CN117836426A - 平面生物样品的空间分析 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于分析平面生物样品的方法等。在一些实施方案中，该方法可包括：将寡核苷酸或包含其的缀合物与平面生物样品在所述寡核苷酸或缀合物特异性结合样品中或样品上的位点的条件下进行接触；进行一个或多个步骤以原位释放和/或延伸寡核苷酸，从而产生报告探针；以保持报告探针在样品中的空间关系的方式，将报告探针从样品转移到不含寡核苷酸阵列的平面支持物上；以及检测支持物上的报告探针。

Description

平面生物样品的空间分析

交叉引用

本申请要求2021年6月24日提交的美国临时申请序列号63/214,701、2021年10月19日提交的美国临时申请序列号63/257,456的权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。

背景技术

组织中的蛋白质表达、RNA表达和生物分子间的相互作用可以用多种方法来检查。例如，可以在组织切片上进行邻近测定法(proximity assay)，并原位检测产物(Hegazy等人(2020),Current Protocols in Cell Biology,89(1):e115)。在此类方法中，邻近定位的靶蛋白或表位被相应的抗体结合，所述抗体将与抗体缀合的寡核苷酸聚集在一起。使用例如滚环扩增(RCA)连接和扩增寡核苷酸。然后可以在组织切片中检测扩增产物，或者在掺入空间条形码后进行测序。根据测序或检测，邻近定位的蛋白质被破译。其它空间分析技术包括使用标记的抗体进行后续免疫组织化学，或使用荧光寡核苷酸的各种组合和设计标记RNA。

然而，这些常规方法由于若干原因而受到限制。对组织中存在的分子的检测遭受光学拥挤的影响，因为在一个图像中可以分辨的分子数量有限。由于许多分子拥挤在分析区域中，因此检测方法失去了分辨率，从而难以产生高分辨率的图像。

另外，基于扩增的方法遭受空间拥挤的影响，即，这些方法受到物理上可被放置在一个区域中的分子数量的限制。例如，RCA扩增产生大的DNA扩增产物，该产物拥挤在区域中，使得难以单独区分它们。

此外，许多常规方法既费时又费力，因为反应物扩散进出组织切片并使用所谓的z堆栈对组织切片的深度成像需要时间。例如，多重测定法，例如诸如单分子荧光原位杂交(smFISH)测定的多重测定法可能需要数天时间(参见例如Shah等人，Neuron 2016 92:342-357)。此外，因为生物样本经常产生大量的背景信号，所以从常规方法获得的图像通常不是非常清晰，这使得标记的分子的检测更具挑战性。

因此，需要解决与常规方法相关的这些问题的空间分析方法。

概述

本文提供了(除其它方法之外)用于分析平面生物样品的方法。在一些实施方案中，该方法可包括：将寡核苷酸或包含其的缀合物与平面生物样品在所述寡核苷酸或缀合物特异性结合样品中或样品上的位点的条件下接触；进行一个或多个步骤以原位释放和/或延伸寡核苷酸，从而产生报告探针；以保持报告探针在样品中的空间关系的方式，将报告探针从样品转移到不包含寡核苷酸阵列的平面支持物上；以及检测支持物上的报告探针。如下面将更详细描述的，该方法可以以各种不同的方式来实施。

在一些实施方案中，该方法可包括对一对或多对结合到样品上的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法以产生邻近测定法反应产物，以保持邻近测定法反应产物在样品中的空间关系的方式将核酸反应产物转移到支持物中或支持物上，以及检测所述支持物中或支持物上的邻近测定法反应产物。

如下文将更详细描述的，转移到支持物上的邻近测定法反应产物可以以多种不同的方式产生，例如，通过在结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸之间进行连接、引物延伸、缺口填充/连接或其任何杂交，使得寡核苷酸之一的序列共价连接到其拷贝或另一个寡核苷酸上，然后将第一产物转移到支持物上。或者，第一产物或未连接的寡核苷酸可用作夹板，用于将其它寡核苷酸连接在一起以产生第二产物。在这些实施方案中，可将第二产物转移到载体上。

例如，在一个非限制性实施方案中，该方法可包括对一对或多对结合到样品上的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法以产生第一产物，然后将第一产物或含有第一产物的互补物的第二产物(通过被第一产物夹住的连接产生的)转移到支持物上。如果第一产物被转移到支持物上，那么就可在转移前将它们从结合剂上切割下来。

被结合剂-寡核苷酸缀合物结合的靶标可以是蛋白质、核酸或者甚至是小分子。因此，在一些实施方案中，结合剂-寡核苷酸缀合物可以由与寡核苷酸缀合的结合剂(例如抗体)组成。在其它实施方案中，结合剂-寡核苷酸缀合物可由寡核苷酸组成，其中寡核苷酸的一部分与细胞RNA或基因中的特定序列杂交，而寡核苷酸的另一部分不与该RNA或基因杂交。取决于所用的结合剂-寡核苷酸缀合物，本发明方法可用于检查蛋白质表达、翻译后修饰、RNA表达和基因组DNA等。

取决于如何实施本发明方法，该方法可以避免常规方法的若干问题。

例如，因为核酸反应产物是在它们已被转移到支持物上后进行分析的，所以可以避免主要的背景来源，即组织切片。

在一些情况下，可以通过在一个平面中对样品成像来获得高分辨率图像。因此，与一些常规方法不同，本文公开的一些实施方案避免了在检测期间获取图像的z堆栈，因为分子可被转移到平面2D表面。制作Z堆栈可能非常耗时，并且会减少分析通量(analysisthroughout)。因此，本文所公开的方法可以避免对z叠栈成像的需要，并且潜在地节省时间和成本，这取决于如何实施该方法。

另外，在一些情况下，本发明方法可涉及标记物检测的重复循环。因为可用非常稳定的化学方法将转移的DNA分子附着到支持物上，所述化学方法包括共价附着或例如生物素-抗生物素蛋白(即使在多次标记和洗涤循环后，其通常也是稳定的)，该方法可以允许在非常多次循环中依次地和组合地检测分子。特别地，附着至支持物的DNA分子经受多轮标记和洗涤。当对组织材料中的分子进行成像时，这可能是重大挑战，因为组织在检测和洗涤循环中缓慢崩解。因为在一个循环中仅检测几个条形码或条形码的组合，所以与在同一循环中检测所有分析的分子相比，在特定循环中标记的分子将间隔更大，从而避免光学拥挤，即，从一个位置发射多个信号。因此，当分子被牢固固定时，使用更多检测循环的可能性也允许检测更多(和不同)的靶分子(更高的多重检测)。本文公开的方法更容易多重化，因为多个标记和检测循环可以针对不同的靶条形码或条形码的组合，所述条形码或其组合可包含在与不同结合剂-寡核苷酸缀合物缀合的寡核苷酸中。

此外，在一些情况下，使用桥接寡核苷酸来放大来自条形码或条形码的组合的信号，从而提供更高的信噪比。例如，与如在某些常规方法中进行的间接读取分子(例如通过如在某些基于扩增的方法中进行的测序)相比，如在本文公开的方法中进行的读取载体上的分子对于高空间分辨率可以是有利的。与在组织中的分析(其中背景荧光可能很高)相比，通过将核酸反应产物转移到支持物上更容易进行背景较低的单分子检测。

在基于扩增的常规方法中，例如通过RCA产生多拷贝的靶核酸。同一核酸靶标的多个拷贝的存在可在被检样本中产生核酸的物理拥挤。此外，基于扩增的方法通常产生拷贝数可变的靶标，这进而导致来自每个分子的可变信号。然而，在本文公开的方法中具有这样的实施方案，其中可使用限定数量的分子标记每个供检测的分子靶标，并且每个单个分子使用预定数量的标记进行检测，导致更加一致的检测信号。此外，与为每个检测的分子产生一大束DNA的基于RCA的方法相比，本方法具有这样的实施方案，其中用于检测的标记和标记性寡核苷酸可以在每个检测循环之间被完全洗去，从而减少了分子之间的物理拥挤，仅留下附着于表面的报告分子。因此，取决于如何实施该方法，本文公开的方法可以避免样品中靶核酸的物理拥挤问题。

另外，在本方法的一些实施方案中，使用初始核酸反应产物作为模板产生报告探针。使用报告探针的有利方面是可将较短的寡核苷酸与结合剂缀合，这反过来增加了该方法的分辨率并改善了动力学以及结合剂与靶的结合。与较短的寡核苷酸相比，将较长的寡核苷酸例如与抗体的缀合更能影响它们有效结合组织中的表位的能力。

甚至更进一步，含有核酸的支持物是极其稳定的，它们可以容易地长期储存而不会损失任何相关信息。

如上所述，转移到支持物上的报告分子是核酸。因为报告分子是核酸，通过将一个探针与报告分子杂交，对支持物成像，使探针去杂交(或使标记失活)，然后将不同的探针与报告分子中的不同位点杂交，可将不同的被标记探针与同一分子杂交。这些杂交/读取/失活/杂交步骤可以根据需要重复多次。因为标记系统允许单分子分辨率，所以图像可以呈现为点状斑点，其中每个斑点对应于探针杂交事件。这允许进行多轮重复的探针杂交，并确定哪些探针与样品中的特定位点杂交。这反过来允许以多路复用的方式分析支持物(使用例如Goransson(Nucl.Acids Res 2009 37e7)中描述的‘编码'系统)，从而允许映射对应于至少10个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1000个或至少10 000个基因或蛋白质的结合位点。

在一些实施方案中，可通过将细胞悬浮液通过过滤器来产生平面样品，其中细胞保留在过滤器上。该实施方案可用于分析细胞悬浮液。在一些实施方案中，该方法可包括：(a)通过多孔毛细管膜过滤细胞悬浮液，从而将细胞分布在膜上，(b)将膜放置于平面支持物上，使膜的细胞侧面向支持物，(c)以保持核酸在细胞中的空间关系的方式将核酸从细胞转移到支持物中或支持物上，(d)从支持物上移除多孔毛细管膜和细胞，以及(e)对转移到支持物上的核酸进行空间分析。下面阐述该方法的进一步细节。

附图简述

本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图无意以任何方式限制本发明的范围。

图1示意性地说明了该方法的一些原理。

图2A-图2M说明了可实施该方法的几种方式。

图3示意性地说明了可以如何实施本发明方法的一些实施方案。

图4说明了可以如何实施本发明方法的一些实施方案。

图5说明了可以如何使用桥接探针、检测探针和标记探针在支持物上检测条形码。

图6A-图6C说明了可以执行邻近测定法的示例性方式。

图7显示荧光生物素化的DNA寡聚物从组织(A)到抗生物素蛋白包被的玻璃盖玻片(B)上的转移。A)转移后组织的荧光图像，其中一些寡聚物仍然存在。B)对应于(A)的转移的盖玻片，其中一些寡核苷酸移动到盖玻片。

图8描述了不同细胞系和组织类型的位置的TMA的图解。

图9中图A；转移到功能化的盖玻片后，通过HCR检测到由邻近连接测定产生的报告分子。图B：剩余的报告分子在组织TMA中被显色染色，此处仅显示颜色去卷积后的DAB染色。两幅图像中的比例尺均为1mm。

图10显示了作为暗背景上的亮点获得的测序图像数据。

图11显示了转移的报告分子。每个报告分子由单个点表示。图像下部的8个圆圈对应于TMA。图12显示了环状报告分子的检测。在圆圈2、4、6和8中使用采用检测系统，其中圆圈3、5、7和9代表剥离或清洁圆圈。圆圈1显示了注入任何检测系统之前的样品区域。

图13A-图13D显示了检测到的报告分子。每个图代表4-FoV区域，其是图11所示的较大采样区域的子集。13A)使用检测系统1(L-探针-7-DetA)鉴定的斑点位置。13B)使用检测系统2(L-探针-8-DetB)鉴定的斑点位置。13C)使用检测系统1和2共检测的斑点/报告分子。13D)使用直接与报告分子缀合的荧光团鉴定的斑点位置。

图14示意性地说明了使用过滤器收集细胞的方法的一些原理。

图15示意性地说明了图14所示方法的实施方案。

定义

除非本文另有定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。

本文提及的所有专利和出版物，包括这些专利和出版物中公开的所有序列，都明确地通过引用并入。

数值范围包括界定该范围的数值。除非另有说明，否则分别地，核酸以5’至3’的方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。

本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制。因此，下面紧接着定义的术语通过参考说明书整体而更全面地定义。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,第2版,John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale&Markham,THEHARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N.Y.(1991)向本领域普通技术人员提供了本文使用的许多术语的一般含义。然而，为了清楚和便于参考，下面定义了某些术语。

如本文中所用，术语“多重化”是指同时检测和/或测量样品中的多个目标生物特征，例如蛋白质表位。

如本文中所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并且为本领域技术人员所熟知。这些术语是指由一种或多种特异性结合抗原的多肽组成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是一种四聚体，由两对相同的抗体链组成，每对抗体链有一条轻链和一条重链。在每一对中，轻链和重链可变区一起负责结合抗原，恒定区负责抗体效应子功能。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白和保留与抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、微型抗体、单链抗体和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。该术语还涵盖Fab′、Fv、F(ab′)₂和/或保留与抗原的特异性结合的其它抗体片段，以及单克隆抗体。抗体可以以多种其它形式(包括例如Fv、Fab和(Fab’)₂，以及双功能(即，双特异性)杂交抗体(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987)))和单链形式(例如Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)和Bird等人，Science,242,423-426(1988))(所述文献通过引用并入本文)存在。(总体上参见Hood等人，“Immunology”,Benjamin,N.Y.，第2版(1984)和Hunkapiller and Hood,Nature,323,15-16(1986))。

术语“特异性结合”是指结合成员优先结合存在于不同分子的均质混合物中的另一结合成员的能力。

在某些实施方案中，当结合成员在复合物中特异性结合时，它们之间的亲和力的特征在于小于10^-6M、小于10^-7M、小于10^-8M、小于10^-9M、小于10^-10M、小于10^-11M或小于约10^-12M或更小的K_D(解离常数)。

“多个”包括至少两个成员。在某些情况下，多个可以具有至少2个、至少5个、至少10个、至少100个、至少1000个、至少10,000个、至少100,000个、至少10⁶个、至少10⁷个、至少10⁸个或至少10⁹个或更多成员。在某些情况下，多个可具有2至100或5至100个成员。

如本文中所用，术语“标记”是指导致结合剂与样品中特定位点(例如含有所用结合剂(例如抗体)的表位的位点)结合，使得可以通过评估结合剂的存在和/或丰度来确定位点的存在和/或丰度的步骤。术语“标记”是指产生标记的样品的方法，其中任何必要的步骤以任何方便的顺序进行，只要产生所需的标记的样品即可。例如，在一些实施方案中以及如下面将举例说明的，可以使用被标记探针标记样品，可以检测所述被标记探针以确定核酸在支持物上的分布。

如本文中所用，术语“平面生物样品”是指基本上平坦的，即二维的材料(例如玻璃、金属、陶瓷、有机聚合物表面或凝胶)，其包含细胞或源自细胞的生物分子诸如蛋白质、核酸、脂质、寡糖/多糖、生物分子复合物、细胞器、细胞碎片或排泄物(外来体、微囊泡)的任何组合。可通过例如以下方式产生平面生物样品：在平面支持物上培养细胞，将细胞沉积在平面支持物上(例如通过离心，通过将含有细胞的三维物体切割成切片并将切片安装在平面支持物上，即产生组织切片)，将细胞组分吸附到用亲和剂(例如抗体、半抗原、核酸探针)功能化的表面上，将生物分子引入聚合物凝胶中或通过电泳或其它方式将它们转移到聚合物表面上。可使用多种试剂来固定细胞或生物分子，所述试剂包括福尔马林、甲醇、多聚甲醛、甲醇:乙酸、戊二醛、双官能交联剂诸如双(琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、双(琥珀酰亚胺基)聚乙二醇等。该定义旨在涵盖细胞样品(例如组织切片等)、电泳凝胶及其印迹、蛋白质印迹、点印迹、ELISA、抗体微阵列、核酸微阵列等。取决于制备切片所用的具体技术，平面生物样品的厚度可以是20至50nm，最高达5至10mm。

如本文中所用，术语“组织切片”是指从受试者获得的，任选地被固定、切片并固定在平面支持物(例如显微镜载玻片)上的一片组织。

如本文中所用，术语“福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织切片”是指一片组织，例如从受试者获得的固定在甲醛(例如3％-5％的甲醛的磷酸盐缓冲盐水)或Bouin溶液中、包埋在蜡中、切成薄片、然后固定在显微镜载玻片上的活检样品。http:// en.wikipedia.org/wiki/Phosphate_buffered_saline

此处使用的短语“原位”是指平面生物样品中的特定位置或部位。例如，“原位结合到样品的结合剂”表示结合剂结合在平面生物样品中的特定位置。

“诊断标志物”是体内具有特定分子特征的特定生物化学物质，所述特定分子特征使其可用于检测疾病、测量疾病进程或治疗效果，或测量感兴趣的过程。

“病理指示性”细胞是指当存在于组织中时，指示该组织所在的动物(或从其获得该组织的动物)患有疾病或病症的细胞。举例来说，在动物的肺组织中存在一种或多种乳腺细胞表明该动物患有转移性乳腺癌。

术语“互补位点”用于指抗体或适体的表位，或具有与寡核苷酸探针互补的序列的核酸。具体而言，如果结合剂是抗体或适体，那么结合剂的互补位点是样品中抗体或适体所结合的表位。表位可以是构象表位，或者其可以是由例如氨基酸序列组成的线性表位。如果结合剂是寡核苷酸探针，那么结合剂的互补位点是互补核酸(例如RNA或基因组中的区域)。

本文使用的术语“表位”被定义为抗原分子上被抗体或适体结合的结构，例如一串氨基酸。抗原可具有一个或多个表位。在许多情况下，表位的大小大约为五个氨基酸或糖。本领域技术人员理解，通常分子的整体三维结构或特定线性序列可以是抗原特异性的主要标准。

诊断或治疗的“对象/受试者”是植物或动物，包括人。接受诊断或治疗的非人动物包括例如家畜和宠物。

如本文中所用，术语“孵育/温育”是指将样品和结合剂保持在适合结合剂与样品中的分子(例如表位或互补核酸)的特异性结合的条件下(该条件包括一段时间、一个或多个温度、适当的结合缓冲液和洗涤)。

如本文中所用，术语“结合剂”是指能特异性结合样品中互补位点的剂。示例性结合剂包括寡核苷酸探针、抗体和适体。如果使用抗体或适体，在许多情况下，它们可以与蛋白质表位结合。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，以描述具有任何长度(例如多于约2个碱基、多于约10个碱基、多于约100个碱基、多于约500个碱基、多于1000个碱基、高达约10,000个或更多个碱基)的由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合)组成的聚合物，并且可通过酶促或合成(例如如美国专利第5,948,902号和其中引用的参考文献中所述的PNA)产生,并且其能够以与两个天然存在的核酸的杂交方式类似的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如，能够参与Watson-Crick碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖的糖主链，而PNA主链由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。在PNA中，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到主链上。锁核酸(LNA)，通常被称为不可及RNA，是包含经修饰的RNA核苷酸的RNA分子。LNA核苷酸的核糖部分被连接2’氧和4’碳的额外桥修饰。该桥将核糖“锁定”在3'-内(North)构象中，这通常存在于A-型双链体中。LNA核苷酸可以在需要时与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合。术语“非结构化核酸”或“UNA”是以降低的稳定性彼此结合的含有非天然核苷酸的核酸。例如，非结构化核酸可包含G’残基和C’残基，其中这些残基对应于G和C的非天然存在的形式(即，类似物)，它们以降低的稳定性彼此碱基配对，但保留分别与天然存在的C和G残基碱基配对的能力。非结构化核酸在US20050233340中有所描述，该文献通过引用并入本文用于UNA的公开。

如本文中所用，术语“寡核苷酸”是指具有至少10个，例如至少15个或至少30个核苷酸的多聚体。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度可在15-200个核苷酸的范围内，或者更长。本文使用的任何寡核苷酸可由G、A、T和C或能够与互补核苷酸可靠地碱基配对的碱基组成。7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、2-脱氮-2-硫代鸟苷、2-硫代-7-脱氮-鸟苷、2-硫代-腺嘌呤、2-硫代-7-脱氮-腺嘌呤、异鸟嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤、5,6-二氢尿苷、5,6-二氢胸腺嘧啶、黄嘌呤、7-脱氮-黄嘌呤、次黄嘌呤、7-脱氮-黄嘌呤、2,6二氨基-7-脱氮嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿苷、5-丙炔基-胞苷、2-硫代-胸腺嘧啶或2-硫代尿苷是此类碱基的实例，许多其它碱基也是已知的。如上所述，寡核苷酸可以是例如LNA、PNA、UNA或吗啉代寡聚物。本文使用的寡核苷酸可包含天然或非天然的核苷酸或键联。

如本文中所用，术语“读取”在读取荧光信号的上下文中是指通过扫描或通过显微镜检查术获取图像，其中图像显示视野中的荧光图案以及荧光强度。

如本文中所用，在例如读取通过添加荧光核苷酸而产生的荧光信号的上下文中，术语“由......产生的信号”是指从荧光核苷酸直接发射的信号或通过能量转移至另一荧光核苷酸(即，通过荧光共振能量转移(FRET))而间接发射的信号。

如本文中所用，术语“可切割的接头”是指含有可被特定刺激物(例如诸如TCEP或DTT的还原剂)选择性切割的键的接头。

本文使用的短语“特异性结合对”包括对彼此具有结合特异性的“第一结合成员”和“第二结合成员”。结合对的结合成员可以是天然衍生的或完全或部分合成产生的。结合成员在其表面上具有区域或具有空腔，所述区域或空腔特异性结合结合对的另一结合成员的特定空间和极性组织并因此与所述空间和极性组织互补。特异性结合对的实例是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、相互杂交的核酸和酶-底物。

如本文中所用，术语“结合剂-寡核苷酸缀合物”或“结合剂缀合物”是指以结合剂仍能与其结合位点结合的方式与单链寡核苷酸非共价(例如通过链霉抗生物素蛋白/生物素相互作用)或共价(例如通过“点击”反应)连接的结合剂，例如抗体、适体或寡核苷酸探针(参见例如Evans Aus.J.Chem.2007 60:384-395)等)。核酸和结合剂可以通过许多不同的方法(包括使用半胱氨酸反应性马来酰亚胺或含卤素基团的方法)连接。结合剂和寡核苷酸可以连接至寡核苷酸的5’末端附近或5’末端、寡核苷酸的3’末端附近或3’末端，或两个末端之间的任何地方。结合剂-寡核苷酸缀合物中的结合剂与寡核苷酸之间的键联可以是可切割的，使得核酸反应产物可以通过可切割的接头的切割从相应的结合剂中释放出来。如下文所说明的，结合剂-寡核苷酸缀合物可由单一寡核苷酸组成，其中多核苷酸的一个区域(其长度可以在15-50个碱基范围内的寡核苷酸的“探针”部分)与样品中的靶核酸(例如RNA)杂交，而另一个区域不与该靶核酸杂交，并自由参与本文所述的另外的反应。

