CN103282511A - 阴道加特纳菌测定 - Google Patents

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CN103282511A CN2011800605314A CN201180060531A CN103282511A CN 103282511 A CN103282511 A CN 103282511A CN 2011800605314 A CN2011800605314 A CN 2011800605314A CN 201180060531 A CN201180060531 A CN 201180060531A CN 103282511 A CN103282511 A CN 103282511A
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Abstract

本发明涉及用于检测阴道加特纳菌的核酸序列的核酸扩增测定。本发明提供了与GV的vly基因的核酸序列互补或退火的寡核苷酸。本发明还提供了可用于核酸扩增反应的内部扩增对照(IAC)。

Description

阴道加特纳菌测定
相关申请的交叉参考
本申请要求2010年11月1日提交的美国临时专利申请号61/408,840的提交日期的利益，将所述临时专利申请的公开内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包括已通过EFS-Web以ASCII格式提交并且通过引用整体并入本文的序列表。2011年10月19日创建的所述ASCII拷贝称为Gardnerella vaginalis_ST25.txt的序列表并且大小为15.6千字节。
发明领域
本发明涉及用于检测和/或定量阴道加特纳菌（Gardnerellavaginalis）(在本文中也称为GV)的核酸序列的核酸扩增法。本发明提供了用于扩增和/或检测阴道加特纳菌的、与阴道加特纳菌的核酸序列互补或与其退火的寡核苷酸。本发明提供了用于扩增和/或检测阴道加特纳菌核酸序列的链置换扩增（SDA）测定或PCR测定。SDA测定可任选地是包括内部扩增对照(IAC)的双重SDA。
发明背景
阴道加特纳菌(GV)是革兰氏可变的球杆菌，其已经讨论为非特异性阴道炎的唯一诱因剂。Kretzschmar U,等人"Purification andCharacterization of Gardnerella vaginalis Hemolysin Curr.Microbiol.23(1):713(1991)。该生物体的诊断和检测通常基于病理学或临床发现并且可通过分离和染色技术来确认。例如，在Kretzschmar等人中，GV的检测和表征的基础是由该生物体产生的细胞外溶血素。GelberS.,等人"Functional and Phylogenetic Characterization ofVaginolysin,the Human Specific cytolysin from Gardnerellavaginalis"J.Bacteriol.190(11):38963903(2008)将由GV产生的另一种细胞外溶血素鉴定为vaginolysin。Rottini,G.,等人"Identificationand Partial Characterization of a Cytolytic Toxin Produced byGardnerella vaginalis”Infect.and Immun.58(11):37513758(1990)将由GV产生的溶血素鉴定为溶细胞素（cytolysin）。分离由GV产生的这些毒素的困难描述于Cuaci S,等人"Pore forming andhaemolytic properties of the Gardnerella vaginalis cytolysin,”Mole.Microbio.9(6):11431155(1993)中。
关于GV产生的毒素的测量和检测（以检测GV）已写了许多。然而，基于生物体本身（而不是其产生的毒素）来检测GV的方法仍被继续寻求。因此，存在对减少假阴性结果的可能性的测定的需要。
本文中的参考资料的引用或论述不应当被解释为这是本发明的现有技术水平的承认。
发明概述
本文中描述了用于定性和/或定量检测阴道加特纳菌在样品中的存在或不存在的方法，所述方法包括:(a)使用具有基本上由本文中公开的任何扩增引物的靶结合序列组成的序列的第一扩增引物扩增靶序列和(b)检测扩增的靶序列。在某些实施方案中，还描述了基本上由本文中公开的任何扩增引物的靶结合序列组成的第二扩增引物的用途。
本文中描述的寡核苷酸可用于通过选择扩增的在产生毒素vaginolysin和溶细胞素/溶血素的基因中发现的核酸序列而检测GV的存在。在这一点上，本发明人已决定将该靶称为vly基因。然而，文献还提及GV的溶细胞素基因和溶血素基因。无论这些基因是不同的基因还是仅仅为同一基因的不同名称，对于本文中描述的发明并不重要。虽然靶序列在本文中被称为"vly基因"或"vly靶"，但其就是靶本身(即产生上述毒素之一的基因)，而不是作为本发明的焦点的基因靶的名称。虽然申请人不希望受具体理论束缚，但申请人相信这些毒素全都由同一基因产生。然而，本发明不限于靶序列所位于的GV基因的名称。
在一个实施方案中，本文中公开了用于检测阴道加特纳菌靶序列的方法。在该方法中，提供了至少一种将扩增GV的vly基因的至少一部分的寡核苷酸引物，在扩增后，扩增的靶序列被检测。GV的vly基因的实例包括SEQ ID NO.1、2、23、24和25。
已鉴定了vly基因的高度保守的区域。高度保守的序列位于vly基因上的大致碱基对328-523之间(对于本文中描述的菌株14018、14019和49145)。在优选实施方案中，靶序列是vly基因的高度保守区域。
菌株14018、14019和49145的高度保守的靶vly基因(对应于各自的Genbank登录号EU522486、EU522487和EU522488)是SEQ IDNO.1、23和24。SEQ ID NO.2和25是两个克隆(分别为T10和T11)的高度保守的靶vly基因。所述克隆具有Genbank登录号EU697811和EU697812。克隆中高度保守的区域的位置大致位于碱基对331-526。vly基因在所述菌株和克隆间是高度保守的，但在菌株与克隆之间存在变异。
