物を攪拌しかつ室温で2分間培養して粒子へのDNA結合を促進する。次いで、磁場が区画の近傍の磁気源によって形成され、懸濁液中の粒子を捕捉する。アクチュエータは、それらの区画を交互に圧縮して粒子を捕捉できる。アクチュエータ及び締め具は、未結合試料及び廃物を廃物貯蔵部に移動するように順次開閉される。
(c)洗浄; 捕捉行程に続いて、洗浄工程が、さらなる試料処理に使用される粒子及び区画から、残留かす及び反応阻害剤を除去するために実施される。希釈に基づく洗浄はエタノール洗浄緩衝剤と共に使用され、流動に基づく洗浄はMES洗浄緩衝液と共に使用される。締め具とアクチュエータがまず開いて、次にアクチュエータが閉じてエタノール緩衝液を第6の区画に移動させ、続いて締め具が閉じる。アクチュエータ及び少なくとも1つの隣接するアクチュエータを、磁場はかけずにそれらの各区画に対して交互に圧縮して、粒子を再懸濁する流れを生成する。その後、磁場をかけて実質的に全ての粒子を捕捉し、液体を廃物貯蔵部に移動させる。最初の洗浄が完了した後に、MES洗浄緩衝液をある区画から別の区画に移動させ、対応するアクチュエーター及び締め具を順次適用及び解放しその緩衝液を操作して、流路を通る洗浄緩衝液を本質的に層流とすることを確実にする。洗浄が完了すると、アクチュエータ及び締め具を閉じ、実質的にすべての廃物を廃物貯蔵部に移動させる。
(d)核酸溶出: 前述と類似の工程を用いて、溶出緩衝液を第の8区画から移動させる。磁場をかけずに、粒子を第4及び第5の区画間の流動下で溶出緩衝液中に再懸濁する。粒子懸濁液を、定常流又は攪拌条件で95℃で2分間培養する。磁場をかけて、実質的に全ての粒子を固定化し、アクチュエータ及び締め具を順次開閉して、溶出した核酸溶液を第8の区画に移動する。アクチュエータは、第8の区画を圧縮して、溶出された核酸溶液の容量を40μLに調整し、次に締め具をデバイスに対し閉じてDNA抽出工程を完了する。
(e)核酸増幅及び検出: 次に核酸溶液を第9の区画に移し、混合し、UNG280と共に37℃で1分間培養して、生体試料中に存在していた可能性がある任意の汚染PCR産物を分解できる。培養後に、温度を95℃に上げて、核酸及びUNGを2分間で変性させてもよい。その後、核酸溶液を第10の区画に移し、65℃で10分間RT−PCR試薬と混合し、続いて60℃で培養してホットスタートPCRを開始することができる。95℃で2秒間及び60℃で15秒間の50サイクルによる典型的な二温度増幅分析は、第8の区画を95℃に第9の区画を60℃に設定し、かつ関連のアクチュエータを開閉して区画間で反応混合物を交互に移動させることにより実施される。95℃で2秒間、60℃で10秒間、72℃で10秒間の50サイクルによる典型的な三温度増幅分析は、第8の区画を95℃に、第9の区画を72℃に、第10の区画を60℃に設定し、かつ関連のアクチュエータを開閉して区画間で反応混合物を交互に移動させることにより実施される。第9の区画に光学的に接続された光度計のような検出センサは、デバイス壁の一部を通してレポーター色素からの即時蛍光発光を監視することができる。分析の完了後に、試験結果が報告される。
ロッシュのコバスLiat(登録商標)6800/8800HIV定量較正パネルを用いて、血漿のダイナミックレンジを決定した。パネル成分は、以下の表1に提供される。
所望の細胞溶解度に基づいて、管内での種々の流体の流動駆動機構を評価した。上述のように、通常は図1に示すデバイスでは、流体の流動は、中央に配置されたアクチュエータ及びそれに隣接する締め具を用いて管の所定の区画を圧縮して制御されて、約1〜約500μm(0.001〜0.5mm)、例えば約5〜500μm(0.005〜0.5mm)の間隙(すなわち流路の直径)を持つ流路をデバイス内に形成する。隣接するアクチュエータは、流路と液体連通する隣接区画を穏やかに圧縮し、ずれた内圧を生成流路に形成して、実質的に均一な流路の間隙を確保する。細胞溶解の程度は、完全な細胞溶解を達成するのに使用された範囲に対して、前処理区画のより短い範囲にわたって間隙を変化させて変更できることが見出された。したがって、この方法を使用して、細胞前処理区画に配置されるフィルターを使用せずとも、細胞溶解の無い細胞枯渇を達成することができた。
a)通常の溶解の流体流動(細胞溶解を伴う低剪断の混合)、
b)激しい溶解の流体流動(細胞溶解を伴う高剪断の混合)、及び
c)細胞枯渇の流体流動(細胞溶解を伴わない低剪断の混合)
Claims (15)
- ウイルス量又は腫瘍量について全血試料の定量分析を実施する方法であって、前記全血試料がウイルス又は腫瘍についての細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含み、ここで前記方法が、
a)固定された抗細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含む流体流路を規定する管を含むデバイスに前記全血試料を加えること、