在结合剂-寡核苷酸缀合物中与结合剂连接的寡核苷酸在本文中可称为“第一寡核苷酸”。

本文所用的短语“邻近测定法”是指其中仅当两个结合事件邻近时才产生新的DNA产物(例如连接产物或引物延伸产物)的测定。在邻近测定法中，寡核苷酸被连接到靶特异性结合剂，诸如抗体、适体或寡核苷酸探针。当靶分子是DNA或RNA时，寡核苷酸可具有与靶核酸互补的序列。当结合剂与样品中邻近的位点结合时，与那些结合剂缀合的寡核苷酸(“第一”寡核苷酸)被拉靠近，这允许产生新的DNA产物。新的DNA产物可通过各种不同的方式产生。例如，新的DNA产物可通过一个第一寡核苷酸与另一个第一寡核苷酸之间的初始酶促反应产生(通过例如将寡核苷酸的一个末端连接至附近的寡核苷酸，使用附近的寡核苷酸作为模板延伸寡核苷酸的一个末端，或者通过利用模板的缺口填充/连接反应将寡核苷酸的一个末端连接至附近的寡核苷酸的反应等)。图6A中显示了涉及两个第一寡核苷酸连接在一起的实例。在其它实施方案中，新的DNA产物可以以相邻的第一寡核苷酸为模板，但不涉及两个第一寡核苷酸之间的连接。参见例如图6B。图6C说明了另一种产物(称为“报告探针”)，其以通过将两个第一寡核苷酸或相邻的两个寡核苷酸(图6B)连接在一起产生的初始产物作为模板。在图6A-图6C中，连接接合点用x表示。检测核酸反应产物表明相应的结合剂-寡核苷酸缀合物与邻近的位点结合。因此，结合剂-寡核苷酸缀合物与样品结合，然后在缀合物与样品结合的同时进行反应(例如连接、缺口填充/连接和/或引物延伸反应)。只有当两种结合剂-寡核苷酸缀合物结合到邻近的位点时，才会产生产物。邻近测定法的某些非限制性实例包括邻近延伸测定(PEA)和邻近连接测定(PLA)。为清楚起见，邻近测定法可包括发生在第一寡核苷酸(即，与结合剂连接的寡核苷酸)之间的初始酶促反应(例如连接等)和任选地发生在其它寡核苷酸(例如报告寡核苷酸)之间的次级酶促反应，所述其它寡核苷酸使用初始反应的产物作为模板彼此进行酶促反应(例如彼此连接)。或者，邻近测定法可涉及在以彼此邻近的第一寡核苷酸为模板的反应中彼此酶促反应(例如彼此连接)的其它寡核苷酸(例如报告寡核苷酸)以及一种或多种可充当夹板或提供悬突的其它寡核苷酸之间的初始酶促反应。实例示于图6A-图6C中，但是其它实例也是显而易见的。

本文所用的短语“邻近测定法反应产物”是指邻近测定法的核酸的产物。如下面将解释的，此类产物含有来自两种寡核苷酸或其互补序列的序列，其中仅在邻近结合事件存在的情况下将序列连接在一起。邻近测定法反应产物的确切性质可以根据如何进行测定而变化。在一些实施方案中，邻近测定法反应产物可以是将两个第一寡核苷酸连接在一起(通过连接或缺口填充/连接反应)的初始反应的产物。在这些实施方案中，邻近测定法反应产物包含与已经连接在一起的两种寡核苷酸相同的序列。在其它实施方案中，邻近测定法反应产物可以是将寡核苷酸的3’末端延伸到彼此之上的初始反应的产物。在这些实施方案中，邻近测定法反应产物包含与寡核苷酸之一和另一寡核苷酸的互补序列相同的序列。在一些实施方案中，邻近测定法反应产物可以是初始产物的拷贝。在这些实施方案中，报告寡核苷酸可以与初始产物杂交，然后连接在一起，如图6B和图4中示意性说明的。在其它实施方案中，邻近测定法反应产物可包含在以两个邻近的第一寡核苷酸为模板的反应中彼此连接的两个或三个寡核苷酸的序列，如图6C所示。

短语“邻近延伸测定”是指依赖于引物延伸的邻近测定法，其中一种寡核苷酸使用另一种寡核苷酸作为模板。在该测定中，与两种结合剂-寡核苷酸缀合物缀合的寡核苷酸通过3’末端的互补序列相互杂交，所述结合剂-寡核苷酸缀合物与邻近的位点结合。然后，邻近延伸测定包括例如使用聚合酶以及使用杂交的寡核苷酸作为模板延伸杂交的寡核苷酸的3’末端，以产生核酸反应产物。所得的核酸反应产物(或其互补物)表明相应的结合剂-寡核苷酸缀合物结合到邻近的位点。由Di Giusto 等人(2005), Nucleic Acids Research,33(6, e64):1-7；Lundberg等人(2011)和Nucleic Acids Research，第39卷， 第15期；以及Greenwood等人(2015),Biomolecular Detection and Quantification,第4卷：10-16描述了PEA的某些细节。

短语“邻近连接测定”或PLA旨在指其中将一种寡核苷酸与另一种寡核苷酸连接的邻近测定法。这种连接可涉及单链或双链寡核苷酸的平端连接、单链寡核苷酸的夹板介导的连接或具有互补悬突(例如包含限制性酶识别位点的悬突)的双链寡核苷酸的连接。在某些夹板介导的连接中，寡核苷酸以在寡核苷酸的两个末端之间留下缺口的方式与夹板杂交。在此类情况下，邻近连接测定涉及在“缺口填充”反应中使用聚合酶封闭缺口，然后将延伸的寡核苷酸的3’末端与另一寡核苷酸的5’末端连接。不管用于连接寡核苷酸的方法如何，分析由连接产生的核酸反应产物。所得的核酸反应产物表明相应的结合剂-寡核苷酸缀合物结合到邻近的位点。由Fredriksson等人(2002),Nature Biotechnology,20:473-477；Gullberg等人(2004),PNAS,101(22):8420-8424；Wang等人(2021),Applied Microbiologyand Biotechnology，第105卷，第923-935页；Greenwood等人(2015),BiomolecularDetection and Quantification,第4卷：10-16描述了PLA的某些细节。

本文使用的短语“保持空间关系”表征了如何将核酸反应产物从平面生物样品转移到支持物上。特别地，当以保持空间关系的方式将核酸反应产物从平面生物样品转移到支持物上时，当将核酸反应产物转移到支持物上时，平面生物样品中存在的不同核酸反应产物在x-y平面中的相对位置基本上不变。例如，由于转移期间核酸反应产物的横向扩散，支持物上不同核酸反应产物的相对位置可能稍微偏离平面生物样品中相应的相对位置。因此，核酸反应产物在支持物上的位置表示核酸反应产物在平面生物样品上的位置。最通常以通过将支持物置于样品顶部(或反之亦然)并将分子定向转移至支持物上(使得它们(大致)彼此平行地移出样品并移动至支持物上，它们粘附在所述支持物上)保持分子在样品中的空间关系的方式将分子(例如反应产物或报告探针)从平面样品转移至平面支持物。当对平面支持物成像时，与原始样品相比，转移的分子将被定位为镜像。在示例性实施方案中，这可通过将平面支持物(例如盖玻片或其它载玻片)置于固定在载玻片上的样本的顶部，使得样品夹在基底与载玻片之间来完成。例如，分子可以通过扩散转移，但是可通过静电力、电力、磁力或其它力来帮助转移。在一些实施方案中，在样品与支持物之间可存在小的间隙(例如小于1mm、小于0.5mm、小于0.2mm、小于100mm、小于50mm、小于10mm、小于5mm或小于1um)，在一些情况下，该间隙可以用转移缓冲液(例如低盐缓冲液)填充。也可以使用位于表面之间的物理结构、间隔物或珠粒来保持间隙。

在另一个示例性实施方案中，将从平面样品转移的分子转移到平面样品所在的支持物上。

本文使用的关于靶位点的位置的术语“邻近”或短语“邻近定位的靶位点”意指靶位点足够近，使得附着于结合到靶位点的结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸通过例如杂交或连接彼此相互作用。靶位点可在同一分子上，例如，一种蛋白质的两个表位。靶位点也可在不同的分子上，例如，两种不同蛋白质的两个表位。靶位点可在不同类型的分子(例如蛋白质、RNA、DNA、脂质、碳水化合物等的任意组合)上。可被称为“邻近定位的靶位点”的位点之间的距离取决于附着于结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸的长度以及结合剂与寡核苷酸之间任何接头的存在。通常，邻近定位的靶位点位于小于50nm，例如，小于30nm、小于20nm、小于10nm或小于5nm的距离处。

本文使用的短语“平面支持物”是指来自被分析的平面生物样品的核酸反应产物被转移至其上的支持物。多种不同的基底可以用作平面支持物。平面支持物可由任何合适的支持物材料制成，所述支持物材料是例如玻璃、改性和/或功能化的玻璃、水凝胶、薄膜、膜、塑料(包括例如丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯与其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、Teflon.TM.、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、沸石、二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅、硅片和改性硅、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物诸如聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯和聚碳酸酯。

此处使用的术语“延伸”是指连接反应(其中另一个寡核苷酸连接到寡核苷酸的末端上)、引物延伸反应(其中使用聚合酶延伸寡核苷酸)、缺口填充/连接反应或其任意组合。

本文所用的术语“释放”是指将分子置于溶液中，而不是系连于支持物的事件。释放可以通过切割共价键(其可以是化学诱导的、光诱导的或酶诱导的)、切割非共价结合以及通过使该分子与另一个分子去杂交(例如通过加热或使用变性剂)来完成。

本文所用的短语“三维支持物”是指DNA分子可以穿过的三维、可渗透的固体。在许多情况下，三维支持物可以是交联的基质，例如凝胶。

如本文中所用，术语“多孔毛细管膜”包括具有跨越膜厚度(即从膜的一侧到另一侧)的相对密集堆积的单个毛细管，从而允许液体从膜的一侧到另一侧通过，但不允许颗粒通过的膜。多孔毛细管膜的实例包括但不限于，例如阳极氧化铝膜(见下文)、纳米通道玻璃膜、径迹蚀刻膜和聚四氟乙烯。纳米通道玻璃膜由玻璃制成，并且具有直径为15微米至15纳米的高密度均匀通道(参见例如Tonucci等人，Advances in Nanophotonics II,AIPConference Proceedings,2007 959:59-71；Pearson等人，Science 1995 270:68-70和Tonucci等人，Science 1992258:783-785，以及美国专利5,306,661、5,332,681、5,976,444、6,087,274、6,376,096、6,483,640和6,599,616中，所述文献通过引用并入本文)。径迹蚀刻膜由透明聚合物(例如聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚酰亚胺等)制成，其包含直径在0.01um至30um范围内的孔，这些孔是通过带电粒子轰击(或辐照)与化学蚀刻的组合制成的。其它感兴趣的多孔膜包括但不限于无定形含氟聚合物，诸如NAFION^TM、TEFLONAF^TM、FEFLON FEIP^TM和CYTOP^TM(DuPont Fluoroproducts,Fayetteville,NC)。如将认识到的，多孔毛细管膜可具有不同于制成膜的材料的表面(例如涂层或化学改性表面)。例如，多孔毛细管膜的表面可具有改变的电荷特性或改变的疏水性或亲水特性。在一些实施方案中，表面可用氨基硅烷、多聚赖氨酸或另一种化合物涂覆，以提供有助于将细胞保留在表面上的正电荷。可选地或另外地，该表面可具有沉积在其中的金属(例如钛、金)薄层，所述金属薄层可以与改变过滤器表面性质的其它剂连接。

如本文中所用，术语“阳极氧化铝膜”包括当在某些酸性介质中对A1进行阳极化处理时产生的规则的、自组织的纳米多孔膜结构。膜中孔的内径、膜中相邻孔中心之间的距离以及膜中相邻孔的边缘之间的距离可以通过沉积电压(voltage of the deposition)、酸的类型和其它参数来控制。阳极氧化铝膜在潮湿时几乎是透明的。阳极氧化铝膜、其性质以及如何制造此类膜在各种出版物中有详细的综述，所述出版物包括但不限于：Li等人(Chem.Mater 1998 10:2470-2480),Santos等人(Trends on Analytical Chemistry 201344:25-38),Ingham等人(Biotechnology Advances 30 2012 1089-1099)和Poinern等人(Materials 2011 4:487-526)，所述文献出于那些教导通过引用并入本文。阳极氧化铝膜可从例如SPI Supplies(West Chester,PA)和其它供应商诸如Sykera Technolgoies Inc(Longmont,CO)和Signma-Aldrich(St.Louis,MO)以商品名ANOPORE^TM商购获得，并且可与支持环一起购买。

术语的其它定义可出现在整个说明书中。

发明详述

一般原理

本文提供了(除其它方法之外)用于分析平面生物样品的方法。在一些实施方案中，所述方法可包括：在寡核苷酸或缀合物特异性结合样品中或样品上的位点的条件下，将所述寡核苷酸或包含其的缀合物(即，寡核苷酸，诸如抗体寡核苷酸缀合物)与平面生物样品接触；进行一个或多个步骤以原位释放和/或延伸寡核苷酸，以产生报告探针；以保持报告探针在样品中的空间关系的方式将报告探针从样品转移到不包含寡核苷酸阵列的平面支持物上；以及检测支持物上的报告探针。如下面将更详细描述的，该方法可以以各种不同的方式来实施。这种方法的一些一般原理如图1所示。

如图2A-图2M所示，该方法可以用许多不同的方式来实践。例如，在一些实施方案中，所述方法可包括在寡核苷酸与样品中的内源RNA或DNA杂交的条件下将所述寡核苷酸与样品杂交，以及通过连接或缺口填充/连接将与RNA或DNA中相邻位点杂交的任何寡核苷酸连接在一起。在其它实施方案中，样品包含来自邻近连接测定的连接产物。在其它实施方案中，所述方法可包括在寡核苷酸与连接产物杂交的条件下，将所述寡核苷酸与样品杂交；以及通过连接或缺口填充/连接反应将与连接产物中相邻位点杂交的任何寡核苷酸连接在一起。在一些实施方案中，寡核苷酸可以是外切核酸酶敏感性的，但是报告探针是抗外切核酸酶的(在它们连接在一起之后)。在这些实施方案中，所述方法还包括用外切核酸酶处理样品以除去未连接的寡核苷酸和其它单链核酸。如所显示的，术语“释放”旨在指产生可转移到支持物上的报告探针的切割事件或去杂交事件。

在一些实施方案中，所述方法可包括在抗体结合样品中或样品上的位点的条件下，将组织样品与抗体-寡核苷酸缀合物接触；并且所述方法还可包括从缀合物抗体中释放寡核苷酸或其延伸产物以产生报告探针。在任何实施方案中，释放可通过使生物样品与支持物接触，使生物样品面向支持物，然后加热样品来完成。

在一些实施方案中，报告探针通过连接、缺口填充或引物延伸反应产生。

在一些实施方案中，分析步骤可以通过显微镜检查术来完成。在这些实施方案中，所述方法可包括将一种或多种被标记寡核苷酸直接或间接与报告探针杂交，然后通过显微镜检查术分析被标记寡核苷酸的结合模式。在一些实施方案中，被标记探针与报告探针中的连接接合点或延伸接合点杂交。

在一些实施方案中，该方法可包括：(a)对一对或多对与样品结合的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法，以产生邻近测定法反应产物；(b)以保持邻近测定法反应产物在样品中的空间关系的方式将核酸反应产物转移到支持物中或支持物上；和(c)检测载体中或载体上的邻近测定法反应产物。

如上文和下文所述，邻近测定法可涉及连接、引物延伸、缺口填充/连接或其杂交，并且可将初始或“第一”产物或第一产物的互补物(其可通过使用初始产物作为模板将两个报告寡核苷酸连接在一起来制备)转移到支持物上。例如，在一个非限制性实施方案中，所述方法可包括在对一对或多对与样品结合的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法，以产生第一产物并将第一产物转移到支持物上。第一种产物可通过邻近连接测定或邻近延伸测定产生。

邻近连接测定可包括使用夹板进行的结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸的利用模板的连接。连接可涉及也可不涉及延伸一个寡核苷酸的3’末端，以使其靠近另一个寡核苷酸的5’末端。邻近延伸测定可包括将结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸的互补3’末端杂交，并使用另外的杂交的寡核苷酸作为模板延伸寡核苷酸的3’末端。

在转移到支持物之前，可从结合剂释放(例如切割或去杂交)第一产物。

在一些情况下，所述方法可包括：步骤(a)，其包括：(i)将结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸连接和/或延伸在一起以产生第一产物；以及(ii)使用第一产物作为模板将一对有尾部的检测寡核苷酸连接在一起以产生第二产物，其中(i)和(ii)依次或在同一步骤中完成；和步骤(b)，其包括：将第二产品转移到支持物上。

图3中描述了所述方法的一个执行的实例。如图3所示，所述方法可包括将组织切片与多种结合剂-寡核苷酸缀合物结合，并对结合的缀合物原位进行邻近测定法。如所显示的，缀合物的结合剂部分可以是抗体。然而，在其它实施方案中，结合剂可以是适体或寡核苷酸探针。可使用各种不同的方法，例如，邻近连接测定法(其产生其中缀合物中与邻近的位点结合的寡核苷酸末端被连接在一起的第一产物)或邻近延伸测定法(其产生其中使用另一种寡核苷酸作为模板来延伸一个或两个寡核苷酸的第一产物)来完成邻近测定法。在任一情况下，可将第一产物从它们所系连至的结合剂中释放出来，然后在步骤(c)中作为邻近测定法反应产物转移到支持物上。在这些实施方案中，在步骤(c)中转移到支持物的邻近测定法反应产物是第一产物。在其它情况下，第一产物可用作夹板，将一对有尾部的检测寡核苷酸连接在一起，以产生第二产物。在这些实施方案中，在步骤(c)中转移到支持物的邻近测定法反应产物是第二产物。如所显示的，将邻近测定法反应产物以保持它们在x-y平面中的空间关系的方式转移到支持物上，然后从支持物上移除组织切片。在该方法中，邻近测定法反应产物被系连至支持物上，然后在支持物上检测其，例如，通过当系连的邻近测定法反应产物在支持物上时使被标记探针与它们杂交(直接或间接)来检测，并通过显微镜检查术分析标记模式。支持物可以是平面基底诸如载玻片(其可被涂覆)，或三维基底诸如凝胶。如果基底是平面基底，那么邻近测定法反应产物将在基底上。如果基底是三维基底，那么邻近测定法反应产物将在基底中。

图4示出了可如何进行邻近测定法的实例。如上所述，邻近测定法可以以许多不同的方式进行。在所示的实施方案中，可将结合至邻近位点的两种结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸连接在一起以产生第一产物。这种连接反应可用夹板固定，但这不是必须的。所述方法的该实施方案可包括使用第一产物作为模板将一对有尾部的报告寡核苷酸连接在一起，以产生邻近测定法反应产物。在这些实施方案中，在步骤(c)中，将邻近测定法反应产物转移到支持物上。

图5示出了一种示例性的检测方法，其细节将在下面更详细地提供。

在支持物上产生信号的位点对应于平面生物样品中的位点。这样，可将对核酸反应产物在支持物上所结合的位点的分析映射到组织样品中的位点。因此，除其它用途之外，支持物中或支持物上不同核酸反应产物的位置可用于：1)确定特定蛋白质或蛋白质所处的位置，例如，使用与同一蛋白质上不同位点结合的抗体来确定；2)鉴定蛋白质-蛋白质相互作用发生的位置，例如，使用与不同蛋白质结合的抗体来鉴定；和/或3)确定翻译后修饰，例如，使用一种与蛋白质中的经修饰的位点结合的抗体和另一种与蛋白质中的不同或未修饰的位点结合的抗体来确定。其它应用，例如映射RNA、蛋白质-RNA相互作用、蛋白质-DNA相互作用等将是显而易见的。

本方法没有任何核酸扩增步骤(例如PCR或滚环扩增),并且报告探针/反应产物被一同(即同时一起)从样品转移到支持物上，而没有将分子从样品的一个区域转移到样品的另一个区域，等等。所述方法无需测序，并且不使用具有空间条形码(即，对应于x-y平面中的坐标的序列或其阵列(其中阵列的每个元素具有识别其在阵列上的位置的序列))的寡核苷酸。没有对转移的分子(在支持物上或其它地方)进行邻近测定；相反，检测是通过将被标记探针与转移的分子杂交并成像(例如通过显微镜检查术)来完成的。为了清楚起见，本方法中使用的平面样品不是液体样品。最常见地(尽管并非总是)样品是组织切片。种报告探针/反应产物都不是环状的；相反，它们是线性的，并且通常在一个末端具有亲和基团而另一个末端被保护，使得它们得到保护而免于外切核酸酶降解，并且可以粘附到支持物上。为清楚起见，对于样品是内源的分子(例如RNA)(即“生物分子”)未被转移到支持物上或在支持物上进行分析；相反，转移并分析合成产生的分子(例如寡核苷酸或其切割、连接或延伸产物)。

在一个示例性实施方案中，所述方法的初始步骤可将成对的寡核苷酸连接在一起。在这些实施方案中，寡核苷酸之一在一个末端处含有生物素基团，并且其中的另一个寡核苷酸在另一个末端处含有使其对外切核酸酶具有抗性的修饰。在其未连接的形式中，两个寡核苷酸都是外切核酸酶敏感性的。然而，当将它们连接在一起时，连接产物是抗外切核酸酶的。将该连接产物转移到涂覆有链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的支持物上，产物粘附于其上。为了降低背景，可用一种或多种外切核酸酶处理样品(在连接后)和/或用一种或多种外切核酸酶处理基底(在产物已被转移到支持物上后)。

在任何实施方案中，所述方法还可包括使用DNA修饰酶(例如,连接酶、激酶、外切核酸酶、末端转移酶、脱氨酶、脱糖基酶、甲基化酶、磷酸酶)修饰寡核苷酸、其延伸产物或报告分子，根据需要，将其在转移过程中或转移后原位连接到化学部分或结合剂等。

粘合剂

结合剂可以是抗体或抗体的抗原结合片段，诸如Fab、Fv、scFv、F(ab’)₂和Fd。结合剂也可以是针对亲和样蛋白和亲和体(Affibody)或类似的亲和蛋白进化的支架蛋白。

在某些情况下，针对抗原的抗体是单克隆抗体。

在一个实施方案中，针对抗原的抗体是裂解多克隆抗体。通过产生针对抗原的多克隆抗血清并将抗血清分成两部分来产生裂解多克隆抗体。在多克隆抗血清的一部分中，将具有特定序列的寡核苷酸与针对抗原的抗体缀合，而在另一部分中，将具有不同的特定序列的寡核苷酸与针对抗原的抗体缀合。

结合剂也可以是特异性结合蛋白质、碳水化合物或甚至小分子的适体。

此外，结合剂可以是特异性结合靶序列(诸如RNA或DNA中的特定靶序列)的寡核苷酸。寡核苷酸结合剂可以特异性结合靶RNA，诸如信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)或核糖体RNA(rRNA)。寡核苷酸结合剂也可以特异性结合靶DNA，诸如染色体DNA或染色体外DNA。染色体外DNA可以是细胞器DNA，诸如线粒体DNA或叶绿体DNA。

结合靶位点

结合剂可以特异性结合结合靶位点，诸如蛋白质、RNA、DNA、碳水化合物、蛋白聚糖、脂质和其它生物分子上的位点。

结合剂所结合的位点可以在同一蛋白质上，也可以在不同的蛋白质上。例如，结合剂可以结合同一蛋白质中的不同表位。在一些情况下，邻近测定法中使用的结合剂之一可以结合蛋白质中未经翻译后修饰的位点，而另一种结合剂可以在翻译后修饰的位点处特异性结合同一蛋白质。翻译后修饰可以是例如磷酸化、糖基化、遍在蛋白化、亚硝酰化、甲基化、乙酰化和脂质化，尽管许多其它类型的翻译后修饰是已知的。