在vly基因内，存在本身是高度保守的有利的靶区域。一个这样的靶区域显示于图1中并且也被鉴定为SEQ ID NO.20。SEQ ID NO.20是SEQ ID NO.1的碱基对325-524。在vly的3个菌株之间，在SEQID NO.20中不存在变异。然而，图1显示在GV的菌株与克隆之间在该靶区域中存在少量序列变异。虽然序列对于所有3个菌株是相同的，但在图1中显示了每一个菌株的序列（作为100、110和120)。SEQ ID NO.21是两个克隆(T10和T11)的靶区域的序列并且对于两个克隆的每一个是相同的。然而，在SEQ ID NO.20与SEQ ID NO.21之间存在一些小的差异。在图1的130和140上显示了SEQ ID NO.21的这些变异(相对于SEQ ID NO.20)。变异非常小：来自有利的靶序列的196个碱基对的7个碱基对。同样地，对于所有序列在相同位置中存在变异。本领域技术人员可设计不与在其中发现变异的靶区域上的位置对齐的引物和探针。
如图1中指出的，vly基因的高度保守的靶区域对于上述鉴定的各菌株和克隆是大体上相同的。在图1中仅显示了靶区域的有义链。因为反义链是有义链的互补链，因此反义链，虽然未在图1中明确地显示，但可从图1中所列的序列获知。图1中的序列比SEQ ID NO.20和21长4个核苷酸，但其它方面相同。图1中提供了另外的核苷酸以更清楚地显示引物与靶序列的末端上的靶之间的关系。
本文中描述了被设计来选择该高度保守区域和提供用于检测的机制的寡核苷酸探针组。探针组的设计基于许多因素，其中最主要的是其中使用该探针组的测定。用于检测DNA或RNA序列的测定在本领域是公知的。这些测定通常使用一些类型的扩增或一些类型的成像来确认靶DNA的存在。扩增反应的实例包括PCR(聚合酶链式反应)、SDA(链置换扩增)、TMA(转录介导的扩增)和LCR(连接酶链式反应)。
在一个实施方案中，选择用于检测的扩增机制是SDA。SDA是等温扩增机制，因此不包括热循环。这样，针对预定的窄范围内的靶解链温度(Tm)设计SDA探针组。靶解链温(Tm)是至少50%的寡核苷酸与其完全互补序列退火时的温度。本领域技术人员知道寡核苷酸序列的Tm由序列中的碱基对数目以及序列中碱基的类型决定。这些用于设计寡核苷酸的指导方针对于本领域技术人员来说是公知的并且未详细地示于本文中。
在本发明的一个实施方案中，用于SDA测定的引物和探针的部分与SEQ ID NO.20所示的vly基因的靶区域互补。首先使靶变性。探针组构造为：使正向引物和探针结合（即与……互补）变性的靶的反义链，并且使反向引物结合所述变性的靶的有义链。SDA探针组的一个实施方案的结合靶的引物和探针的部分以及它们在vly基因的高度保守的部分上的位置列于下列表1中。由于vly基因的高度保守区域对于GV的各种菌株实际上是相同的，因此未单独地列出每一个菌株或克隆的vly基因的高度保守区域。
本文中描述的寡核苷酸SDA引物/探针组与基因的这些部分充分互补以选择性结合这些部分。
表1:SDA引物和探针组的靶结合序列
Figure 2011800605314A00800011
*GenBank登录号EU522486
对于本文中描述的SDA实施方案，寡核苷酸探针组具有左和右缓冲引物（bumper primer）、左和右扩增引物以及探针。如上文中指出的，左或正向引物及探针结合vly基因的反义链，反向或右引物结合有义链。因此，这些引物和探针所结合的vly基因的部分与靶结合序列SEQ ID NO.3-7充分互补以促进引物和探针对其的杂交。
引物和探针可具有与其连接的另外的核苷酸或序列。探针还具有附着至其的另外的成像部分。这些部分有利于靶DNA序列的检测。通过使用这样的寡核苷酸探针组，可对样品进行SDA测定以确定大部分GV菌株的存在或不存在。在一个示例性实施方案中，扩增vly基因的大致碱基对343至大致碱基对486上的vly基因的部分之间的vly基因的大致144个碱基对的区域。
本发明的其它实施方案使用不同的结合上述vly基因区域的寡核苷酸序列。引物/探针组被构造为不仅在vly基因的该区域中选择性结合而且还扩增vly基因序列的一些部分以进行检测。本文中描述的寡核苷酸具有与变性的靶核酸序列的有义或反义链充分互补的序列以使其能够结合靶。还可单独地或组合地使用本文中描述的寡核苷酸以辅助通过扩增vly基因核酸序列来进行检测。在一个实施方案中，探针被设计为对基因的靶部分进行
Figure BDA00003351512500061
实时PCR测定。用于实时PCR测定的两个探针组的实例（以其寡核苷酸序列方式描述的）是:
表2:用于定量实时PCR的引物/探针组
Figure 2011800605314A00800023
*登录号EU522486
在PCR测定中，正向引物和探针与靶核酸的反义链充分互补，从而与其杂交（在适当的条件下），反向引物与靶核酸的有义链充分互补，从而与其杂交(在适当的条件下)。图2显示了表2中描述的引物和探针相对于靶序列的有义链的结合位置（序列的加框部分指示与框结合的特定引物/探针的位置）。
在另一个实施方案中，寡核苷酸可用于用于检测GV在样品中的存在或不存在的方法。在其它实施方案中，方法包括使用一个或多个特异于靶序列的寡核苷酸在核酸扩增反应中处理样品，和检测扩增的核酸产物的存在或不存在。
在一个示例性实施方案中，选择SDA作为扩增反应。在该实施方案的情况中，在SDA测定中将本文中描述的适用于SDA测定的寡核苷酸组合地用作扩增引物、缓冲引物和检测剂。
在另一个实施方案中，提供了用于检测GV的试剂盒。试剂盒包含本文中描述的寡核苷酸的一种或多种，所述寡核苷酸选择性结合GV的vly基因并且能够扩增可用于检测该生物体的靶序列。提供了具有一种或多种用于进行扩增测定的寡核苷酸和缓冲剂的试剂盒。
在试剂盒的一个方面，提供了为了SDA的目的的寡核苷酸和试剂。在这方面，提供了两种寡核苷酸作为扩增引物，提供了两种寡核苷酸作为缓冲引物以及提供了一种寡核苷酸用作检测剂。
在试剂的另一方面，可以以干燥或液体形式提供用于SDA目的的寡核苷酸。在干燥形式中，可将成分用于其中可添加样品和适当的SDA缓冲剂以进行测定的适当的容器。
在试剂盒的另一个方面，可提供为了Taqman PCR目的的寡核苷酸和试剂。在这方面，提供了3种寡核苷酸。所述3种寡核苷酸中的两种是扩增引物并且第三种寡核苷酸被构造为检测剂。
在示例性实施方案中，用于扩增或检测反应的试剂盒具有寡核苷酸，所述寡核苷酸具有靶结合序列，所述靶结合序列为SEQ ID NO:3至13之任一项及其互补序列，和与SEQ ID NO.3至13共有至少70%序列相似性的序列及其互补序列。在其它实施方案中，试剂盒具有寡核苷酸，所述寡核苷酸具有靶结合序列，所述靶结合序列为SEQ IDNO:3至13之任一项及其互补序列，以及与SEQ ID NO.3至13共有至少80%序列相似性的序列及其互补序列。在其它实施方案中，试剂盒具有寡核苷酸，所述寡核苷酸具有靶结合序列，所述靶结合序列为SEQ ID NO:3至13之任一项及其互补序列，以及与SEQ ID NO.3至13共有至少90%序列相似性的序列及其互补序列。在其它实施方案中，试剂盒具有寡核苷酸，所述寡核苷酸具有靶结合序列，所述靶结合序列为SEQ ID NO:3至13之任一项及其互补序列。