b)前記表面と前記試料を前記デバイス内で混合して枯渇試料を生成し、ここで前記枯渇試料が、前記細胞表面マーカーを含有する5%未満の細胞を含み、そして混合工程が、前記流路中にフィルターを伴わず、かつ前記試料中の細胞を溶解させない条件で行われ、及び
c)前記枯渇試料中のウイルス量又は腫瘍量を前記デバイス内で測定すること、
を含む、前記方法。 - 前記デバイスは、その内部に配置された試料前処理室を含み、
前記試料前処理室は、近位端から遠位端にわたって第1の隣接区画、内部区画、及び第2の隣接区画を含み、
前記混合工程は、前記試料前処理室の1つ以上の区画を選択的に圧縮して、前記内部区画の流路の直径が前記第1及び第2の隣接区画の流路の直径よりも小さくなるように前記試料前処理室内に流路を形成することを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記内部区画の流路の直径は、前記第1及び第2の隣接区画の流路の直径の25〜50%である、請求項2に記載の方法。
- 前記内部区画の流路の直径は、前記第1及び第2の隣接区画の流路の直径の約33%である、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記デバイスは試料前処理室を含み、前記表面は前記前処理室の内壁である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記枯渇試料は、前記細胞表面マーカーを含有する2.5%未満の細胞を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記枯渇試料は、前記細胞表面マーカーを含有する1%未満の細胞を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)に続いて、細胞表面マーカー細胞が固定された表面から前記枯渇試料を前記デバイス内で分離することをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞表面マーカーは、CD4、CD45、βミクログロブリン、又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ウイルス量又は腫瘍量の測定値は、前記全血試料を提供する患者から採取した血漿試料中のウイルス量又は腫瘍量の測定値に対しそれぞれ直線関係にある、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルス又は腫瘍についての細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含む全血試料中の1つ以上のウイルス又は腫瘍の標的オリゴヌクレオチド配列のPCR定量分析を実施するように構成されたデバイスであって、当該デバイスが、流体流路及びその内部に配置された複数の区画を規定する管を含み、当該デバイスが、
a)近位端から遠位端にわたって第1の隣接区画、内部区画、及び第2の隣接区画を含み、1つ以上の前記区画内に固定された抗細胞表面マーカー抗体を含み、かつフィルターを含まない試料前処理室を規定する前記流体流路内の第1の組の区画、
b)前記試料前処理室に隣接し、かつ各々が試薬調製、標的濃縮、阻害剤除去、核酸抽出、増幅及び即時検出を含む前記PCR定量分析のうちの1つ以上の工程を実施する1つ以上の追加の区画を含むPCR分析領域を規定する前記流体流路内の第2の組の区画、及び
c)前記複数の区画に動作可能に接続され、かつ前記試料前処理室の1つ以上の区画を選択的に圧縮して、前記内部区画の流路の直径が前記第1及び第2の隣接区画の流路の直径よりも小さくなるように前記試料前処理室内に流路を形成する複数の圧縮部材を含み、
前記細胞表面マーカーを含有する5%未満の細胞を含む前記試料前処理室内で枯渇試料を生成するようになっている、前記デバイス。 - 前記内部区画の流路の直径は、前記第1及び第2の隣接区画の流路の直径の25〜50%である、請求項11に記載のデバイス。
- 前記内部区画の流路の直径は、前記第1及び第2の隣接区画の流路の直径の約33%である、請求項11又は12に記載のデバイス。
- ウイルス又は腫瘍の100コピー/mL未満の検出限界を有する、請求項11〜13のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記細胞表面マーカーは、CD4、CD45、βミクログロブリン、又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項11〜14のいずれか1項に記載のデバイス。
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