CN110438201A - 一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法。本发明将待测microRNA分子与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，通过捕获桥分子分别与microRNA分子和捕获分子的部分杂交，将microRNA分子捕获到固相上，而放大桥分子的一端与靶分子杂交识别，另一端与下一步加入的放大分子结合，放大分子上连接的多个生物素分子再与标记物如辣根过氧化物酶结合，最终实现microRNA分子的检测过程。本发明方法十分灵敏，而且是通过信号放大而不是基于PCR的模板扩增技术来实现对核酸的检测，从而避免PCR固有的污染问题。

Description

一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的 方法

本发明是针对2013年07月30日提交的发明专利申请《一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法》(申请号：201310324829.2)提出的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法，属于生物检测领域。

背景技术

microRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源于内源性染色体上的非编码单链RNA，长度约为22(18～25)个核苷酸的短序列，在进化上具有高度的保守性。它们基于与靶mRNA的序列互补，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。microRNA广泛地存在于多种真核生物中，从低等生物到人类都有其存在的痕迹。其生物学特性主要表现为：高度保守性，时序表达特异性和组织表达特异性。尽管对miRNA功能的认识不够完全，但miRNA在许多生物过程中起关键作用，包括发育、细胞分化、增殖、凋亡等，并在许多疾病发生过程中，如肺癌、白血病等起作用。近期的研究发现人血清中稳定存在一定水平的miRNA，并且血清miRNA表达谱的变化与多种肿瘤的发生、发展具有明确的相关性,说明血清miRNA可以作为肿瘤临床诊断和预后评估的分子标志物。

目前microRNA在疾病控制领域的应用主要集中在肿瘤的诊断与治疗、自身免疫疾病、抗病毒和新药研发等方面。迄今已在人类基因组中注释了500多种microRNA。借助进一步发展的分子检测技术，将会有更深入的研究。这将不断的增加人们对miRNA的认识，为更深入的发展疾病治疗方法及新药研制打下良好的基础。

microRNA由于同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。目前常见的microRNA检测主要有：Nothern Blot，基于酶反应的扩增方法，芯片技术，高通量测序等。

Northern Blot是验证和确认miRNA的传统方法，但该方法操作复杂、工作流程长，同时需要的样本量大，并且灵敏度有限。芯片技术(microarray)检测方法可以实现快速、高通量的检测。目前已有多种类型的miRNA检测芯片可以选用。但是芯片检测方法的重现性和准确性比较差，一般多用于初筛，对获得的结果通常需要采用Northern blot和实时定量PCR进行验证，不适用于临床样本的高通量检测。

荧光定量PCR方法无疑是目前检测miRNA表达的最常用方法。常规的荧光定量检测方法中有基于茎-环的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)以及基于polyA加尾的RT-PCR方法。虽然这两种方法有较好的灵敏度和特异性，但都有各自不足的地方。对于stem-loop RT-PCR，针对一个microRNA的检测需特异对应一个茎-环状结构的反转引物，因此在同时检测多种microRNA时，需要对该样品进行多次反转；并且合成茎环引物的价格较高。而对于polyA加尾的RT-PCR方法，则需要在反转录前进行末端Poly(A)加尾。这两种检测前的预处理使得这两种方法操作复杂且费用昂贵。此外，荧光定量PCR需要较昂贵的仪器，对于实验条件要求较高，容易污染出现假阳性等。针对PCR的不足，其他核酸扩增方法，如滚环扩增，恒温指数扩增等均发展用来检测microRNA，这些方法各有优势，但是复杂的标记、探针设计及仪器的要求等仍然限制着它们的应用。

因此，获得高效、简便以及经济适用的检测microRNA方法已成为临床检测所迫切需要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种microRNA检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法，可以灵敏简便检测microRNA。

本发明所提供的microRNA检测试剂盒，包括捕获分子和捕获桥分子，所述捕获分子为寡核苷酸，包被于固相上；所述捕获桥分子为DNA，一端能与捕获分子部分杂交，另一端能与待测microRNA部分杂交；还包括放大桥分子和放大分子，所述放大分子包括载体分子和标记分子，载体分子为DNA，所述标记分子为生物素标记的多核苷酸，2个或2个以上的标记分子与载体分子杂交形成放大分子，标记分子本身带有的多核苷酸可与其他标记分子的多核苷酸结合，标记分子相互杂交后的杂合体又可以和载体分子进行杂交；所述放大桥分子为DNA，一端能与待测microRNA分子部分杂交，另一端能与不参与标记分子杂交的载体分子部分进行杂交；捕获桥分子的部分序列和放大桥分子的部分序列一起与待测microRNA分子的全部序列互补配对，两者与待测microRNA分子互补配对的区域不重叠。

