CN117980285A - 纯化二氯乙酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供纯化二氯乙酸的制造方法和使用其的核酸分子的高效的制造方法。具体而言，本发明提供纯化二氯乙酸的制造方法和使用上述纯化二氯乙酸作为脱保护剂的核酸分子的制造方法，所述纯化二氯乙酸的制造方法是制造甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10‑5以下、并且二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为20×10‑5以下的纯化二氯乙酸的方法，使甲醛和二氯乙酸酐中的两者或一者的含量超过上述比率的二氯乙酸与选自由脂肪族醇、脂肪族胺和水组成的组中的至少一种具有比二氯乙酸低的沸点的化合物接触，在具有比二氯乙酸低的沸点的非质子性的非活性溶剂的共存下，从生成的混合液中蒸馏除去含有上述溶剂的馏分。

Description

纯化二氯乙酸的制造方法
技术领域
本申请对在2021年9月28日提出申请的日本专利申请第2021-158346主张优先权和其利益，其全部内容通过参照并入本申请中。
本发明涉及纯化二氯乙酸的制造方法、其分析方法和使用纯化二氯乙酸的基于酰胺法的核酸分子的合成方法。
背景技术
近年来，对核酸分子在医疗领域的应用的兴趣不断高涨。例如，可举出反义核酸、适配体、核酶和siRNA等诱导RNA干扰(RNAi)的核酸等，它们被称为核酸药物。
核酸分子可利用固相合成法合成，将在固相载体上使核酸延伸而合成的核酸分子从固相载体切出，接着，对包含核糖的核酸分子而言，对核糖的2’位的羟基的保护基进行脱保护以将其除去，从而制造作为目标的核酸分子。已知固相合成法中使用核苷的亚磷酰胺(以下，称为称为“酰胺(amidite)”)作为原料，使用二氯乙酸溶液对5’位的羟基的保护基进行脱保护，但以往使用二氯乙酸溶液所合成的核酸分子的收率并不总令人满意，合成也并非是高效的(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第99/43694号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供核酸分子的高效的制造方法。
用于解决课题的手段
本申请的发明人为了达成上述目的而反复进行了深入研究，结果提供核酸分子的高效的制造方法、以及上述二氯乙酸的分析方法，所述制造方法中，在合成核酸分子时，使用甲醛和二氯乙酸酐的含量为一定以下的纯化二氯乙酸溶液，或在提高二氯乙酸的品质后使用。
本发明包括以下的方式，但不限于这些。
1.纯化二氯乙酸的制造方法(以下，记为本发明纯化方法)，其是制造甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-5以下、并且二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为20×10-5以下的纯化二氯乙酸的方法，
使甲醛和二氯乙酸酐中的两者或一者的含量超过上述比率的二氯乙酸、与选自由脂肪族醇、脂肪族胺和水组成的组中的至少一种具有比二氯乙酸低的沸点的化合物接触，在具有比二氯乙酸低的沸点的非质子性的非活性溶剂的共存下，从生成的混合液中蒸馏除去含有上述溶剂的馏分。
2.如前项1所述的制造方法，其中，上述非质子性的非活性溶剂为具有181℃以下的沸点的非质子性的非活性溶剂。
3.如前项1或2所述的制造方法，其中，上述非质子性的非活性溶剂为二氯甲烷、乙腈或芳香族有机溶剂。
4.如前项3所述的制造方法，其中，芳香族有机溶剂为甲苯。
5.如前项1～4中任一项所述的制造方法，其中，脂肪族醇为C1-C6的脂肪族醇。
6.如前项1～5中任一项所述的制造方法，其中，上述纯化二氯乙酸中，甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为41×10-5以下。
7.如前项1～6中任一项所述的制造方法，其中，上述纯化二氯乙酸中，二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为10×10-5以下。
8.如前项1～7中任一项所述的制造方法，其中，上述纯化二氯乙酸中，甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-6以下。
9.如前项1～8中任一项所述的制造方法，其中，上述纯化二氯乙酸中，二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为50×10-6以下。
10.核酸分子的制造方法，其为基于酰胺法的核酸分子的制造方法，包括：准备甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-5以下、并且二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为20×10-5以下的纯化二氯乙酸的工序；和使上述纯化二氯乙酸与5’末端的羟基被保护的核酸分子反应，将上述羟基的保护基除去的工序。
11.如前项10所述的制造方法，其中，上述准备工序为前项1～9中任一项所述的方法。
12.如前项10或11所述的制造方法，其中，5’末端的羟基被保护的核酸分子为式(1)表示的核酸分子，
[化学式1]
(式中，
G2表示羟基的保护基，
Ba相同或彼此不同，各自独立地表示可被保护基保护的核酸碱基，
R1、R2和R3相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基，
R相同或彼此不同，各自独立地表示经保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基，
Y相同或彼此不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，
n表示1～200中的任一整数，
W1表示OZ基，且X1表示R基，或者
W1表示OV基，且X1表示OZ基，
V表示羟基的保护基，
Z为具有由固相载体和连接基团组成的结构的基团。
并且，n为2以上的整数时，式(1)表示的核酸分子可以在各核苷酸之间组入非核苷酸接头。)
经脱保护的核酸分子为式(2)表示的核酸分子，
[化学式2]
(式中，
G2、Ba、R、Y、X1、W1和n与前述相同，并且，
可以以式(1)中所定义的方式，在核苷酸之间组入非核苷酸接头。)。
