WO2007105786A1 - 核酸検出方法及び核酸検出キット - Google Patents

核酸検出方法及び核酸検出キット Download PDF

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WO2007105786A1
WO2007105786A1 PCT/JP2007/055179 JP2007055179W WO2007105786A1 WO 2007105786 A1 WO2007105786 A1 WO 2007105786A1 JP 2007055179 W JP2007055179 W JP 2007055179W WO 2007105786 A1 WO2007105786 A1 WO 2007105786A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
cyclodextrin
chemical
mono
cyd
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/055179
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Fumio Hamada
Masaya Toda
Yoichi Akagami
Hiroshi Yoshida
Original Assignee
National University Corporation Akita University
Akita Prefecture
Nipro Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National University Corporation Akita University, Akita Prefecture, Nipro Corporation filed Critical National University Corporation Akita University
Priority to JP2008505198A priority Critical patent/JP5429962B2/ja
Publication of WO2007105786A1 publication Critical patent/WO2007105786A1/ja

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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6816Hybridisation assays characterised by the detection means

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid detection method and a kit used for the detection method.
  • Nucleic acid microarrays are technologies that can analyze multiple genes simultaneously, and have been developed not only as a base sequencing method, but also as a method for efficiently examining gene expression levels and polymorphisms. Technological developments such as classification and disease diagnosis are being developed.
  • nucleic acid microarrays that can be used for tailor-made medicine, as well as biological classification or variant identification, are sufficient to qualitatively detect specific base sequences, and are inexpensive disposables such as test papers. There is a need for one.
  • Patent Document 1 discloses a line probe (LiPA: Line Probe Assay, trademark of Indigo Genetics) method as a nucleic acid microarray used in a method for identifying an HCV (hepatitis C virus) isolate. Yes. In this assembly, nucleic acid probes are fixed as parallel lines on a polyamide membrane piece.
  • Line probe Line Probe Assay, trademark of Indigo Genetics
  • Nucleic acid detection on such an assembly is carried out mainly by methods such as the RI labeling method, the fluorescence labeling method, and the enzyme coloring method.
  • the enzyme coloring method is effective as an inexpensive and simple detection method! / Speak.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 7-503143
  • Non-patent literature l Bioorganic & Medical Chemistry Letters vol. 16, 200
  • an object of the present invention is to provide an inexpensive and simple nucleic acid detection method and a kit for performing the detection.
  • the present inventors have found that the mono-modified cyclodextrin is selectively adsorbed to a hybridized double-stranded nucleic acid, and solved the above problems.
  • the present invention comprises the following.
  • the mono-modified cyclodextrin is a compound represented by the formula (1);
  • CyD is a, ⁇ or ⁇ -cyclodextrin
  • R has a length of 1-20 atoms
  • Unsaturated bond, carbonyl, ester, ether, urethane, and amine group are hydrocarbon chains that may contain at least one selected bond, and X is the same intercalator).
  • nucleic acid detection method wherein the nucleic acid is detected using a mono-modified cyclodextrin as a marker.
  • Intercalator power The method for detecting nucleic acid according to 1 or 2 above, which is any one selected from atalidine, fluorescein, pyrene and rhodamine.
  • CyD is ex, ⁇ or ⁇ -cyclodextrin
  • R has a length of 1 to 20 atoms, and is selected from an unsaturated bond, carbonyl, ester, ether, urethane, and amine group.
  • a hydrocarbon chain that may contain one bond, and X is the same intercalator).
  • a nucleic acid detection kit comprising a mono-modified cyclodextrin represented by the following formula (1):
  • CyD is ex, ⁇ or ⁇ -cyclodextrin
  • R has a length of 1 to 20 atoms, and is selected from an unsaturated bond, carbonyl, ester, ether, urethane, and amine group.
  • a hydrocarbon chain that may contain one bond, and X is the same intercalator).
  • the nucleic acid detection kit according to 5 or 6 above which is any one selected from atalidine, fluorescein, pyrene and rhodamine.
  • CyD is oc, ⁇ or ⁇ -cyclodextrin
  • R has a length of 1 to 20 atoms, and a group force selected from unsaturated bond, carbonyl, ester, ether, urethane, and amine is selected.
  • Intercalator power The use according to item 9 above, which is any one selected from atalidine, fluorescein, pyrene and rhodamine.
  • the present invention does not require special modifications to nucleic acids, and can greatly reduce the cost of raw materials.
  • the reagent can be selectively adsorbed only to double-stranded nucleic acid, and the fluorescence emission time becomes longer, so that the detection operation becomes easier.
  • the number of nucleic acid amplification steps such as PCR can be reduced, and the detection time and cost can be further reduced.
  • FIG. 1 is a photographic diagram showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the fluorescence spectrum results of Reference Example 1.
  • the nucleic acid detection method of the present invention mainly includes the following three steps.
  • the “array in which a sample nucleic acid or a nucleic acid probe is immobilized” refers to a nucleic acid to be detected or a single-stranded nucleic acid that can hybridize with a nucleic acid to be detected on a substrate. Generally, it refers to what is called a DNA chip or a DNA microarray.
  • the above-mentioned nucleic acids include DNA, RNA and PNA. Power in terms of frequency of use DNA is often used.
  • the nucleic acid that can be immobilized on the carrier may be a sample nucleic acid or a nucleic acid probe, Viewpoint power that can be produced industrially in advance It is preferably a nucleic acid probe.
  • a sample nucleic acid refers to a nucleic acid to be detected
  • a nucleic acid probe refers to a nucleic acid that can hybridize with the sample nucleic acid.
  • the production of the nucleic acid probe is not particularly limited, for example, it may be synthesized DNA (oligonucleotide) or cDNA reverse-transcribed from mRNA! /. Oligonucleotides can be synthesized using a commercially available automatic nucleic acid synthesizer or the like.
  • the base sequence of the nucleic acid probe is within a range where it can hybridize with the sample nucleic acid
  • insertion, mutation, and mutation of several bases from the completely complementary base sequence of the specific base sequence are possible. It may be a deleted base sequence. However, for example, when it is intended to detect a mutation at a single base level, it is preferable that the nucleotide sequence is completely complementary from the viewpoint of reaction accuracy.
  • the number of bases of the nucleic acid probe is not particularly limited because it differs depending on the type of the specific base sequence to be detected. For example, when detecting a mutation at the genomic DNA-base level extracted from an organism, depending on the temperature at the time of detection, it is about 10 to 30 bases, preferably about 12 to 26 bases from the viewpoint of detection accuracy. is there.
  • the sample nucleic acid is prepared by extracting the genomic DNA of an animal biological sample according to the purpose of measurement.
  • the biological sample includes blood, saliva, hair, and the like, and preferably various human cells such as blood cells, epidermal cells, and mucosal cells.
  • a method for extracting DNA from a biological sample can be performed by a known method, and examples thereof include a phenol extraction method, a guanidinethiocinate extraction method, and a vanadyl ribonucleoside complex extraction method.
  • the specific base sequence to be detected is preferably amplified.
  • the method for amplifying nucleic acid include PCR method, LAMP method and ICAN method. Of these, the PCR method is preferred from the viewpoint of reagent cost.
  • the PCR method includes, for example, (I) a denaturation step in which a double-stranded genomic DNA is made into a single strand by heat treatment under reaction conditions of about 92 to 97 ° C and about 0.1 seconds to 1 minute, (II) Start PCR reaction by binding at least two amplification primers to each of the single-stranded DNAs at about 50 to 65 ° C for about 0.1 seconds to 1 minute. An annealing process to create a double-stranded part to be a point, and (III) a chain extension process in which DNA polymerase is reacted at about 70 to 75 ° C for about 0.1 seconds to 5 minutes.
  • nucleic acids By repeating steps (I) to (III) of 1 to 40 times Nucleic acids can be amplified. Since the nucleic acid detection method of the present invention has very high detection sensitivity, it is possible to reduce the number of repetitions of steps (I) to (III).
  • the primer pair used in the PCR method has a base sequence that can hybridize with the extracted genomic DNA and can amplify a nucleic acid containing the specific base sequence, and the degree of polymerization thereof. May be about 15 to 40 bases.
  • the primer can be synthesized by an automatic synthesizer or the like as in the case of the nucleic acid probe.
  • the substrate used in the array may be any material that can immobilize the nucleic acid.
  • polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polymethyl methacrylate, polyamide, polystyrene, polyethylene terephthalate, and -toro Examples include organic materials such as cellulose, inorganic materials such as glass and silica, and metal materials such as gold, silver, and barrels.
  • the organic material is more preferably polypropylene, polycarbonate, polymethyl methacrylate, and polyamide from the viewpoint of easy molding processability, but is not limited thereto.
  • the base material when an organic material is selected as the base material, a material exhibiting white or transparent is preferable from the viewpoint that detection by color development can be clearly determined, but the present invention is not limited thereto. is not.
  • the shape of the substrate is not limited to the substrate, and examples thereof include containers, films, and tubes. Among these, a rectangular film and a substrate are preferable from the viewpoint of easy handling. In addition, the size of the base material needs to have a certain area from the viewpoint of easy detection. For example, if the substrate is a rectangular film ⁇ beauty substrate, the area of the upper surface, from the viewpoint it is easy to handle, about 40 to: LOO 0 mm 2, preferably about 60 ⁇ 300mm 2.
  • the substrate is not particularly limited because it can be produced by a person skilled in the art according to the situation and can be appropriately set by a person skilled in the art. Examples include extrusion molding, injection molding, melt molding, and compression molding. Extrusion molding is particularly preferred from the viewpoint of production cost and ease.
  • the sample nucleic acid or nucleic acid probe is immobilized on a substrate by physical or chemical treatment.
  • the immobilization method by physical treatment is not particularly limited as long as it is a method of spotting a sample nucleic acid or nucleic acid probe solution as a base material. Examples of such spotting methods include an extrusion method using a dispenser or the like, a suction method using a Coulomb force, and an ink jet method. From the viewpoint of production cost, the extrusion method is not particularly limited, and the inkjet method is preferable from the viewpoint of accuracy of fixation.
  • the base sequence unrelated to the nucleic acid probe include polyadenine, polycytosine, polythymine and polyguanine, and polythymine is preferable from the viewpoint of the highest fixation rate.
  • the substrate may be subjected to some treatment. For example:
  • a method for fixing to chemistry by covalent bond a method of modifying a functional group capable of forming a covalent bond with the base material at the end of the nucleic acid probe.