如上所述，RNA结合靶标可以是包括mRNA、tRNA、非编码RNA或rRNA在内的任何类型的RNA。

同样，DNA结合靶标可以是染色体DNA或染色体外DNA。染色体外DNA可以是细胞器DNA，诸如线粒体DNA或叶绿体DNA。

在一些情况下，寡核苷酸探针可用于检测DNA中的突变。在此类情况下，靶DNA被转化成单链而不破坏组织和其它分子。例如，可通过使用切刻酶或基于CRISPR的靶向，将DNA分子中的特定靶标可以转化为单链状态。这样产生的单链DNA可以例如使用3’或5’特异性外切核酸酶来消化，只留下靶DNA链的一条链用于突变分析。

靶分子也可以来自病毒或细菌。

邻近测定法

如上所述和如下所述，邻近测定法可以以各种不同的方式进行，所述方法可涉及连接、延伸或缺口填充/连接等。在一些情况下(如图4所示)，所述方法可包括：步骤(a)，其包括：(i)将结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸连接和/或延伸在一起以产生第一产物；和(ii)使用第一产物作为模板，将一对有尾部的报告寡核苷酸连接在一起以产生邻近测定法反应产物，其中(i)和(ii)依次或在同一步骤中完成。在其它实施方案中，步骤(a)可包括连接和/或延伸结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸以产生邻近测定法反应产物。在这些实施方案中，可将邻近测定法反应产物在转移到支持物之前从结合剂上裂解。

邻近连接测定法

在一些实施方案中，步骤(a)包括PLA。可使用任何合适的方法来连接与PLA中的结合剂-寡核苷酸缀合物缀合的寡核苷酸。例如，来自结合试剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸可通过以下方式连接在一起：核酸单链末端的非模板连接，核酸双链末端的非模板连接，使用夹板的模板连接，或使用互补悬突的悬突介导的双链核酸连接。

在一个实施方案中，PLA包括将生物样品与包含第一靶寡核苷酸的第一靶特异性结合剂-寡核苷酸缀合物和包含第二靶寡核苷酸的第二靶特异性结合剂-寡核苷酸缀合物接触。多对第一和第二靶特异性结合剂-寡核苷酸缀合物也可用于多重反应。

在一对靶特异性结合剂-寡核苷酸缀合物中，第一靶寡核苷酸具有游离的3’末端，并从5’末端开始包含：一个或多个对第一靶标独特的条形码和第一夹板杂交区；并且第二靶寡核苷酸具有游离的5’末端，并且从3’末端开始包含：一个或多个对第二靶标独特的条形码和第二夹板杂交区域。

在成对的目标特异性结合剂-寡核苷酸缀合物与相应的靶位点结合后，将生物样品与夹板寡核苷酸接触，所述夹板寡核苷酸在两端与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸杂交，所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸通过第一靶特异性结合剂与第一靶位点的结合和第二靶特异性结合剂与第二靶位点的结合而彼此靠近。

夹板寡核苷酸可将第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的5’和3’末端集合在一起，在该情况下，两个寡核苷酸可以连接产生连接的寡核苷酸。夹板寡核苷酸可被设计成使得一个寡核苷酸的3’末端不靠近另一个寡核苷酸的5’末端。在此类情况下，可以延伸3’末端，例如使用聚合酶将第一寡核苷酸的3’末端向第二寡核苷酸的5’末端延伸。然后可以连接两个寡核苷酸以产生连接的寡核苷酸。

因此，在一些情况下，连接分析可包括：(i)用多对结合剂-寡核苷酸缀合物标记平面生物样品，(ii)在(i)之后将夹板寡核苷酸与样品杂交，其中夹板寡核苷酸与不同缀合物中的寡核苷酸的末端杂交，以及(iii)将缀合物中与同一夹板寡核苷酸杂交的任何寡核苷酸的末端连接在一起，以产生核酸反应产物。

在一些实施方案中，连接测定法可包括通过以下方式连接结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸：寡核苷酸单链末端的模板或非模板连接、寡核苷酸的双链末端的非模板连接，或使用互补悬突的悬突介导的双链寡核苷酸连接。利用模板的连接实施方案可使用连接夹板来完成，其中夹板被设计成使得第一结合剂-寡核苷酸缀合物的第一寡核苷酸的3’末端紧邻第二结合剂-寡核苷酸缀合物的第二寡核苷酸的5’末端，并且其中所述方法包括连接第一和第二寡核苷酸的5’和3’末端。

寡核苷酸也可以通过缺口填充/连接反应彼此连接，其中两个寡核苷酸与模板的相对端杂交，缺口通过聚合填充，切口通过连接封闭。

这些测定法的许多变化形式是已知的。例如，在一些实施方案中可以使用“展开”探针。参见例如Klaesson等人(Sci Rep 8,5400(2018))。

邻近延伸测定法(PEA)

在一些实施方案中，步骤(a)包括PEA。可使用任何合适的方法从来自结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸产生核酸反应产物。在一个实施方案中，PEA包括将生物样品与包含第一寡核苷酸的第一靶特异性结合剂-寡核苷酸缀合物和包含第二寡核苷酸的第二靶特异性结合剂-寡核苷酸缀合物接触。多对第一靶特异性结合剂-寡核苷酸缀合物和第二靶特异性结合剂-寡核苷酸缀合物也可用于多重反应。

在一对特异性结合试剂-寡核苷酸缀合物中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的游离3’末端具有彼此互补的序列，因此，所述游离末端相互杂交。这些游离的3’末端可以例如使用聚合酶来进行延伸，以产生含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸两者的序列的双链寡核苷酸。

因此，在一些情况下，PEA包括：

(i)用多对结合剂-寡核苷酸缀合物标记平面生物样品，

(ii)使寡核苷酸的互补3’末端杂交，并使用另外的杂交的寡核苷酸作为模板延伸寡核苷酸的3’末端，以产生核酸反应产物。

杂交测定法

在一些实施方案中，使用本文公开的方法分析相互作用的多种组合，并且将PLA和PEA的组合用于产生核酸反应产物。

例如，使用PLA从某些相互作用中产生核酸反应产物，以及使用PEA从某些其它相互作用中产生核酸反应产物。PLA和PEA的某些细节如上所述，并可用于本文设想的杂交方法中。

使用连接测定法的RNA检测

在一些情况下，所述方法包括使用连接测定法检测RNA。特别地，可以设计与靶RNA中的某些序列杂交的报告多核苷酸。探针可具有包含条形码的尾部。在一些情况下，寡核苷酸探针包含DNA核苷酸，除非朝向连接位点，其中寡核苷酸包含RNA核苷酸。因此，寡核苷酸探针可以是DNA和RNA核苷酸的杂交体。或者，报告多核苷酸可包含发夹结构，使得寡核苷酸在经由靶RNA而集合在一起时彼此连接。

使用三种或更多种结合剂的邻近测定法

在一些情况下，用三种或更多种结合剂进行邻近测定法。Schallmeiner等人(2007),Nat.Methods.；4(2):135-7描述了这种分析法的实例。

在一些情况下，使用三种结合剂-寡核苷酸缀合物，其中将第一结合剂-寡核苷酸缀合物与第一寡核苷酸缀合，将第二结合剂-寡核苷酸缀合物与第二寡核苷酸缀合，以及将第三结合剂-寡核苷酸缀合物与夹板寡核苷酸缀合。如果通过三种结合剂与邻近结合靶标的结合使三种寡核苷酸彼此靠近，那么夹板寡核苷酸与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸杂交，它们可被连接以产生核酸反应产物。因此，核酸反应产物的产生表明寡核苷酸与结合到邻近位点的结合剂缀合。

报告探针

在一些实施方案中，第一产物，即由初始引物延伸、连接或缺口填充/连接产生的核酸，可用作连接模板或(“夹板”)来将两种或更多种其它寡核苷酸(在本文称为“报告寡核苷酸”)连接在一起，以产生报告探针。在这些实施方案中，报告探针是转移到基底的邻近测定法反应产物。该实施方案的实例示于图4中。或者，报告探针可通过与彼此邻近的寡核苷酸杂交来制备，而无需将第一寡核苷酸连接在一起(参见例如图6B)。

在这些实施方案中，将第一产物用作模板以将一对报告寡核苷酸(“第一”报告寡核苷酸和“第二”报告寡核苷酸)连接在一起，以产生邻近测定法反应产物。如所显示的，报告寡核苷酸可被“加尾”,使得它们包含与第一产物杂交的第一序列和不与第一产物杂交的尾部序列。如所显示的，报告寡核苷酸之一具有5’尾部，另一个具有3’尾部。尾部可具有任何合适的长度，例如高达20-200个碱基，并且可在邻近测定法反应产物已被转移到支持物上之后用于检测。

一个或多个所述尾部可包含修饰。例如，尾部可包含结合成员、反应性基团或有助于将报告探针转移到支持物上、将探针系连在支持物上或支持物中或者进行修饰以保护其不受外切核酸酶活性影响的部分。例如，在一些实施方案中，报告寡核苷酸的一个末端可含有用于将产物连接到基底诸如载玻片上的化学物质。这些修饰包括但不限于酰肼基团(I-LINKER^TM)、胺基团(例如共价连接至激活的羧酸酯基团或琥珀酰亚胺酯的胺)、硫醇基团(例如通过烷基化试剂诸如碘乙酰胺或马来酰亚胺共价连接的硫醇基团)、丙烯酸基团(ACRYDITE^TM)(其可通过硫醚、地高辛NHS酯基团、胆固醇-TEG基团或生物素等连接)。可使用以下化学物质将这些基团系连至载玻片上：NH₂-修饰的寡核苷酸结合到环氧硅烷或异硫氰酸酯涂覆的载玻片上，琥珀酰化的寡核苷酸结合到氨基苯基或氨基丙基衍生的载玻片上，二硫化物修饰的寡核苷酸结合到巯基硅烷化的载玻片上，酰肼寡核苷酸结合到醛或环氧化物修饰的载玻片上。在一些情况下可以使用点击反应性基团。在实施方案中，核酸可通过生物素-抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白相互作用锚定到支持物上，其中核酸含有生物素部分，而支持物涂覆有抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。

很明显，报告寡核苷酸可被设计成使得当它们与第一产物杂交时，它们的末端是相邻的。或者，所述末端不需要相邻，并且缺口可以被填充和封闭。

在一些实施方案中，报告寡核苷酸可以是与结合剂缀合并且在邻近测定法过程中被切除并连接在一起的寡核苷酸的一部分。例如，与结合剂缀合的寡核苷酸可含有发夹或环，其含有更多的尿嘧啶(或限制性位点)，这使得报告寡核苷酸和/或报告探针在反应过程中从那些寡核苷酸上被切割下来(参见例如Klaesson等人(Sci Rep 2018 8,5400))。

在另一个实施方案中，可将报告寡核苷酸与缀合于结合剂的寡核苷酸预杂交，这也避免了单独加入报告寡核苷酸。另外，所得的DNA复合物也可以被设计成具有可被切割或去除以暴露单链序列的区域，所述单链序列可用于通过使用夹板介导的连接或悬突介导的连接来连接结合试剂和/或检测寡核苷酸，从而在结合试剂的孵育和结合过程中消除单链区域的存在，并且还确保检测寡核苷酸存在于每个结合剂上以提高效率。使用两种独立的寡核苷酸减少了需要合成的每种寡核苷酸的长度，并且可以通过减少长ssDNA的合成挑战来提高寡核苷酸的质量，特别是如果寡核苷酸在特定位点被修饰的话。

使用报告多核苷酸的RNA检测

在一些情况下，来自平面生物样品的RNA靶标被直接用作模板来产生报告多核苷酸，即，不进行邻近测定法来产生核酸反应产物，而是RNA靶标被用作模板来产生报告多核苷酸。例如，第一报告探针和第二报告探针可被设计成使得在与RNA靶结合时，第一报告探针和第二报告探针的5’和3’末端彼此接近，在该情况下，两个报告探针可被连接以产生报告多核苷酸。

第一报告探针和第二报告探针还可被设计成使得在与RNA靶标结合时，一个报告探针的3’末端不靠近另一个报告探针的5’末端。在此类情况下，可以延伸3’末端，例如，使用聚合酶将第一报告探针和第二报告探针的5’和3’末端集合在一起，然后能够连接它们以产生报告多核苷酸。

外切核酸酶消化

在任何实施方案中，所述方法可包括用一种或多种外切核酸酶(例如外切核酸酶I和外切核酸酶III两者，尽管在一些情况下可使用其它一种或多种其它外切核酸酶，例如外切核酸酶T、外切核酸酶V、外切核酸酶VII、T5外切核酸酶或T7外切核酸酶)进行消化，以去除未连接的报告寡核苷酸和其它单链核酸。这种消化可在最初的邻近测定法反应产物产生后的任何时间进行。例如，可以在转移步骤期间或转移步骤之后原位进行消化。在这些实施方案中，用于邻近测定法的寡核苷酸(例如附着于结合试剂的第一寡核苷酸，或报告寡核苷酸)可被设计成产生抗外切核酸酶的产物，这使得那些产物能够在外切核酸酶步骤后仍然存在。例如，如果使用报告寡核苷酸，那么报告寡核苷酸之一可以具有受保护的3’末端和/或报告寡核苷酸的另一个可以具有受保护的5’末端。通过添加抗外切核酸酶的键联，诸如硫代磷酸酯键联，可以使寡核苷酸具有外切核酸酶抗性，尽管也可以使用其它键联。在替代实施方案中，可通过在低于邻近测定法反应产物:模板双链体的Tm的温度下洗涤来除去报告寡核苷酸和其它单链DNA分子。

使用冗余探针组增加信号以及使用缺陷连接事件减少信号

为了从罕见的结合事件中产生更多的信号，可以从每个结合事件中产生若干种核酸反应产物。对于蛋白质靶标，这可通过使用各自与若干种寡核苷酸缀合的结合剂来实现。这进而在邻近检测中产生若干种检测产物。对于RNA和DNA靶标，可以设计靶向每种RNA分子或DNA基因座的多个探针组，使得每个靶标产生许多核酸反应产物。每个直接或间接与结合剂缔合的粘合剂可以使用至少2个或更多或至少5个或更多或至少10个或更多核酸。可将至少2个或更多或至少5个或更多或至少10个或更多、至少20个或更多探针用于靶向RNA或DNA序列。

可使用靶分子的表达水平来校准所用探针组的数量，以平衡不同靶标之间产生的报告分子的数量。此外，设计用于分析以非常高的丰度存在的靶标的探针可被设计成具有一部分有缺陷且不能产生报告分子的探针。这可用于减少来自例如高表达的蛋白质或RNA的信号，所述蛋白质或RNA原本将在支持物上占据非常大量的检测空间(detection realestate)。

将核酸反应产物转移到固体支持物上

在邻近测定法中或通过报告探针产生的核酸反应产物可被转移到固体支持物上。在某些实施方案中，所产生的核酸反应产物被切割或以其它方式从相应的结合剂解离，然后被转移到支持物上。将核酸反应产物转移到支持物上是以保持核酸反应产物在样品中的空间关系的方式进行的。

在一些实施方案中，产生具有特异性结合对的第一结合成员的核酸反应产物，并将核酸反应产物转移到包含特异性结合对的第二结合成员的支持物上。因此，特异性结合对的第一结合成员与第二结合成员之间的特异性结合将核酸反应产物固定在支持物上。在一个实施方案中，特异性结合对包含生物素和链霉亲和素。

平面支持物

在一些实施方案中，支持物可以是平面的。平面支持物可以是将固定组织切片固定在其上的同一固体支持物。在这种情况下，核酸反应产物与固体支持物之间的结合是可诱导的。在这种诱导型反应的一个实例中，使用点击化学，其需要诱导剂诸如铜来产生共价键。在另一个实例中，将核酸反应产物与固定在固体支持物上的寡核苷酸连接。这种连接可使用模板式夹板(templating splint)来进行，所述模板式夹板将核酸反应产物的末端和固定于固相支持物的寡核苷酸集合在一起。

或者，可使用另一平面支持物从组织转移报告多核苷酸。可使用电泳来加速报告多核苷酸从组织向平面支持物的转移。在一些实施方案中，静电相互作用(例如被转移的分子与带正电荷的表面之间的相互作用(对于涂覆有多聚赖氨酸的载玻片就是这种情况))可以促进分子向支持物的移动。在一些实施方案中，可用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白涂覆支持物，所述抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白与生物素化的报告分子结合。在一些情况下，使用与报告分子缔合的磁珠或顺磁珠，利用磁力来加速转移。

在一个实施方案中，来自组织的核酸反应产物所转移至的平面支持物没有寡核苷酸附着于其上。因此，通过除通过寡核苷酸外的方式转移核酸反应产物并将其附着于平面支持物。

如上所述，一种将核酸反应产物附着于不含寡核苷酸的平面支持物的方法涉及产生复制的核酸反应产物或报告多核苷酸，其具有特异性结合对的第一结合成员。将报告多核苷酸转移到包含特异性结合对的第二结合成员的平面支持物上。因此，特异性结合对的第一结合成员与第二结合成员之间的特异性结合将核酸反应产物固定在平面支持物上。例如，特异性结合对包括生物素和链霉抗生物素蛋白。

将核酸反应产物附着至不含寡核苷酸的平面支持物上的某些其它方法包括修饰平面支持物以提供某些官能团，所述官能团与含有与平面支持物上的官能团反应的其它官能团的核酸反应产物反应并与之形成键。

将核酸反应产物附着到不含寡核苷酸的平面支持物上的其它方法包括：修饰寡核苷酸以包含与涂覆有环氧硅烷或异硫氰酸酯的平面支持物反应的氨基；修饰寡核苷酸以包含与氨基苯基或氨基丙基衍生的平面支持物反应的琥珀酸基团；修饰寡核苷酸以包含与巯基硅烷化的固体支持物反应的二硫化物基团；修饰寡核苷酸以包含与含醛基或环氧基的固体支持物反应的酰肼基团；以及将寡核苷酸结合到含有多聚赖氨酸的平面支持物上。此外，可使用用于将核酸反应产物附着至不含寡核苷酸的平面支持物上的任何其它合适的方案。

组织的移除

在任何实施方案中，本文公开的方法包括从支持物上移除平面生物样品，以在支持物上或支持物中留下核酸反应产物(图11和图3)。

可以以任何合适的方式从支持物上移除平面生物样品。例如，可以简单地将基底(诸如在其上放置平面生物样品的载玻片)从支持物上移开。因为核酸反应产物共价或非共价结合到支持物上，所以核酸反应产物保持附着在支持物上，而剩余的组织从支持物上除去。

生物样品的任何残余都可通过酶促作用除去。例如，可用降解除多核苷酸外的生物分子的酶处理支持物，从而仅去除除所述核酸外的生物分子。此外，如果核酸反应产物包含DNA，则可用RNA降解酶处理支持物以除去污染的RNA。

标记和检测

在一些情况下，本文公开的方法包括检测核酸反应产物(优选以单个分子的形式)在支持物上的位置。这种检测涉及将可检测地被标记探针与支持物上或支持物中的核酸反应产物结合，以及检测被标记探针以确定核酸反应产物在支持物上或支持物中的分布。

在一个实施方案中，检测支持物上或支持物中的核酸反应产物包括：

(i)标记支持物上或支持物中的核酸反应产物；以及

(ii)对支持物成像以产生核酸反应产物已经结合到支持物上的位点的图像。

在一些实施方案中，通过与由预定数量的寡核苷酸和预定数量的被标记寡核苷酸组成的确定的核酸结构杂交，在支持物中或支持物上检测邻近测定法反应产物。在这些实施方案中，所述结构可通过至少两个与邻近测定法反应产物的杂交事件成核。在这些实施方案中，至少两个杂交事件包括与邻近测定法反应产物中的第一序列的第一杂交和与邻近测定法反应产物中的第二序列的第二杂交。一个实例是图5所示的这种核酸结构。

在这些实施方案中，为了定量以单分子存在的核酸反应产物，在每个核酸反应产物中掺入确定数量的检测标记，以便从所有分子中获得可再现且稳定的信号可以是有利的。尽管像RCA或其它克隆扩增策略的方法可用于检测平面支持物上的转移的分子，但这些方法通常不在每个分子中掺入确定数量的标记，这可产生来自不同分子的不均匀的信号，如果信号大，则导致拥挤，如果信号弱，则导致检测不到信号。通过设计可编程的杂交，对于每个检测的靶标发生特定数量的杂交事件会导致预定和特定数量的寡核苷酸和标记掺入到每个形成的核酸结构中。这些结构可以有利地被设计成使得需要两个或更多个与靶标的初始独立杂交事件，以便使所检测的核酸结构的成核形成。一旦与核酸反应产物的初始杂交发生，这些将稳定地吸引剩余寡核苷酸的杂交和形成。形成核酸结构的杂交事件可以有利地分成两个或更多个步骤，因为在一些情况下，如果所有的寡核苷酸都存在于相同的溶液中，则设计不自发形成整个结构的寡核苷酸可能是具有挑战性的。

检测反应还有利地被设计成使得如果标记或标记结构将非特异性地吸附到表面上，则每个步骤中存在的单个标记或标记结构不会产生可检测的信号。

在任何实施方案中，转移到支持物上的分子可包含与所用探针系统中的序列互补的序列。例如，这些序列可存在于报告寡核苷酸的尾部中(成为报告探针)，或者它们可被构建到与结合剂缀合的寡核苷酸中。

这些序列中的每一个都可具有探针系统的多个结合位点，从而允许通过多轮杂交、读取和信号去除来查询支持物。此类序列在本文中可被称为“条形码”序列。在一些实施方案中，支持物中或支持物上的报告分子的身份可以通过读取编码来确定，所述编码对应于产物是否与一组探针中的每个探针杂交，如Goransson等人(Nucl.Acids Res.2009 37:e7)、Moffitt等人(Methods Enzymol.2016 572:1-49)和Moffit等人(Proc.Natl.Acad.Sci.2016 113:11046-51)中所描述的。

因此，在一些情况下，所述方法可包括确定哪种探针组合与报告分子结合。这种检测可由特异性检测和与那些序列特异性结合的标记探针介导。设计和检测与特定条形码序列结合的被标记探针在本领域中是众所周知的，并且此类实施方案在本发明的权限范围内。

在一些情况下，在多个循环中添加特异性检测探针，并且在每个循环中标记不同的条形码，从而检测每个核酸反应产物中存在的条形码的二进制串。每个循环可包括标记、洗涤、成像和在下一个循环开始之前去除检测探针。

DNA折纸术

在一某些情况下，将DNA折纸术用于标记和检测平面表面上的核酸反应产物。

本文所用的“DNA折纸术”是指混合DNA分子并序列依赖性折叠DNA分子以产生二维和三维形状。二维和三维形状处于纳米级水平。基于以特定方式相互杂交以形成二维或三维结构的混合DNA分子的序列产生形状。

因此，在一些情况下，产生桥接探针、标记探针和/或检测探针，使得当将它们混合在一起时，形成与表面上的核酸反应产物特异性结合的二维或三维结构。

DNA折纸结构可以有利地被设计成使得需要通过两种或更多种接种寡核苷酸与条形码的杂交和/或连接(任选地在单独的初始步骤中引入的)进行的共定位来启动DNA折纸结构的形成，以避免例如由寡核苷酸的背景吸附产生的非特异性信号生成。

检测系统

在一些实施方案中，检测系统可被设计成使得在每个循环中，检测系统中的一对寡核苷酸与转移的报告分子中的相应条形码序列协同杂交。这种标记和检测的一个实例如图5所示。在该实例中，桥接检测探针与条形码的杂交通过桥接检测探针末端处的相对较短(例如4-10bp)的互补序列来稳定(图5)。或者，可通过将桥接探针的末端连接在一起来稳定复合物。

如图5所示，在一些实施方案中，所述方法可包括将系连于支持物的邻近测定法反应产物与一对包括第一桥接探针和第二桥接探针的桥接探针杂交，每个桥接探针包含与条形码的一部分杂交的条形码杂交区域。

