WO2005106030A1

WO2005106030A1 - 核酸の検出方法

Info

Publication number: WO2005106030A1
Application number: PCT/JP2005/008005
Authority: WO
Inventors: Kazutaka Nishikawa; Tomonori Nagaoka; Seiji Kondo
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2004-04-30
Filing date: 2005-04-27
Publication date: 2005-11-10

Abstract

　本発明は、簡便、迅速、低コストに、かつ正確に、試料中の標的核酸を検出することを目的とする。本発明は、標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸プローブと、核酸二本鎖に対して親和性を有する二本鎖認識化合物とを用い、試料核酸を含む試料と前記核酸プローブとを接触させて核酸二本鎖を形成させる第一過程と、該核酸二本鎖に前記二本鎖認識化合物を反応させ、前記試料核酸、前記核酸プローブ及び該二本鎖認識化合物を含む複合体を形成させる第二過程と、該複合体に含まれる二本鎖認識化合物を、標識物質により直接または間接的に検出する第三過程とを有することを特徴とする核酸の検出方法である。

Description

明細書

核酸の検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、標的核酸を検出する核酸検出方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、生体中の微量物質を測定することで、病気の診断をする技術の開発が進んでいる。

例えば、生体組織中で発現した複数種の mRNAの発現変化量や突然変異などを評価する遺伝子検査を、標的遺伝子に対して特異的な結合を形成する遺伝子の短鎖や断片をプローブとした核酸ハイブリダィゼーシヨン技術によって行う技術が開発されている。また、生体組織や血清中のタンパク性分子の同定および定量を、抗体やペプチドをプローブとした抗原抗体反応やリガンドーレセプター結合反応によって行う技術が開発されている。

核酸ハイブリダィゼーシヨンに基づく標的核酸の検出は、一般的には一本鎖のプローブ核酸と標的核酸とに核酸塩基配列特異的に相補的水素結合を形成させ、形成された二本鎖核酸を検出することにより行われる。

[0003] 従来、核酸やタンパク質の検出には、放射性や非放射性の各種標識物質が使用されてきた。なお、放射性標識は、感度は良好であるが、使用できる施設が限られている。また取り扱いに危険を伴うため、現在は主流ではない。非放射性標識としては、蛍光物質での標識が一般的である。

例えば、ゲル電気泳動後の核酸を検出するためにェチジゥムブロマイド等のインタ一力レーター物質を取り込ませて検出する方法が知られている。例えば、特許文献 1 、 2に記載された方法は、核酸サンプルをプローブ核酸とのハイブリダィゼーシヨンに供した後に、インターカレーター色素を導入させて検出する方法である。

また、核酸サンプルを標識した後、プローブ核酸とのハイブリダィゼーシヨンに供し、標識に特異的なシグナルをプローブ核酸の種類に対応して検出することで、試料中の標的核酸を検出することも行われてヽる。核酸サンプルに標識して解析を行う方法には、大きく分けて直接標識法と間接標識法がある。

[0004] 核酸サンプルの直接標識法としては、核酸サンプルの複製、修復、増幅時に標識物質を取り込ませる方法が多く用いられて、る。

一方、核酸サンプルの間接標識法としては、サンプルに結合させた標識物質を 2次的に検出することで検出信号の正確性を向上させたり、酵素標識した物質を用いて、酵素の基質の活性化 (例えば、 HRP酵素と発光基質 ECLなど）によって検出信号を増幅する方法が知られている。また、特許文献 3に記載された方法では、被検出物質の標識と特異的に結合するように修飾された酵素を用いて、検出可能な標識物質を修飾した基質を活性化し、その活性化基質を安定化する位置で沈着させる。この方法を応用した例として、スライドガラスに cDNAプローブを用いたマイクロアレイによる検出に、パーキンエルマ一社より市販されているチラミドシグナル増幅キットを用いる方法が報告されている（非特許文献 1)。チラミドィ匕合物は、酵素の作用によりラジカル化され、その近傍にある幾つかの芳香族アミノ酸に共有結合で結びつく。非特許文献 1に記載の方法では、この性質を利用し、チラミドィ匕合物に検出可能な修飾物質 (例えば、蛍光物質)をつけることで、増感を図っている。

支持体上の核酸を検出又は定量する方法として、検体の第一の核酸と固定化した第二の相補的核酸とでハイブリダィゼーシヨンを行い、前記第二の核酸を、酵素を用 V、て伸長し、 RNA-DNAハイブリッドの組成に特異的に結合する検出可能な抗体を用いて、 RNA—DNAノヽイブリツドの検出を行う方法が特許文献 4に記載されている

[0005] 従来の検出方法を用いる際、検体等から抽出した遺伝子だけでは、正確な検出結果を得るための核酸サンプル量として不足である。例えば、針生検で取得した数 mg の組織、体液中の微量の細胞や、マイクロダイセクションで得られた数個の細胞から得た微量 mRNAを、得られたサンプル量だけで測定すると、特にサンプル中に微量しか含まれな!/、標的核酸につ!、て正確な検出結果を得るのは難、。

そのため、測定可能なサンプル量にまで、抽出した遺伝子を増幅しなければならない。そこで、例えば mRNAに対しては逆転写および増幅工程を経る事で、測定可能なサンプル量まで増幅することが行われて、る。特許文献 1：特開 2003 - 52398号公報

特許文献 2：特許第 2948904号公報

特許文献 3：特開 2003 - 52397号公報

特許文献 4 :米国特許第 6686151B1号明細書

非特許文献 1 :カーステンら（Karsten et. al. )、「ヌクレイック 'ァシッズ'リサーチ（ Nucleic Acids Research)」、（英国）、 2002年、第 30卷、第 2号 E4

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] しかし、特許文献 1、 2に記載の方法では、サンプル中に標的核酸が微量にしか存在しない場合、検出に使われるインターカレーター色素の蛍光輝度が非常に微弱であるため、感度が十分ではなかった。

[0007] また、核酸サンプルに標識を施す場合、解析の度にサンプルに標識処理を行う手間が必須となるのは勿論のこと、直接標識法および間接標識法の、ずれにぉヽても、以下の問題がある。

即ち、検出対象となる核酸またはその相補的核酸に標識する場合、標識物質の導入効率を一定にしなければ検体の正確な測定ができな、ので、標識工程に高度な技術を必要とする。また、標識される核酸の長さ'量が一定でなければ、仮に標識の効率が同じであっても標識量は異なる。このため、手間が非常にかかる、コストが上昇する、実際に標識されるサンプル量にバラツキが発生する等の問題がある。

さらに、標識物質の立体障害や物性によってハイブリダィゼーシヨン反応に支障が出るため、標識物質の付カ卩によって核酸ノヽイブリダィゼーシヨンの効率が低下するという問題も有している。また、標識工程の前後において、核酸の単離精製の工程が必要である。

高感度化を図った特許文献 3、非特許文献 1に記載の方法においても、核酸試料への酵素標識量の違いによって、標的遺伝子の頻度と、検出される信号との対応に差異が生じてしまう。そのため画一的な条件や方法で測定を行っても測定値に大きな誤差範囲が生じる。