  • Examples thereof include a method of modifying a functional group capable of covalent bonding.
  • the base material is an inorganic material such as glass or silicon
  • a functional group capable of a silane coupling reaction such as trimethoxysilane or triethoxysilane is modified at the end of the probe for nucleic acid detection to thereby perform silane coupling. Immobilization by reaction;
  • the base material is an inorganic material such as glass or silicon
  • the surface of the base material is treated with a silane coupling agent having an amino group such as aminoaminosilane on the inorganic material base material. Aminated by Kepling bond.
  • the end of the nucleic acid probe The carboxylic acid is modified. And a method of forming an amide bond by an amino coupling reaction between the amino group of the base material and the carboxylic acid of the nucleic acid probe and fixing the amide bond;
  • the base material is a metal material such as gold or silver
  • those skilled in the art can fix the silane coupling bond by replacing it with a metal-thiol or metal disulfide bond. Can be easily conceived.
  • the amount of nucleic acid immobilized is further increased by subjecting the base material to a surface treatment such as plasma treatment.
  • Plasma treatment means discharging the plasma in an inert gas atmosphere to irradiate the substrate surface with the plasma generated by the ionizing action of the inert gas, etching the surface, improving wettability, and introducing functional groups.
  • Examples of the discharge include corona discharge (high pressure and low temperature plasma), arc discharge (high pressure and high temperature plasma), and glow discharge (low pressure and low temperature plasma).
  • corona discharge is preferable from the viewpoint of good surface treatment reactivity, but the present invention is not limited thereto.
  • Examples of the inert gas in the plasma treatment include nitrogen gas, argon gas, oxygen gas, helium gas, neon gas, and xenon gas.
  • Nitrogen gas or argon gas is preferred from the viewpoint of the highest fixed amount of nuclear acid after the plasma treatment.
  • nitrogen gas when nitrogen or DNA having a phosphate skeleton is immobilized on a substrate, nitrogen gas generates amine, Z or amino groups on the surface of the substrate, thereby improving the wettability of the surface and surface charging. It is preferable because the nucleic acid can be more firmly fixed.
  • a sample nucleic acid and a nucleic acid probe are nominated using the array prepared by the method described above.
  • the hybridization method is achieved by following a general technique, for example, when the nucleic acid immobilized on the array substrate is a nucleic acid probe, by immersing the array in a sample nucleic acid solution. The opposite is true when the nucleic acid immobilized on the array substrate is the sample nucleic acid.
  • the conditions for the hybridization reaction are as follows: Depending on the heat denaturation temperature of the tube. For example, when the thermal denaturation temperature force of the DNA probe is about 55.0 to 75.0 ° C, about 61.5-62.5 ° C is common.
  • the sample nucleic acid and the nucleic acid probe can be nobulated on the array.
  • unreacted sample nucleic acid and Z or nucleic acid probe are preferably removed by a washing step.
  • the nucleic acid hybridized by the above means is then detected by adsorbing the mono-modified cyclodextrin in the next step. That is, the detection of the nucleic acid of the present invention includes a step of adsorbing the mono-modified cyclodextrin to the hybridized nucleic acid.
  • the mono-modified cyclodextrin in the present invention is a compound that can be expressed by the following formula (1).
  • CyD is ⁇ , ⁇ or ⁇ -cyclodextrin
  • R is a linker, has a length of 1 to 20 atoms, and consists of unsaturated bond, carbonyl, ester, ether, urethane, and amine.
  • Group force is a hydrocarbon chain that may contain at least one bond selected, and X is an interstitial power generator).
  • Cyclodextrin is a compound in which D-glucose is cyclically linked to 1,4'- ⁇ -dalcoside, has a bucket-like molecular structure, has a hydrophilic outer wall, and hydrophobic It refers to a compound having the ability to have a property.
  • a compound with 6 D-glucoses is called ⁇ -cyclodextrin
  • 7 compounds are called j8-cyclodextrin
  • 8 compounds are called ⁇ -cyclodextrin.
  • the type of cyclodextrin of the present invention may be any of ⁇ , ⁇ , and is preferably a from the viewpoint of solubility in water and j8 from the viewpoint of production cost.
  • the mono-modified cyclodextrin in the present invention refers to a compound in which an intercalator is modified by interposing a linker in the cyclodextrin.
  • the number of substitutions is one, and the substitution site may be any one of primary or secondary hydroxyl groups, but it is preferably modified to primary hydroxyl groups from the viewpoint of easy production. Mono-modification to primary hydroxyl group This can be easily achieved by utilizing the reaction.
  • the linker is a substance having a molecular structure that interposes a cyclodextrin and an intercalator and that adjusts the distance between the cyclodextrin and the intercalator.
  • the linker is also composed of hydrocarbon chain forces mainly having a length of 1 to 20 atoms.
  • atoms corresponding to primary or secondary hydroxyl groups shall not be included. That is, for example, when a primary hydroxyl group is substituted with an amino group to modify an intercalator, the amino group constitutes a cyclodextrin and does not constitute a linker.
  • the linker may include at least one bond selected from the group force of, for example, an unsaturated bond, carbonyl, ester, ether, urethane, and amine.
  • the group force of, for example, an unsaturated bond, carbonyl, ester, ether, urethane, and amine.
  • carbonyl and amine groups are preferable, and an amine group is particularly preferable.
  • an intercalator refers to a substance that can be stably placed in or near the ⁇ -stacking structure of the base bond of a double-stranded nucleic acid, and has a fluorescent property.
  • intercalators are not particularly limited since they can be appropriately selected depending on the type of cyclodextrins, but rhodamine and pyrene are preferred from the viewpoint of easy visual judgment.
  • the intercalator when the surrounding environment is hydrophilic, the intercalator is disposed in or near the hydrophobic cavity of the cyclodextrin. This allows the mono-modified cyclodextrin to be dissolved in water.
  • the intercalator when the mono-modified cyclodextrin approaches a hybridized double-stranded nucleic acid, the intercalator is stably placed at or near the ⁇ -stacking structure of the base bond of the double-stranded nucleic acid and can be selectively adsorbed. .
  • the mono-modified cyclodextrin of the present invention has a state in which an intercalator is arranged at or near the ⁇ -stacking structure of the base bond of a double-stranded nucleic acid as compared with when it is dissolved in water. It is preferable that the structure is more stable.
  • the structure of such a mono-modified cyclodextrin is difficult to describe in general because it depends on the type of cyclodextrin, the length of the linker, the type of intercalator, and the like.
  • the length of the linker is the original length.
  • the number of children is about 1 to 20, and examples of intercalators include atalidine, fluorescein, and oral amine.
  • the length of the linker is about 1 to 20 atoms, and as the intercalator, atalidine or fluorescein is used.
  • Preferred examples of the U-mono-modified cyclodextrin as described above include compounds of the following formulas (2) to (9).
  • the number of linker atoms in the mono-modified cyclodextrin represented by the above formula (2) is four.
  • ⁇ substituted with a primary hydroxyl group is not included in the number of atoms of the linker, and the same applies to all of the following.
  • the number of atoms of the linker in the mono-modified cyclodextrin represented by the above formula (3) is four.
  • the mono-modified cyclodextrin represented by the above formula (7) has 13 linker atoms.
  • the number of atoms of the linker in the mono-modified cyclodextrin represented by the above formula (8) is four.
  • the mono-modified cyclodextrin described above selectively absorbs double-stranded nucleic acids.
  • the conditions for adsorption are the force depending on the amount of nucleic acid immobilized on the array.
  • the above array is immersed in a solution having a concentration of about 10 M to about LOmM, preferably about 0.1 to about LmM at room temperature. Therefore, it can be easily adsorbed.
  • the reaction time is about 1 minute or longer, preferably about 5 minutes or longer as long as the mono-modified cyclodextrin can be sufficiently adsorbed to the double-stranded nucleic acid.
  • washing may be performed to remove unreacted mono-modified cyclodextrin.
  • the array is irradiated with light having an excitation wavelength of the intercalator.
  • the intercalator when the intercalator is pyrene, it irradiates 400nm light with about 200 forces.
  • the intercalator when the intercalator is fluorescein, light of about 200 power and 400 nm is irradiated.
  • the intercalator of the mono-modified cyclodextrin adsorbed on the double-stranded nucleic acid is excited and emits light, and the operator can easily confirm the presence or absence of the double-stranded nucleic acid visually.
  • the mono-modified cyclodextrin of formula (8) emits yellowish green light.
  • the mono-modified cyclodextrin of formula (9) emits light in light blue.
  • the present invention extends to nucleic acid detection kits in addition to nucleic acid detection methods.
  • the nucleic acid detection kit of the present invention contains at least the above-described mono-modified cyclodextrin.
  • the nucleic acid detection kit can contain a reaction buffer in addition to the mono-modified cyclodextrin.
  • a nucleic acid detection kit of the present invention includes a set of modified cyclodextrins together with various DNA chips and DNA microarrays. Since the mono-modified cyclodextrin of the present invention is soluble in water, it can be stored stably for a long period of time.
  • 1-Hydroxybenzotriazolene (1-HOBt, 96 mg, 0.71 mM) and ataridine mononuclear 9 rubonic acid (130 mg, 0.58 mM) were dissolved in 15 ml of pyridine and cooled to -10 ° C.
  • dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 252 mg, 1.22 mM) was dissolved and stirred at ⁇ 15 to ⁇ 10 ° C. for 1 hour, after which these solutions were dissolved in dimethylformamide (DMF 20 ml).
  • 6- (2-aminoethyl) monoamino-6-deoxy-1-alpha-deoxy dexlin (490 mg, 0.48 mM) was gradually removed from the mixture, and stirred at 15-10 ° C. for 0.5 hour. did.
  • the temperature was raised to 0 ° C., and the mixture was reacted for 1 day in an ice bath, and then allowed to react at room temperature for 48 hours.
  • half of the solvent was distilled off by concentration under reduced pressure, and reprecipitation was performed with about 300 ml of acetone to collect the precipitate.
  • the precipitate was packed in a CM-Sephadex C-50 column, and impurities were eluted with 120 Oml of water.
  • the target 6- (Atarizine mono9-carboxylate monoaminoethyl) monoamino-6-deoxy-a-cyclodextrin (Ac-a-CyD
  • the fraction containing the formula (2)) was collected.