在一些情况下，第一桥接探针还包含第一条形码指示区(即，不与条形码序列杂交的区域)，第二桥接探针还包含第二条形码指示区(即，不与条形码序列杂交的另一区域)，其中第一桥接探针和第二桥接探针与条形码的杂交使第一条形码指示区与第二条形码指示区彼此靠近。

在这些实施方案中，在桥接探针与条形码杂交后，可将检测系统的剩余部分(其可由标记探针和检测探针组成，如图5所示)依次加入或作为一个整体加入。如所显示的，检测系统可包括与第一指示区和第二指示区都杂交的标记探针，以及与标记探针杂交的检测探针。可将检测探针与标记探针预先杂交，然而这不是必需的。如图5所示，标记探针与一对桥接探针杂交。因此，在一些情况下，检测与条形码杂交的桥接探针可包括：将标记探针与条形码指示区杂交，其中标记探针包括与第一条形码指示区杂交的第一标记区和与第二条形码指示区杂交的第二标记区。如所显示的，将检测探针(其可用荧光团标记)与标记探针杂交。

如所显示的，多个(例如,5至10个，高达20个或更多个)检测探针可以与一对标记探针杂交。假设一对桥接探针附着于邻近测定法反应产物，几个检测探针可以与一个标记探针杂交以记录高于背景的信号(图5)。这种设计确保了信号产生的特异性得以保持，并且信号在不同杂交事件间是一致的。如果单个桥接探针粘附于表面，则它们不会产生背景，并且单个标记探针可能不会产生足够的信号以产生高于背景的信号。因此，只有当多个标记探针与一对桥接探针杂交时，才能产生可检测的信号。可使用具有不同荧光团的多种标记，从而可以在一个标记循环中检测多种条形码。杂交化学被设计成对于每个靶分子具有确定数量的荧光团。

因此，通过重复标记和检测的循环，可以确定多个条形码在支持物上的位置。基于支持物上条形码的位置和关于结合试剂的已知信息，可以产生平面生物样品中的结合靶标的图谱，所述结合剂与包含那些条形码的寡核苷酸缀合。

将核酸反应产物映射到平面生物样品

在一些实施方案中，除了检测条形码的位置并因此产生平面生物样品中的结合目标的图谱之外，所述方法还包括产生平面生物样品的光学图像。平面生物样品的光学图像可以通过用显微镜检查术染色剂对样品进行染色来产生。然后可将样品的图像与平面生物样品中的结合靶标的图谱进行比较或叠加。这种叠加可用于确定某些生物分子(即，邻近测定法中使用的结合剂的结合靶标)在生物样品的不同区域内的分布。

在执行上述方法之前或之后，可以使用细胞学染色对样品进行染色。在这些实施方案中，染色剂可以是例如鬼笔环肽、钆双胺、吖啶橙、俾斯麦棕、巴明、考马斯蓝、布雷西紫(bresyl violet)、布里斯特紫(brystal violet)、DAPI、苏木精、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、赫斯特染色剂、碘、孔雀石绿、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇(正式名称：四氧化锇)、罗丹明、番红、磷钨酸、四氧化锇、四氧化钌、钼酸铵、碘化镉、碳酰肼、氯化铁、六胺、三氯化铟、硝酸镧、乙酸铅、柠檬酸铅、硝酸铅(II)、过碘酸、磷钼酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银盐、氯金酸钠、硝酸铊、氨基硫脲、醋酸双氧铀、硝酸双氧铀、硫酸氧钒或其任意衍生物。所述染色剂可对任何感兴趣的特征(例如蛋白质或蛋白质类别、磷脂、DNA(例如dsDNA、ssDNA)、RNA、细胞器(例如细胞膜、线粒体、内质网、高尔基体、核膜等)或细胞的区室(例如胞质溶胶、核级分等))是特异的。所述染色剂可增强细胞内或细胞外结构的对比度或成像。在一些实施方案中，样品可以用苏木精和曙红(H&E)染色。

多路复用所述方法

在一些情况下，本文公开的方法可用于分析多个靶结合位点，例如，多个RNA、蛋白质或多个分子相互作用。在此类实施方案中，具有特定条形码的寡核苷酸缀合多种结合剂。根据多种结合靶标的分布，具有拥有特定条形码的寡核苷酸的不同结合剂将具有拥有其它特定条形码的寡核苷酸的其它结合剂集合在一起。

在支持物上的特定位置中包含两个特定条形码的组合的核酸反应产物的产生和检测表明具有两个特定条形码的结合剂的结合位点位于平面生物样品中的相应位置。

在一些实施方案中，可使用多对结合剂-寡核苷酸缀合物(例如至少4对、至少10对或至少50对)来进行邻近测定法。邻近测定法可被设计成使得每种缀合物可以与一种其它缀合物、与一些但不是全部多种缀合物或与所有其它缀合物产生反应产物。例如，连接夹板可被设计成连接特定的一对3′和5′结合剂，例如以询问特定的蛋白质或相互作用，连接特定的一组3′和5′结合剂，例如以询问具有几种组分的蛋白质复合物，或者一种3′结合剂可被设计成具有与所有5′结合剂反应以询问与一大组蛋白质的可能相互作用，或者使用该蛋白质作为其它蛋白质的亚细胞定位标志物的可能性。

在平面生物样品的一个多重分析中，可以设计多种结合多个位点的结合剂，包括蛋白质、碳水化合物、DNA、RNA和脂质。因此，根据本文公开的方法的多重分析可用于同时检测多种蛋白质、碳水化合物、DNA、RNA、脂质或这些生物分子的任意组合。

其它方面

在设计本文公开的方法的不同细节(例如所用的寡核苷酸的序列或特定荧光标记)时，可以考虑某些方面，并在下文中论述所述方面。

可以选择与结合剂连接的寡核苷酸的序列，使得它们是“正交的”，即它们不会彼此交叉杂交。另外，寡核苷酸的序列应被设计成使与样品内源的其它核酸(例如RNA或DNA)的结合减少至最少。

在一些实施方案中，所述方法中使用的寡核苷酸的长度可以独立是8个核苷酸至长达150个核苷酸(例如长度在8至100个核苷酸的范围内)。然而，在许多实施方案中，寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸，例如10至30个核苷酸或11至25个核苷酸，尽管在许多情况下可使用长度超出这些范围的寡核苷酸。

在一些实施方案中，寡核苷酸可具有在15℃至70℃(例如20℃至60℃或35℃至50℃)范围内的计算的T_m。

可使用任何方便的方法(参见例如Gong等人，Bioconjugate Chem.2016 27:217-225和Kazane等人Proc Natl Acad Sci 2012109:3731-3736)将寡核苷酸与结合剂连接。例如，可使用结合剂上任何合适的化学部分(例如半胱氨酸残基或通过工程改造的位点)将独特的寡核苷酸与结合剂直接连接。在一些实施方案中，可通过非共价相互作用将寡核苷酸与结合剂直接或间接连接。在一些实施方案中，可通过使寡核苷酸-马来酰亚胺缀合物与结合剂反应(从而将那些分子连接在一起)来将所述结合剂连接到它们各自的寡核苷酸上。

在一些实施方案中，所述方法可包括用多种结合剂标记样品。该步骤可涉-及在结合剂与样品中的互补位点(例如蛋白质表位或核苷酸序列)结合的条件下，将样品(例如固定在平面支持物诸如显微镜载玻片上的FFPE切片)与所有结合剂一起接触。将抗体和适体结合到样品中的互补位点的方法以及将核酸探针与样品原位杂交的方法是众所周知的。在一些实施方案中，结合剂可以与样品交联，从而防止结合剂在后续步骤中解离。该交联步骤可使用任何胺-胺交联剂来完成，尽管如果需要，可以使用多种其它化学物质来将结合剂交联到样品上。在一些实施方案中，结合剂未与样品交联。

在某些实施方案中，通过基于荧光的成像(FBI)进行读取。目标荧光团包括但不限于氧杂蒽染料，例如荧光素和罗丹明染料，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常以缩写FAM和F为人所知)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G⁵或G⁵)、6-羧基罗丹明-6G(R6G⁶或G⁶)和罗丹明110；花青染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素类，例如伞形酮；苯酰亚胺染料，例如Hoechst 33258；菲啶染料，例如Texas Red；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，例如BODIPY染料和喹啉染料。

在一些实施方案中，通过FBI进行读取以检测用两种、三种或四种可区分的荧光团标记的样品，并且所述方法包括多次(至少一次或两次，直至可区分的荧光团的数量)重复杂交和检测步骤，每次使用不同的桥接寡核苷酸和针对不同条形码的检测探针，然后通过荧光显微镜检查术读取样品以产生显示不同核酸产物分子在支持物上的位置的图像。

在一些实施方案中，进行重复的标记循环。特别地，在每个标记循环中使用多达四至五种荧光团，并且运行几个标记循环。在每个循环中，支持物上的每种核酸反应产物可以用一种标记物来标记。或者，可以在同一循环中用几种荧光标记物来标记每种核酸反应产物。这种组合标记将在每个循环中解码更多的条形码，并减少成像时间。

在另外一个实施方案中，可用特定比例的荧光标记物标记每种核酸反应产物。例如，取决于核酸反应产物中存在的条形码组合和针对不同条形码组合的荧光被标记探针，可以这样标记核酸反应产物，使得任何核酸反应产物可用100％的第一荧光标记，但仅用50％的第二荧光标记，而其它核酸反应产物可用50％的第一荧光标记，但用100％的第二荧光标记。这增加了在每个循环中用设定数量的光谱可分辨的染料检测到的可区分分子的数量。

在一些实施方案中，寡核苷酸和结合剂通过可切割的接头连接。在一些情况下，可切割接头能够使用刺激物(例如化学物质、光或其环境的变化)选择性切割，而不破坏寡核苷酸中的任何键。可切割接头通过从结合剂上释放核酸，并因此从结合剂特异性结合的靶标上释放核酸而促进核酸反应产物转移到支持物上。因此，在某些实施方案中，本文公开的方法包括以下步骤：在对一对或多对与样品结合的结合剂原位进行邻近测定法以产生核酸反应产物的步骤(a)之后并在以保留核酸反应产物在样品中的空间关系的方式将核酸反应产物转移到支持物上的步骤(b)之前，切割寡核苷酸与结合剂之间的接头。

在一些实施方案中，可切割接头可以是允许核酸组分从结合试剂中断裂或释放的酶促反应。可使用的合适的可裂解的键包括但不限于以下：限制性酶消化、使用尿嘧啶DNA糖基化酶然后使用内切核酸酶的特异性位点降解或通过酸性或碱性条件的处理。

在一些实施方案中，可裂解的键联可以是二硫键，其可使用还原剂(例如β-巯基乙醇、TCEP等)容易地断裂。可使用的合适的可裂解的键包括、但不限于以下键：可碱裂解的位点，诸如酯，特别是琥珀酸酯(可被例如氨或三甲胺裂解)、季铵盐(可被例如二异丙胺裂解)和氨基甲酸乙酯(可被氢氧化钠水溶液裂解)；酸可裂解位点诸如苯甲醇衍生物(可用三氟乙酸裂解)、替考拉宁苷元(可用三氟乙酸然后用碱裂解)、缩醛和硫缩醛(也可被三氟乙酸裂解)、硫醚(可被例如HF或甲酚裂解)和磺酰基(可被三氟甲磺酸、三氟乙酸、茴香硫醚等裂解)；亲核体可裂解位点诸如邻苯二甲酰胺(可被取代的肼裂解)、酯(可被例如三氯化铝裂解)；和Weinreb酰胺(可被氢化锂铝裂解)；以及其它类型的化学可裂解位点，包括硫代磷酸酯(可被银或汞离子裂解)和二异丙基二烷氧基甲硅烷基(可被氟离子裂解)。其它可裂解的键对本领域技术人员来说是显而易见的，或者描述于相关文献和教科书(例如Brown(1997)Contemporary Organic Synthesis 4(3)；216-237)中。在一些实施方案中，可裂解的键可被酶裂解。在一些特定的实施方案中，可使用光可切割的(“PC”)接头(例如紫外光可切割的接头)。如Guillier等人所述，合适的供使用的可光切割的接头可包括基于邻硝基苄基的接头、苯甲酰甲基接头、烷氧基苯偶姻接头、铬芳烃络合物接头、NpSSMpact接头和新戊酰基二醇接头，如Guillier等人(Chem Rev.2000Jun14；100(6):2091-158)中所描述的。可用于本发明方法的示例性连接基团可描述于Guillier等人(同上)和Olejnik等人(Methods inEnzymology 1998 291:135-154)中，并进一步描述于U.S.P.N.6,027,890；Olejnik等人(Proc.Natl.Acad Sci,92:7590-94)；Ogata等人(Anal.Chem.2002 74:4702-4708)；Bai等人(Nucl.Acids Res.200432:535-541)；Zhao等人(Anal.Chem.2002 74:4259-4268)；以及Sanford等人(Chem Mater.1998 10:1510-20)中，并且可以从Ambergen(Boston,MA；NHS-PC-LC-Biotin)、Link Technologies(Bellshill,Scotland)、Fisher Scientific(Pittsburgh,PA)和Calbiochem-Novabiochem Corp.(La Jolla,CA)购买。

在一些实施方案中，可切割的接头包含可被还原剂切割的键联(例如二硫键)。在这些实施方案中，可以使用还原剂例如三(2-羧基乙基)膦(TCEP)来去除标记。

在其中通过荧光读取样品的实施方案中，每个读取步骤可产生分布在支持物上的核酸产物分子的图像。在一些实施方案中，该方法还可包括分析、比较或叠加至少两个图像。在一些实施方案中，所述方法还可包括叠加所有图像以产生显示不同核酸产物分子在支持物上的分布模式的图像。所使用的图像分析模块可以转换来自每个荧光团的信号，以产生多个伪彩图像。图像分析模块可以叠加多个伪彩图像(例如叠加每个像素处的伪彩色)以获得多路复用的伪彩图像。多个图像(例如未加权的或加权的)可被转换成单一的伪彩色，例如，以便表示以特定结合剂的结合为特征的感兴趣的生物特征。基于用户的手动输入，可将伪彩色分配给特定的结合剂或结合剂的组合。在某些方面，图像可包括仅与和感兴趣的特征相关联的标记的强度(诸如在细胞核区室中)相关的伪颜色。图像分析模块还可被配置成调整(例如归一化)信号强度或伪彩色的强度和/或对比度，以执行去卷积操作(诸如强度或伪彩色的模糊化或锐化)，或者执行任何其它合适的操作来增强图像。图像分析模块可以执行上述操作中的任一种，以对准从连续图像中获得的像素和/或使从连续图像中获得的像素上的强度或伪色模糊或平滑。

在一些情况下，核酸反应产物被转移到三维(3-D)凝胶基质中。可这样选择凝胶，使得其仅固定结合在组织中的核酸反应产物，而不固定来自生物样品的其它生物分子。这种凝胶基质的一个实例包括聚丙烯酰胺凝胶和硅胶。蛋白质、RNA、DNA和未连接的寡核苷酸以及其它生物分子可被消化，从而在凝胶中仅留下核酸反应产物。可使用外切核酸酶保护修饰来保护核酸反应产物免受酶促消化。因此，经过消化另外的生物分子，只有核酸反应产物会留在凝胶中。核酸反应产物也可具有将它们与3D凝胶基质交联的官能团，从而将它们空间固定在凝胶中，以便在已从凝胶中清除了其它分子时用于后续分析。

替代性的原位实施方案

在一些实施方案中，邻近测定法反应产物可保留在组织中产生它们的位点上。在这些实施方案中，可使用可编程杂交原位检测邻近测定法反应产物。

原位邻近测定通常涉-及RCA(滚环扩增)，然后例如通过与被标记探针杂交来原位检测RCA产物，所述探针与RCA产物杂交。然而，如上所述，RCA产物是相对大的分子，需要物理空间来高效产生。在许多情况下，产生的RCA产物在其密度和长度方面均不一致。因此，在任何一个实验中，一些RCA产物可是密集堆积的，而其它产物可是松散堆积的。同样，一些RCA产物可占用很大的物理空间，而其它产物可占用很小的空间。这些问题经常混淆结果。

在本方法的原位实施方案中，在标记邻近测定法反应产物之后观察到的“斑点”应该是明亮的、大小一致的并且具有一致的强度。此外，由于斑点比通过基于RCA的方法获得的斑点小得多，因此可以观察到多得多的斑点。另外，本方法允许该方法以使用基于RCA的方法是不可能的方式多路复用。一些相同的有利方面可适用于其中邻近测定法反应产物被转移到支持物上的实施方案，如上所述的。

过滤器实施方案

在任何实施方案中，可通过将细胞悬浮液通过过滤器来产生平面样品，其中细胞保留在过滤器上。提供了用于分析细胞悬浮液的方法。在一些实施方案中，该方法可包括：(a)通过多孔毛细管膜过滤细胞悬浮液，从而将细胞分布在膜上，(b)将膜放置于平面支持物上，使膜的细胞面向支持物，(c)以保持核酸在细胞中的空间关系的方式将核酸从细胞转移到支持物中或支持物上，(d)从支持物上移除多孔毛细管膜和细胞，以及(e)对转移到支持物上的核酸进行空间分析。

如上所述，除其它方法以外，本文提供了用于分析细胞悬浮液的方法，其可包括：(a)通过多孔毛细管膜过滤细胞悬浮液，从而将细胞分布在膜上；(b)将膜置于平面支持物上，使膜的细胞侧面向支持物；(c)以保持核酸在细胞中的空间关系的方式将核酸从细胞转移到支持物中或支持物上；(d)从支持物上移除多孔毛细膜和细胞；以及(e)对转移到支持物上的核酸进行空间分析。这种方法的一些原理如图14所示。

在一些实施方案中，所述方法还可包括，在步骤(c)之前，例如在步骤(a)与步骤(c)之间，对一对或多对与细胞结合的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法，以在细胞中或细胞上产生邻近测定法反应产物。该实施方案的一些原理示意性地示于图14中。在这些实施方案中，在步骤(c)中转移并在步骤(e)中分析的核酸包括邻近测定法反应产物。在这些实施方案中，分析步骤可包括(i)标记支持物中或支持物上r转移的邻近测定法反应产物；以及(ii)对支持物成像以产生支持物中或支持物上与邻近测定法反应产物结合的位点的图像。邻近测定包括牵涉结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸的连接、引物延伸和缺口填充/连接反应的任意组合。此类测定法的实例描述于本公开的其它地方。

在一些情况下，可将RNA从细胞转移到基底上。在一些实施方案中，支持物可涂覆有与polyA⁺RNA杂交的寡聚d(T)。在其它实施方案中,(b)的平面支持物包含带空间条形码的捕获寡核苷酸阵列，步骤(c)包括将转移的核酸与带空间条形码的捕获寡核苷酸杂交，并且步骤(e)包括使用转移的核酸作为模板延伸捕获寡核苷酸，并对引物延伸模板的拷贝进行测序以产生序列读数。关于该方法的一些方面的描述，参见例如Nerurkar等人(Cancers(Basel)2020 12:2572)。在这些实施方案中，所述方法可包括使用序列读数中的空间条形码将序列读数映射到支持物上的位点。

转移步骤(c)可通过电泳或扩散来完成。在任何实施方案中，多孔毛细管膜可以是多孔阳极氧化铝(AAO)膜，尽管其它过滤器是已知的并且可被使用。

在任何实施方案中，所述方法可包括(i)将细胞悬浮液置于多孔毛细管膜上；以及(ii)施加使悬浮液的液体组分穿过膜的力。在这些实施方案中，例如，所述力可以是选自离心力、负压和正压的主动力，或者是选自毛细作用和蒸发的被动力。

如上所述，可以以允许细胞粘附于其上的方式(例如通过静电相互作用)涂覆过滤器。在一些实施方案中，所述方法可包括根据需要，例如在步骤(d)与步骤(e)之间洗涤多孔毛细管膜，以去除剩余的反应物等。

在任何实施方案中，膜中的孔的内径在2nm至500nm的范围内，膜中相邻孔的中心之间的平均距离在50nm至1000nm的范围内，并且膜中相邻孔的边缘之间的平均距离在10nm至500nm的范围内。这些距离可以根据需要进行调整。

在任何实施方案中，细胞悬浮液可包括血细胞、免疫细胞(例如从血液中分离的免疫细胞)、通过胰蛋白酶处理而彼此分离的单细胞或悬浮培养的细胞。

将细胞悬浮液粘附到表面上的常规方法通常包括将细胞沉积在表面上，并等待细胞扩散或沉淀至表面。这些方法需要大量的时间，并且不是所有的细胞都能到达表面。另外，因为细胞以由毒物分布决定的模式沉降，所以现有方法可导致大量的双联体(doublet)和团块，这反过来会干扰分析。过滤器的使用确保所有细胞以非常快的方式到达表面。此外，因为细胞将随着液体的流动方向行进，所以细胞应该比其它方法更均匀地展开(例如彼此相邻，而不是彼此叠置)。

所述方法可用于将RNA从细胞转移到支持物(例如涂覆有寡聚d(T)或带空间条形码的寡核苷酸阵列的表面)上，以及用于将邻近测定产物转移到支持物(例如载玻片)上，使得可以标记产物，然后在支持物上进行分析。在一些实施方案中，所述方法可包括对一对或多对与细胞结合的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法，以在细胞中或细胞上产生邻近测定法反应产物，并将邻近测定法反应产物转移到支持物上。如下文将更详细描述的，转移到支持物上的邻近测定法反应产物可以以多种不同的方式产生，例如，通过在结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸之间进行连接、引物延伸、缺口填充/连接或其任何杂交，使得寡核苷酸之一的序列共价连接到其拷贝或另一个寡核苷酸上，然后将第一产物转移到支持物上。或者，第一产物或未连接的寡核苷酸可用作夹板，用于将其它寡核苷酸连接在一起以产生第二产物。在这些实施方案中，可将第二产物转移到载体上。

在一些情况下，在混合和分析之前，可对多个样品进行“散列标记(hash-tag)”(参见例如Stoeckius等Genome Biology 2018 19:224)。在这些实施方案中，可将细胞与样品加条形码亲和试剂(例如带条形码的抗体)混合，这允许样品进行多路复用。

在将细胞通过过滤器中，细胞在固相上变得彼此更加分开，这与可依赖随机分布的方法相反。这反过来使许多下游步骤工作更高效，并允许收集更有意义的数据。如根据下面的讨论将会显而易见的，细胞可被固定在过滤器上，当细胞在过滤器上时，细胞可被固定和透化。过滤器的结构可以变化很大。然而，在许多情况下，过滤器可具有使细胞自组装成有序图案的元件(由物理结构例如孔或另一种表面化学物质介导的)，从而最大化表面积的利用。

在一些实施方案中，可将连接至带条形码的寡核苷酸(例如结合剂-寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸具有识别针对缀合有其的抗体的抗原的条形码)的捕获剂引入到细胞中或细胞上。探针结合特定的分子，例如DNA、RNA或蛋白质。在去除未反应的探针(使用例如洗涤或酶促降解等)后，然后可将结合事件被转化成报告分子，所述报告分子可被转移(或“印迹”)到另一个表面上。在这些实施方案中，可以以保持分子的相对空间位置的方式将报告分子从细胞转移到支持物(例如载玻片)的表面。报告分子附着于支持物，并且可使用光学单分子分辨率在支持物上检测其。如果样品是散列标记的，则可使用循环解码进行多路复用分析，细胞所源自的样品可通过分析在合并之前添加的样品条形码来确定。