本发明还提供了用于检测阴道加特纳菌靶序列的方法，包括:(a)使本文中公开的一种或多种扩增引物与GV的靶vly基因中的靶序列杂交和(b)检测所述杂交的扩增引物。在所述方法中，至少一种扩增引物是还包含可检测标记物的报道探针。可检测标记物的实例包括TAMRA、6ROX或6FAM。
附图概述
图1显示GV的vly基因的靶区域的有义链和各种GV菌株和克隆的有义链序列中的变异，以及本文中描述的引物和探针的实施方案相对于有义链的杂交位置；
图2显示靶区域的nt328-523的有义和反义链以及两个示例性PCR引物组在靶区域中的相对杂交位置，引物和探针的杂交位置进一步通过在有义链上描绘轮廓来显示；
图3显示靶区域的nt328-523的有义和反义链以及示例性SDA引物/探针组在靶区域中的相对杂交位置，引物和探针的杂交位置进一步通过在靶区域的有义链上描绘轮廓来显示；和
图4显示用于本文中描述的方法的IAC的有义链和反义链以及示例性SDA引物/探针组在靶区域中的相对杂交位置，以及引物和探针的杂交位置。
发明详述
提供的任何定义是为了清楚起见并且不应当被认为是限定。除其中所记录的，本文中使用的技术和科学术语意欲具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
本文中描述了用于阴道加特纳菌(GV)的核酸序列的检测和/或定量的核酸扩增法和测定。本发明提供了一个或多个与阴道加特纳菌的核酸序列互补或退火的用于扩增和/或检测所述序列的寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，提供了内部扩增对照(IAC)。IAC可在本发明的核酸扩增测定中用于确定测定条件是否可允许扩增和/或检测靶序列。寡核苷酸可用于所有类型的扩增反应例如链置换扩增(SDA)、聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)和QB复制酶介导的扩增。
本发明的方法相对于用于阴道加特纳菌的检测的常规方法是特别有利的，因为它们检测生物体本身，而不是检测由生物体产生的毒素（例如vaginolysin）而非生物体本身的现有技术检测方法和试剂盒。
测定的灵敏度与假阴性的耐受性相关。如果测试结果是阴性的但样品确实包含靶序列，则测试结果是假阴性的。一种测定可检测的靶序列的量越小，则该测定具有的灵敏度越高。
一种测定的特异性与假阳性的耐受性相关。如果测试结果是阳性的但样品实际上不包含靶序列，则测试结果是假阳性的。因此，一种测定的特异性越高，则假阳性结果的水平越低。
根据本发明的实施方案，可如表3中所描述的，判读利用IAC检测检测样品中的阴道加特纳菌的测定的结果。
表3.双重SDA测定的判读
Figure 2011800605314A00800031
可使用IAC替代常规扩增对照（AC）和/或除常规扩增对照(AC)外还可使用IAC。本领域技术人员理解，常规AC反应是在来自待测试的样品的单独的反应混合物中进行。常规AC反应包括扩增试剂和靶DNA。如果AC反应中靶DNA的扩增和/或检测被抑制，则靶序列不存在于测试样品中的指示可归于反应中的抑制信号。虽然该形式的对照反应是有效的，但其不是最理想的。由于AC反应是单独进行的，因此其不能确切地反映包含测试样品的反应的条件。本发明的方法是特别有用的，因为它们具有IAC并且对照反应是在与靶序列的扩增和/或检测相同的空间和时间条件下进行的，从而使人为错误降至最低限度。
本文中描述了与靶序列(即，阴道加特纳菌的序列)退火的扩增引物。在其中使用IAC的那些实施方案中，提供了与IAC退火的扩增引物。在本发明的一些实施方案中，表1或图1、3和4中描述的缓冲引物或其各自的靶结合序列可用作扩增引物。在本发明的一些实施方案中，扩增引物选自表1和2或图1-4中描述的扩增引物，如本文中公开的。在本发明的另一个实施方案中，扩增引物选自图1-4中描述的扩增引物的靶结合序列，如本文中公开的。
扩增法
本文中公开的寡核苷酸可用于本领域已知的任何核酸扩增法。
适当的扩增法包括但不限于聚合酶链式反应(“PCR”；参见美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188)、链置换扩增(“SDA”；参见Walker等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA89:392(1992);Walker等人,Nucl.Acids Res.20:1691(1992);和美国专利号5,270,184，其公开内容通过引用整体并入本文)、嗜热链置换扩增(“tSDA”；参见EP0684315)、自主持续序列复制(“3SR”；参见Guatelli等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA87:1874-78(1990))、基于核酸序列的扩增(“NASBA”；参见美国专利号5,130,238)、Qβ复制酶系统(参见Lizardi等人,BioTechnology6:1197(1988))；连接酶链式反应(“LCR”；参见美国专利号5,427,930)；滚环扩增(参见Lizardi等人,Nat Genet19:225-232(1998))和基于转录的扩增(参见Kwoh等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:1173-77(1989))。本发明的扩增引物可用于进行PCR、SDA或tSDA。
核酸扩增技术是按照扩增过程的温度需要常规地进行分类的。等温扩增是在恒定的温度下进行的，这与需要高温与低温之间的循环的扩增相反。等温扩增技术的实例是：SDA、3SR、Qβ复制酶系统；以及WO90/10064和WO91/03573中公开的技术。需要温度循环的技术的实例是：PCR、LCR、基于转录的扩增；和限制性扩增(美国专利号5,102,784)。