  • the solvent was removed by concentration under reduced pressure, and the desired product was collected and dried under reduced pressure to obtain the product (51 1 mg, yield 86.8%).
  • the structure of the obtained product was confirmed by NMR spectrum measurement. Moreover, it confirmed that it melt
  • 1-Hydroxybenzotriazolene (1-HOBt, 104 mg, 0.77 mM) and Atharidin monostrength rubonic acid (141 mg, 0.58 mM) were dissolved in 15 ml of pyridine and cooled to -10 ° C. Next, dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 306 mg, 1.48 mM) was dissolved and stirred at ⁇ 15 to ⁇ 10 ° C. for 1 hour, after which these solutions were added to dimethylformamide (DMF, 20 ml).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • 6- (2aminoethyl) monoamino-6-deoxy-1-beta-cycline dexporin 503 mg, 0.43 mM was gradually removed from the mixture and stirred at 15 to 10 ° C. for 0.5 hour. Raise the temperature to 0 ° C and let it react for 1 day in an ice bath, then react at room temperature for 48 hours. It was. After completion of the reaction, half of the solvent was distilled off by concentration under reduced pressure, and reprecipitation was performed with about 300 ml of acetone to collect the precipitate. The precipitate was packed in a CM-Sephadex C-50 column, and impurities were eluted with 120 Oml of water.
  • the target 6- (Atarizine mono-9-carboxylate monoaminoethyl) monoamino-6-deoxy mono ⁇ -cyclodextrin (Ac- ⁇ -CyD
  • the fraction containing the formula (3)) was collected.
  • the solvent was removed by concentration under reduced pressure, and the desired product was collected and dried under reduced pressure to obtain the product (432 mg, yield 73.3%).
  • the structure of the resulting product was confirmed by NMR spectroscopy. Moreover, it confirmed that it melt
  • 1-Hydroxybenzotriazolene (1-HOBt, 86 mg, 0.41 mM) and ataridine monolithic 9 rubonic acid (141 mg, 0.52 mM) were dissolved in 15 ml of pyridine and cooled to -10 ° C.
  • dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 252 mg, 1.25 mM) was dissolved and stirred at ⁇ 15 to ⁇ 10 ° C. for 1 hour.
  • 6- (11-amino-3,6,9-triazoundedecane) -amino-6-deoxy-at-cyclodextrin 500mg, 0.44mM was gradually added, and the temperature was reduced to -15 ⁇ -10 ° C.
  • 1-Hydroxybenzotriazolene (1-HOBt, 96 mg, 0.71 mM) and ataridine mononuclear uronic acid (130 mg, 0.58 mM) were dissolved in 15 ml of pyridine and cooled to 10 ° C. Next, dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 252 mg, 1.22 mM) was dissolved and stirred at ⁇ 15 to ⁇ 10 ° C. for 1 hour, and then these solutions were added to dimethylformamide (DMF, 20 ml).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • 6- (11 amino-1, 3, 6, 9 triazonedecane) monoamino-6-deoxy-13-cyclodextrin (502 mg, 0.38 mM) was gradually added, and the temperature was 15 to 10 ° C. Stir for 5 hours. The temperature was raised to 0 ° C, and the mixture was reacted for 1 day in an ice bath, and then allowed to react at room temperature for 144 hours. After completion of the reaction, half of the solvent was distilled off by concentration under reduced pressure, and reprecipitation was performed with about 300 ml of acetone, and the precipitate was collected. The precipitate was packed in a CM-Sephadex C-50 column, and impurities were eluted with 1200 ml of water.
  • the target product 6- (Ataridin 9-Carboxylate 11-Amino 1,3,6,9-Triazonedecane) 1-Amino 6-Deoxy j8—cyclodextri (Ac- TEPA- ⁇ -CyD, formula (5))-containing fraction was collected.
  • the solvent was distilled off by concentration under reduced pressure, and the desired product was collected and dried under reduced pressure to obtain the product (321 mg, yield 55.3%).
  • the structure of the obtained product was confirmed by 3 ⁇ 4-NMR spectrum measurement. Moreover, it confirmed that it melt
  • 6- (11 amino-1,3,6,9 triazondedecane) 6-amino-1-deoxy-13-cyclodextrin 500 mg 0.38 mM was gradually added, and 0.5 at 10 5 ° C. Stir for hours.
  • the temperature was raised to 0 ° C., and the mixture was reacted for 1 day in an ice bath, and then allowed to react at room temperature for 144 hours.
  • half of the solvent was removed by concentration under reduced pressure, and reprecipitation was performed with about 300 ml of acetone, and the precipitate was collected.
  • the precipitate was loaded onto a CM-Sephadex C-50 column, and impurities were eluted with 1000 ml of water.
  • 1-Hydroxybenzotriazole 96 mg, 0.71 mM
  • fluorescein 130 mg, 0.58 mM
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • 6- (2-aminoethinole) monoamino-6-deoxy-1- ⁇ -cyclodextrin 502 mg, 0.33 mM
  • the temperature was raised to 0 ° C, and the mixture was reacted for one day in an ice bath, and then allowed to react at room temperature for 144 hours. After completion of the reaction, half of the solvent was removed by concentration under reduced pressure, and reprecipitation was carried out with about 300 ml of acetonitrile, and the precipitate was collected. The precipitate was packed on a CM-Sephadex C-50 column, and impurities were eluted with 1200 ml of water.
  • 1-Hydroxybenzotriazole (1-HOBt, 67 mg, 0.50 mM) and 1-pyrenebutyric acid (133 mg, 0.46 mM) were dissolved in 7 ml of pyridine and cooled to 10 ° C.
  • dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 120 mg, 0.50 mM) was dissolved and stirred at ⁇ 15 to ⁇ 10 ° C. for 2.5 hours.
  • 6- (11 amino-3, 6, 9-triazondedecane) -amino-6-deoxy- ⁇ -cyclodextrin 500mg, 0.38mM gradually and then at -15 ⁇ -10 ° C for 1 hour Stir.
  • the temperature was raised to 0 ° C., and the mixture was reacted for one day in an ice bath, and then reacted at room temperature for 144 hours. After completion of the reaction, half of the solvent was distilled off by concentration under reduced pressure, and reprecipitation was performed with about 300 ml of acetone to collect the precipitate. The precipitate was packed into CM-Sephadex C-50, and impurities were eluted with 1200 ml of water.
  • a polycarbonate (PC) substrate was plasma treated.
  • a small high-performance plasma surface treatment device manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd., PDC200 series was used as the plasma treatment device.
  • the PC substrate was placed in a chamber under a nitrogen gas atmosphere, and was processed for about 600 seconds at an output of 500 W under a high pressure (about 20 Pa) at about 25 ° C.
  • a nucleic acid probe was immobilized on the PC substrate.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (provided by Sigma Dienos Japan) was used.
  • the DND probe of SEQ ID NO: 1 detects the sequence (x-type) of the estrogen receptor allele (Xbal polymorphism) present in the intron region between the first and second exons without being cleaved by the restriction enzyme Xbal Is something that can be done.
  • Polythymine was attached to the 3 ′ end of each nucleic acid probe.
  • terminal transferase (20unitZ / l) is 41
  • deoxythymidine triphosphate (lOpmolZ ⁇ 1) is 10 ⁇
  • nucleic acid probe of SEQ ID NO: 1 50mM
  • NEBuffer4 attached to the product 5 ⁇ l and 5 ⁇ l of the power codylate buffer supplied with the product to 50 ⁇ l of purified water, respectively, add 2 pmolZ ⁇ 1 I got each.
  • Nucleic acid probe for X-type detection (SEQ ID NO: 1): gtggtctaga gttggg
  • a nucleic acid of SEQ ID NO: 2 added with polythymine was prepared and immobilized on the above-described nucleic acid microarray without forming a double strand.
  • Polythymine addition and probe fixation were performed in the same manner as described above.
  • the DNA probe of SEQ ID NO: 2 detects an estrogen receptor allele (Xbal polymorphism) existing in the intron region between the first and second exons, which is cleaved by the restriction enzyme Xbal (type X) It is something that can be done.
  • Nucleic acid probe for X-type detection (SEQ ID NO: 2): tctggagttg ggatga
  • a nucleic acid microarray was produced in the same manner as in Example 1 except that the mono-modified cyclodextrin produced in Synthesis Example 8 was used in place of the mono-modified cyclodextrin produced in Synthesis Example 7 as a marker.
  • a genomic DNA of a specimen that is known to be of type XX in advance is used as a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and Taq DNA polymerase (The nucleotide sequence containing the Xbal polymorphism was amplified by PCR using Roche's Diagno Status Co.). PCR reaction conditions were 94 ° C for 30 seconds for the denaturation process, 55 ° C for 20 seconds for the annealing process, 72 seconds for the chain extension process.
  • Forward primer (SEQ ID NO: 3): gttccaaatg tcccagccgt
  • Reno squeeze primer (IJ No. 4): cctgcaccag aatatgttac c
  • the state of binding between the intercalator of the mono-modified dextrin of the present invention and the base of the double-stranded nucleic acid was confirmed by fluorescence spectrum measurement.
  • the double-stranded nucleic acid was added to the mono-modified cyclodextrin aqueous solution (0.1 M) of Synthesis Example 8 so that the concentration after addition was 0.001 gZ 1, and the solution was stirred for 5 minutes. .
  • the fluorescence spectrum of this solution was measured (excitation wavelength: 365 nm).
  • the fluorescence spectrum of the monocyclodextrin aqueous solution of Synthesis Example 8 was also measured.
  • the present invention eliminates the need for special modifications to nucleic acids, and can greatly reduce the cost of raw materials.