カロえて、特許文献 4に記載の方法では、核酸自身の抗原性が乏しぐ核酸サンプルが微量である場合、測定感度が低い。

[0008] 核酸ハイブリダィゼーシヨンに基づく標的核酸の検出を、病気の診断をするための技術として確立するには、得られた微量のサンプルより簡便で迅速に正確な診断ができることが求められる。

しかし、従来の方法では、検体力も抽出した遺伝子を増幅した後に核酸ハイブリダィゼーシヨンに供する必要があるため、以下の問題がある。

[0009] 即ち、ハイブリダィゼーシヨンに用いる核酸サンプルを調製するためだけに、長時間、煩雑、かつ高価な試薬を必要とする操作を行わなければならない。例えば RNAサンプルを調製するためだけに、逆転写および増幅工程として、 2〜4日間の煩雑かつ高価な試薬を必要とする作業を行わなければならない。また、上記の逆転写および増幅工程によって増幅されるサンプル量は、調製毎で常に一定とは限らず、増幅サンプル量のバラツキや複製ミス等の可能性が伴う。

また、増幅反応に用いる遺伝子サンプルは十分な単離精製を必要とする等、測定の目的に応じて、検体を核酸やタンパク質や糖など個別に精製する必要があるから、工程数が増加する。このため、サンプル調製のために高度な技術および時間がさらに必要とされる。

[0010] 本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、簡便、迅速、低コストに、かつ正確に、試料中の標的核酸を検出することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明の核酸の検出方法は、標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸プロ一ブと、核酸二本鎖に対して親和性を有する二本鎖認識化合物とを用い、試料核酸を含む試料と前記核酸プローブとを接触させて核酸二本鎖を形成させる第一過程と、該核酸二本鎖に前記二本鎖認識化合物を反応させ、前記試料核酸、前記核酸プローブ及び該ニ本鎖認識化合物を含む複合体を形成させる第二過程と、該複合体に含まれる二本鎖認識ィ匕合物を、標識物質により直接または間接的に検出する第三過程とを有することを特徴とする。

[0012] 前記二本鎖認識ィ匕合物に第一の標識物質が結合していることが好ましい。

ここで、前記第三過程を、前記第一の標識物質の直接検出により行うことが好ましい。

また、前記第三過程を、前記第一の標識物質に特異的な 1次反応、該 1次反応の生成物が関与する 2次反応、及び該 2次反応の生成物の検出により行うことが好ましい。

前記第三過程を、前記第一の標識物質と、該第一の標識物質に対して特異的に結合可能であり、かつ第二の標識物質が結合された特異的物質との反応、及び該第二の標識物質の検出により行うことが好ましい。

前記第二の標識物質の検出を、該第二の標識物質に特異的な 1次反応、該 1次反応の生成物が関与する 2次反応、及び該 2次反応の生成物の検出により行うことが好ましい。

前記第一の標識物質と、前記特異的物質との反応に、リガンドーレセプター反応又は抗原抗体反応を用いる事が好まし、。

前記第一の標識物質に、タンパク質、ペプチド、糖鎖力も選ばれる 1種以上が含まれることが好ましい。

[0013] 前記第三過程を、前記二本鎖認識化合物と、該ニ本鎖認識化合物に対して特異的に結合可能であり、かつ標識物質が結合された特異的物質との反応、及び、該標識物質の検出により行うことが好ましい。

ここで、前記標識物質の検出を、該標識物質に特異的な 1次反応、該 1次反応の生成物が関与する 2次反応、及び該 2次反応の生成物の検出により行うことが好ましい前記二本鎖認識化合物と、前記特異的物質との反応に、リガンドーレセプター反応又は抗原抗体反応を用いることが好ま、。

[0014] 前記第三過程において、検出される物質が酵素反応による生成物であることが好ましい。

前記第三過程において、検出される物質に特異的な信号を経時的に測定することが好ましい。

[0015] 前記二本鎖認識化合物は、インターカレーター物質を含むことが好ましい。

前記二本鎖認識化合物は、抗核酸抗体を含むことが好ま Uヽ。 [0016] 前記試料核酸は、転写及び逆転写反応の、ずれも施されて、な、ことが好ま、前記試料核酸は、複製及び増幅処理のヽずれも施されてヽなヽことが好まヽ。核酸の単離精製処理を行わな、ことが好ま、。

[0017] 一定温度で全ての反応を行うことが好ま、。

ここで、前記温度は、 20°C〜60°Cの範囲であることが好ましい。

前記第一過程より後の過程を 20°C以下で行うことが好ましい。

[0018] 1種類以上の前記核酸プローブが、担体表面の 1箇所以上に固相化されていることが好ましい。

前記核酸プローブの固相化された領域の面積は、 1プローブ当り m²〜2mm² であり、該領域が、担体表面 lcm²当りに 2箇所以上設けられていることが好ましい。前記担体は、多孔質基材カもなることが好ましい。

発明の効果

[0019] 本発明の核酸の検出方法によれば、簡便、迅速、低コストに、かつ正確に、試料中の標的核酸を検出することができる。

図面の簡単な説明

[0020] [図 1A]本発明における一実施形態の第一過程中を示す概念図である。

[図 1B]本発明における一実施形態の第一過程完了後を示す概念図である。

[図 1C]本発明における一実施形態の第二過程を示す概念図である。

[図 2A]本発明における他の実施形態の第二過程を示す概念図である。

[図 2B]本発明における他の実施形態の第三過程前半を示す概念図である。

[図 2C]本発明における他の実施形態の第三過程後半を示す概念図である。

[図 3A]本発明における他の実施形態の第二過程を示す概念図である。

[図 3B]本発明における他の実施形態の第三過程前半を示す概念図である。

[図 3C]本発明における他の実施形態の第三過程後半を示す概念図である。

[図 4A]本発明における他の実施形態の第一、第二過程を示す概念図である。

[図 4B]本発明における他の実施形態の第三過程を示す概念図である。

[図 5]本発明における他の実施形態を示す概念図である。 [図 6A]本発明における他の実施形態の第一、第二過程を示す概念図である。

[図 6B]本発明における他の実施形態の第三過程を示す概念図である。

符号の説明

[0021] 1 担体

2 核酸プローブ

3 試料核酸

4 二本鎖認識化合物

5 微粒子

6 酵素

7 基質

8 還元物質

9 接合体

10 標識物質

11 活性化接合体

12 沈着相

13 抗原

14 抗体

20 核酸二本鎖 (結合対）

30 複合体

100 反応前の基質

101 反応生成物

発明を実施するための最良の形態

[0022] 本発明の核酸の検出方法は、標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸プロ一ブと、核酸二本鎖に対して親和性を有する二本鎖認識化合物とを用い、試料核酸を含む試料と前記核酸プローブとを接触させて核酸二本鎖を形成させる第一過程と、該核酸二本鎖に前記二本鎖認識化合物を反応させ、前記試料核酸、前記核酸プローブ及び該ニ本鎖認識化合物を含む複合体を形成させる第二過程と、該複合体に含まれる二本鎖認識ィ匕合物を、標識物質により直接または間接的に検出する第三過程とを有することを特徴とする。

(試料）

本発明の方法に供される試料は、核酸 (試料核酸)を含むものであればよい。この試料については、後述するように、核酸の転写、逆転写、複製、増幅、標識、単離精製等の前処理や調製は必要でな、。