SDA通常沿着下列途径进行。首先，扩增引物结合靶序列或结合先前已被聚合的置换的单链延伸产物。随后，缺乏5'-3'外切核酸酶的聚合酶将α-硫代脱氧核糖核苷三磷酸(“α-硫代dNTP”)掺入延伸产物。如果α-硫代dNTP是例如α-硫代dCTP，则只要在模板中存在互补G残基，其就会被掺入延伸产物。α-硫代dNTP在限制性内切核酸酶识别位点上至延伸产物的掺入产生了半修饰位点，即仅在延伸产物链上修饰的位点。限制性内切核酸酶随后在半修饰双链限制位点产生切口。接着，限制性内切核酸酶与切口位点分离。最后，缺乏5'-3'外切核酸酶活性的聚合酶从切口的3'末端延伸并且置换DNA的下游链。切口形成、链延伸和链置换同时且连续地发生，因为从切口延伸会再生另一个可切的限制位点。当使用一对各自与包含靶序列的双链体的两条链之一杂交的扩增引物时，扩增是指数的，因为有义和反义链在每一轮扩增中都用作模板。当使用单个扩增引物时，扩增是线性的，因为只有一条链用作引物延伸的模板。当α-硫代dNTP被掺入时使它们的双链识别位点产生切口并且适用于SDA的限制性内切核酸酶的实例包括BsoB1、BsrI、BstNI、BsmAI、BstOI、BslI、AvaI、HincII和NciI。SDA进一步描述于美国专利号5,270,184、5,455,166和5,648,211中，所述美国专利通过引用整体并入本文。SDA测定可以是但不限于传统(或常规)SDA(如Walker等人,PNAS(1992)89:392-396,美国专利号5,962,273、5,712,124和5,744,311中描述的，将所述文献和美国专利各自通过引用并入本文)、嗜热SDA(+SDA，如Walker等人,Nuc.Acids Res.(1992)20:1691-1696，美国专利号5,648,211和5,744,311中描述的，将所述文献和美国专利各自通过引用并入本文)和均质实时荧光嗜热SDA(如美国专利号6,379,888中所描述的，将其通过引用并入本文)。
可通过将各种残基掺入延伸产物来减少试剂、移液设备和实验室表面中与从先前扩增反应传带的与扩增产物的交叉染污。例如，胸腺嘧啶可用2'-脱氧尿苷5'三磷酸(“dU”)置换，如EP0624643中所教导的。被掺入扩增产物的dU的切除由尿嘧啶DNA糖基化酶(“UDG”)催化，这使得包含dU的扩增产物不能进一步扩增。UDG本身可被灭活(视需要)以继续扩增时。
在tSDA的情况下，优选选择引物及其靶序列以便它们的GC含量低于总核苷酸组成的70%，以使可限制靶扩增效率的二级结构和引物间相互作用降至最低。用于tSDA的适当的扩增引物以从探针的3'末端至5'末端的顺序包括靶结合序列、限制性内切核酸酶识别位点和“尾”。靶结合序列与靶核酸的互补序列特异性杂交。限制性内切核酸酶识别位点被限制性内切核酸酶识别，当识别位点被半修饰时，所述核酸酶使DNA双链体的一条链产生切口，如由Walker等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA89:392(1992)和Walker等人,Nucl.Acids.Res.20:1691(1992)描述的。当扩增引物的其余部分在tSDA过程中被切开和置换时，5'尾用作聚合酶再引发位点。所述尾的再引发功能支持在tSDA反应中持续，从而允许从单个靶分子合成多个扩增子。尾区域的长度和序列可变化，只要尾在切口形成后保持与靶结合以及尾不包含将与靶结合序列或与其它引物杂交的序列即可。
一些扩增法例如tSDA使用“缓冲引物”或“外部引物”来置换引物延伸产物。“缓冲引物”或“外部引物”是用于在扩增反应中置换扩增引物及其延伸产物的引物。缓冲引物与扩增引物上游的靶序列退火，以便缓冲引物的延伸置换下游扩增引物及其延伸产物。引物延伸产物可选择地通过加热进行置换。缓冲引物可与来自扩增引物上游并且充分靠近扩增引物的结合位点的任何靶序列杂交，以在缓冲引物延伸后置换扩增引物延伸产物。缓冲引物序列与靶序列之间的错配通常不影响扩增效率，只要缓冲引物仍然与靶序列杂交。此外，相对于其它核酸优先扩增靶序列的SDA系统的特异性不依赖于缓冲引物对于与靶核酸的杂交的特异性。SDA系统对于靶序列的特异性源于SDA引物和探针或用于检测扩增产物的寡核苷酸的杂交的保真性。
当按照本发明使用的扩增反应是tSDA反应时，可使用的聚合酶包括但不限于exo-Vent(New England Biolabs)、exo-Deep Vent(NewEngland Biolabs)、Bst(BioRad)、exo-Pfu(Stratagene)、Bca(Panvera)和测序级Taq(Promega)。其它聚合酶可使用前述延伸测定来常规地鉴定。聚合酶Tth(Boehringer)、Tfi(Epicentre)、REPLINASE(DuPont)和REPLITHERM(Epicentre)能够从切口置换链，但它们还具有5'-3'外切核酸酶活性。这些聚合酶在例如通过基因工程除去外切核酸酶活性后用于本发明的方法。由于嗜热限制性内切核酸酶的热稳定性通常限定于低于65°C，因此，在大致该温度或更低的温度下具有最佳活性的嗜热聚合酶（例如Bst和Bca)在反应中与嗜热限制性内切核酸酶更兼容。
可将本发明的组分优化成其中每一种组分可被干燥并且当需要时通过使用本领域已知的任何技术再水化的形式。(参见Little等人,Clinical Chemistry45(6):777-784(1999)，将其通过引用并入本文中)。
引物设计
“扩增引物”是用于通过在与靶序列杂交后延伸寡核苷酸或通过连接多个当与靶序列杂交时相邻的寡核苷酸来扩增靶序列的寡核苷酸。扩增引物的至少一部分与靶序列杂交。该部分被称为靶结合序列并且其确定引物的靶特异性。应当理解，在本发明中例示的靶结合序列还可用于多种用于检测GV的其它方法中。例如，本文中公开的靶结合序列可以可选择地用作杂交探针，用于无先前扩增的情况下或在扩增后测定中直接检测GV。这些杂交法在本领域是公知的并且通常使用与靶结合序列缔合或连接的可检测标记物，以帮助检测杂交。
可优化用于每一种扩增方法的扩增引物的设计。由于不需要特殊序列或结构来驱动扩增反应，因此用于聚合酶链式反应(PCR)的扩增引物可仅由模拟结合序列组成。然而，其它扩增反应除了靶结合序列外还需要专门的核苷酸序列，以使反应进行下去。例如，用于SDA测定的扩增引物还包括靶结合序列5'的限制性内切核酸酶识别位点(参见美国专利号5,455,166和5,270,184)。扩增引物还可包含3'-OH基团，当扩增引物的模板结合序列与靶序列退火时，其可被DNA聚合酶延伸。用于自主持续序列复制(3SR)和基于核酸序列的测定(NASBA)的扩增引物，相反地，在5'末端附近包含RNA聚合酶启动子。(3SR测定描述于Guatelli等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878中)。将启动子添加至靶结合序列并且用于通过指导模板的多个RNA拷贝的转录来驱动扩增反应。除了特定扩增反应所必需的靶结合序列以外的这些序列，在本领域是公知的。