  • the reagent can be selectively adsorbed only to the double-stranded nucleic acid, the detection operation is facilitated. In order to enable detection with high sensitivity, the number of nucleic acid amplification steps such as PCR can be reduced, and the detection time and cost can be further reduced. And since a reagent melt

Abstract

 本発明は、核酸検出方法及び当該検出方法に使用するキットに関する。本発明は、検体核酸又は核酸プローブを固定化したアレイを準備する工程、検体核酸と核酸プローブとをハイブリダイズする工程、ハイブリダイズした二本鎖の核酸にモノ修飾シクロデキストリンを吸着させる工程を含む核酸検出方法による。モノ修飾シクロデキストリンは式(1)に示される化合物である。 CyD-R-X (1) (式中、CyDはα、β又はγ-シクロデキストリン、Rは原子数1~20の長さを有し、不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンからなる群から選択される少なくとも1の結合を含んでもよい炭化水素鎖であり、Xはインターカレーターである。)

Description

明 細 書
核酸検出方法及び核酸検出キット
技術分野
[0001] 本発明は、核酸検出方法及び当該検出方法に使用するキットに関する。
[0002] 本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願 2006— 072083号 優先権を請求する。
背景技術
[0003] 近年、ゲノムシークェンシングの進展により各生物のゲノムの全塩基配列が明らか にされつつある中、この結果を有効に利用する技術が望まれている。核酸マイクロア レイは複数の遺伝子を同時に解析できる技術であり、塩基配列決定法のみではなく 、遺伝子の発現量や多型などを効率よく調べる方法として開発され、テーラーメイド 医療、菌類などの生物学的分類の特定および疾病の診断などへの技術開発が展開 されている。
[0004] 一般に、テーラーメイド医療、ならびに生物学的分類又は変異体の同定に用いられ うる核酸マイクロアレイは、特定の塩基配列を定性的に検出する程度で十分であり、 試験紙のような安価な使い捨て用のものが求められている。
[0005] 例えば、特許文献 1には HCV(C型肝炎ウィルス)単離物の同定方法に用いる核酸 マイクロアレイとして、ラインプローブ(LiPA: Line Probe Assay,イノジジエネテイクス 社商標)法が開示されている。このアツセィは、ポリアミド膜片上に平行線として核酸 プローブが固定されたものである。
[0006] このようなアツセィ上での核酸の検出は、主に RI標識法、蛍光標識法及び酵素発 色法などの方法で実施される。これらの方法の中でも酵素発色法は安価で簡便な検 出方法として有効とされて!/ヽる。
[0007] し力しながら、酵素発色法でさえもプライマーにピオチンを修飾する必要があるため 、その分コストは高くなるという問題がある。さらに酵素発色法では、ストレプトアビジン を修飾したアルカリホスファターゼ、及び、当該ストレプトアビジンに対する基質を作 用'洗浄する必要があり、検出工程が極めて煩雑であった。 [0008] 一方、高感度で簡便な検出方法として、ハイブリダィズした核酸の塩基の π電子ス タツキング構造に作用するインターカレーターに関する研究が近年盛んになされてい る (非特許文献 1)。
[0009] し力しながら、これらのインターカレーターは水に難溶であるためにノ、イブリダィズし た二本鎖の核酸に作用しうるだけの濃度調製が極めて困難であった。また、試薬の 保存性が悪く工業的実施が困難であった。
[0010] 特許文献 1 :特表平 7— 503143号公報
非特許文献 l : Bioorganic & Medical Chemistry Letters vol. 16, 200
5, page 154—157
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] したがって、本発明は安価で簡便な核酸の検出方法、及び、当該検出を行うため のキットを提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明者らは、モノ修飾シクロデキストリンがハイブリダィズした二本鎖の核酸に選 択的に吸着することを見出し、上記課題を解決した。
[0013] 即ち、本発明は、以下からなる。
1. ノ、イブリダィズした核酸を検出する方法であって、
検体核酸又は核酸プローブを固定ィ匕したアレイを準備する工程、
検体核酸と核酸プローブとをハイブリダィズする工程、
ハイブリダィズした二本鎖の核酸にモノ修飾シクロデキストリンを吸着させる工程 を含み、
前記モノ修飾シクロデキストリンが、式(1)に示される化合物であることを特徴とする 核酸検出方法;
[化 1]
CyD-R-X (1 )
(式中、 CyDは a、 β又は γ—シクロデキストリン、 Rは原子数 1〜20の長さを有し、 不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンカ なる群力 選 択される少なくとも 1の結合を含んでもよい炭化水素鎖であり、 Xはインターカレータ 一である)。
2.モノ修飾シクロデキストリンをマーカーとして核酸を検出する前項 1に記載の核酸 検出方法。
3.インターカレーター力 アタリジン、フルォレセイン、ピレン及びローダミンから選択 されるいずれか 1である前項 1又は 2に記載の核酸検出方法。
4.モノ修飾シクロデキストリン力 下記式(2)〜(9)に示される化合物のいずれか 1で ある前項 1〜3のいずれ力 1項に記載の核酸検出方法。
[化 2]
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
Figure imgf000006_0001
[化 9]
Figure imgf000007_0001
5.下記の式(1)に示されるモノ修飾シクロデキストリンを含む核酸検出キット;
[化 10]
CyD-R-X (1 )
(式中、 CyDは ex、 β又は γ—シクロデキストリン、 Rは原子数 1〜20の長さを有し、 不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンカ なる群力 選 択される少なくとも 1の結合を含んでもよい炭化水素鎖であり、 Xはインターカレータ 一である)。
6.二本鎖核酸を検出するためのキットであって、
検体核酸又は核酸プローブを固定化した核酸マイクロアレイと、
下記の式(1)に示されるモノ修飾シクロデキストリンを含む核酸検出キット;
[化 11]
CyD-R-X (1 )
(式中、 CyDは ex、 β又は γ—シクロデキストリン、 Rは原子数 1〜20の長さを有し、 不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンカ なる群力 選 択される少なくとも 1の結合を含んでもよい炭化水素鎖であり、 Xはインターカレータ 一である)。
7.インターカレーター力 アタリジン、フルォレセイン、ピレン及びローダミンから選択 されるいずれか 1である前項 5又は 6に記載の核酸検出キット。
8.モノ修飾シクロデキストリン力 下記式(2)〜(9)に示される化合物のいずれか 1で ある前項 5〜7のいずれ力 1項に記載の核酸検出キット。
[化 12]
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
[化 16]
Figure imgf000009_0001
9.下記式(1)に示されるモノ修飾シクロデキストリンの、二本鎖の核酸との選択的結 合性を利用した核酸検出のための用途;
[化 20] CyD-R-X (1 )
(式中、 CyDは oc、 β又は γ—シクロデキストリン、 Rは原子数 1〜20の長さを有し、 不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンカ なる群力 選 択される少なくとも 1の結合を含んでもよい炭化水素鎖であり、 Xはインターカレータ 一である)。
10.インターカレーター力 アタリジン、フルォレセイン、ピレン及びローダミンから選 択されるいずれか 1である前項 9に記載の用途。
11.モノ修飾シクロデキストリン力 下記式(2)〜(9)に示される化合物のいずれか 1 である前項 9又は 10に記載の用途。
[化 21]
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
Figure imgf000010_0003
Figure imgf000011_0001
[化 28]
Figure imgf000012_0001
発明の効果
[0014] 本発明は、核酸に特別な修飾を行う必要がなく原材料のコストが大幅に削減できる 。また、試薬が二本鎖の核酸のみに選択的に吸着することができ、蛍光発光時間が 長くなるため、検出作業が容易となる。カロえて、高感度での検出を可能とするために 、 PCRなどの核酸の増幅工程の回数を抑えることができ、検出の時間及びコストをさ らに削減することが可能となる。そして、試薬は水に容易に溶解するため安定して保 存することができ、工業的実施を可能とすることができる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1は、実験例 1の結果を示す写真図である。
[図 2]図 2は、参考例 1の蛍光スペクトルの結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明の核酸検出方法は、主に以下の 3工程を含む。
(1)検体核酸又は核酸プローブを固定ィ匕したアレイを準備する工程。
(2)検体核酸と核酸プローブとをハイブリダィズする工程。
(3)ハイブリダィズした二本鎖の核酸にモノ修飾シクロデキストリンを吸着させる工程
[0017] (1)検体核酸又は核酸プローブを固定ィ匕したアレイを準備する工程
「検体核酸又は核酸プローブを固定ィ匕したアレイ」とは、検出対象の核酸、又は、検 出対象の核酸とハイブリダィズしうる一本鎖の核酸を基材上に固定ィ匕したものをいい 、一般的には DNAチップ又は DNAマイクロアレイと称するものをいう。上記核酸は、 DNA、 RNAおよび PNAが挙げられる力 使用頻度の観点力 DNAが多く使用さ れる。
[0018] 担体に固定されうる核酸は、検体核酸であっても、核酸プローブであってもよいが、 予め工業的に製造できる観点力 核酸プローブであることが好ましい。検体核酸とは 、検出の対象となる核酸を、核酸プローブとは、当該検体核酸とハイブリダィズしうる 核酸をいう。核酸プローブの製造は、特に限定されるものではなぐ例えば、合成され た DNA (オリゴヌクレオチド)又は mRNAから逆転写された cDNAであってもよ!/、。 オリゴヌクレオチドの合成は、市販の核酸の自動合成機などで合成することができる。