本方法允许以高度多路复用的方式分析细胞。过滤步骤在实际分析的可用细胞数量方面提供了高产量。在表面上使用单分子组合读出可以潜在地避免使用下一代测序仪器来产生数据，从而降低分析成本并提供高空间分辨率。如上所述，散列标记允许能够并行分析许多样本，并在分析期间解码样品身份。

本方法的一个有利方面是：在过滤器表面上光学询问细胞是具有挑战性的。此外，将细胞固定在无孔表面上可能非常缓慢且效率低下。

如下文将更详细描述的，所述方法可包括对一对或多对与细胞结合的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法，以在细胞中或细胞上产生邻近测定法反应产物，然后将邻近测定法反应产物转移到支持物上。在这些实施方案中，结合剂-寡核苷酸缀合物各自包含：i.与样品中的位点或序列结合的结合剂和ii.第一寡核苷酸。在一些情况下，邻近测定可包括将成对的报告寡核苷酸原位连接在一起，以产生报告探针，其中报告寡核苷酸的连接以i.彼此邻近的第一寡核苷酸或ii其连接产物为模板。然后将报告探针转移到支持物上，然后在所述支持物上进行检测。

在一些实施方案中，邻近测定可以是用于分析DNA或RNA的基于连接的测定、或用于分析蛋白质、蛋白质间相互作用或蛋白质修饰的基于连接的邻近测定。在一些情况下，所述方法可产生生物素化的报告分子，所述报告分子通过连接不参与连接反应的末端被保护的两个分子而免受外切核酸酶降解。

在一些实施方案中，可使用例如寡聚d(T)捕获寡核苷酸在接收表面上转移和捕获RNA分子。随后可将捕获的RNA分子共价固定到基底上，并使用基于探针的方法(例如使用单分子FISH或基于挂锁探针/RCA的方法)在基底上进行询问。

在一些实施方案中，抗体-寡核苷酸缀合物可用于询问蛋白质在细胞中或细胞上的存在。在这些实施方案中，寡核苷酸可在抗体已经与细胞结合并经洗涤后释放。在这些实施方案中，释放的寡核苷酸可被设计成具有例如生物素，以促进在接收表面上的捕获。可使用用于RNA和DNA分析的杂交探针，其在印迹过程中全部或部分释放，并使用例如生物素部分和涂覆有链霉抗生物素的捕获表面将所述杂交探针捕获在接收表面上。

过滤器可以是阳极氧化铝(AAO)过滤器，或任何允许捕获细胞并随后对细胞的生物分子进行印迹的过滤器。此类过滤器可具有微米或纳米结构的可渗透表面，所述表面具有这样的结构，该结构利用流动将细胞引导至过滤器上的不同位置，使得细胞位于孔上并可能堵塞孔，从而抑制其它细胞位于相同的隔室中。在一些实施方案中，可使用经修饰的表面，以将细胞吸引或排斥至特定位置。在某些情况下，一旦细胞被固定，溢出/过量的细胞可被从表面洗掉。

所述方法特别适用于分析血液中的外周血细胞和免疫细胞。可以富集血细胞的某些亚型，以针对感兴趣的某些细胞类型进行分析。可以询问血细胞的表面受体、分泌的因子或对抗原的受体亲和力，以阐明免疫反应，使用核酸标记的抗体分析途径激活状态等。所述方法还可用于以多路复用的方式分析细胞培养物，例如，以使用与CRISPR插入片段相关的表达的条形码结合分析对基因表达、蛋白质表达和蛋白质相互作用和修饰的影响来进行CRISPR筛选分析。所述方法也可用于以多路复用的方式分析获自组织的解离的细胞。

在一些情况下，在过滤和透化之前，可以有利地使用例如PFA固定细胞，以便能够分析细胞内的RNA和/或蛋白质。

邻近测定方法可包括将细胞与多种结合剂-寡核苷酸缀合物结合，并对结合的缀合物原位进行邻近测定法。结合可以在将细胞分布在过滤器上之前或之后进行。缀合物的结合剂部分可以是抗体。然而，在其它实施方案中，结合剂可以是适体或寡核苷酸探针。可使用各种不同的方法，例如，邻近连接测定法(其产生其中缀合物中与邻近的位点结合的寡核苷酸末端被连接在一起的第一产物)或邻近延伸测定法(其产生其中使用另一种寡核苷酸作为模板来延伸一个或两个寡核苷酸的第一产物)来完成邻近测定法。在任一情况下，可将第一产物从它们所系连至的结合剂中释放出来，然后在步骤(c)中作为邻近测定法反应产物转移到支持物上。在这些实施方案中，在步骤(c)中转移到支持物的邻近测定法反应产物是第一产物。在其它情况下，第一产物可用作夹板，将一对有尾部的检测寡核苷酸连接在一起，以产生第二产物。在这些实施方案中，在步骤(c)中转移到支持物的邻近测定法反应产物是第二产物。可以以保持邻近测定法反应产物在x-y平面中的空间关系的方式将它们转移到支持物上，然后从支持物上移走过滤器(和附着于其上的细胞)。在该方法中，转移的核酸被系连于支持物上，然后可以例如，通过将被标记探针与系连的邻近测定法反应产物杂交(直接或间接)来在支持物上检测其，同时它们存在于支持物上，并通过显微镜检查术分析标记模式。支持物可以是平面基底诸如载玻片(其可被涂覆)，或三维基底诸如凝胶。如果基底是平面基底，那么邻近测定法反应产物将在基底上。如果基底是三维基底，那么邻近测定法反应产物将在基底中。

本方法可使用任何类型的捕获支持物来实现，所述捕获支持物可以作为细胞的过滤器。这种过滤器应该具有足以允许液体快速流过并捕获细胞的孔径。合适的捕获支持物可由多孔有机或无机材料制成，所述材料包括固体，诸如多孔金属、陶瓷、均质薄膜(例如聚合物)和非均质固体(聚合物混合物、混合玻璃)。多孔陶瓷膜可由无机材料(诸如氧化铝、二氧化钛、氧化锆、重结晶的碳化硅)制成。参见例如由Pamgene(The Netherlands)出售的PamChip,Wu等人,Nucleic Acids Res.2004 32:e123和Anthony等人Biotechniques.(2003)34:1082-6,1088-9。示例性多孔聚合物膜可由醋酸纤维素、硝化纤维素、纤维素酯(CA、CN和CE)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚丙烯腈(PAN)、聚酰胺、聚酰亚胺、聚乙烯和聚丙烯(PE和PP)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)和聚氯乙烯(PVC)制成。

在任何实施方案中，毛细管膜的孔应该具有足够的尺寸，以防止细胞穿过孔。例如，在实施方案中，毛细管膜的孔径可以不超过细胞中值直径的50％，而在一些实施方案中，其可以不超过细胞中值直径的10％。因此，在使用多孔毛细管膜过滤样品时，细胞应该保留在膜的顶部，并且不应该完全进入或穿过孔。

在某些实施方案中，多孔毛细管膜可包含与细胞结合的涂层和/或帮助分离细胞的图案化表面(例如亲水或疏水区域的阵列)。

膜中孔的内径、膜中相邻孔的中心之间的距离以及膜中相邻孔的边缘之间的距离可通过沉积的电压、酸的类型和其它参数来控制(一般参见Poinern，同上)。在一些实施方案中，膜中的孔的内径可在5nm至500nm，例如，4nm至250nm、4nm至50nm、50nm至100nm、100nm至200nm或200nm至500nm的范围内。独立地，膜中相邻孔的中心之间的平均距离可在50nm至1000nm，例如，50nm至420nm、50nm至100nm、100nm至250nm、250nm至500nm或500nm至1000nm的范围内。膜中相邻孔的边缘之间的平均距离可在10nm至500nm、10nm至50nm、50nm至200nm或200nm至500nm的范围内。可以理解，本文提供的孔的直径和其间的平均距离值是示例性的，并且这些值可根据实施方案而变化。根据需要，所使用的膜可具有任何合适的厚度(例如在20μm至500m或50μm至200μm的范围内)并且如上所述，可包含一个或多个支持结构(例如支持环)以便在使用过程中保持膜的完整性。

如上所述，细胞悬浮液可包括血细胞、免疫细胞、通过胰蛋白酶处理而彼此分离的单细胞或悬浮培养的细胞等。在这些实施方案中，术语“血液样品”或其语法上的等同物是指全血样品或全血中的细胞亚群的样品。全血中的细胞亚群包括血小板、红血细胞(红细胞)、血小板和白细胞(即，外周血白细胞，其由嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞组成)。这五种类型的白细胞可以进一步分为两组：粒细胞(其也被称为多形核白细胞，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核白细胞(其包括单核细胞和淋巴细胞)。淋巴细胞可以进一步分为T细胞、B细胞和NK细胞。外周血细胞存在于血液循环池中，并且未被隔离在淋巴系统、脾脏、肝脏或骨髓中。如果首先将血液与剂接触，然后将血液样品用于测定中，那么可将一部分或全部接触的血液用于测定中。血液只是该方法中可以使用的许多生物样品中的一种。在其它实施方案中，可采用来自其它组织(例如其它软组织诸如肝脏或脾脏等)的完整细胞或在组织培养中生长的细胞。处理此类组织以提供适用于流式细胞术的细胞悬浮液的方法是已知的。一旦产生，就可以以与下面描述的方式类似的方式使用细胞悬浮液。细胞悬浮液可由软组织诸如脑、肾上腺、皮肤、肺、脾脏、肾脏、肝脏、脾脏、淋巴结、骨髓、膀胱、胃、小肠、大肠或肌肉等以及单层细胞制成。

在一些实施方案中，可将细胞与测试剂离体(即，使用从受试者抽取的血液)或体内(例如通过向哺乳动物施用测试剂)接触，并且可将测定的结果与从细胞参照样品(例如未与测试剂或不同量的测试剂接触的血细胞)获得的结果进行比较。

施加到过滤器上的悬浮液可包含至少1,000个、至少10⁴个、至少10⁵个、至少10⁶个细胞。

在一些情况下，本文公开的方法包括从支持物上移走过滤器(和细胞)以将转移的核酸留在支持物上或支持物中。

可以以任何合适的方式从支撑物上移走过滤器。例如，可以简单地将基底(诸如在其上放置平面生物样品的载玻片)从支持物上移开。因为核酸反应产物共价或非共价结合到支持物上，所以当从支持物上移除过滤器时，核酸反应产物仍然附着于支持物。

生物样品的任何残余都可通过酶促作用除去。例如，可用降解除多核苷酸外的生物分子的酶处理支持物，从而仅去除除核酸外的生物分子。此外，如果核酸反应产物包含DNA，则可用RNA降解酶处理支持物以除去污染的RNA。例如，可用外切核酸酶的混合物处理支持物。

试剂盒

如上所述，本公开还提供了包括用于实施本发明方法的试剂的试剂盒。试剂盒的这些不同组分可存在于单独的容器中或混合在在同一容器中。

该试剂盒的各种组分可存在于单独的容器中，或者根据需要，可以将某些相容的组分预先组合到单个容器中。

除了上述组分之外，本发明试剂盒还可包括使用试剂盒的组分实施本发明方法的说明书。

效用

本文所述的方法和组合物可广泛用于多种分析平面生物样品的应用中(例如在分析组织切片、细胞片或离心沉降的细胞中)。例如，所述方法可用于分析任何组织，包括已经例如通过脂质消除而澄清的组织。可使用膨胀显微镜法(expansion microscopy method)(参见例如Chozinski等人Nature Methods 2016 13:485-488)制备样品，所述方法涉-及产生通过有机聚合物和细胞组分的选择性共聚合产生的生物系统的聚合物复制品。例如，所述方法可用于分析细胞、外来体、细胞外结构、沉积在固体支持物上或凝胶中的生物分子(Elisa、蛋白质印迹、斑点印迹)、整个生物体、单个器官、组织、细胞、细胞外组分、细胞器、细胞组分、染色质和表观遗传标志物、生物分子和生物分子复合物。结合剂可以与任何类型的分子，包括蛋白质、脂质、多糖、蛋白聚糖、代谢物、核酸或人造小分子等结合。所述方法可以在筛选和药物发现等方面具有许多生物医学应用。另外，所述方法具有多种临床应用，包括但不限于诊断、预后、疾病分层、个性化药物、临床试验和药物伴随试验。

在空间分析技术领域，本公开旨在提供蛋白质间相互作用和蛋白质原位修饰的高度多路复用读出。本公开还允许蛋白质、蛋白质翻译后修饰和蛋白质相互作用的单分子分析。

本文公开的方法也可用于在单一测定形式中分析RNA或RNA与其它分子诸如蛋白质之间的RNA相互作用。

在一些情况下，本文公开的方法可用于分析靶RNA。例如，如上所述，可使用报告探针将来自平面生物样品的RNA靶标直接复制到报告多核苷酸中。特别地，不进行邻近测定法来产生核酸反应产物，而是将RNA靶标用作模板来产生报告多核苷酸。这种步骤可以例如在将样品与结合剂接触之前进行，因为蛋白质分析所需的抗原修复步骤可能会破坏RNA而不会破坏DNA，或者在引入检测寡核苷酸的同时进行，所述检测寡核苷酸与通过连接结合剂的核酸而产生的第一产物连接。

此外，本文公开的方法可用于分析RNA与其它生物分子诸如RNA、蛋白质、DNA、碳水化合物、脂质等的相互作用。在某些此类实施方案中，可使用一种靶向RNA的结合剂和另一种靶向蛋白质、碳水化合物或脂质的结合剂进行邻近测定。也可使用一种靶向RNA的结合剂和另一种靶向不同RNA的结合剂进行邻近测定。此类实施方案可用于分析靶RNA与任何其它生物分子的相互作用，对于所述生物分子，存在可用的特异性结合剂。

在一些情况下，本文公开的方法可用于鉴定彼此邻近的靶位点。例如，第一结合剂-寡核苷酸缀合物结合第一位点，第二结合剂-寡核苷酸缀合物结合第二位点。当第一位点和第二位点邻近时，寡核苷酸彼此靠近。因此，从与第一和第二结合剂-寡核苷酸缀合物缀合的寡核苷酸产生核酸表明寡核苷酸与结合到邻近位点的结合剂缀合。

因此，在某些情况下，本文公开的方法可用于：确定一种或多种特定蛋白质在平面生物样品中的位置。在这些实施方案中，结合剂结合到同一蛋白质的不同位点。

在一些情况下，本文公开的方法也可用于鉴定蛋白质间相互作用发生的位置。在这些实施方案中，结合剂与不同的蛋白质结合。

因为靶标的相对接近度取决于绝对浓度，并且每次相互作用产生的信号的量取决于另外的效率因素(efficiency factor)如结合亲和力和化学及酶促效率，所以使多重实验中的相对信号相互关联将是有利的。例如，使用参考蛋白质、RNA或DNA靶标或者使来自单个蛋白质的信号与来自蛋白质相互作用的信号相关联。例如，可以针对通过细胞标志物的存在或通过面积确定的细胞类型，分析一组细胞中的每个细胞的信号。

此外，在一些情况下，本文公开的方法可用于确定生物分子诸如蛋白质的翻译后修饰。在某些此类实施方案中，一种结合剂结合翻译后修饰或结合覆盖翻译后修饰的表位和靶蛋白，另一种结合剂结合同一蛋白质中的不同位点。从与第一结合剂-寡核苷酸缀合物和第二结合剂-寡核苷酸缀合物缀合的寡核苷酸产生核酸表明该蛋白质具有被翻译后修饰的位点。通过使用对一般翻译后修饰特异的结合剂，可以询问大量蛋白质中此类修饰的存在。可以有利地以相对的方式分析信号，以将修饰的整体存在的作用、蛋白质浓度和测定效率的影响归一化掉。

在特定实施方案中，样品可以是从患者获得的组织活检物的切片。感兴趣的活检物包括皮肤(黑素色瘤、癌等)、软组织、骨骼、乳腺、结肠、肝脏、肾脏、肾上腺、胃肠、胰腺、胆囊、唾液腺、宫颈、卵巢、子宫、睾丸、前列腺、肺、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、垂体(腺瘤等)、脑、脊髓、眼、神经和骨骼肌等的肿瘤和非肿瘤活检物。

在某些实施方案中，结合剂可以与蛋白质性质的生物标志物(包括癌症生物标志物)特异性结合。示例性癌症生物标志物包括但不限于癌胚抗原(用于腺癌的鉴定)、细胞角蛋白(用于癌的鉴定，但也可在一些肉瘤中表达)、CD15和CD30(用于霍奇金病)、甲胎蛋白(用于卵黄囊瘤和肝细胞癌)、CD117(用于胃肠间质瘤)、CD10(用于肾细胞癌和急性淋巴母细胞性白血病)、前列腺特异性抗原(用于前列腺癌)、雌激素和孕酮(用于肿瘤鉴定)、CD20(用于B细胞淋巴瘤的鉴定)和CD3(用于T细胞淋巴瘤的鉴定)。

上述方法可用于分析来自受试者的细胞，以确定例如细胞是否正常，或确定细胞是否对治疗有反应。在一个实施方案中，所述方法可用于确定癌细胞中发育异常的程度。在这些实施方案中，细胞可以是来自多细胞生物的样品。生物样品可以从个体中分离，例如从软组织中分离。在特定情况下，所述方法可用于区分FFPE样品中的不同类型的癌细胞。

上述方法在使用多种抗体或抗体对检查样品时特别有用，每种抗体或抗体对识别不同的标志物。癌症和可用于鉴定这些癌症的生物标志物的实例如下所示。在这些实施方案中，不需要检查下面列出的所有标志物来作出诊断。

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在一些实施方案中，所述方法可涉及获得如上所述的数据(图像)(其电子形式可以是从远程位置转发的)，并且所述图像可由医生或其它医学专业人员分析以确定患者是否具有异常细胞(例如癌细胞)或者存在哪种类型的异常细胞。所述图像可以用作诊断以确定受试者是否患有疾病或疾患，例如癌症。在某些实施方案中，例如，所述方法可用于确定癌症的分期，鉴定转移的细胞，或监测患者对治疗的反应。

还可询问细胞标志物，包括T细胞、B细胞和嗜中性粒细胞的标志物(例如CD3、CD20、CD15等)。本文所述的组合物和方法可用于诊断患有疾病的患者。在一些情况下，患者样品中生物标志物的存在或不存在可以指示患者患有特定疾病(例如癌症)。在一些情况下，通过将来自患者的样品与来自健康对照的样品进行比较，可以诊断出患者患有疾病。在该实例中，可以测量相对于对照的生物标志物的水平。患者样品中生物标志物水平相对于对照的差异可以指示疾病。在一些情况下，分析一种或多种生物标志物以诊断患有疾病的患者。本公开的组合物和方法特别适合于鉴定样品中多种生物标志物的存在或不存在，或确定其表达水平。

在一些情况下，本文的组合物和方法可用于确定患者的治疗计划。生物标志物的存在或不存在可以表明患者对特定疗法有反应或对于所述疗法是难治性的。例如，一种或多种生物标志物的存在或不存在可以表明疾病对于特定疗法是难治性的，并且可以施用替代疗法。在一些情况下，患者目前正在接受治疗，并且一种或多种生物标志物的存在或不存在可以指示该疗法不再有效。

在一些情况下，所述方法可用于各种诊断、药物发现和研究应用，包括但不限于疾病或疾患的诊断或监测(其中图像鉴定疾病或疾患的标志物)、药物靶标的发现(其中图像中的标志物可作为药物疗法的靶标)、药物筛选(其中药物的效果通过图像中所示的标志物监测)、确定药物敏感性(其中药物敏感性与标志物相关)和基础研究(其中需要测量样品中细胞之间的差异)。

在某些实施方案中，可使用上述方法来比较两个不同的样品。不同的样品可由“实验”样品(即，感兴趣的样品)和可将其与实验样品作比较的“对照”样品组成。在许多实施方案中，不同的样品是成对的细胞类型或其级分，一种细胞类型是感兴趣的细胞类型，例如异常细胞，而另一种细胞类型是对照细胞，例如正常细胞。如果比较细胞的两个级分，则所述级分通常是来自两种细胞中的每一种的相同级分。然而，在某些实施方案中，可以比较同一细胞的两个级分。示例性细胞类型对包括例如从组织活检物中分离的细胞(例如来自患有诸如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、皮肤癌或感染了病原体等疾病的组织的细胞)和来自同一组织(通常来自同一患者)的正常细胞；在组织培养中生长的永生化的细胞(例如具有增殖突变或永生化转基因的细胞)、被病原体感染的或经处理的细胞(例如用环境或化学剂诸如肽、激素、改变的温度、生长条件、物理应激、细胞转化等处理的细胞)和正常细胞(例如除了不是永生的、被感染的或经处理的等之外与实验细胞完全相同的细胞)；从患有癌症、疾病的哺乳动物、老年哺乳动物或暴露于某种状况的哺乳动物中分离的细胞，以及来自同一物种(优选来自同一科)的健康或年轻的哺乳动物的细胞；以及来自同一哺乳动物的分化细胞和未分化细胞(例如在哺乳动物中，作为另外的细胞的祖先的细胞)。在一个实施方案中，可使用不同类型的细胞(例如神经元和非神经元细胞)或不同状态的细胞(例如在细胞上刺激之前和之后)。在本发明的另一个实施方案中，实验材料包含易受病原体诸如病毒(例如人免疫缺陷病毒(HIV)等)感染的细胞，并且对照材料包含抵抗该病原体感染的细胞。在另一个实施方案中，样品对由未分化细胞，例如干细胞和分化的细胞代表。

由所述方法产生的图像可以并排观看，或者在一些实施方案中，可将图像叠加或组合。在一些情况下，图像可以是彩色的，其中图像中使用的颜色可以对应于所使用的标记物。

来自任何生物体，例如来自细菌、酵母、植物和动物(诸如鱼、鸟、爬行动物、两栖动物和哺乳动物)的细胞可用于本发明方法中。在某些实施方案中，可以使用哺乳动物细胞，即来自小鼠、兔、灵长类动物或人的细胞或其培养的衍生物。

实施方案

实施方案F1.一种用于分析样品的方法，其包括：

(a)将寡核苷酸或包含其的缀合物与平面生物样品在所述寡核苷酸或缀合物特异性结合所述样品中或所述样品上的位点的条件下接触；(b)进行一个或多个步骤以原位释放和/或延伸寡核苷酸或其互补序列，以产生报告探针；(c)以保持报告探针在样品中的空间关系的方式，将报告探针的全部或部分从样品转移到不包含寡核苷酸阵列的平面支持物上；以及(d)检测支持物上的报告探针。

实施方案F2.实施方案F1的方法，其中：

步骤(a)包括在寡核苷酸与样品中的内源RNA或DNA杂交的条件下，将所述寡核苷酸与样品杂交；以及

步骤(b)包括通过连接或缺口填充/连接将与RNA或DNA中相邻位点杂交的任何寡核苷酸连接在一起。

实施方案F3.实施方案F1的方法，其中样品包含来自邻近连接测定的连接产物；以及

步骤(a)包括在寡核苷酸与连接产物杂交的条件下将寡核苷酸与样品杂交；以及

步骤(b)包括通过连接或缺口填充/连接反应将与连接产物中相邻位点杂交的任何寡核苷酸连接在一起。

实施方案F4.实施方案F1或F2的方法，其中寡核苷酸是外切核酸酶敏感性的，但报告探针是抗外切核酸酶的。

实施方案F5.实施方案F4的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)与(c)之间用外切核酸酶处理样品。