転写とは核酸中の DNAと相補的な塩基配列力なる RNAを合成する事であり、逆転写とは核酸中の RNAと相補的な塩基配列力なる DNAを合成する事である。複製とは、サンプルとなる核酸と相補的な塩基配列を有する核酸を合成する事を指す。増幅とは、核酸合成反応を用いて核酸サンプル中の核酸の複製を繰り返し行うことで、核酸の量を増加させる工程を言う。核酸の標識とは、例えば試料核酸、または相補的核酸に色素やピオチンなどの標識物質を取り込ませることを言う。

(核酸プローブ）

本発明に用いられる核酸プローブ（以下、「プローブ」という場合がある）は、標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸である。以下、プローブの種類とは、核酸プローブの塩基配列の別を、う。

標的核酸とは、本発明の方法によって検出しょうとする、特定塩基配列を有する核酸領域をいう。この標的核酸は、対象となる試料核酸の核酸分子全体に渡ってもよいし、核酸分子の一部であってもよい。

(二本鎖認識化合物）

本発明に用いられる二本鎖認識ィ匕合物は、核酸二本鎖に対して親和性を有する。二本鎖認識化合物としては、例えば、インターカレーター物質、抗核酸抗体等を用いることがでさる。

インターカレーター物質は、相補的な核酸分子間で形成される 2本鎖構造に入り込む性質を示す物質として知られている。インターカレーター物質としては、例えば、ェチジゥムブロマイド、アタリジンオレンジ、プロビジゥムョーダイド、チアゾールオレンジ、ォキサゾールイエロー、ジアミジノフエニルインドール、ナフタレンジイミド、及びこれらの誘導体等が挙げられる。

各種インターカレーター物質に、タンパク質等の任意の化合物を結合させて化学修飾することができる。そのため、核酸の 2本鎖構造を認識する物質として機能させつつ、別途、化学修飾による標識を施す事が容易であり、インターカレーター物質は本発明における二重鎖認識ィ匕合物として好適である。

インターカレーター物質の中でも、化学的に安定かつ標識物質を結合させやすい構造を有する化合物が好ましぐアタリジ-ゥム化合物、フエナンスリジニゥム化合物、アントラセン環、ピレン環を有する化合物、ナフタレン環を有する化合物が好適である抗核酸抗体は、核酸、又は、核酸と核酸に親和性を有する物質との複合体を抗原として特異的に結合する抗体である。抗核酸抗体の中でも、 2本鎖を形成した DNA に特異的に結合することが知られている抗 2本鎖 DNA抗体、若しくは 2本鎖核酸とこれに親和性を有する化合物との複合体に対する抗体が好ましい。

二本鎖認識化合物は、上記インターカレーター物質ゃ抗核酸抗体に限定されず、これらの物質と同様に、プローブと分析対象物質との複合体に特異的に導入される性質を有していれば良い。但し、二本鎖認識化合物は、インターカレーター物質及び Z又は抗核酸抗体を含むことが好まし、。

(第一過程）

第一過程にお!ヽては、試料核酸を含む試料と前記核酸プローブとを接触させて核酸二本鎖を形成させる。

第一過程によって形成される核酸二本鎖は、試料核酸中の標的核酸と、前記核酸プローブ中の、標的核酸に相補的な塩基配列を有する領域とが、互いに相補的に結合してなるものである。

(第二過程）

第二過程においては、第一過程で形成された核酸二本鎖に、前記二本鎖認識ィ匕合物を反応させ、前記試料核酸、前記核酸プローブ及び該ニ本鎖認識化合物を含む複合体を形成させる。

第二過程によって形成される複合体は、核酸二本鎖に、二本鎖認識化合物が結合してなるものである。

(第三過程）第三過程にお！、ては、第二過程で形成された複合体に含まれる二本鎖認識化合物を、標識物質により直接または間接的に検出する。

なお、所望により、第二過程と第三過程との間に、複合体に含まれない二本鎖認識化合物を複合体近傍から除去する洗浄操作を行う。

[0025] 第三過程で得られる信号強度は、前記複合体の形成量、ひ、ては、プローブ及び試料核酸の、各々少なくとも一部からなる核酸二本鎖の形成量に相関している。したがって、得られた信号強度を指標として、試料における標的核酸の有無を推定することがでさる。

さらに、検出を、前記複合体に含まれる二本鎖認識化合物の存在量に比例する信号強度を与えるような条件で行えば、試料中の標的核酸を定量することができる。条件としては、後述する標識物質の種類、信号強度測定の時点等が挙げられる。

[0026] 従来の検出方法においては、核酸試料を標識することに伴う誤差要因や、インターカレーター色素自体の信号が微弱であることによる感度不足の問題があった。

これに対し本発明では、複合体に含まれる二本鎖認識ィ匕合物を、標識物質により直接または間接的に検出することにより、標的核酸の存在量と、検出される信号との対応に誤差要因を生じずに、増感を含む、所望の感度の信号を与えるような検出方法を選択して、核酸二本鎖の存在量に対応し、かつ感度の高い検出結果を得ることが可能となる。

また、従来のように核酸サンプルを標識し、この標識に由来する信号を、プローブと核酸サンプルとの二本鎖形成の指標とすると、標識量のバラツキにより、信号と標的核酸の頻度とが正確に対応しない可能性があつたのに対し、本発明では、プローブと標的核酸が形成した 2本鎖構造に対して生じる各反応の効率を一定とし、検出される信号と、標的核酸の頻度が正確に対応させられるから、核酸サンプルを標識する場合に比し、より高い正確性を有している。

し力も、本発明によれば、従来の検出方法に必要とされていた、試料の前処理および調製工程である転写、逆転写、増幅、標識、単離精製等をいずれも不要としつつ、充分な感度をもって、試料中の標的核酸の存在を検出することができる。したがつて、上述工程に伴う所要時間、費用、難しい調製技術、調製誤差を削減する事が出来る。

したがって、試料における標的核酸の存在を、簡便、迅速、低コストに、かつ正確に検出することができる。

[0027] 前記第三過程において、二本鎖認識ィ匕合物の直接または間接的な検出は、第一の標識物質が結合されて!ヽるニ本鎖認識化合物 (標識型二本鎖認識化合物)を利用して、第一の標識物質の直接または間接的な検出によって行うことができる。また、二本鎖認識化合物の標識を必要とせず、二本鎖認識化合物に対して特異的に結合可能であり、かつ標識物質が結合された特異的物質を利用して行うこともできる。

[0028] 以下、本発明の実施態様を例示する。

(実施態様 1)

本発明の一実施態様として、前記二本鎖認識化合物に第一の標識物質が結合している場合において、前記第三過程を、前記第一の標識物質の直接検出により行うことができる。

この態様を第一の実施態様として、図 1A〜図 1Cを参照して説明する。図 1A〜図 1 Cに示す例では、担体 1表面に、標的核酸と相補的な塩基配列を有する核酸プロ一ブ 2を固相化して用いて、る。

[0029] まず、第一過程として、図 1Aに示す核酸プローブ 2の固相化された担体 1の表面に、試料核酸 3を含む試料溶液を供給する。試料核酸 3に標的核酸が存在すると、図 1Bに示すように、試料核酸 3と核酸プローブ 2とが、標的核酸と、これに相補的な核酸領域にぉ、てハイブリダィゼーシヨンしてなる結合対 (核酸二本鎖） 20が形成される。