[0019] さらに、上記核酸プローブの塩基配列は、検体核酸とハイブリダィズすることが可能 な範囲内であれば、前記特定の塩基配列の完全相補的な塩基配列から数個の塩基 の挿入、変異および欠失された塩基配列であってもよい。し力しながら、例えば、一 塩基レベルの変異を検出することを目的とした場合、反応精度の観点から、完全相 補的な塩基配列であることが好まし 、。
[0020] また、上記核酸プローブの塩基数は、検出する特定の塩基配列の種類によって異 なるため、特に限定されるものではない。例えば、生物から抽出されたゲノム DNA— 塩基レベルの変異を検出する場合は、検出する時の温度にもよるが、検出精度の観 点から約 10〜30塩基、好ましくは約 12〜26塩基である。
[0021] 一方、検体核酸の調製は、測定の目的に応じて動物の生体試料力 ゲノム DNAを 抽出する。生体試料とは、血液、唾液又は毛髪などが挙げられ、好ましくは、血球細 胞、表皮細胞および粘膜細胞などの各種ヒト細胞である。生体試料から DNAを抽出 する方法は、公知の方法で行うことができ、例えば、フエノール抽出法、グァニジンチ オシナネート抽出法およびバナジルリボヌクレオシド複合抽出法などが挙げられる。
[0022] 次に、好ましくは上記抽出されたゲノム DNA力 検出すべき特定の塩基配列を増 幅する。核酸を増幅する手法としては、例えば、 PCR法、 LAMP法および ICAN法 などが挙げられる。中でも試薬のコストの観点から、 PCR法が好ましい。
[0023] PCR法は、例えば、(I)二本鎖ゲノム DNAを約 92〜97°C、約 0. 1秒〜 1分間の反 応条件で熱処理することにより一本鎖にする変性工程、 (II)前記一本鎖 DNAのそれ ぞれに約 50〜65°Cを約 0. 1秒〜 1分間の反応条件で、少なくとも 2種類の増幅ブラ イマ一を結合させることにより PCRの反応開始点となる二本鎖部分を作製するァニー ル工程、並びに、(III)約 70〜75°Cを約 0. 1秒〜 5分間の反応条件で DNAポリメラ ーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の(I)〜(III)の工程を、 1〜40回繰り返すことで 核酸を増幅することができる。本発明の核酸の検出方法は、検出感度が非常に高い ことからこれら (I)〜(III)の工程の繰り返し回数を少なくすることが可能である。
[0024] また、上記 PCR法に用いられるプライマー対は、上記抽出されたゲノム DNAとハイ ブリダィズすることができ、上記特定の塩基配列を含む核酸を増幅しうる塩基配列を 有し、その重合度は約 15〜40塩基程度のものであればよい。前記プライマーは、上 記核酸プローブと同様自動合成機などで合成することができる。
[0025] また、アレイに使用される基材としては、上記核酸を固定しうる材料であればよぐ 例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリ アミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート及び-トロセルロースなどの有機材料 、ガラス及びシリカなどの無機材料、並びに、金、銀及び胴などの金属材料などが挙 げられる。これらの中でも成形加工性が容易である点から、有機材料が好ましぐさら に好ましくは、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル及びポリアミド であるが、これに限定されるものではない。
[0026] さらに、基材として有機材料を選択する場合、発色による検出が明確に判断するこ とができる観点から、白色又は透明を呈した材料が好ましいが、本発明はこれに限定 されるものではない。
[0027] 基材の形状としては、基板だけに限定されず、例えば、容器、フィルム及びチュー ブなどが挙げられる。これらの中でも取り扱いが容易である観点から、長方形状のフ イルム及び基板が好ましい。また、基材の大きさなどは、検出を容易にする観点から、 検出する面はある程度の面積が必要である。例えば、基材が長方形状のフィルム及 び基板である場合、上表面の面積は、取り扱いが容易である観点から、約 40〜: LOO 0mm2,好ましくは約 60〜300mm2である。
[0028] 基材は、当業者により状況に応じて製造することができ、当業者が適宜設定できる ものであるため特に限定されるものではない。例えば、押出成形、射出成形、溶融成 形および圧縮成形などが挙げられる。特に製造コストおよび容易性の観点から、押出 成形が好ましい。
[0029] 上記検体核酸又は核酸プローブは、物理的若しくは化学的処理により基材上に固 定化される。 [0030] 物理的な処理による固定ィ匕方法としては、検体核酸又は核酸プローブの溶液を基 材にスポッティングする方法であれば特に限定されるものではな 、。このようなスポッ ティングの方法としては、デイスペンサなどを用いた押出し法,クーロン力を用いた吸 引法及びインクジェット法などが挙げられる。製造コストの観点力 は押出し法が、固 定ィ匕の精度の観点からはインクジェット法が好ましぐ特に限定されるものではない。
[0031] また、このような物理的な処理により固定ィ匕する場合は、上記核酸プローブに無関 係な塩基配列を付加すれば、 UV照射により基材に固定ィ匕率が向上して好ましい。 前記核酸プローブに無関係な塩基配列とは、ポリアデニン、ポリシトシン、ポリチミン およびポリグァニンなどが挙げられるが、固定ィ匕率が最も高い観点力もポリチミンが 好ましい。
[0032] また、核酸プローブは親水性高分子であるため、基材に何らかの処理を行ってもよ い。例えば:
(A) ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子を基材表面に被覆する方法;
(B) 基材がガラスなどの無機材料である場合、アミノエトキシシランなどのアミノ基を 有するシランカップリング剤などで処理する方法;
(C) 基材が金などの金属材料である場合は、 2—アミノエタンチオールなどのアミノ 基を有するチオールもしくはジスルフイド化合物などで担体表面を処理する方法; などが挙げられる。
[0033] 一方で、共有結合による化学に固定ィ匕する方法としては、核酸プローブの末端に 基材と共有結合形成可能な官能基を修飾する方法、もしくは、核酸プローブの末端 および基材にそれぞれ共有結合可能な官能基を修飾する方法などが挙げられる。 例えば:
(a) 基材が、ガラスおよびシリコンなどの無機材料の場合、核酸検出用プローブの末 端にトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能 基を修飾し、シランカップリング反応により固定ィ匕する方法;
(b) 基材が、ガラス、シリコンなどの無機材料の場合、上記無機材料基材上に、ァミノ エトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、基 材の表面をシランケップリング結合によりアミノ化する。一方で、核酸プローブの末端 にカルボン酸を修飾する。そして、基材のァミノ基と核酸プローブのカルボン酸のアミ ノカップリング反応によりアミド結合を形成させて固定ィ匕する方法;
などが挙げられる。
[0034] また、基材が金、銀などの金属材料の場合であっても、当業者であれば、前記シラ ンカップリング結合を、金属ーチオール又は金属 ジスルフイド結合に置きかえること によって固定ィ匕できることは容易に想到することができる。
[0035] 以上の固定化方法の中でも、核酸の固定化に関しては、製造が容易である観点か ら、上記核酸プローブの末端にポリチミンを付加し、 UV照射により固定ィ匕する方法 が好ましい。
[0036] また、基材にプラズマ処理などの表面処理を施すことにより核酸の固定ィ匕量はさら に増加する。プラズマ処理とは、不活性ガス雰囲気下で放電する事により、前記不活 性ガスの電離作用によって生じるプラズマを基材表面に照射し、当該表面をエツチン グ、濡れ性の向上及び官能基の導入などの効果を付与する処理をいう。放電として は、コロナ放電 (高圧低温プラズマ)、アーク放電 (高圧高温プラズマ)及びグロ一放 電 (低圧低温プラズマ)などが挙げられる。これらの中でも表面処理の反応性がよい 観点から、コロナ放電が好ましいが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[0037] 前記プラズマ処理における不活性ガスとしては、窒素ガス、アルゴンガス、酸素ガス 、ヘリウムガス、ネオンガス及びキセノンガスなどが挙げられる。プラズマ処理後の核 酸の固定量が最も高くなる観点から、窒素ガス又はアルゴンガスが好ましい。特に、 窒素ガスは、リン酸骨格を有する DNA又は RNAを基材に固定する場合、基材表面 にァミン及び Z又はアミノ基を発生させ、当該表面の濡れ性の向上及び表面のィォ ンチャージによって、より強固に核酸を固定することができて好ましい。
[0038] (2)検体核酸と核酸プローブとをハイブリダィズする工程
以上に説明した手法により準備したアレイを用いて検体核酸と核酸プローブとをノヽ イブリダィズする。ノ、イブリダィズの方法は一般的な手法に従い、例えば、アレイの基 材上に固定ィ匕した核酸が核酸プローブである場合、検体核酸の溶液に当該アレイを 浸漬することにより達成される。アレイの基材上に固定ィ匕した核酸が検体核酸である 場合はその逆となる。ノ、イブリダィズ反応の条件は、基材に固定ィ匕された DNAプロ 一ブの熱変性温度による。例えば、前記 DNAプローブの熱変性温度力 約 55. 0〜 75. 0°C程度である場合、約 61. 5-62. 5°Cが一般的である。
[0039] 以上の方法により検体核酸と核酸プローブがアレイ上でノヽイブリダィズすることがで きる。この際、未反応の検体核酸及び Z又は核酸プローブは洗浄工程により除去す ることが好ましい。
[0040] (3)前記ハイブリダィズした核酸にモノ修飾シクロデキストリンを吸着させる工程
上記の手段によってハイブリダィズした核酸は、次 、でモノ修飾シクロデキストリンを 吸着させること〖こよって検出する。つまり、本発明の核酸の検出は、ハイブリダィズし た核酸にモノ修飾シクロデキストリンを吸着させる工程を含む。本発明におけるモノ修 飾シクロデキストリンとは、下記式(1)で表現されうる化合物を 、う。
[0041] [化 29]
CyD-R-X (1 )
(式中、 CyDは α、 β又は γ—シクロデキストリン、 Rはリンカ一であり、原子数 1〜20 の長さを有し、不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンか らなる群力 選択される少なくとも 1の結合を含んでもよい炭化水素鎖であり、 Xはィ ンタ一力レーターである)。
[0042] シクロデキストリンとは、 D—グルコースが環状に 1 , 4 ' - α—ダルコシド結合した化 合物をいい、バケツのような形状の分子構造を有し、親水性を有する外壁と、疎水性 を有するキヤビティを有する化合物をいう。一般的に、 D—グルコースの数が 6個の化 合物を α—シクロデキストリン、 7個の化合物を j8—シクロデキストリン、 8個の化合物 を Ύ—シクロデキストリンとそれぞれ称す。本発明のシクロデキストリンの種類は、 ひ、 β及び γのいずれであってもよいが、水への溶解性の観点から a、製造コストの観 点から j8が好ましい。