在设计本发明的扩增引物和缓冲引物时，应当考虑本领域内已知的一般考虑。例如，当将包含大量GC和AT重复的靶序列用于设计引物时，应当小心地使潜在的二聚体相互作用减小至最小以避免引物的自我杂交。通常应当避免可与自身形成4个或更多个连续键或与其它引物形成8个或更多个链间键的引物。可形成3'二聚体的引物尤其应当要避免，因为在引物的3'末端上的杂交，即使是短暂的，将因聚合酶作用而导致引物的延伸和引物的破坏。某些计算机软件程序(例如，OligoTM,National Biosciences,Inc.,Plymouth,Minn)可用于设计所述引物来避免问题。还可就最佳条件筛选引物组合。
如在本领域中是已知的，互补和部分互补核酸序列的退火或杂交还可通过调整反应条件以增加或减小严格度(例如，调整温度或缓冲液的盐含量)来获得。本发明包括公开的序列的这些修饰和条件的任何必需调整。关于缓冲条件的信息可见于由Dr.Perry Haaland编著的生物技术的实验设计（Experimental Design in Biotechnology）(MarcellDekker,NY,1989)，通过引用整体并入本文。
在采用IAC（一种双重扩增反应）的实施方案中，设计扩增引物以使其能够与GV靶序列和IAC序列杂交并且扩增其所杂交的序列。这可通过使用GV靶序列与IAC序列之间共有的核酸序列设计扩增引物来实现。可任选地将其它序列，如用于进行所选择的扩增反应所需要的，添加至本文中公开的扩增引物。
例如，但不限于，用SDA测定的扩增引物通常包括3'模板结合序列、模板结合序列5'的可切开的限制性内切核酸酶识别位点以及限制性内切核酸酶识别位点5'的长度为约10-25个核苷酸的尾序列。这些扩增引物可包含限制性内切核酸酶BsoBI的识别位点，该识别位点在SDA反应中被切开。对于本领域技术人员来说很显然的是其它可切开的限制性内切核酸酶识别位点可置换BsoBI识别位点。尾序列不应当包含用于SDA的限制位点和将与其自已的靶结合序列或与其它引物（例如，缓冲引物）退火的序列。
在一些实施方案中，使用一对扩增引物，所述一对引物的每一个引物与双链靶序列或IAC序列的两条链之一退火。在该情况下，扩增是指数的，因为有义和反义链在随后轮的扩增中都用作相反引物的模板。当使用单个扩增引物时，扩增是线性的，因为只有一条链用作引物延伸的模板。
在一些实施方案中，本发明的方法包括扩增引物，所述引物包含基本上由SEQ ID NO:3和4或它们各自的靶结合序列组成的核苷酸序列。在其它实施方案中，本发明的方法包括至少两个扩增引物，其中第一扩增引物包含基本上由SEQ ID NO:3或其相应的靶结合序列组成的核苷酸序列；并且第二扩增引物包含基本上由SEQ ID NO:4或其相应的靶结合序列组成的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的方法包括一个或多个缓冲引物。缓冲引物是用于在扩增反应中置换扩增引物及其延伸产物的引物。缓冲引物与扩增引物上游的靶序列退火，以便缓冲引物的延伸置换下游扩增引物及其延伸产物。缓冲引物还可用作扩增引物。在一些实施方案中，本发明的方法包括一个或多个缓冲引物。在某些实施方案中，缓冲引物包含具有包含SEQ ID NO:6或7的序列的寡核苷酸。在一个实施方案中，缓冲引物包含具有SEQ ID NO:6或7的部分或完整序列的寡核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的方法包括至少两个缓冲引物，其中第一引物包含基本上由SEQ ID NO:6组成的核苷酸序列并且第二引物包含基本上由SEQ ID NO:7组成的核苷酸序列。
按与它们的靶结合序列100%互补来描述本文中描述的引物/探针。然而，基于上述引物设计条件，引物和探针可结合靶序列，即使它们与这些区域的互补性低于100%。所需的互补性程度取决于多个因素，包括结合条件的严格度。取决于所使用的严格度条件，可修饰引物和探针以在其序列中包括不同碱基并且仍然具有充足的互补性以与靶区域结合。充足的互补性，如本文中所用，包括70%或更高的互补性。在优选实施方案中，引物/探针对其靶序列的互补性在引物/探针的结合部分的长度上为至少80%。更优选地，引物和探针对其靶序列的互补性为90%或更高。
靶序列
“靶”或“靶序列”是指待扩增和/或检测的GV核酸序列。靶或靶序列包括待扩增的GV核酸序列及任何互补的第二链。在一些实施方案中，靶序列可以是单链或双链的，在该情况下，一条链或两条链可结合扩增引物。靶或靶序列还可包含被接头（adapter）寡核苷酸识别的核苷酸序列（即，接头结合序列）。本发明的引物经设计与如SEQ IDNO.1、2和23-25中鉴定的GV的vly基因的区域退火。靶序列优选为SEQ ID NO.20和21中鉴定的靶序列。
内部扩增对照
“内部扩增对照”、“IAC”或“IAC序列”是指包含与扩增引物退火的序列和可从靶序列单独地检测到的序列的核酸序列。可使用本领域已知的任何检测法。
根据本发明，IAC序列被设计为与GV靶序列共有核酸序列，从而当其存在于样品中时，相同扩增引物可扩增IAC序列和靶序列二者。IAC序列也被设计为具有一些与GV靶序列不同的核酸序列，以便可区分IAC序列与靶序列的检测。由于在与靶序列相同的反应混合物中扩增和/或检测IAC序列，因此双重测定具有检测人为错误或抑制性反应条件，例如抑制剂的存在或关键试剂的不存在的有利方面。在与待测试的样品相同的反应中IAC的存在消除了对单独的扩增对照反应（如现有单重SDA测定所需要的）的需要。
虽然不希望受特定作用机制束缚，但在与靶序列相同的反应中IAC的存在使得本发明的扩增测定能够检测可指示假阴性结果的反应的抑制剂和/或条件的存在。如本文中所用，假阴性结果是指显示未检测到靶序列，然而这样的显示不是因靶序列在样品中的不存在引起，而是因人为错误或反应条件，例如关键反应成分的不存在或反应的抑制剂的存在或在进行测定中所犯的错误而引起的。
使用这样的检测法：其中这样的方法区分靶序列的扩增产物与IAC序列的扩增产物。在一个实施方案中，靶序列和IAC的扩增产物可通过不同的染料标记的检测探针来检测。在一个实例中，荧光素用于检测靶序列的扩增产物，罗丹明荧光用于检测IAC的扩增产物。
在一些实施方案中，设计IAC序列以便其3'或5'末端包含与GVDNA序列相同的序列。在一些其它实施方案中，设计IAC以便3′和5′末端都包含与扩增引物所结合的DNA序列相同的序列。