次いで、第二過程として、光学的または分析ィ匕学的に検出可能な微粒子 5からなる第一の標識物質が結合した二本鎖認識化合物 4の溶液を、担体 1の表面に供給する。このことにより、結合対 20に二本鎖認識ィ匕合物 4が反応し、図 1Cに示すように、試料核酸 3、核酸プローブ 2、及び二本鎖認識化合物 4からなる複合体 30が形成される。

その後、第三過程として、核酸プローブ 2が固相化されたプローブスポットに対応して、微粒子 5を光学的または分析ィ匕学的に検出することで、核酸プローブ 2に対応して、複合体 30を検出することができる。

したがって、核酸プローブ 2の種類に対応する標的核酸が、試料核酸 3中に存在することを検出できる。さらに、微粒子 5に対応して検出される信号の強度は、核酸プローブ 2と試料核酸 3による結合対形成の頻度に相関するから、得られる信号強度を用いて、試料核酸 3における標的核酸の頻度を推定することができる。

[0030] (実施態様 2)

前記第三過程を、前記第一の標識物質に特異的な 1次反応、該 1次反応の生成物が関与する 2次反応、及び該 2次反応の生成物の検出により行う態様を、第二の実施態様として、図 2A〜図 2Cを参照して説明する。

以下、第一の実施態様と同様の部位には図 1A〜図 1Cと同一の符号を付し、説明を省略する。

二本鎖認識ィ匕合物 4に結合させておく第一の標識物質を、図 1Cに示す微粒子 5に代わり、図 2Aに示す酵素 6とする以外は、第一の実施態様と同様に第一、第二過程を行う。

第三過程において、図 2Bに示すように、担体 1表面に、酵素 6の触媒活性により還元される基質 7と、直接検出可能な標識物質 10を結合した接合体 9とを供給する。このとき、図 2Bに示すように、基質 7が酵素 6により還元される 1次反応が起こり、生成物として、還元物質 8、及び図示しないラジカルが発生する。このラジカルにより、接合体 9が活性化され活性ィ匕接合体 11が生成する 2次反応が起こる。

活性ィ匕接合体 11はエネルギー的に不安定なため、図 2Cに示すように担体 1の表面で安定化され、担体 1の表面に沈着し、標識物質 10を有する接合体 9が担体に沈着して!/ヽる沈着相 12を形成する。

担体 1表面を洗浄した後、各種の核酸プローブ 2が固相化されたプローブスポットに対応して、沈着相 12中の標識物質 10を検出することで、試料における、核酸プローブ 2の種類に対応する標的核酸の存在を確認できる。

[0031] この態様において、 1次、 2次反応は、基質 7と、標識物質 10を有する接合体 9とが酵素 6の周りに存在する限り継続され、沈着相 12は時間の経過とともに累積されていく。このため、試料中に存在する標的核酸が非常に微少量の場合にも、上記反応を経ることで標識物質 10が複合体 30の周囲に数多く定着し、所定時間後には検出に十分なほどの量となっている。したがって、試料に標識、増幅等の工程を行うことなく、さらなる高感度化を実現することができる。

第二の態様で利用可能な接合体 9としては、チラミドィ匕合物、ヒドロキシル基を除去することにより可視沈殿を生ずるキナゾロン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾォキサゾール、キノリン、インドリン、フエナント口リン類等が例示される。

[0032] 本発明では、前記二本鎖認識ィ匕合物に第一の標識物質が結合している場合において、前記第三過程を、前記第一の標識物質と、該第一の標識物質に対して特異的に結合可能であり、かつ第二の標識物質が結合された特異的物質との反応、及び該第二の標識物質の検出により行うことができる。

ここで、第一の標識物質と、特異的物質との反応に、リガンドーレセプター反応又は抗原抗体反応を用いる事が好ましい。この場合、特異的物質として、二本鎖認識ィ匕合物に第一の標識物質として結合して、る抗原 ·抗体もしくはリガンド ·レセプター部位に対して結合する抗体'抗原やレセプター ·リガンド部位を有する物質を用いれば良い。

すなわち、第一の標識物質と特異的物質のいずれがリガンドとして機能してもよいし、いずれが抗原として機能しても構わない。例えば、第一の標識物質に、タンパク質、ペプチド、糖鎖力選ばれる 1種以上が含まれることで、リガンド—レセプター反応又は抗原抗体反応を容易に用いることができる。

なお、リガンドーレセプター反応として、ピオチンアビジンによる結合反応、糖類レクチンによる結合反応等が例示される。

第二の標識物質は、第一の標識物質と同じでも異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。

以下、第二の標識物質を直接検出する方式を第三の実施態様として、第二の標識物質を 2次的に検出する方式を第四の実施態様として、図 3A、図 3B、図 4を参照して説明する。

[0033] (実施態様 3)

第三の実施態様では、二本鎖認識化合物 4に結合させておく第一の標識物質を、図 1Cに示す微粒子 5に代わり、図 3Aに示す抗原 13とする以外は、第一の実施態様と同様に第一、第二過程を行う。抗原 13の具体例としては、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。

第三過程において、図 3Bに示すように、担体 1表面に、抗原 13に特異的であり、直接検出可能な標識物質 10を結合した抗体 14を供給する。このことにより、図 3Bに示すように、複合体 30中の二本鎖認識ィ匕合物 4に結合された抗原 13と、抗体 14とが特異的に結合する。

担体 1表面を洗浄した後、各種の核酸プローブ 2が固相化されたプローブスポットに対応して、標識物質 10を検出することで、試料における、核酸プローブ 2の種類に対応する標的核酸の存在を確認できる。

[0034] (実施態様 4)

第四の実施態様では、第三の実施態様と同様に、図 3Aで示される第一、第二過程を行う。

第三過程において、抗体 14に結合している標識を、図 3Aに示す標識物質 10に代わり、図 4に示す酵素 6とする。担体 1表面に、抗原 13に特異的であり、酵素 6を結合した抗体 14を供給する。このことにより、図 4に示すように、複合体 30中の二本鎖認識化合物 4に結合された抗原 13と、抗体 14とが特異的に結合する。

酵素 6が結合された抗体 14を供給した後、担体 1表面に、図 2Bに示されるように、酵素 6の触媒活性により還元される基質 7と、直接検出可能な標識物質 10を結合した接合体 9とを供給する。このことにより、図 2B、図 2Cに示されるような、上記第二の実施態様と同様の 1次反応、 2次反応と、沈着相 12の形成が進行する。

担体 1表面を洗浄した後、第二の実施態様と同様の操作で、試料における、核酸プローブ 2の種類に対応する標的核酸の存在を確認できる。

[0035] 本発明においては、上述したとおり、前記第三過程を、前記二本鎖認識化合物と、該ニ本鎖認識化合物に対して特異的に結合可能であり、かつ標識物質が結合された特異的物質との反応、及び、該標識物質の検出により行うこともできる。ここで特異的物質は、第二過程で形成された複合体を認識して結合するものであってもよヽ。前記二本鎖認識化合物と、前記特異的物質との反応には、リガンドーレセプター反応又は抗原抗体反応を用いる事が好ま U、。この反応で利用可能な、し好まし、リガンドーレセプター反応、抗原抗体反応は、上述した第一の標識物質と特異的物質との反応における例示と同様である。