[0043] 本発明におけるモノ修飾シクロデキストリンとは、上記シクロデキストリンにリンカ一を 介在してインターカレーターが修飾された化合物をいう。置換数は 1つであり、置換 箇所は 1級又は 2級の水酸基の何れ力 1であればよいが、製造が容易である観点か ら 1級の水酸基に修飾することが好ましい。 1級の水酸基へのモノ修飾は、トシルイ匕 反応を利用することにより容易に達成できる。
[0044] また、リンカ一とはシクロデキストリンとインターカレーターとを介在する分子構造を 有し、当該シクロデキストリンとインターカレーターとの距離を調節するものをいう。リン カーは、主に原子数 1〜20の長さを有する炭化水素鎖力も構成される。この時、 1級 又は 2級の水酸基に該当する原子は含まないものとする。つまり、例えば、 1級の水 酸基がァミノ基に置換してインターカレーターを修飾する場合、当該アミノ基はシクロ デキストリンを構成し、リンカ一を構成するものではないものとする。またリンカ一は、 例えば、不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンカ なる 群力 選択される少なくとも 1の結合を含んでもよい。特に親水性を付与できる観点 から、カルボニル及びアミン基が好ましぐ特に好ましくはァミン基である。
[0045] さらに、インターカレーターとは、二本鎖の核酸の塩基結合の πスタツキング構造又 はその近傍に安定して配置しうる物質をいい、蛍光特性を有する物質をいう。例えば 、 Ν ァセトキシ Ν —ァセチルァミノオルオレン、アタリジン、フルォレセイン、ピレ
2
ン及びローダミンなどが挙げられる。これらのインターカレーターは、シクロデキストリ ンの種類によって適宜選択できるものであるため、特に限定されるものではないが、 目視での判定が容易となる観点からローダミン及びピレンが好ま 、。
[0046] 以上に説明したモノ修飾シクロデキストリンは、その周りの環境が親水的である場合 、インターカレーターはシクロデキストリンの疎水性キヤビティ内又はその近傍に配置 される。このことにより当該モノ修飾シクロデキストリンは、水に溶解することができる。 一方、当該モノ修飾シクロデキストリンがハイブリダィズした二本鎖の核酸に近づくと、 インターカレーターは二本鎖の核酸の塩基結合の πスタツキング構造又はその近傍 に安定して配置され、選択的に吸着されうる。
[0047] したがって、本発明のモノ修飾シクロデキストリンは、水に溶解している時よりも、二 本鎖の核酸の塩基結合の πスタツキング構造又はその近傍に、インターカレーター が配置されて 、る状態の方が安定であるような構造であることが好ま 、。このような モノ修飾シクロデキストリンの構造は、シクロデキストリンの種類、リンカ一の長さ、及び 、インターカレーターの種類などに依存するために一概に述べることは困難である。
[0048] 例えば、シクロデキストリンが ex—シクロデキストリンである場合、リンカ一の長さは原 子数 1〜20程度であり、インターカレーターとしてはアタリジン、フルォレセイン及び口 ーダミンなどが挙げられる。
[0049] また、例えば、シクロデキストリンが β—シクロデキストリンである場合、リンカ一の長 さは原子数 1〜20程度であり、インターカレーターとしてはアタリジン、フルォレセイン
、ピレン及びローダミンなどが挙げられる。
[0050] 以上のような好ま Uヽモノ修飾シクロデキストリンとしては、以下の式(2)〜(9)の化 合物などが例示される。
[0051] [化 30]
Figure imgf000019_0001
[0052] 上記式(2)に示すモノ修飾シクロデキストリンにおけるリンカ一の原子数は 4個であ る。ここにおいて、 1級水酸基が置換した ΝΗはリンカ一の原子数に含まないものとし 、以下、全てについて同様である。
[0053] [化 31]
Figure imgf000019_0002
[0054] 上記式(3)に示すモノ修飾シクロデキストリンにおけるリンカ一の原子数は 4個であ る。
[0055] [化 32]
Figure imgf000020_0001
[0056] 上記式 (4)に示すモノ修飾シクロデキストリンにおけるリンカ一の原子数は 13個で ある。
[0057] [化 33]
Figure imgf000020_0002
[0058] 上記式(5)に示すモノ修飾シクロテキストリンにおけるリンカ一の原子数は 13個で ある。
[0059] [化 34]
Figure imgf000020_0003
[0060] 上記式(6)に示すモノ修飾シクロデキストリンにおけるリンカ一の原子数は 13個で ある。
[0061] [化 35]
Figure imgf000021_0001
[0062] 上記式(7)に示すモノ修飾シクロデキストリンにおけるリンカ一の原子数は 13個で ある。
[0063] [化 36]
Figure imgf000021_0002
[0064] 上記式(8)に示すモノ修飾シクロデキストリンにおけるリンカ一の原子数は 4個であ る。
[0065] [化 37]
Figure imgf000021_0003
[0066] 上記式(9)に示すモノ修飾シクロデキストリンにおけるリンカ一の原子数は 17個で ある。
[0067] 以上に説明したモノ修飾シクロデキストリンは、二本鎖の核酸に対して選択的に吸 着する。吸着時の条件は、アレイ上に固定した核酸の量にもよる力 通常約 10 M 〜: LOmM程度、好ましくは約 0. 1〜: LmM程度の濃度の溶液に上記アレイを常温で 浸漬することにより、容易に吸着させることができる。反応時間は、モノ修飾シクロデ キストリンが、二本鎖の核酸へ十分に吸着できる程度であればよぐ約 1分以上、好ま しくは約 5分以上である。また、吸着反応後は、未反応のモノ修飾シクロデキストリンを 除去するために洗浄を行ってもょ ヽ。
[0068] 上記工程で吸着させた後は、インターカレーターの励起波長の光をアレイに照射 する。例えば、インターカレーターがピレンの場合、約 200力も 400nmの光を照射す る。また、例えば、インターカレーターがフルォレセインの場合、約 200力ら 400nmの 光を照射する。この事により、二本鎖の核酸に吸着したモノ修飾シクロデキストリンの インターカレーターが励起 '発光し、作業者は目視で容易に二本鎖の核酸の存在の 有無を確認することができる。例えば、式 (8)のモノ修飾シクロデキストリンは、黄緑色 で発光する。また、例えば、式(9)のモノ修飾シクロデキストリンは、水色で発光する。
[0069] 本発明は、核酸検出方法のほか核酸検出キットにも及ぶ。本発明の核酸検出用キ ットには、少なくとも上述したモノ修飾シクロデキストリンを含む。核酸検出キットには、 モノ修飾シクロデキストリンの他、反応用緩衝液を含めることができる。また、各種の D NAチップや DNAマイクロアレイとともに修飾シクロデキストリンをセットにしたものも 本発明の核酸検出キットに含まれる。本発明のモノ修飾シクロデキストリンは、水に可 溶であるために長期間保存安定して保存することができる。
実施例
[0070] 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは ない。
[0071] [合成例 1] 6—(アタリジン一 9—カルボキシレート一 2—アミノエチル)一アミノー 6 —デォキシ一 (X—シクロデキストリン (Ac— a -CyD)
1—ヒドロキシベンゾトリァゾーノレ(1— HOBt、 96mg、 0. 71mM)とアタリジン一 9 一力ルボン酸(130mg、 0. 58mM)を 15mlのピリジンに溶解させ、— 10°Cまで冷却 した。次に、ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC、 252mg、 1. 22mM)を溶解させ 、— 15〜― 10°Cにて 1時間攪拌した後、これらの溶液をジメチルホルムアミド(DMF 、 20ml)に加えた。その後、 6— (2—アミノエチル)一アミノー 6—デォキシ一 α—シ ク口デキス卜リン(490mg、 0. 48mM)を徐々にカロ免、 15〜一 10oCにて 0. 5時間 攪拌した。 0°Cまで昇温し、氷浴にて 1昼夜反応させた後、室温にて 48時間反応させ た。反応終了後、減圧濃縮にて半分量の溶媒を留去し、約 300mlのアセトンで再沈 させ、沈殿物を回収した。沈殿物を CM— SephadexC— 50カラムに充填し、水 120 Omlにて不純物を溶出させた。次いで、 0. 1 %アンモニア水 1000mlにて溶出し、 目 的物である 6— (アタリジン一 9—カルボキシレート一アミノエチル)一アミノー 6—デォ キシ— a—シクロデキストリン (Ac— a— CyD、式(2) )が含まれている画分を回収し た。減圧濃縮にて溶媒を留去し、 目的物を回収した後、減圧乾燥することにより生成 物(51 1mg、収率 86. 8%)を得た。得られた生成物は、 NMRスペクトル測定 によりその構造を確認した。また、水に容易に溶解することを確認した。
[0072] [化 38]
Figure imgf000023_0001
[0073] [合成例 2」 6—(アタリジン一 9—カルボキシレート一 2 アミノエチル)一アミノー 6 —デォキシ一 β—シクロデキストリン (Ac— β - CyD)
1—ヒドロキシベンゾトリァゾーノレ(1— HOBt、 104mg、 0. 77mM)とアタリジン一 9 一力ルボン酸(141mg、 0. 58mM)を 15mlのピリジンに溶解させ、—10°Cまで冷却 した。次に、ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC、 306mg、 1. 48mM)を溶解させ 、 — 15〜― 10°Cにて 1時間攪拌した後、これらの溶液をジメチルホルムアミド(DMF 、 20ml)に加えた。その後、 6— (2 アミノエチル)一アミノー 6 デォキシ一 β—シ ク口デキス卜リン(503mg、 0. 43mM)を徐々にカロ免、 15〜一 10oCにて 0. 5時間 攪拌した。 0°Cまで昇温し、氷浴にて 1昼夜反応させた後、室温にて 48時間反応させ た。反応終了後、減圧濃縮にて半分量の溶媒を留去し、約 300mlのアセトンで再沈 させ、沈殿物を回収した。沈殿物を CM— SephadexC— 50カラムに充填し、水 120 Omlにて不純物を溶出させた。次いで、 0. 1 %アンモニア水 1000mlにて溶出し、 目 的物である 6— (アタリジン一 9—カルボキシレート一アミノエチル)一アミノー 6—デォ キシ一 β—シクロデキストリン (Ac— β— CyD、式(3) )が含まれている画分を回収し た。減圧濃縮にて溶媒を留去し、 目的物を回収した後、減圧乾燥することにより生成 物(432mg、収率 73. 3%)を得た。得られた生成物は、 — NMRスペクトル測定 によりその構造を確認した。また、水に容易に溶解することを確認した。
[0074] [化 39]
Figure imgf000024_0001
[0075] [合成例 3] 6—(アタリジン一 9—カルボキシレート一 11—ァミノ一 3, 6, 9—トリァゾ ゥンデカン)一アミノー 6—デォキシ一 at—シクロデキストリン (Ac— TEPA— a— Cy D)