实施方案F6.实施方案F1的方法，其中：

步骤(a)包括在抗体与样品中或样品上的位点结合的条件下，将组织样品与抗体-寡核苷酸缀合物接触；以及

步骤(b)包括从缀合抗体上切割寡核苷酸或其延伸产物以产生报告探针。

实施方案F7.实施方案F1的方法，其中所述报告探针是通过连接或缺口填充反应产生的。

实施方案F8.实施方案F1的方法，其中通过引物延伸反应产生报告探针。

实施方案F9.任何前述F实施方案的方法，其中通过显微镜检查术进行步骤(d)。

实施方案F10.实施方案F9的方法，其中步骤(d)包括将被标记探针与报告探针杂交，然后通过显微镜检查术分析探针的结合模式。

实施方案F11.实施方案F10的方法，其中将探针组在重复的循环中进行杂交并洗掉以解码个体报告分子，使用至少两个或更多个循环来进行解码。

实施方案F12.任何前述F实施方案的方法，其中所述样品是组织切片。

实施方案F13.任何前述F实施方案的方法，其中所述样品包含哺乳动物细胞。

实施方案F14.任何前述F实施方案的方法，在步骤(a)之后，通过使生物样品与支持物接触来进行释放，其中所述生物样品面向支持物，然后加热样品。

实施方案A1.一种用于分析平面生物样品的方法，其包括：

(a)对一对或多对与样品结合的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法，以产生邻近测定法反应产物；

(b)以保持邻近测定法反应产物在样品中的空间关系的方式将核酸反应产物转移到支持物中或支持物上；以及

(c)检测支持物中或支持物上的邻近测定法反应产物。

实施方案A2.实施方案A1的方法，其中邻近测定包括牵涉结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸的连接、引物延伸和缺口填充/连接反应的任意组合。

实施方案A3.实施方案A1的方法，其中载体是平面载体。

实施方案A4.实施方案A1的方法，其中载体是基质。

实施方案A5.实施方案A1的方法，其中支持物是凝胶。

实施方案A6.任何前述实施方案的方法，其中步骤(c)包括：

(b)(i)标记支持物中或支持物上的邻近测定法反应产物；以及

(ii)对支持物成像以产生支持物中或支持物上与邻近测定法反应产物结合的位点的图像。

实施方案A7.任何前述A实施方案的方法，其中通过将样品置于支持物上并通过电泳或扩散将邻近测定法反应产物转移到支持物的表面上来完成步骤(b)中的转移。

实施方案A8.任何前述A实施方案的方法，其中步骤(c)包括：将一种或多种被标记寡核苷酸直接或间接与核酸反应产物杂交。

实施方案A9.任何前述A实施方案的方法，其中在步骤(c)中，通过与由预定数量的寡核苷酸和预定数量的被标记寡核苷酸组成的确定的核酸结构杂交来检测邻近测定法反应产物。

实施方案A10.实施方案A9的方法，其中所述结构通过至少两个与邻近测定法反应产物的杂交事件而成核。

实施方案A11.实施方案A10的方法，其中所述至少两个杂交事件包括与邻近测定法反应产物中的第一序列的第一杂交和与邻近测定法反应产物中的第二序列的第二杂交。

实施方案A12.任何前述A实施方案的方法，其中所述方法包括将步骤(A)中产生的图像与样品的图像进行比较。

实施方案A13.实施方案A12的方法，其中通过用显微镜检查术染色剂对样品进行染色来产生样品的图像。

实施方案A14.前述A实施方案中任一项的方法，所述方法还包括在步骤(b)与步骤(c)之间从支持物上移除样品。

实施方案A15.前述A实施方案中任一项的方法，其中所述生物样品是组织切片。

实施方案A16.实施方案A15的方法，其中所述组织切片是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织切片。

实施方案A17.任何前述A实施方案的方法，其中所述支持物是载玻片。

实施方案A18.任何前述A实施方案的方法，其中步骤(A)的结合剂是寡核苷酸探针、抗体或适体。实施方案B1.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：

(a)将多对报告寡核苷酸与生物样品中的RNA原位杂交；

(b)将任何对的与彼此相邻的位点原位杂交的报告寡核苷酸对连接在一起，以产生连接产物；

(c)以保持连接产物在样品中的空间关系的方式将连接产物转移到支持物中或支持物上；以及

(d)通过被标记探针与连接产物的杂交来检测支持物上的连接产物。

实施方案B2.实施方案B1的方法，其中：

每对报告寡核苷酸的一个成员具有包含反应性基团的末端，并且另一个成员具有抗外切核酸酶的键联；

在步骤(c)中，连接产物通过反应基团系连于支持物上；以及，

在步骤(d)之前，所述方法包括通过外切核酸酶处理降解任何未连接的报告寡核苷酸和其它单链DNA分子。

实施方案B3.任何前述B实施方案的方法，其中每对报告寡核苷酸的至少一个成员具有不与RNA杂交的尾部，并且在步骤(d)中，被标记探针与连接产物中报告寡核苷酸的尾部杂交。

实施方案B4.任何前述B实施方案的方法，其中所述生物样品是组织切片。

实施方案B5.任何前述B实施方案的方法，其中所述被标记探针包含确定数量的相互杂交的未标记和被标记寡核苷酸的复合物。

实施方案B6.任何前述B实施方案的方法，其中步骤(d)包括：

(b)(i)将支持物上的连接产物与第一和第二桥接寡核苷酸杂交，其中第一和第二桥接寡核苷酸与连接产物中的不同序列杂交；以及

(ii)将与连接产物杂交的第一和第二桥接寡核苷酸与被标记复合物杂交，所述被标记复合物由预定数量的在复合物中杂交的标记和未被标记寡核苷酸组成，其中被标记复合物与两种桥接寡核苷酸都杂交；以及

(iii)以能够检测单个被标记复合物的杂交的分辨率检测杂交的被标记复合物。

在这些实施方案中，所述第一和第二桥接寡核苷酸可以以“头对头”的方式杂交，其中一个桥接寡核苷酸的5’末端与另一个的3’末端相邻(具有小于10个、小于5个或4个、3个、2个、1个或0个核苷酸的缺口)。在所述复合物中引出：这些分子是镜像的而非相同的。桥接分子可以有若干标记探针的结合位点。

实施方案B7.实施方案B6的方法，其中

所述第一和第二桥接寡核苷酸具有不与连接产物杂交的尾部；

被标记复合物中至少一些未被标记寡核苷酸与第一和第二桥接寡核苷酸两者的尾部杂交；以及

所述复合物包含确定数量的被标记寡核苷酸，其中所述被标记寡核苷酸与所述未被标记寡核苷酸杂交。

实施方案B8.实施方案B5-B7中任一项的方法，其中所述复合物包含4-20个未被标记寡核苷酸和8-200个被标记寡核苷酸。

实施方案B9.实施方案B6-B8中任一项的方法，其中所述第一桥接寡核苷酸具有第一稳定化序列并且所述第二桥接寡核苷酸具有第二稳定化序列，并且当所述第一和第二桥接寡核苷酸与连接产物杂交时，所述第一和第二稳定化序列相互杂交。

实施方案B10.实施方案B9的方法，其中稳定化序列的长度为4-10bp，其中一个稳定化序列位于第一桥接寡核苷酸的3’末端，而另一个稳定化序列位于第二桥接寡核苷酸的5’末端。

实施方案C1.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：

(a)用多种缀合物标记生物样品，每种缀合物包含：i.与样品中的位点或序列结合的结合剂和ii.第一寡核苷酸；

(b)将成对的报告寡核苷酸原位连接在一起，以产生报告探针，其中所述报告寡核苷酸的连接以：i.彼此邻近的第一寡核苷酸，或ii.所述第一寡核苷酸的连接产物作为模板；

(c)任选地以保持邻近测定法反应产物在生物样品中的空间关系的方式将报告探针转移到支持物中或支持物上；

(d)通过外切核酸酶处理或洗涤去除未反应的报告寡核苷酸和其它单链DNA分子，其中原位或在支持物中或在支持物上完成该除去；以及

(e)通过被标记探针与报告探针的杂交，原位或在支持物中或在支持物上检测报告探针。

实施方案C2.实施方案C1的方法，其中被标记探针包含由预定数量的未标记和被标记寡核苷酸组成的确定的核酸结构。

实施方案C3.任何前述C实施方案的方法，其中每对报告寡核苷酸中的至少一个成员具有不与第一寡核苷酸或其连接产物杂交的尾部，并且在步骤(e)中，被标记探针与报告探针中的报告寡核苷酸的尾部杂交。

实施方案C4.实施方案C3的方法，其中不进行步骤(c),原位进行步骤(d)和(e)，并且在步骤(e)中，被标记探针与报告探针中的报告寡核苷酸的尾部杂交。

实施方案C5.实施方案C3的方法，其中进行步骤(c)并且：

每对报告寡核苷酸的一个成员具有包含反应性基团的末端，另一个成员具有不与第一寡核苷酸或其连接产物杂交的尾部，

在步骤(c)中，报告探针通过反应基团系连于支持物上；以及

在步骤(d)中，通过标记探针与报告探针中的报告寡核苷酸尾部的杂交，原位检测报告探针。

实施方案C6.实施方案C1的方法，其中步骤(b)包括：

(b)(i)将第一寡核苷酸对原位连接在一起以产生第一产物，以及

(ii)使用第一产物作为模板，将报告寡核苷酸对原位连接在一起以产生报告探针。

实施方案C7.实施方案C6的方法，其中步骤(d)包括通过外切核酸酶处理或通过在低于报告探针:第一产物双链体的Tm的温度下洗涤来去除未反应的报告寡核苷酸和其它单链DNA分子。

实施方案C8.任何前述C实施方案的方法，其中(b)(ii)的连接产物通过连接或缺口填充/连接反应来制备。

实施方案C9.任何前述C实施方案的方法，其中(b)(ii)的连接产物使用夹板连接反应来制备。

实施方案C10.实施方案C6的方法，其中(i)和(ii)在分开的反应中完成。

实施方案C11.实施方案C6的方法，其中(i)和(a)(ii)在相同的反应中完成，在所述反应中将报告寡核苷酸与第一寡核苷酸预杂交并用作夹板用于将第一寡核苷酸连接在一起，并将第一寡核苷酸之一用作模板用于连接报告寡核苷酸。

实施方案C12.任何前述C实施方案的方法，其中步骤(a)的结合剂是寡核苷酸探针、抗体或适体。

实施方案C13.前述C实施方案中任一项的方法，其中所述生物样品是组织切片。

实施方案D1.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：

(a)在生物样品中进行原位邻近测定法以产生邻近测定法反应产物；

(b)以保持邻近测定法反应产物在样品中的空间关系的方式将邻近测定法反应产物转移到支持物中或支持物上；

(c)通过以下方式标记支持物上的邻近测定法反应产物：

(i)将邻近测定法反应产物与第一桥接寡核苷酸和第二桥接寡核苷酸杂交，其中所述第一和第二桥接寡核苷酸与所述邻近测定法反应产物中的不同序列杂交；以及

(ii)将与邻近测定法反应产物杂交的第一和第二桥接寡核苷酸与被标记复合物杂交，所述被标记复合物由在复合物中杂交的预定数量的未被标记寡核苷酸和预定数量的被标记寡核苷酸组成，其中所述被标记复合物与两种桥接寡核苷酸都杂交；以及

(d)以能够检测单个被标记复合物的杂交的分辨率检测杂交的被标记复合物。

实施方案D2.实施方案D1的方法，其中：

第一和第二桥接寡核苷酸具有不与邻近测定法反应产物杂交的尾部；

被标记复合物中至少一些未被标记寡核苷酸与所述第一和第二桥接寡核苷酸的尾部杂交；以及

所述被标记复合物包含确定数量的被标记寡核苷酸，其中所述被标记寡核苷酸与所述标记性寡核苷酸杂交。

实施方案D3.任何前述D实施方案的方法，其中所述被标记复合物包含4-20个标记性寡核苷酸和8-200个标记的检测寡核苷酸。

实施方案D4.任何前述D实施方案的方法，其中所述第一桥接寡核苷酸具有第一稳定化序列并且所述第二桥接寡核苷酸具有第二稳定化序列，并且当所述第一和第二桥接寡核苷酸与所述邻近测定法反应产物杂交时，所述第一和第二稳定序列相互杂交。

实施方案D5.实施方案D4的方法，其中所述稳定化序列的长度为4-10bp，其中一个稳定化序列位于第一桥接寡核苷酸的3’末端，而另一个稳定化序列位于第二桥接寡核苷酸的5’末端。

实施方案D6.任何前述D实施方案的方法，其中所述生物样品是组织切片。

实施方案D7.任何前述D实施方案的方法，其中在步骤(b)中，将在邻近测定法反应产物中与第一第一桥接寡核苷酸和第二第一桥接寡核苷酸杂交的序列一起集合到(a)的邻近测定中的单个分子中。

实施方案D8.前述D实施方案D1的实施方案中任一项的方法，其中所述邻近测定包括：

(b)(i)将成对的第一寡核苷酸原位连接在一起以产生第一产物，其中连接在一起的第一寡核苷酸各自为与样品结合的结合剂-寡核苷酸缀合物的一部分，以及

(ii)使用第一产物作为模板，将成对的报告寡核苷酸连接在一起以产生报告探针，以及

其中，在步骤(c)中，所述第一和第二桥接寡核苷酸与报告探针杂交。

实施方案D9.实施方案D8的方法，其中每对报告寡核苷酸的至少一个成员具有不与第一产物杂交的尾部，并且其中被标记复合物与报告探针中的报告寡核苷酸的尾部杂交。

实施方案D10.任何前述D实施方案的方法，所述方法还包括在步骤(a)与步骤(c)之间用外切核酸酶处理样品或支持物以除去未反应的单链DNA分子。

实施方案D11.任何前述D实施方案的方法，其中步骤(a)的邻近测定中使用的结合剂是寡核苷酸探针、抗体或适体。

实施方案E1.一种用于分析生物样品的方法，所述方法包括：

(a)在生物样品中进行原位邻近测定以产生邻近测定法反应产物；

(b)通过以下步骤原位标记邻近测定法反应产物：

(i)将邻近测定法反应产物与第一桥接寡核苷酸和第二桥接寡核苷酸杂交，其中所述第一和第二桥接寡核苷酸与所述邻近测定法反应产物中的不同序列杂交；以及

(ii)将与邻近测定法反应产物杂交的第一和第二桥接寡核苷酸与被标记复合物杂交，所述被标记复合物由在复合物中杂交的预定数量的未被标记寡核苷酸和预定数量的被标记寡核苷酸组成，其中所述被标记复合物与两种桥接寡核苷酸都杂交；以及

(c)以能够检测单个被标记复合物的杂交的分辨率检测杂交的被标记复合物。

实施方案E2.实施方案E1的方法，其中：

第一和第二桥接寡核苷酸具有不与邻近测定法反应产物杂交的尾部；

被标记复合物中的至少一些未被标记寡核苷酸与第一和第二桥接寡核苷酸两者的尾部杂交；以及

被标记复合物包含确定数量的被标记寡核苷酸，其中被标记寡核苷酸与标记性寡核苷酸杂交。

实施方案E3.任何前述E实施方案的方法，其中被标记复合物包含4-20个标记性寡核苷酸和8-200个标记的检测寡核苷酸。

实施方案E4.任何前述E实施方案的方法，其中第一桥接寡核苷酸具有第一稳定化序列并且第二桥接寡核苷酸具有第二稳定化序列，并且当第一和第二桥接寡核苷酸与邻近测定法反应产物杂交时，所述第一和第二稳定序列相互杂交。

实施方案E5.实施方案E4的方法，其中所述稳定化序列的长度为4-10bp，其中一个稳定化序列位于第一桥接寡核苷酸的3’末端，而另一个稳定化序列位于第二桥接寡核苷酸的5’末端。

实施方案E6.任何前述E实施方案的方法，其中所述生物样品是组织切片。

实施方案E7.任何前述E实施方案的方法，其中在步骤(b)中，将在邻近测定法反应产物中与第一第一桥接寡核苷酸和第二第一桥接寡核苷酸杂交的序列一起集合到(a)的邻近测定中的单个分子中。

实施方案E8.实施方案E1-E6中任一项的方法，其中所述邻近测定包括：

(b)(i)将第一寡核苷酸对原位连接在一起以产生第一产物，其中连接在一起的第一寡核苷酸各自为与样品结合的结合剂-寡核苷酸缀合物的一部分，以及

(ii)使用第一产物作为模板，将报告寡核苷酸对连接在一起以产生报告探针，以及

其中，在步骤(b)中，第一和第二桥接寡核苷酸与报告探针杂交。

实施方案E9.实施方案E8的方法，其中每对报告寡核苷酸的至少一个成员具有不与第一产物杂交的尾部，并且其中被标记复合物与报告探针中的报告寡核苷酸的尾部杂交。

实施方案E10.任何前述E实施方案的方法，所述方法还包括在步骤(b)之前用外切核酸酶处理样品以去除未反应的单链DNA分子。

实施方案E11.任何前述E实施方案的方法，其中步骤(a)的邻近测定中使用的结合剂是寡核苷酸探针、抗体或适体。

在A-G的任何实施方案中，可以通过使生物样品与支持物接触，使生物样品面向支持物(即，通过将样品夹在两个支持物之间)，然后加热样品来进行释放。

在A-G的任何实施方案中，平面样品可以通过将细胞悬浮液通过过滤器来产生，其中将细胞保留在过滤器上。过滤器上的细胞是平面支持物。

实施方案G1.一种用于分析细胞悬浮液的方法，所述方法包括：(a)通过多孔毛细管膜过滤细胞悬浮液，从而将细胞分布在膜上；(b)将膜置于平面支持物上，使膜的细胞侧面向支持物；(c)以保持核酸在细胞中的空间关系的方式将核酸从细胞转移到支持物中或支持物上；(d)从支持物上移除多孔毛细膜和细胞；以及(e)对转移到支持物上的核酸进行空间分析。

实施方案G2.实施方案G1的方法，其中：所述方法还包括在步骤(a)与步骤(c)之间，对一对或多对与细胞结合的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法，以在细胞中或细胞上产生邻近测定法反应产物，并且在步骤(c)中转移并在步骤(e)中分析的核酸包含邻近测定法反应产物。

实施方案G3.实施方案G2的方法，其中步骤(e)包括：(i)标记支持中或载体上的转移的邻近测定法反应产物；以及(ii)对支持物成像以产生支持物中或支持物上与邻近测定法反应产物结合的位点的图像。

实施方案G4.实施方案G2或G3的方法，其中邻近测定包括涉及结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸的连接、引物延伸和缺口填充/连接反应的任意组合。

实施方案G5.任何前述G实施方案的方法，其中(b)的平面支持物包含带空间条形码的捕获寡核苷酸阵列，步骤(c)包括将转移的核酸与带空间条形码的捕获寡核苷酸杂交，以及步骤(e)包括使用转移的核酸作为模板延伸捕获寡核苷酸，并对引物延伸模板的拷贝进行测序以产生序列读数。

实施方案G6.实施方案G5的方法，所述方法还包括使用序列读数中的空间条形码将序列读数映射到支持物上的位点。

实施方案G7.任何前述G实施方案的方法，其中转移步骤(c)通过电泳或扩散来完成。

实施方案G8.任何前述G实施方案的方法，其中所述多孔毛细管膜是多孔阳极氧化铝膜。

实施方案G9.任何前述G实施方案的方法，其中步骤(a)通过以下步骤完成：(i)将细胞悬浮液置于多孔毛细管膜上；以及(ii)施加使悬浮液的液体成分穿过膜的力。

实施方案G10.实施方案G7的方法，其中所述力是选自离心力、负压和正压的主动力或者选自毛细作用和蒸发的被动力。

实施方案G11.任何前述G实施方案的方法，所述方法还包括在步骤(d)与步骤(e)之间清洗多孔毛细管膜。

实施方案G13.任何前述G实施方案的方法，其中所述膜中的孔的内径在2nm至500nm的范围内。

实施方案G14.任何前述G实施方案的方法，其中所述膜中相邻孔的中心之间的平均距离在50nm至1000nm的范围内。

实施方案G15.任何前述G实施方案的方法，其中所述膜中相邻孔的边缘之间的平均距离在10nm至500nm的范围内。

实施方案G16.任何前述G实施方案的方法，其中所述细胞的悬浮液包括血细胞、免疫细胞、通过胰蛋白酶处理而彼此分离的单细胞或悬浮培养的细胞。

实施方案G17.实施方案G2的方法，其中：

结合剂-寡核苷酸缀合物各自包含：i.与样品中的位点或序列结合的结合剂和ii.第一寡核苷酸，并且邻近测定包括将成对的报告寡核苷酸原位连接在一起以产生报告探针，其中报告寡核苷酸的连接以i.彼此邻近的第一寡核苷酸或ii.所述第一寡核苷酸的连接产物为模板；并且在步骤(c)中将报告探针转移到支持物上；并且步骤(e)包括通过被标记探针与报告探针的杂交来检测支持物上的报告探针。

实施方案G18.实施方案G17的方法，其中所述方法还包括通过外切核酸酶处理或通过洗涤除去未反应的报告寡核苷酸和其它单链DNA分子。

实施方案G19.实施方案G17或G18的方法，其中每对报告寡核苷酸的至少一个成员具有不与第一寡核苷酸或其连接产物杂交的尾部，并且在步骤(e)中被标记探针与报告探针中的报告寡核苷酸的尾部杂交。

实施方案G20.实施方案G17-G19中任一项的方法，其中：每对报告寡核苷酸的一个成员具有包含反应性基团的末端，而另一个成员具有不与第一寡核苷酸或其连接产物杂交的尾部，在步骤(c)中，报告探针通过反应性基团连接到支持物上；并且在步骤(e)中，通过被标记探针与报告探针中的报告寡核苷酸的尾部杂交来检测报告探针。

实施例

为了进一步说明本发明的一些实施方案，给出以下具体实施例，应理解它们是为了说明本发明的实施例而提供的，并且不应以任何方式解释为限制其范围。

实施例1

本实施例提供了一种测定法，其包括将关于邻近定位的生物分子的信息转换成DNA并将该DNA转移到平面支持物上。检测平面支持物上的DNA以鉴定关于邻近定位的生物分子的信息，或者检测靶向两个独立表位或基因座的单个生物分子。因此，在这些方法中，关于邻近生物分子的信息被转换成DNA分子，以流线型的、多路复用的格式对其进行分析。

本实施例描述了进行PA以将蛋白质信息转移到DNA。例如，使用PA确保了RNA和DNA分子两者从PA到一种报道分子形式(即DNA)的特异性和转移。该设计允许短寡核苷酸用于邻近连接，以确保PA测定法中的紧密邻近要求。然后，将这些较短的寡核苷酸转换成较长的寡核苷酸，使得能够在第二步骤中进行基于杂交的条形码读出。

在本实施例中，检测被设计成确定数量的检测荧光团的可编程级联。通过将核酸反应产物转移到平面支持物上，与其中背景荧光高的组织中的分析相比，更容易以较低的背景进行单分子检测。成像时间也减少了，因为当在平面表面上对分子成像时，不需要对z叠栈(z-stacks)成像或减少了对z叠栈成像的需要。

在本实施例中，检测PA过程中产生的核酸反应产物的实际数量，而不是使用精确扩增水平难以控制的滚环复制。此外，其中将精确数量的荧光团添加到每个靶分子的受控的杂交反应化学产生了对目标单分子的更均匀的检测。因此，无RCA的蛋白质和蛋白质相互作用的空间检测允许以更高的密度分析/检测更小的荧光分子。在每个检测循环后，洗掉标记的检测寡核苷酸，只有单个报告分子保留在表面上，以避免表面上的物理拥挤。