二本鎖認識化合物を標識せず、特異的物質に結合された標識物質の検出を、該標識物質に特異的な 1次反応、該 1次反応の生成物が関与する 2次反応、及び該 2 次反応の生成物の検出により行う例を、第五の実施態様として、図 5A、図 5Bを参照して説明する。

[0036] (実施態様 5)

二本鎖認識化合物 4に標識物質が結合されていない以外は、第一の実施態様と同様に第一、第二過程を行う。これにより、二本鎖認識化合物が隣接する結合対間に導入され、図 5Aに示すように、試料核酸 3、核酸プローブ 2、及び二本鎖認識化合物 4からなる複合体 30が形成される。

第三過程において、図 5Bに示すような、酵素 6が結合され二本鎖認識化合物 4に特異的な物質 (この例では抗体） 14を、担体 1表面に供給する。その後、第二の実施態様と同様に、図 2Bに示される、酵素 6の触媒活性により還元される基質 7と、直接検出可能な標識物質 10を結合した接合体 9とを担体 1表面に供給する。第二の実施態様と同様に沈着相 12を形成させ、試料における、核酸プローブ 2の種類に対応する標的核酸の存在を確認できる。

[0037] 本発明の核酸の検出方法において、上記第一の標識物質、第二の標識物質、特異的物質に結合される標識物質としては、上述の実施態様で示したものも含め、発色物質（DAB、 BCIP、オルソフヱ-レンジァミンなど）、化学発光物質 (ルミノール、 B OLD (登録商標）など）、蛍光物質 (フルォレセイン、アレクサ、シァニンなど）、コロイド粒子 (金や銀の金属、ラテックス等の榭脂、ガラス、セラミックス）、蛍光ガラス粒子、蛍光半導体粒子などを用いることができる。

なお、上記第二の態様のように、二本鎖認識化合物 4に酵素 6で標識した標識型二本鎖認識化合物を用いれば、第三の態様に含まれる、抗体を反応させる工程を省くことができる。

[0038] 本発明にお、ては、前記二本鎖認識化合物に第一の標識物質が結合して、る場合の第一の標識物質として、第一の標識物質に特異的な特異的物質に結合された第二の標識物質として、また前記二本鎖認識化合物に特異的な特異的物質に結合した標識物質として、酵素を用い、前記第三過程において、複合体形成の指標として信号が検出される物質を、酵素反応による生成物とすることが好ましい。

酵素を用いる場合、酵素に特異的な 1次反応の生成物を検出してもよいし、第二の態様等で例示したように、 1次反応の生成物が関与する 2次反応の生成物を検出してもよい。

蛍光物質の信号を検出して、複合体形成の指標とする方式を用いると、信号のバックグラウンドやノイズにより、弱い検出信号が正確性を失う場合がある。そのため、特に低発現の遺伝子についての解析は困難な場合がある。これに対し、検出される物質を、酵素反応による生成物とすれば、核酸プローブと試料核酸とのハイブリダィゼーシヨンの後に、ハイブリダィゼーシヨンの有無を反映する物質を蓄積し、信号を増幅させることができるので、極めて高感度な検出も可能となる。酵素に特異的な 1次反応と、 1次反応の生成物が関与する 2次反応を行えば、検出信号をさらに増幅し、標的核酸の検出能をさらに向上させることができる。

なお、信号検出物質の蓄積が酵素反応の条件や状態により異なり、一定の条件や時間で反応を行っても、検出値が極端に増加して飽和する場合が在る。このようなときには、核酸の存在量に比例した信号強度ではなくなつてしまうことが多い。しかし、実際の反応の進行具合を観察しながら、検出値が飽和しない範囲にて測定を行う事により、核酸の存在量に比例した信号強度を取得する事が出来る。

また、恒温する温度の設定により酵素反応の進行を制御する事も可能であり、より適切な反応条件で測定する事が出来る。

本発明において酵素を用いる場合、酵素の種類については特に制限は無い。例えば、酸化還元酵素、加水分解酵素、リアーゼ、転移酵素、異性化酵素、リガーゼ等が挙げられ、好ましくはホースラディッシュペルォキシターゼ (HRP)またはアルカリフォスファターゼが、コストや反応条件等の都合力良く用いられる。

酵素反応によって生成される物質としては、ジァミノベンチジン (DAB)、臭化塩ィ匕インドリルリン酸エステル (BCIP)等の発色基質や、チラミン等の置換フエノール、チ口シンホスフェート等のホスホリル化置換フエノールなどが好適に用いられる力これに限られるものではない。

本発明で使用する各種の標識物質、二本鎖認識化合物は、特に制限を受けるものではなぐ検出する標的核酸の量、検体の状態、バッファー組成などの条件により、適宜選択して用いることができる。

[0040] また、本発明においては、前記第三過程において、検出される物質に特異的な信号を経時的に測定することが好まし、。

経時的な測定を行うことにより、核酸の動的な解析を行うことができる。特に、酵素反応の生成物の信号を指標として検出する場合においては、生成物の生成状態を経時的に測定することで、反応を停止する最適なタイミングを得ることができる。

本発明の核酸の検出方法において、一定温度で全ての反応を行い、より簡便な、また自動化に適した方法とすることができる。この場合、一定温度は、 20°C〜60°Cの範囲であることが好ましい。

一般に、核酸のハイブリダィゼーシヨン反応、および酵素反応や抗原抗体反応の効率や特異性は、反応時の温度および溶液の塩濃度に影響を受ける。

一般的にハイブリダィゼーシヨン反応温度は、抗原抗体反応や ELISA等の生体由来の反応の温度より高!、。例えば非放射性標識のサザンハイブリダィゼーシヨンなどは、 55〜65°C程度の範囲で任意に温度制御してハイブリダィゼーシヨン反応を行!ヽ、それ以降の作業では特に温度の制御は無ぐ自然の室温で取り扱う。

ところが、溶液の塩濃度をコントロールすることで、ハイブリダィゼーシヨン反応が低温度であっても特異性を失わずにハイブリダィゼーシヨン反応を行う事ができる。例えば低塩濃度のハイブリダィゼーシヨンバッファーを用いる事により、核酸分子間の相補的水素結合の形成が厳しい反応条件にする事で、非特異的水素結合の発生を抑制する事ができる。

この性質を用いて、一般的なノ、イブリダィゼーシヨン温度に比べて低温度でノヽイブリダィゼーシヨン反応を行う事ができ、試料核酸とプローブのハイブリダィゼーシヨン反応と、それ以外の反応工程の温度を任意の一定温度で行う事ができる。

[0041] また、本発明にお、て、前記第一過程より後の過程を 20°C以下で行!、、以下の利点を発揮させることちできる。

試料核酸及び核酸プローブのハイブリダィゼーシヨン反応の後に、 20°C以下に温度変更すると、一般的な生体由来の反応の進行に厳しい条件となるので、反応時間は余計に掛カるが、非特異的な反応が起こりに《なる。

第三過程において、検出される物質を生成する酵素反応を利用する場合、検出される物質の生成が酵素反応の条件や活性により異なり、一定の条件や時間で反応を行っても、検出値が極端に増力 tlして飽和する場合が在る。しかし、第一過程より後の過程を、 20°C以下の低温で行えば、酵素活性を抑えながら反応を進める事で反応時間を長く取ることができるので、過度の反応進行を抑制する事ができる。ここでさらに、標識物質の生成状態を経時的に測定すれば、反応を停止する最適なタイミングをさらに得やすくすることができる。