1—ヒドロキシベンゾトリァゾーノレ(1— HOBt、 86mg、 0. 41mM)とアタリジン一 9 一力ルボン酸(141mg、 0. 52mM)を 15mlのピリジンに溶解させ、—10°Cまで冷却 した。次に、ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC、 252mg、 1. 25mM)を溶解させ 、— 15〜― 10°Cにて 1時間攪拌した。その後、 6— ( 11—ァミノ— 3, 6, 9—トリァゾ ゥンデカン)一アミノー 6—デォキシ一 atーシクロデキストリン(500mg、 0. 44mM)を 徐々に加え、— 15〜― 10°Cにて 0. 5時間攪拌した。 0°Cまで昇温し、氷浴にて 1昼 夜反応させた後、室温にて 96時間反応させた。反応終了後、減圧濃縮にて半分量 の溶媒を留去し、約 300mlのアセトンで再沈させ、沈殿物を回収した。沈殿物を、 C M— SephadexC— 50絡むに充填し、水 1200mlにて不純物を溶出させた。次いで 、 0. 1 %アンモニア水 1200mlにて溶出し、 目的物である 6—(アタリジン— 9—カル ボキシレート一 11—ァミノ一 3, 6, 9 トリァゾゥンデカン)一ァミノ一 6 デォキシ一 a—シクロデキストリン(Ac— TEPA— a— CyD、式(4) )が含まれている画分を回 収した。減圧濃縮にて溶媒を留去し、 目的物を回収した後、減圧乾燥することにより 生成物(432mg、収率 73. 3%)を得た。得られた生成物は、 NMRスペクトル 測定によりその構造を確認した。また、水に容易に溶解することを確認した。
[0076] [化 40]
Figure imgf000025_0001
[0077] [合成例 4] 6—(アタリジン一 9—カルボキシレート一 11—ァミノ一 3, 6, 9 トリァゾ ゥンデカン)一アミノー 6—デォキシ一 13—シクロデキストリン (Ac— TEPA— β - Cy D)
1—ヒドロキシベンゾトリァゾーノレ(1— HOBt、 96mg、 0. 71mM)とアタリジン一 9 一力ルボン酸(130mg、 0. 58mM)を 15mlのピリジンに溶解させ、 10°Cまで冷却 した。次に、ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC、 252mg、 1. 22mM)を溶解させ 、 — 15〜― 10°Cにて 1時間攪拌した後、これらの溶液をジメチルホルムアミド(DMF 、 20ml)に加えた。その後、 6— ( 11 ァミノ一 3, 6, 9 トリァゾゥンデカン)一ァミノ —6—デォキシ一 13—シクロデキストリン(502mg、 0. 38mM)を徐々に加え、 15 〜一 10°Cにて 0. 5時間攪拌した。 0°Cまで昇温し、氷浴にて 1昼夜反応させた後、 室温にて 144時間反応させた。反応終了後、減圧濃縮にて半分量の溶媒を留去し、 約 300mlのアセトンで再沈させ、沈殿物を回収した。沈殿物を CM— SephadexC— 50カラムに充填し、水 1200mlにて不純物を溶出させた。次いで、 0. 1 %アンモニア 水 1000mlにて溶出し、 目的物である 6— (アタリジン一 9—カルボキシレート一 11— ァミノ一 3, 6, 9—トリァゾゥンデカン)一ァミノ一 6—デォキシ j8—シクロデキストリ ン (Ac— TEPA— β— CyD、式(5) )が含まれている画分を回収した。減圧濃縮に て溶媒を留去し、 目的物を回収した後、減圧乾燥することにより生成物(321mg、収 率 55. 3%)を得た。得られた生成物は、 ¾— NMRスペクトル測定によりその構造を 確認した。また、水に容易に溶解することを確認した。
[0078] [化 41]
Figure imgf000026_0001
[0079] [合成例 5] 6— (ローダミン一カルボキシレート一 11—ァミノ一 3, 6, 9 トリァゾゥン デカン)一アミノー 6—デォキシ一 at—シクロデキストリン (RB— TEPA— a— CyD) 1—ヒドロキシベンゾトリァゾーノレ(1— HOBt 77mg 0. 57mM)とローダミン B (2 52mg 0. 53mM)を 10mlのピリジン及びジメチルホルムアミド(DMF)の混合溶媒 ( 1 : 1)に溶解させ、 10°Cまで冷却する。次に、 1—ェチル—3— (3 ジメチルアミ ノプロピル)一カルポジイミド(EDC 110mg 0. 56mM)を溶解させ、 20°Cにて 2 時間攪拌した。その後、 6— ( 11—ァミノ一 3, 6, 9—トリァゾゥンデカン)一ァミノ一 6 —デォキシ一 α—シクロデキストリン(500mg 0. 44mM)を徐々にカロえ、 10 5°Cにて 1時間攪拌した。 0°Cまで昇温し、氷浴にて 1昼夜反応させた後、室温にて 9 6時間反応させる。反応終了後減圧濃縮にて半分量の溶媒を留去し、約 300mlのァ セトンで再沈させ、沈殿物を回収した。沈殿物を CM— SephadexC— 50カラムに充 填し、水 1100mlにて不純物を溶出させた。次いで、 0. 2%アンモニア水 2000mlに て溶出し、 目的物である 6— (ローダミン一カルボキシレート一 11—ァミノ一 3, 6, 9 - トリァゾゥンデカン)一アミノー 6—デォキシ一 at—シクロデキストリン (RB— TEPA— a - CyD,式 (6) )が含まれている画分を回収した。減圧濃縮にて溶媒を留去し、 目 的物を回収した後、減圧乾燥することにより生成物(283mg、収率 40%)を得た。得 られた生成物は、 ^ NMR ^ベクトル測定によりその構造を確認した。
Figure imgf000027_0001
[合成例 6] 6— (ローダミン一カルボキシレート一 11—ァミノ一 3, 6, 9 トリァゾゥン デカン)一アミノー 6—デォキシ一 13—シクロデキストリン (RB— TEPA— β— CyD) 1—ヒドロキシベンゾトリァゾーノレ(1— HOBt 69mg 0. 50mM)とローダミン B (2 20mg 0. 54mM)を 20mlのピリジン及びジメチルホルムアミド(DMF)の混合溶媒 (1 : 1)に溶解させ、 10°Cまで冷却した。次に、 1—ェチル—3— (3 ジメチルアミ ノプロピル)一カルポジイミド(EDC 110mg 0. 56mM)を溶解させ、 20°Cにて 2 時間攪拌した。その後、 6— (11 ァミノ一 3, 6, 9 トリァゾゥンデカン)一ァミノ一 6 —デォキシ一 13—シクロデキストリン(500mg 0. 38mM)を徐々に加え、 10 5°Cにて 0. 5時間攪拌した。 0°Cまで昇温し、氷浴にて 1昼夜反応させた後、室温に て 144時間反応させた。反応終了後減圧濃縮にて半分量の溶媒を留去し、約 300m 1のアセトンで再沈させ、沈殿物を回収した。沈殿物を CM— SephadexC— 50カラム に充填し、水 1000mlにて不純物を溶出させた。次いで、 0. 2%アンモニア水 1400 mlにて溶出し、 目的物である 6— (ローダミン一カルボキシレート一 11—ァミノ一 3, 6 , 9—トリァゾゥンデカン)一ァミノ一 6—デォキシ一 13—シクロデキストリン (RB— TEP A- β -CyD,式 (7) )が含まれている画分を回収した。減圧濃縮にて溶媒を留去し 、 目的物を回収した後、減圧乾燥することにより生成物(260mg、収率 40%)を得た 。得られた生成物は、 ^—NMRスペクトル測定によりその構造を確認した。また、水 に容易に溶解することを確認した。 目的物である 6— (ローダミン—カルボキシレート — 11—ァミノ一 3, 6, 9 トリァゾゥンデカン)一ァミノ一 6 デォキシ j8—シクロデ キストリン (RB— TEPA— β -CyD,式(7) )を回収した。 [0082] [化 43]
Figure imgf000028_0001
[0083] [合成例 7] 6— (フルォレセイン一カルボキシレート一 2—アミノエチル)一アミノー 6 —デォキシ一 β—シクロデキストリン(FL— β -CyD)
1—ヒドロキシベンゾトリアゾール(1— HOBt、 96mg、 0. 71mM)とフルォレセイン (130mg、 0. 58mM)を 15mlのピリジンに溶解させ、— 10°Cまで冷却した。次に、 ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC、 252mg、 1. 22mM)を溶解させ、—15〜― 10°Cにて 1時間攪拌した。その後、 6— (2—アミノエチノレ)一アミノー 6—デォキシ一 β—シクロデキストリン(502mg、 0. 33mM)を徐々に加え、— 15〜一 10°Cにて 0. 5時間攪拌した。 0°Cまで昇温し、氷浴にて 1昼夜反応させた後、室温にて 144時間 反応させた。反応終了後、減圧濃縮にて半分量の溶媒を留去し、約 300mlのァセト ンで再沈させ、沈殿物を回収した。沈殿物を CM— SephadexC— 50カラムに充填し 、水 1200mlにて不純物を溶出させた。次いで、 0. 1%アンモニア水 1000mlにて溶 出し、 目的物である 6— (フルォレセイン—カルボキシレート— 2—アミノエチル)—ァ ミノ一 6—デォキシ一 13—シクロデキストリン(FL— β -CyD,式(8) )が含まれてい る画分を回収した。減圧濃縮にて溶媒を留去し、 目的物を回収した後、減圧乾燥す ることにより生成物(211mg、収率 24. 3%)を得た。得られた生成物は、 'H -NMR スペクトル測定によりその構造を確認した。また、水に容易に溶解することを確認した
[0084] [化 44]
Figure imgf000029_0001
[0085] [合成例 8] 6— (ピレン一 4 ブチレート一 11—ァミノ一 3, 6, 9 トリァゾゥンデカン )—アミノー 6—デォキシ一 13—シクロデキストリン(PY— TEPA— β - CyD)
1—ヒドロキシベンゾトリアゾール(1— HOBt、 67mg、 0. 50mM)と 1—ピレン酪酸 ( 133mg、 0. 46mM)を 7mlのピリジンに溶解させ、 10°Cまで冷却した。次に、ジ シクロへキシルカルボジイミド(DCC、 120mg、 0. 50mM)を溶解させ、—15〜― 1 0°Cにて 2. 5時間攪拌した。その後 6—(11 アミノー 3, 6, 9ートリアゾゥンデカン) —アミノー 6 デォキシ一 β—シクロデキストリン(500mg、 0. 38mM)を徐々に加え 、— 15〜― 10°Cにて 1時間攪拌した。 0°Cまで昇温し、氷浴にて 1昼夜反応させた後 、室温にて 144時間反応させた。反応終了後、減圧濃縮にて半分量の溶媒を留去し 、約 300mlのアセトンで再沈させ、沈殿物を回収した。沈殿物を CM— SephadexC —50絡むに充填し、水 1200mlにて不純物を溶出させた。次いで、 0. 1 %アンモ- ァ水 1000mlにて溶出し、 目的物である 6— (ピレン一 4 ブチレート一 11—ァミノ - 3, 6, 9—トリァゾゥンデカン)一ァミノ一 6—デォキシ一 j8―シクロデキストリン(PY -TEPA- β—CyD)、式 (9) )が含まれている画分を回収した。減圧濃縮にて溶媒 を留去し、 目的物を回収した後、減圧乾燥することにより生成物(83mg、収率 13. 7 %)を得た。得られた生成物は、 ^—NMRスペクトル測定によりその構造を確認した 。また、水に容易に溶解することを確認した。
[0086] [化 45]
Figure imgf000030_0001
[0087] [実施例 1] 核酸マイクロアレイの作成 1