在本实施例中，遵循以下方案来分析平面生物样品。

将组织切片固定在固体支持物上。通过连接与抗体缀合的寡核苷酸，将有关蛋白质位置的信息转换成DNA分子。对于每种检测的蛋白质、蛋白质修饰或蛋白质/蛋白质相互作用，使用两种抗体。孵育包含多对抗体的抗体混合物，并允许其结合组织中各自的靶蛋白。

抗体对被设计成使得与抗体对中的一种抗体缀合的一个寡核苷酸具有游离的3’末端，而与该抗体对中的另一种抗体缀合的另一个寡核苷酸具有游离的5’末端。洗掉未结合的抗体，并且任选地将抗体固定在组织中。将抗体固定在组织中有助于经受随后的洗涤和孵育。

加入与寡核苷酸对互补的夹板。然后加入连接酶以允许连接寡核苷酸形成成对抗体，如果它们邻近结合的话。夹板被设计成使得它们能够稳定地与两种寡核苷酸杂交，所述两种寡核苷酸与两种邻近结合的抗体缀合。

还可添加夹板，允许一种抗体与许多其它抗体的组合连接，以询问特定的潜在相互作用或蛋白质修饰。或者，所有3’缀合的抗体可连接到所有5’缀合的抗体。然而，获得显著噪声/背景的风险更高，因为许多蛋白质将是偶然而非通过蛋白质间相互作用接近的。在这种情况下，信噪比可通过比较不同细胞群的计数以观察细胞群之间的相互作用模式的统计上显著的波动来确定。也可测量来自使用靶向相同蛋白质的两种结合剂和靶向涉及相同蛋白质的相互作用的两种结合剂的检测的信号并将其用作内部参考。

洗去夹板，并加入报告探针。报告探针可被设计成使得它们与来自邻近抗体的连接的寡核苷酸杂交。某些报告探针也可被设计成与RNA靶标杂交。报告探针被设计成使得它们形成带有条形码的报告多核苷酸，所述条形码对应于它们所杂交的连接的寡核苷酸或它们所杂交的RNA分子。因此，报告探针中的条形码序列和所得的报告多核苷酸包含关于被靶向蛋白和靶RNA的信息。

报告探针对被设计成各具有一个可连接的末端。探针之一配有亲和部分。任选地，可以修饰报告多核苷酸的未连接末端，以使其对外切核酸酶具有抗性。亲和部分有利地是可诱导的，如点击化学反应性基团。亲和部分也可以是可使用特定序列连接的DNA序列。亲和部分甚至可以是特异性结合存在于平面支持物上的成员的特异性结合对的结合成员。

在与组织中的连接寡核苷酸和/或RNA分子杂交时，报告探针包含条形码的组合，所述组合一起构成被设计成通过检测报告多核苷酸来解码的独特的条形码。

连接夹板和报告探针的步骤可以在同一反应中进行。这意味着蛋白质分子有两个连接位点，这可能会降低效率，但另一方面，只需要一个连接步骤，这将提高效率。在相同条件下，连接也需要对RNA分子具有特异性。

多余的报告探针被洗掉。将组织中的报告探针转移到固相上，并使用报告多核苷酸上的亲和部分进行附着。为了促进报告多核苷酸向平面支持物的转移，可以例如使用通过化学物质(如NaOH、甲酰胺、尿素、胍或尿素)和温度产生的变性条件将报告多核苷酸从它们的靶标上释放。也可通过切割抗体与缀合的寡核苷酸之间的可切割接头来促进释放。

或者，可使用RNA降解RNA靶标，从而释放与RNA结合的报告探针，并设计与抗体缀合的具有可使用尿嘧啶-DNA糖基化酶降解的尿嘧啶碱基的寡核苷酸，来酶促介导释放。选择相应的释放化学法，使其与表面上的亲和化学法和朝向表面的转移机制相容。

平面支持物可以是其上固定有组织切片的相同固体支持物，或者是在组织顶部提供的第二支持物。在前一种情况下，亲和反应需要是可诱导的，因为不这样，探针会在加入过量探针的杂交过程中封闭表面。在这种亲和反应的一个实例中，使用需要铜来产生共价键的点击化学。在另一个实例中，使用模板式夹板对固定在表面上的寡核苷酸进行连接，从而促进报告多核苷酸与固定在固体支持物上的寡核苷酸的共价连接。

或者，另一个平面支持物可用于从组织转移报告多核苷酸。可使用电泳来加速报告多核苷酸从组织向平面支持物的转移。

在一个实例中，在连接报告探针后，不使用平面固体支持物，而是将组织固定在透明凝胶基质支持物中。报告探针之一配备有将报告多核苷酸固定在凝胶中的部分。凝胶聚合后，可以从凝胶中清除组织组分，而不会破坏DNA多核苷酸。

然后进行固定的报告多核苷酸的单分子鉴定。报告多核苷酸包含一组给定的待检测的条形码。例如，如果每个检测周期分析两种颜色，运行16个周期，则将读取32个不同的条形码。条形码可被设计成使得每种报告多核苷酸具有来自32种条形码组合的一组独特的条形码。

在多个循环中加入检测探针，并且在每个循环中标记一种或多种不同的条形码，从而检测每个报告多核苷酸中存在的条形码的二进制串。每个循环包括标记、洗涤、成像和在下一个循环开始之前去除检测探针。

检测方案可被设计成使得在每个循环中，首先将一对桥接探针与每个相应的条形码杂交，从而将条形码转换成用于检测的更长的寡核苷酸(图5)。桥接探针可被有利地设计成使得它们彼此稳定化，并且在通过弱互补杂交、堆叠杂交(stacking hybridization)或酶促连接杂交时稳定，并且它们在单独的情况下不稳定。

桥接探针杂交后，加入检测探针。检测探针需要两个桥接探针都在附近才能形成稳定的杂交。这确保了单个桥接探针的背景吸附不会产生背景。在本实施例中，每个桥接探针可以与三个检测探针杂交。每个检测探针被设计成能够与多个(例如，九个)标记性探针杂交。每个检测探针单独产生的信号太弱，以至于不能产生高于背景的信号，而三个各自用九个标记性探针标记的检测探针聚集了总共27个标记，这被设计成产生高于背景的信号(图5)。可将检测探针与标记性探针预先杂交在一起，并在同一步骤中加入。

假定一对桥连探针与一个报告多核苷酸连接，则需要多个检测探针(每个检测探针与几个标记性探针杂交)与一对桥接探针杂交以记录高于背景的信号。这种设计确保了信号产生的特异性得以保持。如果单个桥接探针粘附在表面上，则它们不会产生背景，并且单个检测探针或标记性探针不会产生足够的信号来产生高于背景的信号。可使用具有不同荧光团的多种标记，从而可以在一个标记循环中检测多种条形码。杂交化学被设计成对于每个靶分子具有确定数量的荧光团。

实施例2

在本实施例中，使用了抗体寡核苷酸缀合物。将寡核苷酸A与抗体A缀合以产生缀合物A。在允许缀合物A与其靶标结合之前，将组织寡核苷酸A′中的蛋白质A与寡核苷酸A杂交。寡核苷酸A′还在5′末端携带生物素并在3′末端携带荧光团，具有与寡核苷酸A不互补的额外序列A′1。允许与寡核苷酸A′杂交的缀合物A与固定在载玻片上的FFPE组织切片结合，流动适当的样品制备，包括例如抗原修复和封闭。然后洗洗组织切片，将涂覆有链霉抗生物素蛋白的捕获平面支持物面向组织切片放置。将具有组织和平面支持物的载玻片固定就位，并将载玻片置于烘箱中，使温度升高到高于寡核苷酸A和寡核苷酸A′的解链温度。然后利用链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用将寡核苷酸A′捕获在平面支持物上。使用荧光显微镜术对载玻片成像，可使用附着的荧光分子来检测寡核苷酸A。平面支持物上的图案代表组织的镜像。

实施例3

转移来自抗体缀合物的报告寡核苷酸，并使用免疫荧光在捕获表面上进行检测

抗体-寡核苷酸的缀合：使用0.5mL Zeba^TM旋转脱盐柱7KMWCO将针对角蛋白8的抗体(目录号904804，Biolegend)和针对角蛋白18的抗体(目录号628402，Biolegend)缓冲液交换为DPBS，将0.5mL Zeba^TM旋转脱盐柱7K MWCO用于缓冲液交换，并使用Ultra-0.5离心过滤器10K MWCO装置浓缩至1mg/ml。将DBCO-NHS-酯(目录号761524,Sigma-Aldrich)溶解在DMSO中并在DMSO中稀释至2mM。向抗体中加入15倍摩尔过量的DBCO-NHS酯，将反应物在室温下避光孵育45分钟。加入1M Tris-HCl pH 8至终浓度为30-100mM，并将反应物在室温下孵育5min。根据制造商的说明书，使用平衡至DPBS的0.5mL Zeba^TM旋转脱盐柱7K MWCO(Thermo Scientific目录号89882)以除去未反应的DBCO-NHS酯。将2.5倍摩尔过量的叠氮化物修饰的DNA寡核苷酸加入到用DBCO活化的抗体中。将反应物在冰箱(2-8℃)中孵育至少60小时。用聚丙烯酰胺凝胶电泳、用SYBR金核酸凝胶染色剂(S11494，Invitrogen)和InstantBlue考马斯蛋白染色剂(Abcam，ab119211)对缀合物进行染色来验证成功的缀合。用0.1％ BSA和0.02％ NaN₃在DPBS中将抗体-寡核苷酸缀合物稀释至0.15μg/μl。

组织准备：将具有来自FFPE块的核心的组织微阵列切成4μm厚的切片，并放置在TOMO载玻片(Matsunami)上。烘烤后，将载玻片在二甲苯中脱蜡(2次，每次5min)，并在一系列梯度乙醇至去离子水中水合。在室温下，用3％的于PBS中的H₂O₂封闭内源过氧化物酶10min。将载玻片在PBS中漂洗1次。对于抗原修复，将抗原修复缓冲液柠檬酸盐缓冲液，pH6.0[Abcam，ab93678]在98℃使用50min。将载玻片在PBS中漂洗1次。通过用ImmEdge^TM疏水屏障笔绘制来产生屏障。最后，用含0.05％ Tween-20的TBS漂洗载玻片。

染色：如下制备抗生物素蛋白封闭缓冲液：1X TBS，0.05％Tween-20,0.25mg/mlBSA,0.5mg/ml鲑鱼精子DNA(Sigma)，5μg/ml抗生物素蛋白。

用抗生物素蛋白封闭缓冲液覆盖TMA，将载玻片在室温下在湿室中孵育1小时。最后，在含0.05％ Tween-20的TBS中进行2次2min的洗涤。

如下制备生物素封闭缓冲液：1X TBS,0.05％ Tween-20,0.25mg/ml BSA,0.5mg/ml鲑鱼精子DNA(Sigma),12.5μg/ml生物素,10mg/ml硫酸葡聚糖。

用生物素封闭缓冲液覆盖TMA，将载玻片在室温下于湿室中孵育1小时。

将角蛋白-18抗体在生物素封闭溶液中稀释至0.75ng/μl。然后将其用于覆盖在TMA，将载玻片在室温下于湿室中孵育1小时。最后，在45℃下用0.05％ Tween-20在TBS中洗涤3次，每次5min。

再次用生物素封闭缓冲液覆盖TMA，将载玻片在室温下于湿室中孵育1小时。

如下制备杂交缓冲液：10mM tris乙酸盐、10mM乙酸镁、50mM乙酸钾、0.5mg/mlBSA、250mM NaCl、0.05％ Tween-20，加水至最终体积。

将DNA寡聚物(22bp，生物素化的并具有荧光团)在杂交缓冲液中稀释至50nM，并在TMA上于37℃下在湿室中孵育30min。最后，在45℃下用0.05％ Tween-20在TBS中洗涤3次，每次5min。

玻璃盖玻片抗生物素蛋白涂层:玻璃盖玻片：200nm生物素衍生的线性聚羧酸酯水凝胶，中等电荷密度(XanTec bioanalytics GmbH)。

用PBS漂洗盖玻片1次，并在室温下于0.1mg/ml抗生物素蛋白(于PBS中)中孵育1小时。然后在PBS中洗涤3次。

转移：将组织载玻片和盖玻片在10mM NaAc pH 5.5溶液中孵育15min。将两块玻璃对齐并放在一起，不产生气泡，然后在湿室中于60℃下孵育75min。最后，小心地将盖玻片与载玻片分离。

固定：将转移的盖玻片与生物素化的荧光1μm珠粒在室温下孵育5min(用于聚焦目的)。然后在含0.05％ Tween-20的TBS中洗涤3次，每次2min。最后，将组织载玻片和转移的盖玻片分别用EverBrite Hardset固定介质固定。

成像：按照制造商的说明，将载玻片在3D Histech载玻片扫描仪中成像。

结果：

该测定法设计成靶向具有FFPE固定细胞系MCF7的1mm微阵列特征的样品中的角蛋白-18。可在原始组织载玻片上使细胞可视化(图7A)，并且单个细胞印迹(ssDNA荧光寡聚物转移的产物)在捕获表面上也是可见的(图7B)，这表明样品的保留空间分辨率的转移。

实施例4

通过转移后捕获表面上的杂交链式反应(HCR)检测PLA产生的报告探针

抗体和组织制备：如上所述。

图8中描述的具有人扁桃体、人胎盘、MCF7细胞和MOLT4细胞以及FFPE DAUDI细胞和MDA-MB231的0.6mm核心的TMA。

邻近连接分析(PLA)

组织封闭:如下制备抗生物素蛋白封闭缓冲液：TBS,0.05％Tween-20,0.25mg/mlBSA,0.5mg/ml鲑鱼精子DNA(Sigma),5μg/ml抗生物素蛋白。

用抗生物素蛋白封闭缓冲液覆盖TMA切片，将载玻片在室温下孵育1小时。最后，在含0.05％ Tween-20的TBS中进行2次2min的洗涤。

如下制备生物素封闭缓冲液：TBS,0.05％ Tween-20,0.25mg/ml BSA,0.5mg/ml鲑鱼精子DNA(Sigma),12.5μg/ml生物素。

用生物素封闭缓冲液覆盖TMA，将载玻片在室温下孵育30min。载玻片用含0.05％Tween-20的TBS漂洗一次。

抗体孵育：将一对抗体-寡核苷酸缀合物在生物素封闭缓冲液中稀释至每种抗体1μg/ml。将稀释的缀合物施加到载玻片上。将载玻片在4℃下孵育过夜。将载玻片在含0.05％Tween-20的TBS中洗涤2次，每次5min。

产生连接的报告探针的邻近连接分析(PLA)：通过加入125nM夹板、0.04U/μl T4DNA连接酶(ThermoScientific)、10mM三(羟甲基)氨基甲烷乙酸盐、10mM乙酸镁、50mM乙酸钾、0.5mg/ml BSA、200mM NaCl和0.05％ Tween-20来连接两个靶寡核苷酸。将反应物在37℃的湿室中孵育30min。对于没有连接的阴性对照，省略了该以夹板为模板的连接步骤。将载玻片在含0.05％ Tween-20的TBS中洗涤2次，每次5min。

在10mM三(羟甲基)氨基甲烷乙酸盐、10mM乙酸镁、50mM乙酸钾、0.5mg/ml BSA、250mM NaCl和0.05％ Tween-20中，将报告寡核苷酸(一种具有生物素，一种具有Alexa647)稀释至33nM，然后加入到载玻片以与第一连接产物杂交。将杂交反应物在37℃于湿室中孵育30min。然后将载玻片在含0.05％ Tween-20的TBS中洗涤2次，每次5min。然后，在37℃于湿室中孵育30min期间，通过加入0.04U/μl T4 DNA连接酶(ThermoScientific)、10mM tris乙酸盐、10mM乙酸镁、50mM乙酸钾、0.5mg/ml BSA、200mM NaCl和0.05％Tween-20来连接报告寡核苷酸。将载玻片在含0.05％ Tween-20的TBS中洗涤2次，每次2min。

消化未连接的报告寡核苷酸，制备连接的反应产物/报告探针以用于用含有0.01U/μl USER(New England Biolabs),0.1U/μlλ外切核酸酶(New England Biolabs)、1XrCutSmart缓冲液(New England Biolabs)和0.05％ Tween-20的核酸酶混合物进行释放。将载玻片在含0.05％ Tween-20的TBS中洗涤2次，每次5min。

玻璃盖波片涂层：如上所述。

转移：将组织载玻片和盖玻片在10mM NaAc pH 5.5溶液中孵育15min。将两块玻璃对齐并放在一起，不产生气泡，然后在湿室中于60℃下孵育60min。最后，小心地将盖玻片与载玻片分离。

在盖玻片上进行报告分子的HCR检测：应该发生转移的区域用ImmEdge笔(VectorLaboratories)来描绘。将盖玻片与(生物素标记的微球，0.2μM，黄绿色荧光(505/515)在室温下于2x SSC(Sigma)中孵育15min。用含0.1％ Tween-20的2x SSC洗涤盖玻片3次，每次2min。在含有20％碳酸乙烯酯和0.1％ Tween-20的4X SSC中将识别反应产物/报告探针的具有HCR起始序列的探针稀释至10nM，并添加到盖玻片上。将盖玻片在室温下于湿室中孵育1小时。将盖玻片在含0.1％Tween-20的2X SSC中洗涤2次，每次5min。如之前Choi、Beck和Pierce 2014(ACS Nano 2014,8,5,4284-4294)所述进行HCR。简言之，将具有ATTO565的HCR发夹探针单独地在440μl 5X SSC中稀释至0.5μM，在95℃下孵育5min，然后在室温下冷却10min。此后，将两种发夹探针混合，并在含有0.1％ Tween-20的5X SSC中稀释至10nM。将HCR发夹探针混合物施加到盖玻片上，将反应在室温下于湿室中避光进行3小时。盖玻片用含0.1％ Tween-20的2X SSC洗涤一次，并用TBS再洗涤一次。盖玻片用SlowFade钻石防伪装裱剂(SlowFade Diamond Antifade Mountant)(Invitrogen)和TOMO玻璃载玻片(TOMOglass slides)(Matsunami)固定。

成像：用落射荧光显微镜术对盖玻片的2.5x2.5 mm区域进行成像。在FITC中对珠粒进行成像，曝光时间为25ms(数据未显示)，在TRITC中对报告探针的HCR检测进行成像，曝光时间为1s(图9)。

结果：使用一种靶向角蛋白8的抗体和一种靶向角蛋白18的抗体进行PLA测定。该测定用于分析包含6个特征的组织微阵列，其中两个显示为明显阳性(图9)。结果与参考文献一致。

实施例5

使用PLA检测角蛋白8和18，并在使用流动池单分子测序将报告探针转移到捕获表 面后读出

抗体和组织制备：如上所述。

图8中描述的具有人扁桃体、人胎盘、MCF7细胞和MOLT4细胞以及FFPE DAUDI细胞的0.6mm核心和MDA-MB231的TMA。

邻近连接测定法：如上所述。

玻璃盖玻片抗生物素蛋白涂层:如上所述。

转移：将组织载玻片和盖玻片在10mM NaAc pH 5.5溶液中孵育15min。将两块玻璃对齐并放在一起，不产生气泡，然后在湿室中于60℃下孵育75min。最后，小心地将盖玻片与载玻片分离。

流动池安装：将盖玻片在超纯水中漂洗两次，然后按照制造商的说明安装在Bioptechs FCS2室中。

测序：通过将标记性寡核苷酸重复地引入通过流动池来进行测序。目前的化学需要在每个循环中依次引入三种不同的寡溶液：桥接探针、标记性探针，随后是荧光标记的检测探针。在每个寡混合物之间进行洗涤。测序在每个循环中对约0.5cm²的面积进行成像。

在该设置中，使用Fluigent流体系统(Flow EZ^TM2000)以受控方式使试剂流过流动池和转移的表面。所有试剂都以200μl/min的流速注入。所有洗涤步骤的流速设定为800μl/min。

将用于视野(FOV)对准的珠粒(生物素标记的微球，0.2μM，黄绿色荧光(505/515))在2x SSC中从最初的1％储备悬浮液以1:20,000稀释，手动添加，以及在启动流体系统之前孵育至少10min。

在FITC中对珠粒进行成像，曝光时间为100ms，如果用Alexa647N标记报告分子，则将其在Cy5中成像，曝光时间为1000ms。

对珠粒成像后，通过用400μl封闭缓冲液(1％生物素化的牛血清白蛋白(BSA)，2XSSC)在室温下孵育30min，使非特异性结合减少至最少。通过用含有盐和去垢剂的洗涤缓冲液连续流动洗涤除去过量的BSA。

除非另有说明，否则在室温下于400μl杂交缓冲液(4X SSC，0.1％Tween，30％碳酸乙烯酯)中以10nM的终浓度将桥接寡核苷酸对孵育至少1小时。通过用含盐和去垢剂的4ml洗涤缓冲液连续流动洗涤5分钟来停止杂交反应。

在室温下，在杂交缓冲液(30％碳酸乙烯酯、0.1％ Tween、4X SSC)中，以每种探针10nM的终浓度，将多达五种标记性探针的混合物杂交30min。通过用4ml含盐和去垢剂的洗涤缓冲液连续流动洗涤5分钟来停止杂交反应。

接下来，将荧光标记的检测探针在室温下于杂交缓冲液(30％碳酸亚乙酯、0.1％Tween、4X SSC)中与标记探针杂交15min。然后用4ml含盐和去垢剂的洗涤缓冲液连续流动洗涤表面5min，以除去未结合的/非特异性的寡核苷酸和探针。

通过在与检测探针的荧光相匹配的通道中对表面成像来检测信号。

信号检测后，使用有机溶剂或离子化合物(例如，DMSO或NaOH)在连续流动下进行剥离(stripping)至少10分钟。剥离后，用4ml含盐和去垢剂的洗涤缓冲液连续流动洗洗表面5分钟。

测序硬件：测序系统是围绕为宽视野落射荧光成像而配备的倒置显微镜(NikonTi2-E)和压力驱动流动控制系统(Fluigent Flow EZ 2000和Fluigent FLOW UNIT L)构建的，所述压力驱动流动控制系统具有两个串联的11端口旋转阀(Fluigent M-SWITCH)。

使用在与每个系统相关联的专有软件上运行的定制脚本来控制所述两个系统。使用双向TTL接口实现了两个系统的同步。

显微镜配有60倍油浸物镜(Nikon CFIPlan Apochromat Lambda D 60X Oil)和sCMOS照相机(Hamamatsu ORCA-Flash4.0 LT)。三组荧光滤光器用于在描述的实验中成像：用于对Alexa 647N和ATTO647N成像的Semrock LED-Cy5-A(此处称为Cy5)，用于对ATTO 565成像的Semrock LED-TRITC-A(此处称为TRITC)，以及用于对基准珠成像的LED-FITC-A(此处称为FITC)。所用光源是CoolLED pE-800，其中对于TRITC和Cy5通道，分别打开550和635nm LED并100％用于成像，以及其中打开470nm LED并以1％用于使用FITC对基准珠成像。

图像分析：如图10所示，测序图像数据在几个成像循环中表现为暗背景上衍射受限的亮点。采集了三组图像，分别对应于Cy5、TRITC和FITC成像通道。Cy5和TRITC通道包含测序点，FITC包含用于图像比对的参考珠。检测荧光条形码信息的图像分析方法由几个步骤组成。首先，检测并分割Cy5和TRITC通道中的斑点以及FITC通道中的珠粒。为了分割斑点和珠粒，使用被调整为斑点大小的圆检测算法。将所有不同循环中检测到的珠粒用于校准循环数据。对光斑图像进行预处理，以校正前景和背景照明的不均匀性。在校正非均匀照明之后，提取诸如位置、荧光团计数等斑点特征。使用珠粒获得的对准信息用于在相应的图像周期中对准斑点。使用通过对准的斑点数据的斑点的邻域搜索来检测所有不同成像周期中分子的条形码信息(即开或关)。将Cy5和TRITC的条形码信息组合以获得两个成像通道中的条形码。使用Pandas软件将条形码信息以feather格式导出，以便在分析的后期进行处理。除了条形码信息之外，还获得了检查数据和分析的质量的其它辅助信息，诸如校准质量度量等。使用图像和数据分析库诸如Numpy、Scipy、OpenCV等在Python软件中完成整个分析。