IAC序列还被设计为包含与待扩增的GV靶序列不同的核酸序列，以便可区分IAC和靶序列的扩增产物的检测。
在一些实施中，本发明的方法利用包含基本上由SEQ ID NO:19组成的核苷酸序列的IAC。注意除其中检测剂(GVvlyACD2b)结合IAC靶的区域外，SEQ ID NO:19与SEQ ID NO.20和21(优选的靶结合序列)是十分相似的。GVvlyACD2b在本文中被鉴定为SEQ ID NO.22。除了检测剂之外，用于IAC靶的缓冲物和引物与用于SDA的缓冲物和引物(SEQ ID NO.14-17)相同。
按与它们的靶结合序列100%互补来描述上述引物。如下文中所描述的，引物和探针可结合靶序列，即使它们与这些区域的互补性低于100%。需要的互补性程度取决于多个因素，包括结合条件的严格度。取决于使用的严格度条件，引物和探针可被修饰以在其序列中包括不同的碱基并且仍然具有充足的互补性以结合靶vly基因。充足的互补性，如本文中所用，包括70%或更高的互补性。在优选实施方案中，引物/探针对其靶序列的互补性在引物/探针的结合部分的长度上为至少80%。更优选，引物和探针对其靶序列的互补性为90%或更高。
虽然本文中描述的寡核苷酸必须具有充足的互补性以结合其各自的靶的部分，但要承认在一些点上，寡核苷酸的序列变得对靶序列不太互补并且可结合其它核酸序列。因此，理想的是，寡核苷酸探针保持充足的与其各自的靶部分的互补性并且不丢失对于其各自靶结合位点的选择性。
核酸的检测
使用本发明的一个或多个引物产生的扩增产物可利用本领域已知的任何方法来检测。如本文中所用，扩增产物包括扩增的靶序列和扩增的IAC序列。可通过使用常规技术与标记的探针，例如在存在于扩增引物之间的序列上与扩增的核酸杂交的探针来检测扩增产物。或者，扩增产物可通过它们的特征尺寸，例如通过电脉，然后进行溴化乙锭染色以显现核酸来检测扩增产物。在其它选择中，使用标记的扩增引物。在其它选择中，在靶序列上延伸标记的扩增引物/内部探针，如由Walker等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA89:392(1992)或Walker等人,Nucl.Acids Res.20:1691(1992)所描述的。在另一个实施方案中，直接通过标记的报道探针的杂交和延伸实现检测，如美国专利5,928,869和美国专利号5,958,700中所描述的。检测法还包括化学发光法，其中使用生物素化的捕获探针和缀合有酶的检测探针来检测扩增产物，如美国专利号5,470,723中所描述的。在这两个探针在两个扩增引物结合位点之间的不同位点上杂交后，复合物被捕获在链霉抗生物素蛋白涂覆的微量滴定板上，对化学发光信号进行显影，在照度计（luminometer）读取所述信号。
在本发明的实施方案中，检测法应当检测靶扩增产物和IAC扩增产物（如果存在的话），并且区分被检测的扩增产物。可使用本领域已知的能够实现该目的的任何方法。例如，可按照本发明使用Walker等人,Nucl.Acids Res.,(1992)20:1691-1696、美国专利号5,648,211、5,962,273、5,814,490、5,928,869、6,316,200和欧洲专利EP0678582(将其各自通过引用并入本文)中公开的检测法。在另一个实施方案中，使用用于检测核酸的通用探针和方法(参见美国专利号6,379,888，将其通过引用并入本文)。
本领域已知的许多供体/淬灭剂染料对用于本发明。这些染料包括但不限于例如异硫氰酸荧光素(FITC)/异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、FITC/德克萨思红(Molecular Probes)、FITC/罗丹明X、FITC/四甲基罗丹明(TAMRA)、6-羧基荧光素(6-FAM)/TAMRA等。具体的供体/淬灭剂对的选择不是至关重要的。对于能量转移淬灭机制，供体荧光团的发射波长与淬灭剂的激发波长重叠是必需的，即在两种染料之间必须具有充足的光谱重叠以允许高效率的能量转移、电荷转移或荧光淬灭。对-(二甲基氨基偶氮苯)苯甲酸(DABCYL)是有效地淬灭来自相邻荧光团例如荧光素或5-(2'-氨乙基)氨基萘(EDANS)的荧光的非荧光淬灭剂染料。在本发明的检测探针中产生荧光淬灭的任何染料对可用于本发明的方法，无论淬灭所籍以发生的机制如何。末端和内部标记法在本领域也是已知的并且可常规地用于在检测探针中将供体和淬灭剂染料在它们各自的位置上连接。
本发明提供了检测探针，其为包含SEQ ID NO:5、10或13和标记物的单链寡核苷酸。在某些实施方案中，标记物包括至少一个连接至寡核苷酸的荧光供体/淬灭剂对，其中荧光部分为TAMRA或6-FAM。对于IAC，荧光部分为ROX。
在一些实施方案中，本发明提供了双重均质实时荧光嗜热SDA(tSDA)。均质实时荧光嗜热SDA是通过荧光淬灭机制检测核酸靶序列的改进的tSDA(参见，例如，美国专利号6,379,888，将其通过引用整体并入本文)。例如，在一个实施方案中，检测探针可包含荧光供体/受体对，以便在靶序列不存在的情况下发生荧光淬灭。虽然不希望受特定作用机制束缚，但在检测探针对第二寡核苷酸(其通过靶序列的扩增产生)的杂交不存在的情况下，所述探针采用使供体与淬灭剂在空间上紧密靠近并导致供体荧光的淬灭的构象。探针可折叠成有序的二级结构(例如，G-四联体、发夹或三股螺旋)、折叠成无规卷曲或折叠成使供体与淬灭剂足够靠近以产生荧光淬灭的任何其它构象。然而，当检测探针与第二寡核苷酸杂交时，检测探针的分子内碱基配对的二级结构变为展开或线性化，这增加了供体与淬灭剂之间的距离，从而减少或消除了荧光淬灭。或者，可将检测探针设计为线性检测探针(即，其不折叠成二级结构)，其中供体与淬灭剂之间的距离短至足以产生荧光淬灭。在该情况下（和任选地在使用本文中描述的非线性检测探针的情况下），检测探针还在荧光供体/淬灭剂对之间包含限制性内切核酸酶识别位点(RERS)。检测探针与第二寡核苷酸之间的分子间碱基配对使得RERS成为双链，从而可被限制性内切核酸酶切割或切开。虽然不希望受特定作用机制束缚，但由限制性内切核酸酶产生的切割或切口将供体和受体分离至分开的核酸片段上，这导致减少的淬灭。
可按照本发明的检测和/或监测靶序列的存在的方法监测荧光参数的相关变化(例如，供体荧光强度的增加、受体荧光强度的减小或供体和/或受体荧光强度的比率)。监测供体荧光强度的改变通常是优选的，因为该改变通常大于受体荧光强度的改变。还可以按照本发明监测其它荧光参数例如荧光寿命的改变。
试剂盒