所述的载体分子通过多核苷酸与2-100个生物素分子相连。

所述的载体分子可以通过化学合成或生物合成。

所述的多核苷酸可由15-50个一种或多种核苷酸组成。

本发明上述的试剂盒，在实际使用中，还包括杂交液、杂交洗液、封闭液、标记物标记的链霉亲和素,等等。

本发明的试剂盒中的放大桥分子、捕获桥分子和放大分子的设计和合成方法如下：

1)生物素通过化学反应与多核苷酸连接形成标记分子。

2)合成载体分子，载体分子的部分序列能够和放大桥分子的部分序列互补，另一部分序列与标记分子中多核苷酸的序列互补。

3)多个标记分子在一定的条件下与载体分子进行杂交，形成放大分子。

4)放大分子的纯化。

5)根据被检测microRNA分子的序列，设计和合成捕获桥分子和放大桥分子，捕获桥分子的部分序列和放大桥分子的部分序列一起与待测microRNA分子的全部序列互补配对，但两者与待测microRNA分子互补配对的区域不重叠。捕获桥分子的部分序列与捕获分子互补配对，放大桥分子的部分序列能与放大分子中不参与标记分子杂交的序列互补配对。

由于microRNA分子是通过捕获桥分子与捕获分子的杂交而捕获到固相上，通过放大桥分子与放大分子的杂交来实现信号的放大，因此针对不同的待测对象，捕获分子和放大分子都是相同的，只需设计不同的捕获桥分子和放大桥分子，即可实现特定microRNA分子的检测。

使用本发明的试剂盒检测microRNA分子的方法，包括如下步骤：

(1)将待测microRNA分子与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，42-50℃孵育12-16小时，待测microRNA分子通过捕获桥分子与预包被在固相上的捕获分子的特异识别而捕获到固相上；

(2)洗去未结合于固相上的microRNA分子和放大桥分子、捕获桥分子，将放大分子加入到固相上，42-50℃孵育0.5-1小时；

(3)将标记物标记的链霉亲和素或亲和素加入到固相上，室温孵育半个小时；

(4)通过链霉亲和素或亲和素上的标记物的特征反应，实现microRNA分子检测。

根据链霉亲和素或亲和素上不同的标记物，使用不同的方法进行检测。以所述的标记物为辣根过氧化物酶为例，通过化学发光底物对辣根过氧化物酶进行显色反应。根据待检测样本的相对光单位测定值来对样本进行定性分析。

在本发明中，检测原理为：待测microRNA分子与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，通过捕获桥分子分别与microRNA分子和捕获分子的部分杂交，将microRNA分子捕获到固相上，而放大桥分子的一端与靶分子杂交识别，另一端与下一步加入的放大分子结合，放大分子上连接的多个生物素分子再与标记物如辣根过氧化物酶结合，最终实现microRNA分子的检测过程。

本发明将生物素与多核苷酸相连，设计合成一种新型多生物素分子。与碱性磷酸酶比较来言，生物素体积小，与多核苷酸连接形成的标记分子可以有效地杂交到载体分子上形成多生物素标记的放大分子，这使得检测更加灵敏。并且，用于生物素检测的亲和素或链霉亲和素可标记具有二次扩增能力的酶(辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)，进行检测信号的二次放大，使得本发明的检测核酸方法具有极高的灵敏度。

本发明涉及到的检测方法中，microRNA的全部序列可以与放大桥分子和捕获桥分子杂交。只有当序列完全匹配的时候，放大桥分子与捕获桥分子才能和miRNA杂交，形成RNA/DNA的杂合体。即使只有一个核苷酸不匹配都会造成杂交或者随后连接的失败。因此不同亚型的同源microRNA可以被区分开。

本发明的有益效果还在于本发明是通过信号放大而不是基于PCR的模板扩增技术来实现对核酸的检测，从而避免PCR固有的污染问题。此外，本发明的技术可以直接利用裂解的样本，不需要提取或反转录，可完全并简单地自动化。这对于高通量筛选是必需的，并且对于诊断测定或常规实验室测定也是有利的。

附图说明

图1，本发明方法原理示意图，其中1：待测microRNA分子，2：捕获桥分子，3：放大桥分子，4：载体分子，5：标记分子，6：标记物标记的链霉亲和素或亲和素，7：捕获分子，8：固相。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】microRNA21和microRNA25的检测：

1.捕获分子、捕获桥分子、放大桥分子、标记分子和载体分子的设计和合成：

捕获分子：GTTGGGCTACGACTTAGAGGCC(SEQ ID No：1)