本発明は従来の核酸の検査に用いられている検出技術や方法に広く応用する事が出来る。例えばサザンおよびノーザンハイブリダィゼーシヨン、細胞および組織染色、 DNAマイクロアレイ等に応用する事が出来る。

本検出方法は、プローブおよび標的核酸が存在する部位で検出信号を増幅することができるので、複数配置したプローブ領域の識別を必要とするアレイデバイスにお、てち適用することができる。

例えば、 1種類以上、好ましくは 2種類以上の核酸プローブが、担体表面の 1箇所以上、好ましくは 2箇所以上に固相化されたマイクロアレイを構成して、本発明の方法に用いることができる。

このようなマイクロアレイにおいて、前記核酸プローブの固相化された領域（以下、「プローブ領域」という）の面積は、 1プローブ当り（すなわち、プローブ種類 1種あたり） 20 μ m²〜2mm²であり、該領域が、担体表面 lcm²当りに 2箇所以上設けられていることが好ましい。

プローブ領域が円形の場合は直径が 5〜500 m、四角形等の多角形の場合は、 1辺の長さが 10〜500 μ mであると、直径 4mm程度の領域に 20〜 500種類程度の核酸プローブを固相化できる。したがって、極少量の被検体で標的核酸を検出することが可能である。従来、多種の標的核酸を検出する場合は、それぞれの標的核酸に最適な条件下で試料核酸をプローブに捕捉させることが難しヽので、得られる信号が弱くなつてしまう場合があった。これに対し、本発明によれば、線形性を保ったまま信号の増幅を実現することが可能であり、多種の標的核酸を検出する場合に有利である。プローブの種類が 20以上の場合に有利性が顕著である。

[0043] 核酸プローブを担体表面に固相化して用いる場合、本発明の全過程では、固相化されたプローブおよび標的核酸が相補的に結合して形成された複合体に対して反応が進行するので、各反応は担体の材質に影響を受けない。よって幅広い担体を選定する事が出来る。

一般的にはガラス、セラミック等の無機材料、もしくはアクリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリサッカライド、ポリスルホン等の汎用性高分子を用いるのが、コスト等の視点から望ましい。

さらに、担体として、貫通した微細空孔構造を有する多孔質基材を用いる事が好ましい。この場合、各過程での反応において、供給された試料溶液等を、多孔質基材を介して繰り返し駆動する事で、反応を大幅に促進する効果がある。

[0044] なお、上述の実施態様では、核酸プローブを、担体上に固相化されたものとして示したが、本発明においては、信号強度を、核酸プローブの種類に対応して測定することができれば、核酸プローブの性状は特に限定されない。例えば、磁性ビーズの結合した核酸プローブも利用可能である。

[0045] 以上本発明の核酸の検出方法は、任意の標的配列に対応したプローブを用いることにより、病気の診断等の分野に好適に用いることができる。

実施例 1

[0046] 以下、実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。

試料核酸と核酸プローブとのハイブリダィゼーシヨンの検出を行った。

アタリジン誘導体力もなる二本鎖認識ィ匕合物に、標識物質として蛍光を発する微粒子 (蛍光微粒子)が結合した標識型二本鎖認識ィ匕合物を使用した。

核酸プローブ (プローブ)の固相化されたマイクロアレイとして、多孔質基材からなる担体の表面に、各 1種類のプローブが固相化されたプローブ領域が、 1cm²の領域にお!/、て 20箇所設けられた DNAマイクロアレイを用いた。

[0047] (アツセィプロトコール）

以下の順序で操作を行った。

1)ラットの肝臓より totalRNA 0. 2 gを抽出し、この total RNAをそのまま（逆転写、複製、核酸精製処理のいずれも施さずに)試料とした。

2)マイクロアレイを設定温度 42°Cの恒温条件に保持した。

3)洗浄液でアレイ表面の洗浄を行った。

4)洗浄液を除去し、試料をバッファーに溶カゝしたサンプル溶液を、マイクロアレイ表面に供給した。その後、温度条件 42°Cでハイブリダィゼーシヨン反応を行った。

5)サンプル溶液を除去し、ノッファーでアレイを洗浄した。

6)バッファーをろ紙で取り去り、蛍光微粒子で標識したアタリジン誘導体の溶液をァレイ表面にのせ、 42°Cで 20分間反応させた。

7)溶液を除去し、バッファーで洗浄した。

8) CCDカメラを用いて任意の露光時間でアレイ表面のプローブ領域 (スポット）の明るさを観察し、検出信号が飽和する露光時間を確認した。

9)新しいバッファーに置換し、任意の露光時間でアレイ画像を撮影した。

撮影結果を解析した結果、表 1に示すように、プローブ種類ごとに陽性'陰性を判別可能な強度比をもってシグナル輝度データを得ることができた。また、各種 RNAの量が既知のラット total RNAサンプルを用い、同様にして解析した結果を表 2に示す。

表 1と表 2を比較したところ、表 1に示すデータは、 RNAの量が既知のサンプルの各種 RN A量と良い相関と示すものであった。

[0048] [表 1] ブローブシグナルブローブシグナルプローブシグナルブローブシグナル

輝度 No. 輝度 No. 輝度 No. 輝度

1 142 6 2105 1 1 1446 16 2288

2 1 101 7 1858 12 840 17 613

3 850 8 231 13 25 18 219

4 1989 9 22 14 1266 19 1007

5 325 10 47 15 1680 20 722 表 2] ブローブシグナルブローブシグナルブローブシグナルブ□ーブシグナル

No. 輝度 No. 輝度 No. 輝度 Mo. 輝度

1 71 6 1040 1 1 723 16 1 144

2 518 7 929 12 420 17 299

3 425 8 1 15 13 13 18 109

4 990 9 1 1 14 533 19 497

5 155 10 23 15 840 20 361 実施例 2

標識型二本鎖認識ィ匕合物として AP標識アタリジン誘導体を使用した。解析には実施例 1と同様のマイクロアレイを用 Vヽた。

(アツセィプロトコール）

以下の順序で操作を行った。

1)ラットの肝臓より totalRNA 0. 2 gを抽出し、この total RNAをそのまま試料とした。

2)マイクロアレイを 60°Cの恒温条件に保持した。

3)洗浄液でアレイ表面の洗浄を行った。

4)洗浄液を除去し、試料をバッファーに溶かしたサンプル溶液を、マイクロアレイ表面に供給した。その後、温度条件 60°Cでハイブリダィゼーシヨン反応を行った。

5)サンプル溶液を除去し、新、バッファーでアレイを洗浄した。

6)アレイ表面にブロッキングバッファーを供給し、設定温度 25°Cの恒温条件に制御した。 7)ブロッキングバッファーを除去し、 AP標識アタリジン誘導体の溶液をアレイ表面にのせ、 25°Cで 20分間反応させた。

8)溶液を除去し、アレイ表面をブロッキングバッファーで洗浄した。

9)設定温度 25°Cの恒温条件に制御した。

10)蛍光基質 100の溶液をアレイ表面に供給した。ついで、任意の露光時間にてァレイ表面のスポットの明るさを観察した。検出可能な反応生成物である 101を検出し、信号が飽和しな、ことを確認しながら 25°Cで反応を進めた。