本发明还提供了用于扩增和/或检测GV核酸的试剂盒，其包括一个或多个基本上由SEQ ID NO:8-18或其各自的靶结合序列组成的扩增引物和至少一个包含这些引物的容器。试剂盒可任选地包括如下的任一种或多种：IAC、接头寡核苷酸或检测探针。试剂盒还可包括用于进行杂交或扩增反应例如Southern杂交、斑点印迹杂交、PCR或SDA的其它组分和试剂。为了通过杂交进行检测，可包含进行杂交的适当溶液，例如0.3M NaCl、0.03M柠檬酸钠、0.1%SDS。还可将用于检测法的组分包括在试剂盒中，例如第二探针、放射性标记、酶底物、抗体等。还可包括适合与核酸扩增法一起使用的试剂。将试剂盒的组分一起包装在共同的容器中，通常包括用于进行选择的本文中公开的方法的具体实施方案的说明书。
实施例
实施例1:SDA引物组的设计
已通过扩增测定就靶向对GV的vly基因的一部分进行了测序和表征。为了进行该测定，选择先前未被靶向以进行扩增测定的GV基因组的一部分(即vly基因)。在现有GenBank数据库中分析GV基因组的该亚区域的GV特异性。GV的Vly基因由SEQ ID NO.1、2和23-25代表。
扩增引物被设计为扩增表1中描述的GV靶序列。图1、3和4中举例说明了与选择的寡核苷酸(扩增引物、缓冲引物和接头寡核苷酸)退火的GV vly基因的区域的位置。一组SDA引物和探针的一个实例描述于下列的表4中。引物/探针序列的加下划线的部分代表靶结合序列。限制性内切核酸酶识别位点(RERS)以粗体表示。
表4.用于GV的扩增和/或检测的SDA测定的引物寡核苷酸
Figure 2011800605314A00800041
*登录号No.EU522486
实施例2:利用GV的3个菌株进行的灵敏度测试
通过进行检测限(LOD)实验来确定GV vly测定的灵敏度。测试从GV的3个菌株分离的基因组DNA并且计算每一菌株的LOD。对于每一个靶水平运行24个重复，使用来自Becton Dickinson&Co的LOD计算器分析数据。数据显示该测定对于GV是既是灵敏性的又是特异性的。
将所有三种菌株的DNA稀释于10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0中并且煮沸5分钟，使其冷却10分钟。将DNA在下文表5中描述的洗出液中稀释至适当的工作稀释度。测试的靶水平为100、50、20、5、1和0个拷贝/反应(c/rxn)。将样品(159μL)添加至适当的引发微孔。
表5:洗脱液
Figure 2011800605314A00800051
将微孔板转移至72°C的加热块。将对应的扩增微量板置于54°C加热块上。随后将微孔温育10分钟。将来自引发反应的微孔内容物的等分(100uL)转移至扩增微孔。
将扩增微孔的内容物混合3x50uL。密封扩增微孔，随后将微孔板转移进入由Becton Dickinson&Co.of Franklin Lakes,New Jersey提供的BD ProbeTecTM ET仪。
终反应条件是:
表6:终SDA反应条件
Figure 2011800605314A00800061
无外源的人DNA的干净的非提取系统中每一个菌株的计算的检测水平(LOD)是：
表7:LOD
Figure 2011800605314A00800071
注:CI是95%的置信区间
表7中给出了GV vly测定的灵敏度。该测定能够检测所测试的GV的3个菌株。数据表明本发明中描述的SDA测定每反应可检测至少58个阴道加特纳菌基因组拷贝，其中95%LOD为每反应55个基因组拷贝。
实施例3:交叉反应性测试
进行交叉反应性筛选。从34种生物体提取核酸，在Viper XTR仪上测试所述核酸。对于每一种核酸获得阴性结果。
将生物体在内汤培养基中生长至1McFarland，并且通过直接板计数来进行定量。通过离心肉汤培养基的等分来制备细胞沉淀以收获细胞。在弃去上清液后，将细胞沉淀在-70°C贮存。为了进行该实验，将细胞沉淀物重悬浮于1mL样品稀释剂中。在于Viper XTR仪上进行处理后，以约2x107CFU/反应测试每一个样品。除两个例外之外，在该浓度下测试表9中所列的生物体。阴道滴虫（T.vaginalis）生长在肉汤培养基中，通过直接计数进行定量，以2x105个细胞/反应进行测试。沙眼衣原体(C.trachomatis)培养在BGMK细胞中，通过超声处理和差速离心进行收获以及通过免疫细胞化学进行定量。以5x106EB/反应测试沙眼衣原体。通过将GV基因组DNA稀释至1000个拷贝/mL的浓度来制备阳性对照样品，以用作阳性对照。将未搀杂的样品稀释剂用作阴性对照(表8)。
表8:样品稀释剂
Figure 2011800605314A00800081
在114°C预加温样品架15分钟，随后在室温下冷却15分钟。将制备的样品转移至来自Becton Dickinson&Co.of Franklin Lakes,New Jersey的ViperTM XTR仪中以进行提取和分析。在Viper XTR系统中，使用磁性颗粒从样品提取核酸。磁性颗粒分离除去样品的非核酸组分。随后使用表5中描述的溶液从磁性颗粒洗脱核酸。随后使用SDA，利用上文表4中描述的探针组测试洗脱物。
交叉反应性小组包括表9的生物体。结果显示唯一被检测到的生物体是GV阳性对照。未检测到其它生物体，这表明上文表4中描述的SDA引物探针组与其它生物体具有极低的交叉反应性。
表9:交叉反应性测试结果
Figure 2011800605314A00800082
1Per GNE算法
实施例4:针对念球菌属的6个种的另外的交叉反应性测试
在临床环境中，对于临床医生重要的是能够区分细菌性阴道炎与阴道念珠菌病。为了证明GV SDA测定进行该区分的效用，利用来自念珠菌属的6个医学上相关的种的基因组DNA评估该测定。GV SDA测定不与所测试的念菌属的种的任何种交叉反应。具体地，在上文中实施例1中描述的GV vly测定中测试来自念珠菌属的6个种的基因组DNA。对于每一个靶运行6个重复。
下文表10中例举了使用的生物体的种:
表10:生物体的种
Figure 2011800605314A00800102
将DNA稀释于10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0中，煮沸5分钟。让溶液冷却10分钟。随后使用表5中描述的洗脱液稀释DNA。将样品(159μL)添加至适当的引发微孔。将微孔板转移至72°C的加热块。将对应的扩增微孔板置于54°C的加热块上。随后将微孔温育10分钟。将来自引发反应的微孔内容物的等分(100uL)转移至扩增微孔。密封扩增微孔，将微孔板转移至由Becton Dickinson&Co.of FranklinLakes,New Jersey提供的BD ProbeTec ET仪。