标记分子1：Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA(SEQ ID No：2)

标记分子2：Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG(SEQ ID No：3)

标记分子3：biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG(SEQ ID No：4)

载体分子：AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGCTTCACCGACCTATCCATCGGGTCTGCGAAAGGGCACGATGCTTACATGTGAGAACGCGAACGTGGT(SEQ ID No：5)

根据genebank中microRNA21和microRNA25的序列，设计捕获桥分子和放大桥分子的序列，序列如下：

microRNA21-捕获桥分子：CTGATAAGCTAGGCCTCTAAGTCGTAGCCCAAC(SEQ ID No：6)

microRNA21-放大桥分子：GCCTCAAAGACGGACGCCTTCTTCAACATCAGT(SEQ ID No：7)

microRNA25-捕获桥分子：CAAGTGCAATGGGCCTCTAAGTCGTAGCCCAAC(SEQ ID No：8)

microRNA25-放大桥分子：GCCTCAAAGACGGACGCCTTCTTCAGACCGAGA(SEQ ID No：9)

同时合成单个生物素标记的探针和多个标记分子标记的放大分子，比较单生物素标记探针与多生物素分子的信号放大效果。

2.预包被：将捕获分子包被到微孔板上，加入固定液，固定2小时后室温风干。3.样本处理

将样本用细胞裂解液进行裂解，得到其中含有的核酸。

4.样本核酸和放大桥分子、捕获桥分子温育：

将样本核酸与放大桥分子、捕获桥分子共同稀释到100μL预热的杂交液中，加入到微孔板中。用铝箔膜封住反应孔，50℃温育12到16个小时。

5.与放大分子温育：

去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。按1:500的比例，用杂交液稀释放大分子，每孔加入稀释后的100μL放大分子，封膜。50℃温育1小时。

6.与链霉亲和素-辣根酶温育：

去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。每孔加入200μL封闭液，室温振荡15分钟。弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素-HRP酶联物，室温震荡30分钟。

7.显色

弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的检测洗涤液，室温振荡5分钟后，弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。配制底物溶液，每孔加入95μL底物溶液，孵育1分钟后，置于化学发光检测仪上进行测定。

8.结果

检测分子	单生物素标记探针	多生物素标记的放大分子
			microRNA-21	541.45	5621.78
microRNA-25	231.43	7841.86
			空白对照	132	133

多生物素标记的放大分子检测到的信号是单生物素标记的探针检测信号的10倍以上。

序列表

<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司

<120> 一种microRNA 检测试剂盒和多生物素分子检测microRNA的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttgggctac gacttagagg cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acccgatgga taggtcggtg aa 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taagcatcgt gccctttcgc ag 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accacgttcg cgttctcaca tg 22

<210> 5

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agaaggcgtc cgtctttgag gcttcaccga cctatccatc gggtctgcga aagggcacga 60

tgcttacatg tgagaacgcg aacgtggt 88

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgataagct aggcctctaa gtcgtagccc aac 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcctcaaaga cggacgcctt cttcaacatc agt 33

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caagtgcaat gggcctctaa gtcgtagccc aac 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcctcaaaga cggacgcctt cttcagaccg aga 33

Claims (5)

1.一种microRNA检测试剂盒，包括捕获分子和捕获桥分子，所述捕获分子为寡核苷酸，包被于固相上；所述捕获桥分子为DNA，一端能与捕获分子部分杂交，另一端能与待测microRNA部分杂交；还包括放大桥分子和放大分子，其特征在于：所述放大分子包括载体分子和标记分子，载体分子为DNA，所述标记分子为生物素标记的多核苷酸，2个或2个以上的标记分子与载体分子杂交形成放大分子，标记分子本身带有的多核苷酸可与其他标记分子的多核苷酸结合，标记分子相互杂交后的杂合体又可以和载体分子进行杂交；所述放大桥分子为DNA，一端能与待测microRNA分子部分杂交，另一端能与不参与标记分子杂交的载体分子部分进行杂交；捕获桥分子的部分序列和放大桥分子的部分序列一起与待测microRNA分子的全部序列互补配对，两者与待测microRNA分子互补配对的区域不重叠。

2.根据权利要求1所述的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述的载体分子通过多核苷酸与2-100个生物素分子相连。

3.根据权利要求1所述的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述的载体分子通过化学合成或生物合成。

4.根据权利要求1所述的microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述标记分子的多核苷酸由15-50个一种或多种核苷酸组成。

5.根据权利要求1所述的microRNA检测，其特征在于，还包括杂交液、杂交洗液、封闭液和标记物标记的链霉亲和素或亲和素。