基材の調製
ポリカーボネート (PC)基板にプラズマ処理を施した。プラズマ処理の装置として、 小型高性能プラズマ表面処理装置 (ャマト科学社製、 PDC200シリーズ)を用いた。 PC基板を窒素ガス雰囲気下のチャンバ一内に配置し、約 25°C、高圧 (約 20Pa)下 、出力 500Wで約 600秒処理した。
[0088] 核酸プローブ
上記の PC基板上に核酸プローブを固定した。核酸プローブとしては、配列番号 1 に示される塩基配列(シグマジエノスジャパン社提供)を用いた。配列番号 1の DND プローブは、第 1ェクソンと第ェクソンの間のイントロン領域内に存在するエストロゲン 受容体対立遺伝子 (Xbal多型)のうち制限酵素 Xbalにより切断されな 、配列 (x型) を検出することができるものである。この核酸プローブの 3'末端にはそれぞれポリチミ ンを付カ卩した。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ(20unitZ / l)を 4 1、デ ォキシチミジン三リン酸(lOpmolZ μ 1)を 10 μ 1、配列番号 1の核酸プローブ(50m M)を 4 μ 1、製品添付の NEBuffer4を 5 μ 1、及び、製品添付の力コジル酸緩衝液を 5 μ 1をそれぞれ精製水 50 μ 1に加えることにより、ポリチミン付加された配列番号 1の 核酸プローブ(平均 400bp長) 2pmolZ μ 1をそれぞれ得た。
[0089] X型検出用核酸プローブ (配列番号 1): gtggtctaga gttggg
[0090] 核酸プローブの固定
次に、ポリチミン付加された配列番号 1の核酸プローブを、それぞれ 1. OpmolZ 1となるように、製品添付の 10X SSC緩衝液で希釈し、上記 PC基板上にそれぞれ 異なる位置に 0. 5 1ずつ塗布した。そして、 312nmの紫外線を 2分間照射すること により核酸マイクロアレイを製造した。 [0091] 対照核酸プローブの固定
また、二本鎖を形成しな 、比較対象として配列番号 2の核酸にポリチミンを付加した ものを作成し、上述した核酸マイクロアレイに固定した。ポリチミン付加及びプローブ の固定は上述した方法と同様に行った。配列番号 2の DNAプローブは、第 1ェクソン と第 ェクソンの間のイントロン領域内に存在するエストロゲン受容体対立遺伝子( Xbal多型)のうち制限酵素 Xbalにより切断される配列 (X型)を検出することができる ものである。
[0092] X型検出用核酸プローブ (配列番号 2): tctggagttg ggatga
[0093] マーカー
さらに、マーカーとして合成例 7で製造したモノ修飾シクロデキストリン溶液を、上記 核酸マイクロアレイ上に塗布 ·乾燥させることにより固定した。
[0094] [実施例 2] 核酸マイクロアレイの作成 2
マーカーとして合成例 7で製造したモノ修飾シクロデキストリンの代わりに、合成例 8 で製造したモノ修飾シクロデキストリンを用いた以外は実施例 1と同様に核酸マイクロ アレイを製造した。
[0095] [実験例 1]
検体ゲノム DNAの増幅
あらかじめ XX型であることが判明している検体のゲノム DNAを配列番号 3に示され た塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号 4に示された塩基配列を有 するリバースプライマー、および Taq DNAポリメラーゼ(ロシュ'ダイァグノステイタス 社製)を用いた PCR法により Xbal多型を含む塩基配列の増幅を行った。 PCRの反 応条件は、変性過程を 94°C、 30秒、ァニール過程を 55°C、 20秒、鎖伸長過程を 72
。C、 20秒とし、この工程を 30サイクル行った。
[0096] フォワードプライマー(配列番号 3): gttccaaatg tcccagccgt
リノくースプライマー (酉己歹 IJ番号 4): cctgcaccag aatatgttac c
[0097] 核酸の検出
増幅した DNA溶液 20 しに、水酸化ナトリウム(5M)、エチレンジァミン四酢酸(0 . 05M)の溶液(20 /z L)をカ卩えてよく攪拌し、 5分間放置して、増幅した DNAを一本 鎖に変性した。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム (0. 01wZv%)、塩ィ匕ナ トリウム(1. 8wZv%)、クェン酸ナトリウム(1. OwZv%)の溶液(lmL)及び実施例 1で作成した核酸マイクロアレイ 1枚を加え、反応温度 45°Cのもとで 30分間振とうして 反応させた。その後、合成例 8で合成したモノ修飾シクロデキストリン水溶液(ImM) 中に 5分浸漬させた。次いで、核酸マイクロアレイを取り出し、励起波長 365nmの光 を照射してその様子にっ 、て目視で観察した。
[0098] その結果を図 1に示す。配列番号 1の核酸プローブを固定した箇所は黄緑色に発 色しているのに対して、配列番号 2の核酸プローブを固定した箇所は発色されなかつ た。つまり、本発明のモノ修飾シクロデキストリンは一本鎖の核酸には吸着しないが、 二本鎖の核酸には吸着する性質を有することが明らかとなった。
[0099] [参考例 1]
本発明のモノ修飾デキストリンのインターカレーターと、二本鎖の核酸の塩基との結 合の様子について蛍光スペクトル測定により確認した。具体的には、合成例 8のモノ 修飾シクロデキストリン水溶液 (0. 1 M)に二本鎖核酸を添加後の濃度が 0. 001 gZ 1となるように加えた後、溶液を 5分間攪拌した。この溶液の蛍光スペクトル測定 を測定した (励起波長 365nm)。比較として合成例 8のモノシクロデキストリン水溶液 の蛍光スペクトルも測定した。
[0100] その結果を図 2に示す。二本鎖の核酸を添加することにより、 380nm及び 400nm のピークが消失し、 440nmに新たなピークが観測された。このことから合成例 8のモノ 修飾シクロデキストリンのピレン力 二本鎖の核酸の塩基にインター力レートして!/、る ことが示唆された。
産業上の利用可能性
[0101] 本発明は、核酸に特別な修飾を行う必要がなく原材料のコストが大幅に削減できる
。また、試薬が二本鎖の核酸のみに選択的に吸着することができるために、検出作 業が容易となる。カロえて、高感度での検出を可能とするために、 PCRなどの核酸の 増幅工程の回数を抑えることができ、検出の時間及びコストをさらに削減することが 可能となる。そして、試薬は水に容易に溶解するため安定して保存することができ、 工業的実施を可能とすることができる。

Claims

請求の範囲
[1] ノ、イブリダィズした核酸を検出する方法であって、
検体核酸又は核酸プローブを固定ィ匕したアレイを準備する工程、
検体核酸と核酸プローブとをハイブリダィズする工程、
ハイブリダィズした二本鎖の核酸にモノ修飾シクロデキストリンを吸着させる工程 を含み、
前記モノ修飾シクロデキストリンが、式(1)に示される化合物であることを特徴とする 核酸検出方法;
[化 1]
CyD-R-X (1 )
(式中、 CyDは ex、 β又は γ—シクロデキストリン、 Rは原子数 1〜20の長さを有し、 不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンカ なる群力 選 択される少なくとも 1の結合を含んでもよい炭化水素鎖であり、 Xはインターカレータ 一である)。
[2] モノ修飾シクロデキストリンをマーカーとして核酸を検出する請求項 1に記載の核酸 検出方法。
[3] インターカレーター力 アタリジン、フルォレセイン、ピレン及びローダミンから選択さ れるいずれか 1である請求項 1又は 2に記載の核酸検出方法。
[4] モノ修飾シクロデキストリン力 下記式(2)〜(9)に示される化合物のいずれか 1で ある請求項 1〜3のいずれ力 1項に記載の核酸検出方法。
[化 2]
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[化 3]
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[化 7]
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[5] 下記の式(1)に示されるモノ修飾シクロデキストリンを含む核酸検出キット;
[化 10]
CyD-R-X (1 )
(式中、 CyDはひ、 β又は γ—シクロデキストリン、 Rは原子数 1〜20の長さを有し、 不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンカ なる群力 選 択される少なくとも 1の結合を含んでもょ ヽ炭化水素鎖であり、 Xはインターカレータ 一である)。
[6] 二本鎖核酸を検出するためのキットであって、
検体核酸又は核酸プローブを固定化した核酸マイクロアレイと、
下記の式(1)に示されるモノ修飾シクロデキストリンを含む核酸検出キット; [化 11]
CyD-R-X (1 )
(式中、 CyDは oc、 β又は γ—シクロデキストリン、 Rは原子数 1〜20の長さを有し、 不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンカ なる群力 選 択される少なくとも 1の結合を含んでもよい炭化水素鎖であり、 Xはインターカレータ 一である)。
[7] インターカレーター力 アタリジン、フルォレセイン、ピレン及びローダミンから選択さ れるいずれか 1である請求項 5又は 6に記載の核酸検出キット。
[8] モノ修飾シクロデキストリン力 下記式(2)〜(9)に示される化合物のいずれか 1で ある請求項 5〜7のいずれ力 1項に記載の核酸検出キット。
[化 12]
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[化 14]
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[化 18]
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[9] 下記式(1)に示されるモノ修飾シクロデキストリンの、二本鎖の核酸との選択的結合 性を利用した核酸検出のための用途;
[化 20]
CyD-R-X (1 )
(式中、 CyDは ex、 β又は γ—シクロデキストリン、 Rは原子数 1〜20の長さを有し、 不飽和結合、カルボニル、エステル、エーテル、ウレタン及びアミンカ なる群力 選 択される少なくとも 1の結合を含んでもよい炭化水素鎖であり、 Xはインターカレータ 一である)。
[10] インターカレーター力 アタリジン、フルォレセイン、ピレン及びローダミンから選択さ れる 、ずれか 1である請求項 9に記載の用途。
[11] モノ修飾シクロデキストリン力 下記式(2)〜(9)に示される化合物のいずれか 1で ある請求項 9又は 10に記載の用途。
[化 21]
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[化 25]
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[化 28]
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