11)溶液を除去し、ノッファーで洗浄した。

12)新しいバッファーに交換し、任意の露光時間でアレイ画像を撮影した。

撮影結果を解析した結果、表 3に示すように、サンプルにおける各種標的核酸の R NA量を反映するシグナル輝度データを得ることができた。

[0051] [表 3]

実施例 3

[0052] 標識型二本鎖認識ィ匕合物として HRP標識アタリジン誘導体を使用した。実施例 1と同様のマイクロアレイを用いて解析を行った。

'実施例 3—1

(アツセィプロトコール）

1)ラットの肝臓より totalRNA 0. 2 gを抽出し、これをそのまま試料とした。

2)マイクロアレイを 60°Cの恒温条件に保持した。

3)洗浄液でアレイ表面の洗浄を行った。 4)洗浄液を除去し、試料をバッファーに溶カゝしたサンプル溶液を、マイクロアレイ表面に供給した。その後、温度条件 60°Cでハイブリダィゼーシヨン反応を行った。

5)サンプル溶液を除去し、新し、バッファーで洗浄した。

6)アレイ表面にブロッキングバッファーを供給し、設定温度 25°Cの恒温条件に制御した。

7)ブロッキングバッファーを除去し、 HRP標識アタリジン誘導体の溶液をアレイ表面にのせ、 25°Cで 20分間反応させた。

9)設定温度 25°Cの恒温条件に制御した。

10)蛍光基質の溶液をアレイ表面に供給した。ついで、任意の露光時間にてアレイ表面のスポットの明るさを観察した。検出信号が飽和しな!/、事を確認しながら 25°Cで反応を進めた。

11)溶液を除去し、バッファーで洗浄した。

12)新しいバッファーに置換し、任意の露光時間でアレイ画像を撮影した。

'実施例 3 - 2

上記実施例 3— 1の「アツセィプロトコール」において、 9)および 10)の温度条件を 1 5°Cに変更した以外は、実施例 3—1と同様に実施し、アレイ画像を撮影した。

[0053] 撮影結果を解析した結果、表 4に示すように、サンプルにおける各種標的核酸の R NA量を反映するシグナル輝度データを得ることができた。

[0054] [表 4]

実施例 4

[0055] 標識型二本鎖認識化合物として、ペプチド標識アタリジン誘導体を用いた。ぺプチドに特異的であり、かつ標識物質の結合した特異的物質として、蛍光標識抗ぺプチド抗体である FITC標識抗ペプチド抗体を使用した。また、実施例 1と同様の DNAマイクロアレイを用いた。

(アツセィプロトコール）

2)マイクロアレイを 37°Cの恒温条件に保持した。

3)洗浄液でアレイ表面の洗浄を行った。

4)洗浄液を除去し、試料をバッファーに溶力たサンプル溶液を、マイクロアレイ表面に供給した。その後、温度条件 37°Cでハイブリダィゼーシヨン反応を行った。

5)サンプル溶液を除去し、新し!、バッファーで洗浄を行った。

6)バッファーを除去し、ペプチド標識アタリジン誘導体の溶液をアレイ表面にのせ、 3 7°Cで 20分間反応させた。

7)溶液を除去し、アレイ表面をバッファーで洗浄した。

8)洗浄した液を除去後、ノッファーに溶かした FITC標識抗ペプチド抗体溶液をァレィ表面にのせ、 37°Cで 10分間反応させた。

9)溶液を除去し、新しいバッファーで洗浄した。

10)洗浄した液をろ紙で除去し、任意の露光時間でアレイ画像を撮影した。

[0056] 撮影結果を解析した結果、表 5に示すように、サンプルの各種 RNA量を反映するシグナル輝度データを得ることができた。また、一定温度で検出までの全ての反応を行いつつ、正確なデータを確保することができた。

[0057] [表 5]

実施例 5 [0058] 標識型二本鎖認識化合物として、ペプチド標識アタリジン誘導体を用いた。ぺプチドに特異的であり、かつ標識物質の結合した特異的物質として、 HRP標識した抗ぺプチド抗体を使用した。すなわち、二本鎖認識化合物の標識と、特異的物質との反応に、抗原抗体反応を利用した。

HRP酵素反応の基質と、蛍光標識されたチラミド化合物とを含む蛍光基質溶液を準備した。また、実施例 1と同様の DNAマイクロアレイを用いた。

(アツセィプロトコール）

2)マイクロアレイを 37°Cの恒温条件に保持した。

3)洗浄液でアレイ表面の洗浄を行った。

4)洗浄液を除去し、試料をバッファーに溶カゝしたサンプル溶液を、マイクロアレイ表面に供給した。その後、温度条件 37°Cでハイブリダィゼーシヨン反応を行った。

5)サンプル溶液を除去し、アレイをハイブリダィゼーシヨンバッファーで洗浄した。

6)洗浄した液を除去し、ペプチド標識アタリジン誘導体の溶液をアレイ表面にのせ、 37°Cで 20分間反応させた。

7)溶液を除去し、新、バッファーでアレイを洗浄した。

8)洗浄液を除去し、 HRP標識抗ペプチド抗体をバッファーに溶カゝした酵素標識抗体溶液を、マイクロアレイ表面に供給した。その後、温度条件 37°Cで 10分間反応させた。

9)溶液を除去し、新し、バッファーでアレイを洗浄した。

10)蛍光基質溶液をアレイ表面に供給した。ついで任意の露光時間にてアレイ表面のスポットの明るさを観察した。検出信号が飽和しな、事を確認しながら 37°Cで反応を進めた。

11)溶液を除去し、ノッファーで洗浄した。

12)新 U、バッファーに置換し、 CCDカメラで任意の露光時間でアレイ画像を撮影した。

[0059] 撮影結果を解析した結果、表 6に示すように、サンプルの各種 RNA量を反映するデータを得ることができた。 [0060] [表 6]

実施例 6

[0061] 二本鎖認識ィ匕合物として、アタリジン誘導体を用いた。アタリジン誘導体に特異的であり、かつ標識物質の結合した特異的物質として、 HRPで標識した、核酸-アタリジン複合体を抗原として認識する抗体を使用した。また別途、 HRPで標識した、二本鎖核酸を抗原として認識する抗核酸抗体を使用した。

実施例 5と同様の蛍光基質溶液を用いた。また、実施例 1と同様の DNAマイクロアレイを用いた。

<実施例 6— 1 >

(アツセィプロトコール）

2)マイクロアレイを 37°Cの恒温条件に保持した。

3)洗浄液でアレイ表面の洗浄を行った。

4)洗浄液を除去し、試料をバッファーに溶カゝしたサンプル溶液を、マイクロアレイ表面に供給した。その後、温度条件 37°Cでノヽイブリダィゼーシヨン反応を行った。

5)サンプル溶液を除去し、アレイをバッファーで洗浄した。

6)洗浄した液を除去し、二本鎖認識化合物の溶液をアレイに供給し、 37°Cで 20分間反応させた。

7)溶液を除去し、新しレ、バッファーでアレイを洗浄した。

8)バッファーを除去し、 HRPで標識した核酸-アタリジン複合体を抗原として認識する抗体溶液をアレイ表面にのせ、 37°Cで 10分間反応させた。

9)溶液を除去し、ノッファーでアレイを洗浄した。 10)蛍光基質溶液をアレイ表面に供給した。ついで任意の露光時間にてアレイ表面の各スポットの明るさを観察した。検出信号が飽和しない事を確認しながら 37°Cで反応を進めた。