数据分析：通过arrow和data.table包将上一步获得的汇总表(feather格式文件)导入到R中，并在R环境中进行下游分析，所述汇总表包含关于每个视野和每个循环中鉴定的荧光点的信息。使用ggplot软件包对结果进行图形表示。

该分析分为两个主要任务：i)鉴定转移的报告分子和ii)使用靶向其报告位点的探针评估它们的检测。前者通过观察整个样品区域的斑点分布来进行，所述斑点对应于与每个报告分子直接缀合的荧光团(图11)。

分析的第二部分主要是使用成组的携带许多荧光团的寡核苷酸序列或探针检测参考报告分子；每个报告分子含有两个不同的核苷酸区段，其分别为检测系统1和2的杂交靶标。由于实验交替进行检测系统的注射和旨在从一个系统中除去探针然后从另一个系统中加入探针的“剥离”循环，我们能够观察在每个循环中检测到报告分子的哪个靶区域(图12)。

为了进一步研究报告分子的检测，我们对构成整个样品区域的单个图像进行了分析。具体来说，我们将重点放在与一个组织样品重叠的一组四个相邻的视野(FOV)上。在这些视野中，我们提取了用系统1(图13A；检测率＝0.166)和系统2(图13B；检测率＝0.284)检测到的以及用这两个系统(图13C；检测率＝0.098)共同检测检测到的斑点，并将后者与参考报告分子斑点进行比较(图13D；N＝1173)。

结果:如上所解释的，分析的第一目的是确认我们能够将携带荧光团的分子转移到表面，然后我们将所述表面用于检测。图11清楚地显示了报告分子被正确地转移到表面，并且在预期的位置上。第二目的是证明我们能够使用循环检测系统检测这些分子。图12显示报告分子密度较高的区域也是在检测循环(循环2、4、6和8)中从检测系统产生较高信号强度的区域。另外，图13显示检测系统1和2都能够与其靶位点杂交(图13A-图13B),并且两者之间的重叠(图13C)特别地位于可以发现大多数报告分子的地方(图13D)。综上所述，这证明了i)足够数量的分子已经从组织转移到表面，以及ii)该方法能够以高置信度检测这些分子的存在。

实施例6

寡核苷酸设计

以下寡核苷酸可用于该方法的一些实施方案中：

左靶寡核苷酸(缀合物臂)：

/5AzideN/TTTUUUCGTUTACGACCUCUAAGGCCACGAUAGCGT(SEQ ID NO:1)

右靶寡核苷酸(缀合物臂)：

/5Phos/ATGCUAACCGC*A*G*A*C*CACTAGGCGAATACGTTTTTT/3AzideN/(SEQ ID NO:2)

夹板：

/5Phos/CGGTTAGCATACGCTATCGT(SEQ ID NO:3)

左侧报告寡核苷酸：

/5Phos/GGCCTTAGAGGTCGTAAACGTTTGAAGCAATCCGTGGGCGGGCGCAAACGTTTGTCGACA/3Bio/(SEQ ID NO:4)

右侧报告寡核苷酸：

A*A*T*GTTTCGCGTGCATCCGGCTCCACCGGATTTGCAGCTTCGTATTCGCCTAGTGGTCTG(SEQID NO:5)

下面描述了该寡核苷酸的修饰。

/5AzideN/:通过NHS酯连接的叠氮化物修饰

/5Phos/:磷酸化

U脱氧尿苷

*硫代磷酸酯键

/3AzideN/通过NHS酯连接的叠氮化物修饰

/3Bio/生物素

在本实施方案中，左右靶寡核苷酸通过它们的叠氮化物基团连接到抗体上，抗体结合到样品上。结合后，将样品与连接酶和夹板寡核苷酸一起孵育。邻近的靶寡核苷酸在由夹板寡核苷酸介导的连接中相互连接。在下一步骤中，将左右报告寡核苷酸与样品杂交，其中夹板仍与连接产物杂交。左右报告寡核苷酸与连接产物中邻近夹板的位点杂交，报告寡核苷酸与夹板连接以产生报告分子。产生报告分子后，用UDG或USER处理样品以在尿嘧啶处切割连接产物或除去尿嘧啶。这降低了报告分子与基础连接产物之间相互作用的Tm，这使得报告分子易于释放。该实施方案如图2B所示。

尽管为了清楚理解的目的，已经通过图示和实例的方式详细描述了前述发明，但是对于本领域普通技术人员来说，根据本发明的教导显而易见的是在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。

序列表

<110> MOLECULENT AB

<120> 平面生物样品的空间分析

<130> MOLE-001WO

<150> 63/214,701

<151> 2021-06-24

<150> 63/257,456

<151> 2021-10-19

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 1

tttuuucgtu tacgaccucu aaggccacga uagcgt 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 2

atgcuaaccg cagaccacta ggcgaatacg tttttt 36

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 3

cggttagcat acgctatcgt 20

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 4

ggccttagag gtcgtaaacg tttgaagcaa tccgtgggcg ggcgcaaacg tttgtcgaca 60

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 5

aatgtttcgc gtgcatccgg ctccaccgga tttgcagctt cgtattcgcc tagtggtctg 60

Claims (82)

1.一种用于分析样品的方法，其包括：

(a)将寡核苷酸或包含其的缀合物与平面生物样品在所述寡核苷酸或缀合物特异性结合所述样品中或所述样品上的位点的条件下接触；

(b)进行一个或多个步骤以原位释放和/或延伸所述寡核苷酸或其互补序列，以产生报告探针；

(c)以保持所述报告探针在所述样品中的空间关系的方式，将所述报告探针或其互补物的全部或部分从所述样品转移到不包含寡核苷酸阵列的平面支持物上；以及

(d)检测所述支持物上的所述报告探针。

2.根据权利要求1所述的方法，其中：

步骤(a)包括在所述寡核苷酸与所述样品中的内源RNA或DNA杂交的条件下，将所述寡核苷酸与所述样品杂交；以及

步骤(b)包括通过连接或缺口填充/连接将与RNA或DNA中相邻位点杂交的任何寡核苷酸连接在一起。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含来自邻近连接测定的连接产物；并且

步骤(a)包括在寡核苷酸与所述连接产物杂交的条件下将所述寡核苷酸与所述样品杂交；以及

步骤(b)包括通过连接或缺口填充/连接反应将与所述连接产物中相邻位点杂交的任何寡核苷酸连接在一起。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸是外切核酸酶敏感性的，但所述报告探针是抗外切核酸酶的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)与步骤(c)之间用外切核酸酶处理所述样品。

6.根据权利要求1所述的方法，其中：

步骤(a)包括在所述抗体与所述样品中或所述样品上的位点结合的条件下，将所述样品与抗体-寡核苷酸缀合物接触；以及

步骤(b)包括从所述缀合抗体中释放所述寡核苷酸或其延伸产物以产生所述报告探针。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述报告探针通过连接或缺口填充反应产生的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述报告探针通过引物延伸反应产生。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)通过显微镜术进行。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述释放通过在步骤(a)之后将所述生物样品与所述支持物接触，然后加热所述样品来完成。

11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(d)包括将一种或多种被标记寡核苷酸直接或间接与所述报告探针杂交，然后通过显微镜检查术分析所述被标记寡核苷酸的结合模式。

12.根据权利要求10所述的方法，其中将探针组在重复的循环中进行杂交和洗掉以解码个体报告分子，使用至少两个或更多个循环来解码。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是组织切片。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含哺乳动物细胞。

15.根据权利要求1所述的方法，其中通过将细胞悬浮液通过过滤器来产生所述平面样品，其中将所述细胞保留在过滤器上。

16.一种用于分析平面生物样品的方法，其包括：

(a)对一对或多对与所述样品结合的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法，以产生邻近测定法反应产物；

(b)以保持所述邻近测定法反应产物在所述样品中的空间关系的方式将所述核酸反应产物转移到平面支持物上；以及

(c)检测所述支持物上的所述邻近测定法反应产物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述邻近测定包括涉及所述结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸的连接、引物延伸和缺口填充/连接反应的任意组合。

18.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(c)包括：

(i)标记所述支持物上的所述邻近测定法反应产物；以及

(ii)对所述支持物成像以产生所述邻近测定法反应产物结合至所述支持物的位点的图像。

19.根据权利要求16所述的方法，其中通过将所述样品置于所述支持物上并通过电泳或扩散将所述邻近测定法反应产物转移到所述支持物的表面上来完成步骤(b)中的转移。

20.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(c)包括：将一种或多种被标记寡核苷酸直接或间接与所述核酸反应产物杂交。

21.根据权利要求20所述的方法，其中在步骤(c)中，通过与由预定数量的寡核苷酸和预定数量的被标记寡核苷酸组成的确定的核酸结构杂交来检测所述邻近测定法反应产物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述结构通过至少两个对所述邻近测定法反应产物的杂交事件来成核。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少两个杂交事件包括与邻近测定法反应产物中的第一序列的第一杂交和与所述邻近测定法反应产物中的第二序列的第二杂交。

24.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法包括将步骤(a)中产生的图像与所述样品的图像进行比较。

25.根据权利要求24所述的方法，其中通过用显微镜检查术染色剂对所述样品进行染色来产生所述样品的图像。

26.根据权利要求16所述的方法，所述方法还包括在步骤(b)与步骤(c)之间从所述支持物上移除所述样品。

27.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物样品是组织切片。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述组织切片是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织切片。

29.根据权利要求16所述的方法，其中所述支持物是载玻片。

30.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(a)的所述结合剂是寡核苷酸探针、抗体或适体。

31.一种用于分析平面生物样品的方法，其包括：

(a)将报告寡核苷酸与平面生物样品中的RNA原位杂交；

(b)洗去未结合的报告寡核苷酸；

(c)以保持所述报告寡核苷酸在所述样品中的空间关系的方式将所述报告寡核苷酸转移到支持物上；以及

(d)通过被标记探针与所述报告寡核苷酸的杂交来检测所述支持物上的所述报告寡核苷酸。

32.一种用于分析平面生物样品的方法，所述方法包括：

(a)将多对报告寡核苷酸与平面生物样品中的RNA原位杂交；

(b)将原位杂交到彼此邻近或相近的位点的任何报告寡核苷酸对连接在一起，以产生报告产物；

(c)以保持所述连接产物在所述样品中的空间关系的方式将所述连接产物转移到支持物上；以及

(d)通过被标记探针与所述连接产物的杂交来检测所述支持物上的所述连接产物。

33.根据权利要求32所述的方法，其中：

每对报告寡核苷酸的一个成员具有包含反应性基团的末端，并且另一个成员具有抗外切核酸酶的键联；

在步骤(c)中，所述连接产物通过反应基团系连于所述支持物上；以及，

在步骤(d)之前，所述方法包括通过外切核酸酶处理降解任何未连接的报告寡核苷酸和其它单链DNA分子。

34.根据权利要求32所述的方法，其中每对报告寡核苷酸中的至少一个成员具有不与所述RNA杂交的尾部，并且在步骤(d)中所述被标记探针与所述连接产物中的报告寡核苷酸的尾部杂交。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述生物样品是组织切片。

36.根据权利要求32所述的方法，其中所述被标记探针包括相互杂交的确定数量的未标记和被标记寡核苷酸的复合物。

37.根据权利要求32所述的方法，其中步骤(d)包括：

(i)将所述支持物上的所述连接产物与第一桥接寡核苷酸和第二桥接寡核苷酸杂交，其中所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸与所述连接产物中的不同序列杂交；以及

(ii)将与所述连接产物杂交的所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸与被标记复合物杂交，所述被标记复合物由预定数量的在复合物中杂交的被标记和未被标记寡核苷酸组成，其中所述被标记复合物与两种桥接寡核苷酸都杂交；以及

(iii)以能够检测单个被标记复合物的杂交的分辨率检测所述杂交的被标记复合物。

38.根据权利要求37所述的方法，其中

所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸具有不与所述连接产物杂交的尾部；

所述被标记复合物中的至少一些所述未被标记寡核苷酸与所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸两者的尾部杂交；以及

所述复合物包含确定数量的被标记寡核苷酸，其中所述被标记寡核苷酸与所述未被标记寡核苷酸杂交。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一桥接寡核苷酸具有第一稳定化序列，并且所述第二桥接寡核苷酸具有第二稳定化序列，并且当所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸与连接产物杂交时，所述第一稳定化序列与所述第二稳定化序列相互杂交。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述稳定化序列的长度为4-10bp，其中一个稳定化序列位于所述第一桥接寡核苷酸的3’末端，而另一个稳定化序列位于所述第二桥接寡核苷酸的5’末端。

41.一种用于分析平面生物样品的方法，其包括：

(a)用多种缀合物标记平面生物样品，每种缀合物包含：i.与样品中的位点或序列结合的结合剂，和ii.第一寡核苷酸；

(b)将成对的报告寡核苷酸原位连接在一起以产生报告探针，其中所述报告寡核苷酸的连接以i.彼此邻近的第一寡核苷酸或ii.其连接产物为模板；

(c)以保持所述邻近测定法反应产物在生物样品中的空间关系的方式将所述报告探针转移到支持物中或支持物上；

(d)通过外切核酸酶处理和/或通过洗涤除去未反应的报告寡核苷酸和其它单链DNA分子，其中所述除去是在原位或在支持物上进行的；以及

(e)通过被标记探针与所述报告探针的杂交来检测所述支持物上的所述报告探针。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述被标记探针包含由预定数量的未被标记和被标记寡核苷酸组成的确定的核酸结构。

43.根据权利要求41所述的方法，其中每对报告寡核苷酸的至少一个成员具有不与所述第一寡核苷酸或其连接产物杂交的尾部，并且在步骤(e)中所述被标记探针与所述报告探针中的报告寡核苷酸的尾部杂交。

44.根据权利要求43所述的方法，其中执行步骤(c)，并且：

每对报告寡核苷酸的一个成员具有包含反应性基团的末端，并且另一个成员具有不与所述第一寡核苷酸或其连接产物杂交的尾部，

在步骤(c)中，所述报告探针通过反应基团系连于所述支持物上；以及

在步骤(d)中，通过所述被标记探针与所述报告探针中的报告寡核苷酸的尾部的杂交，原位检测所述报告探针。

45.根据权利要求41所述的方法，其中步骤(b)包括：

(i)将第一寡核苷酸对原位连接在一起以产生第一产物，以及

(ii)使用所述第一产物作为模板，将报告寡核苷酸对原位连接在一起以产生报告探针。

46.根据权利要求41所述的方法，其中步骤(d)包括通过外切核酸酶处理或通过在低于报告探针:第一产物双链体的Tm的温度下洗涤来去除未反应的报告寡核苷酸和其它单链DNA分子。

47.根据权利要求41所述的方法，其中(b)(ii)的所述连接产物通过连接或缺口填充/连接反应来制备。

48.根据权利要求41所述的方法，其中使用夹板连接反应来制备(b)(ii)的所述连接产物。

49.根据权利要求45所述的方法，其中(i)和(ii)在分开的反应中完成。

50.根据权利要求45所述的方法，其中在同一反应中完成(i)和(a)(ii)，其中将所述报告寡核苷酸与所述第一寡核苷酸预杂交并用作夹板用于将所述第一寡核苷酸连接在一起，并且所述第一寡核苷酸之一用作模板用于连接所述报告寡核苷酸。

51.根据权利要求41所述的方法，其中步骤(a)的所述结合剂是寡核苷酸探针、抗体或适体。

52.根据权利要求41所述的方法，其中所述生物样品是组织切片。

53.一种用于分析平面生物样品的方法，所述方法包括：

(a)在平面生物样品中进行原位邻近测定法，以产生邻近测定法反应产物；

(b)以保持所述邻近测定法反应产物在所述样品中的空间关系的方式将所述邻近测定法反应产物转移到所述支持物中或所述支持物上；

(c)通过以下方式标记所述支持物上的所述邻近测定法反应产物：

(i)将所述邻近测定法反应产物与所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸杂交，其中所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸与所述邻近测定法反应产物中的不同序列杂交；以及

(ii)将与所述邻近测定法反应产物杂交的所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸与被标记复合物杂交，所述被标记复合物由在所述复合物中杂交的预定数量的未被标记寡核苷酸和预定数量的被标记寡核苷酸组成，其中所述被标记复合物与两种桥接寡核苷酸都杂交；以及

(d)以能够检测单个被标记复合物的杂交的分辨率检测所述杂交的被标记复合物。

54.根据权利要求53所述的方法，其中：

所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸具有不与所述邻近测定法反应产物杂交的尾部；

所述被标记复合物中的至少一些未被标记寡核苷酸与所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸两者的尾部杂交；以及

所述被标记复合物包含确定数量的被标记寡核苷酸，其中所述被标记寡核苷酸与所述标记性寡核苷酸杂交。

55.根据权利要求53所述的方法，其中所述被标记复合物包含4-20个标记性寡核苷酸和8-200个被标记的检测寡核苷酸。

56.根据权利要求53所述的方法，其中所述第一桥接寡核苷酸具有第一稳定化序列并且所述第二桥接寡核苷酸具有第二稳定化序列，并且当所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸与所述邻近测定法反应产物杂交时，所述第一稳定化序列与所述第二稳定化序列相互杂交。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述稳定化序列的长度为4-10bp，其中一个稳定化序列位于所第一桥接寡核苷酸的3’末端，而另一个稳定化序列位于所第二桥接寡核苷酸的5’末端。

58.根据权利要求53所述的方法，其中所述生物样品是组织切片。

59.根据权利要求53所述的方法，其中在步骤(b)中，将所述邻近测定法反应产物中与第一第一桥接寡核苷酸和第二第一桥接寡核苷酸杂交的序列一起集合到(a)的邻近测定法中的单个分子中。

60.根据权利要求53所述的方法，其中所述邻近测定法包括：

(i)将第一寡核苷酸对原位连接在一起以产生第一产物，其中连接在一起的所述第一寡核苷酸各自为与所述样品结合的结合剂-寡核苷酸缀合物的一部分，以及

(ii)使用所述第一产物作为模板将报告寡核苷酸对原位连接在一起以产生所述报告探针，以及

其中，在步骤(c)中所述第一桥接寡核苷酸和所述第二桥接寡核苷酸与所述报告探针杂交。

61.根据权利要求60所述的方法，其中每对报告寡核苷酸的至少一个成员具有不与所述第一产物杂交的尾部，并且其中所述被标记复合物与所述报告探针中的报告寡核苷酸的尾部杂交。

62.根据权利要求53所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)与步骤(c)之间用外切核酸酶处理所述样品或支持物，以除去未反应的单链DNA分子。

63.根据权利要求53所述的方法，其中步骤(a)的邻近测定法中使用的所述结合剂是寡核苷酸探针、抗体或适体。

64.一种用于分析细胞悬浮液的方法，所述方法包括：

(a)通过多孔毛细管膜过滤细胞悬浮液，从而将所述细胞分布在所述膜上；

(b)将膜置于平面支持物上，使所述膜的细胞侧面向所述支持物；

(c)以保持所述细胞中所述核酸的空间关系的方式将所述核酸从所述细胞转移到所述支持物中或所述支持物上；

(d)从所述支持物上移除所述多孔毛细管膜和细胞；以及

(e)对转移到所述支持物上的所述核酸进行空间分析。

65.根据权利要求64所述的方法，其中：

所述方法还包括在步骤(a)与步骤(c)之间，对一对或多对与所述细胞结合的结合剂-寡核苷酸缀合物原位进行邻近测定法，以在所述细胞中或所述细胞上产生邻近测定法反应产物，以及

在步骤(c)中转移并在步骤(e)中分析的所述核酸包括所述邻近测定法反应产物。

66.根据权利要求65所述的方法，其中步骤(e)包括：

(i)标记所述支持物中或所述支持物上的所述转移的邻近测定法反应产物；以及

(ii)对所述支持物成像以产生所述支持物中或所述支持物上与所述邻近测定法反应产物结合的位点的图像。

67.根据权利要求65所述的方法，其中所述邻近测定法包括涉及所述结合剂-寡核苷酸缀合物的寡核苷酸的连接、引物延伸和缺口填充/连接反应的任意组合。

68.根据权利要求64所述的方法，其中(b)的所述平面支持物包含带空间条形码的捕获寡核苷酸阵列，步骤(c)包括将所述转移的核酸与所述带空间条形码的捕获寡核苷酸杂交，并且步骤(e)包括使用所述转移的核酸作为模板延伸所述捕获寡核苷酸，并对所述引物延伸模板的拷贝进行测序以产生序列读数。

69.根据权利要求68所述的方法，所述方法还包括使用所述序列读数中的所述空间条形码将所述序列读数映射到所述支持物上的位点。

70.根据权利要求64所述的方法，其中所述转移步骤(c)通过电泳或扩散完成。

71.根据权利要求64所述的方法，其中所述多孔毛细管膜是多孔阳极氧化铝膜。

72.根据权利要求64所述的方法，其中步骤(a)通过以下步骤完成：

(i)将所述细胞悬浮液置于所述多孔毛细管膜上；以及

(ii)施加使所述悬浮液的液体组分穿过所述膜的力。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述力是选自离心力、负压和正压的主动力，或者是选自毛细作用和蒸发的被动力。

74.根据权利要求64所述的方法，所述方法还包括在步骤(d)与步骤(e)之间洗涤所述多孔毛细管膜。

75.根据权利要求64所述的方法，其中所述膜中的孔的内径在2nm至500nm的范围内。

76.根据权利要求64所述的方法，其中所述膜中相邻孔的中心之间的平均距离在50nm至1000nm的范围内。

77.根据权利要求64所述的方法，其中所述膜中相邻孔的边缘之间的平均距离在10nm至500nm的范围内。

78.根据权利要求64所述的方法，其中所述细胞悬液包括血细胞、免疫细胞、已经通过胰蛋白酶处理而彼此分离的单细胞或已经悬浮培养的细胞。

79.根据权利要求65所述的方法，其中：

所述结合剂-寡核苷酸缀合物各自包含：i.与所述样品中的位点或序列结合的结合剂和ii.第一寡核苷酸，并且

所述邻近测定法包括将报告寡核苷酸对原位连接在一起以产生报告探针，其中所述报告寡核苷酸的连接以i.彼此邻近的第一寡核苷酸或ii.其连接产物为模板；并且

在步骤(c)中将所述报告探针转移到所述支持物上；并且

步骤(e)包括通过被标记探针与所述报告探针的杂交来检测所述支持物上的所述报告探针。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述方法还包括通过外切核酸酶处理或通过洗涤除去未反应的报告寡核苷酸和其它单链DNA分子。

81.根据权利要求79所述的方法，其中每对报告寡核苷酸的至少一个成员具有不与所述第一寡核苷酸或其连接产物杂交的尾部，并且在步骤(e)中所述被标记探针与所述报告探针中的报告寡核苷酸的尾部杂交。

82.根据权利要求79所述的方法，其中：

每对报告寡核苷酸的一个成员具有包含反应性基团的末端，而另一个成员具有不与所述第一寡核苷酸或其连接产物杂交的尾部，

在步骤(c)中，所述报告探针通过所述反应基团系连于支持物上；以及

在步骤(e)中，通过所述被标记探针与所述报告探针中的报告寡核苷酸的尾部的杂交来检测所述报告探针。