引用的参考资料和等同物
本文中引用的所有参考资料为了所有目的通过引用整体并入本文，并且达到相同的程度，就如同为了所有目将每一个个别的公开案或专利或专利申请明确地且单独地通过引用整体并入本文。
可在背离其精神和范围的情况下进行本发明的许多变动和变化，这对于本领域技术人员来说将是很显然的。本文中描述的具体实施方案仅通过举例说明的方式提供，并且本发明将仅受所附权利要求的项连同这些权利要求所赋予的等同物的整个范围限制。
Figure IDA00003351513200011
Figure IDA00003351513200021
Figure IDA00003351513200031
Figure IDA00003351513200041
Figure IDA00003351513200051
Figure IDA00003351513200061
Figure IDA00003351513200071
Figure IDA00003351513200081
Figure IDA00003351513200091

Claims (22)

1.一种用于检测阴道加特纳菌靶序列是否存在于样品中的方法，包括：
(a)提供至少一种寡核苷酸引物，所述引物将与选自SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21的GV的vly基因的靶区域的至少一些部分退火；
(b)将所述至少一种寡核苷酸引物与生物样品组合；
(c)使所述样品经历引起所述靶序列的一部分扩增的条件，如果所述靶序列存在于样品中的话；和
(d)确定扩增的靶序列的存在或不存在。
2.权利要求1的方法，其中至少一种寡核苷酸引物具有选自下列之一的靶结合序列：SEQ ID NO.3至13、SEQ ID NO.3至13的互补序列以及与SEQ ID NO.3至13共有至少70%序列相似性的序列及其互补序列。
3.权利要求1的方法，其中至少一种寡核苷酸引物具有选自下列之一的靶结合序列：SEQ ID NO.3至13、SEQ ID NO.3至13的互补序列以及与SEQ ID NO.3至13共有至少80%序列相似性的序列及其互补序列。
4.权利要求1的方法，其中至少一种寡核苷酸引物具有选自下列之一的靶结合序列：SEQ ID NO.3至13、SEQ ID NO.3至13的互补序列以及与SEQ ID NO.3至13共有至少90%序列相似性的序列及其互补序列。
5.权利要求1的方法，其中所述至少一种寡核苷酸引物是一组寡核苷酸引物，其中:
(a)第一扩增引物具有基本上由SEQ ID NO:3、6、8或11组成的靶结合序列；和
(b)第二扩增引物具有基本上由SEQ ID NO:4、7、9或12的结合序列组成的靶。
6.权利要求1的方法，其中所述扩增通过选自链置换扩增(SDA)反应和聚合酶链式反应(PCR)的扩增反应来实现。
7.权利要求1的方法，其中所述扩增通过选自直接检测、聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交、转录介导的扩增(TMA)、自主持续序列复制(SSR)、滚环扩增或基于核酸序列的扩增(NASBA)的扩增或检测反应来实现。
8.权利要求1的方法，其中所述扩增引物还包括发夹、G-四联体、限制位点或与报道探针杂交的序列。
9.权利要求8的方法，其中所述报道探针还包括可检测标记物。
10.权利要求9的方法，其中所述标记物是荧光标记物。
11.权利要求1的方法，其中所述扩增引物还包含限制性内切核酸酶识别位点或RNA聚合酶启动子。
12.权利要求1的方法，其还包括扩增内部扩增对照(IAC)。
13.一种检测GV靶序列的方法，包括:
(a)提供生物样品；
(b)将一种或多种针对GV的vly基因的靶区域的扩增引物与所述生物样品组合，其中GV的vly基因的靶区域具有选自SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22的序列；
(c)使与一种或多种扩增引物组合的生物样品经历引起一种或多种扩增引物与GV的vly基因的靶区域杂交的条件；和
(d)确定杂交的扩增引物在所述生物样品中的存在或不存在。
14.权利要求13的方法，其中所述一种或多种扩增引物具有下列任一靶结合序列：SEQ ID NO:3至13及其互补序列，以及与SEQ IDNO.3至13共有至少70%序列相似性的序列及其互补序列。
15.权利要求13的方法，其中所述一种或多种扩增引物具有下列任一靶结合序列：SEQ ID NO:3至13及其互补序列，以及与SEQID NO.3至13共有至少80%序列相似性的序列及其互补序列。
16.权利要求15的方法，其中所述一种或多种扩增引物具有下列任一靶结合序列：SEQ ID NO:3至13及其互补序列，以及与SEQID NO.3至13共有至少90%序列相似性的序列及其互补序列。
17.权利要求13的方法，其中至少一种扩增引物是还包含可检测标记物的报道探针。
18.权利要求17的方法，其中所述可检测标记物是TAMRA、6ROX或6FAM。
19.一种用于扩增或检测反应的试剂盒，其包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有基本上由下列任一靶结合序列组成的靶结合序列：SEQID NO:3至13及其互补序列，以及与SEQ ID NO.3至13共有至少70%序列相似性的序列及其互补序列。
20.一种用于扩增或检测反应的试剂盒，其包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有基本上由下列任一靶结合序列组成的靶结合序列：SEQID NO:3至13及其互补序列，以及与SEQ ID NO.3至13共有至少80%序列相似性的序列及其互补序列。
21.一种用于扩增或检测反应的试剂盒，其包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有基本上由下列任一靶结合序列组成的靶结合序列：SEQID NO:3至13及其互补序列，以及与SEQ ID NO.3至13共有至少90%序列相似性的序列及其互补序列。
22.一种用于扩增或检测反应的试剂盒，其包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有基本上由下列任一靶结合序列组成的靶结合序列：SEQID NO:3至13及其互补序列。
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