11)溶液を除去し、ノッファーで洗浄した。

12)新しレ、バッファーに置換し、 CCDカメラで任意の露光時間でアレイ画像を撮影した。

[0062] 撮影結果を解析した結果、表 7に示すように、サンプル中の各種 RNA量を反映するデータを得ることができた。

[0063] [表 7]

[0064] <実施例 6— 2 >

上記実施例 6— 1の（アツセィプロトコール）において、 6)、及び 7)を行わず、 8)にて用いた抗体を、二本鎖核酸に特異的に結合する HRP標識抗核酸抗体に変更した以外は、実施例 6—1と同様に実施し、アレイ画像を撮影した。

実施例 1において、試料の転写、増幅、標識を行わずに、二本鎖認識化合物に標識された標識物質を直接検出することにより、核酸プローブと標的核酸力なる核酸 2本鎖を検出し、標的核酸を測定する事ができた。よって、簡易、迅速、かつ正確な測定が実現された。

実施例 3において、二本鎖認識化合物に標識された標識物質を 2次的に検出することにより、サンプル中の標的核酸を検出できることが解った。本実施例では、標的核酸の転写、逆転写、増幅、標識、精製を必要とせずに正確な検出が可能であった。さらに、検出対象が微量サンプルであっても酵素の反応時間に伴って標識物質が蓄積されていくため、より明確に検出する事ができた。よって、簡易、迅速、低コスト、且つ高感度な検出が実現された。

実施例 3— 1と 3— 2の解析結果は殆ど同程度であった力 25°Cでの酵素反応における高輝度のシグナルが飽和しきるまでの反応時間は 0. 5〜1分程度であつたのに対し、 15°Cの場合は 3〜5分程度であった。よって、低温度設定により反応の過度な進行を抑え、反応停止のタイミングに時間的余裕を持たせる事ができることが示された。

実施例 5の結果から、二本鎖認識化合物に標識された標識物質を間接的に検出することにより、サンプル中の標的核酸を測定できることが解った。

実施例 6より、二本鎖認識化合物が非標識であっても、標的核酸を測定できることが解った。さらに、二本鎖認識ィ匕合物が非標識であるので、よりコストを低減する事が出来た。

実施例 6— 1と 6— 2の解析結果は、核酸 -アタリジン複合体を抗原として認識する抗体を用いるほうが、二本鎖核酸を抗原として認識する抗体を用いた場合より高い輝度を呈した。よって、二本鎖認識ィ匕合物の使用により、感度を向上させることができた

Claims

請求の範囲

[1] 標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸プローブと、核酸二本鎖に対して親和性を有する二本鎖認識化合物とを用い、

試料核酸を含む試料と前記核酸プローブとを接触させて核酸二本鎖を形成させる第一過程と、

該核酸二本鎖に前記二本鎖認識化合物を反応させ、前記試料核酸、前記核酸プローブ及び該ニ本鎖認識化合物を含む複合体を形成させる第二過程と、

該複合体に含まれる二本鎖認識化合物を、標識物質により直接または間接的に検出する第三過程とを有することを特徴とする核酸の検出方法。

[2] 前記二本鎖認識ィ匕合物に第一の標識物質が結合していることを特徴とする請求項

1に記載の核酸の検出方法。

[3] 前記第三過程を、前記第一の標識物質の直接検出により行うことを特徴とする請求項 2に記載の核酸の検出方法。

[4] 前記第三過程を、前記第一の標識物質に特異的な 1次反応、該 1次反応の生成物が関与する 2次反応、及び該 2次反応の生成物の検出により行うことを特徴とする請求項 2に記載の核酸の検出方法。

[5] 前記第三過程を、前記第一の標識物質と、該第一の標識物質に対して特異的に結合可能であり、かつ第二の標識物質が結合された特異的物質との反応、及び該第二の標識物質の検出により行うことを特徴とする請求項 2に記載の核酸の検出方法。

[6] 前記第二の標識物質の検出を、該第二の標識物質に特異的な 1次反応、該 1次反応の生成物が関与する 2次反応、及び該 2次反応の生成物の検出により行うことを特徴とする請求項 5に記載の核酸の検出方法。

[7] 前記第一の標識物質と、前記特異的物質との反応に、リガンドーレセプター反応又は抗原抗体反応を用いることを特徴とする請求項 5または 6に記載の核酸の検出方法。

[8] 前記第一の標識物質に、タンパク質、ペプチド、糖鎖力も選ばれる 1種以上が含まれることを特徴とする請求項 2〜7のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[9] 前記第三過程を、前記二本鎖認識化合物と、該ニ本鎖認識化合物に対して特異的に結合可能であり、かつ標識物質が結合された特異的物質との反応、及び、該標識物質の検出により行うことを特徴とする請求項 1に記載の核酸の検出方法。

[10] 前記標識物質の検出を、該標識物質に特異的な 1次反応、該 1次反応の生成物が関与する 2次反応、及び該 2次反応の生成物の検出により行うことを特徴とする請求項 9に記載の核酸の検出方法。

[11] 前記二本鎖認識化合物と、前記特異的物質との反応に、リガンドーレセプター反応又は抗原抗体反応を用いる事を特徴とする請求項 9または 10に記載の核酸の検出方法。

[12] 前記第三過程において、検出される物質が酵素反応による生成物であることを特徴とする請求項 1〜11のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[13] 前記第三過程において、検出される物質に特異的な信号を経時的に測定することを特徴とする請求項 1〜12のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[14] 前記二本鎖認識化合物は、インターカレーター物質を含むことを特徴とする請求項

1〜13のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[15] 前記二本鎖認識化合物は、抗核酸抗体を含むことを特徴とする請求項 1〜 14のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[16] 前記試料核酸は、転写及び逆転写反応のヽずれも施されてヽなヽことを特徴とする請求項 1〜15のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[17] 前記試料核酸は、複製及び増幅処理のヽずれも施されてヽなヽことを特徴とする請求項 1〜16のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[18] 核酸の単離精製処理を行わないことを特徴とする請求項 1〜17のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[19] 一定温度で全ての反応を行うことを特徴とする請求項 1〜18のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[20] 前記温度は、 20°C〜60°Cの範囲であることを特徴とする請求項 19に記載の核酸の検出方法。

[21] 前記第一過程より後の過程を 20°C以下で行うことを特徴とする請求項 1〜18のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[22] 1種類以上の前記核酸プローブが、担体表面の 1箇所以上に固相化されていることを特徴とする請求項 1〜 21のいずれかに記載の核酸の検出方法。

[23] 前記核酸プローブの固相化された領域の面積は、 1プローブ当り 20 /ζ πι²〜2πιπι² であり、該領域が、担体表面 lcm²当りに 2箇所以上設けられていることを特徴とする請求項 22に記載の核酸の検出方法。

[24] 前記担体は、多孔質基材カもなることを特徴とする請求項 22または 23に記載の核酸の検出方法。