13.式(2’)表示的核酸分子的制造方法，其包括：
前项12所述的工序；
进一步从该工序中生成的式(2)表示的核酸分子除去Z表示的基团的工序；以及
除去羟基和核酸碱基的保护基的工序，
[化学式3]
(式中，
Y和n与前述相同，
Bc相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
G4相同或彼此不同，各自独立地表示氢离子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
R’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’与前述相同，并且，
X3和W3各自独立地表示羟基，或者
X3表示R’基，且W3表示羟基。并且，
可以以式(1)中所定义的方式，在核苷酸之间组入非核苷酸接头。)。
14.如前项10～13中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为包含核糖核酸(RNA)的核酸分子。
15.如前项14所述的制造方法，其中，核酸分子为核糖核酸(RNA)，其核糖的2’位的羟基的保护基为式(6)表示的保护基。
式(6)：
[化学式4]
(式中，
q表示0～5中的任一整数，
Ra和Rb相同或彼此不同，各自独立地表示甲基、乙基或氢原子，
＊标记表示与源自核糖的2’位的羟基的氧原子的键合点，并且，EW表示吸电子基团。)
16.如前项15所述的制造方法，其中，Ra或Rb中的任一者为甲基，另一者为氢原子，并且，Ew为氰基。
17.如前项10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为40链长以上的寡聚物。
18.如前项10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为50链长以上的寡聚物。
19.如前项10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为60链长以上的寡聚物。
20.如前项10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为80链长以上的寡聚物。
21.如前项10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为100链长以上的寡聚物。
22.二氯乙酸试剂中包含的二氯乙酸酐的分析方法，其中，使包含二氯乙酸酐的二氯乙酸试剂与芳基烷基胺反应，将二氯乙酸酐转化为对应的2,2-二氯-N-芳基烷基乙酰胺，利用高效液相色谱法对生成的上述酰胺进行分析。
23.如前项22所述的分析方法，其中，芳基烷基胺为式(I)的化合物，
[化学式5]
(式中，
R10、R20和R30相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷基，
X10表示氢原子、烷基或烷氧基，
n为1～5中的任一整数。)
2,2-二氯-N-芳基烷基乙酰胺为式(II)的酰胺化合物，
[化学式6]
(式中，R10、R20、R30、X10和n与前述相同。)。
24.如前项23所述的分析方法，其中，R10、R20或R30相同或彼此不同，各自独立地为氢原子或C1-C6的烷基，X10为氢原子、C1-C6的烷基、或C1-C6的烷氧基。
25.如前项22～24中任一项所述的分析方法，其中，相对于1摩尔的二氯乙酸，使用0.01～3.0摩尔的芳基烷基胺。
26.如前项22～24中任一项所述的分析方法，其中，相对于1摩尔的二氯乙酸，使用0.05～2.0摩尔的芳基烷基胺。
27.如前项22～24中任一项所述的分析方法，其中，相对于1摩尔的二氯乙酸，使用0.08～1.1摩尔的芳基烷基胺。
28.如前项22～27中任一项所述的分析方法，其中，芳基烷基胺为苄胺，酰胺化合物为2,2-二氯-N-苄基乙酰胺。
29.如前项22～28中任一项所述的分析方法，其中，包含二氯乙酸酐的二氯乙酸试剂与芳基烷基胺的反应以乙腈为溶剂来进行。
发明效果
本发明提供纯化二氯乙酸的制造方法和使用其的高效的核酸分子的制造方法。利用本发明的制造方法，可期待所制造的核酸分子的收率提高。
附图说明
图1为示出由式(1)表示的核酸分子制造式(5)表示的核酸分子的典型例的路线A。图中，作为G1，只要是能够用二氯乙酸除去的作为羟基的保护基发挥功能的基团即可，可以没有特别限制地使用，可以广泛地使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。另外，G3相同或彼此不同，各自独立地表示烷基，或者也可以2个G3彼此键合而形成环状结构。作为G3，相同或彼此不同，各自独立地为烷基，例如优选为甲基、乙基、丙基、或异丙基，更优选两者为异丙基。其它符号与前述相同。
具体实施方式
对甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-5以下、并且二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为20×10-5以下的纯化二氯乙酸的制造方法进行说明。
作为上述纯化二氯乙酸的制造方法中使用的甲醛和二氯乙酸酐中的两者或一者的含量超过上述比率的二氯乙酸，例如，可示例市售的二氯乙酸试剂或利用已知的方法制造的二氯乙酸。可以对这些二氯乙酸试剂等中包含的甲醛和二氯乙酸酐的量进行分析而使用。
作为供于本发明的纯化中的二氯乙酸，可示例：1)甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比大于81×10-5、并且二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比大于20×10-5的二氯乙酸；2)甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-5以下、并且二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比大于20×10-5的二氯乙酸；3)甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比大于81×10-5、二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为20×10-5以下的二氯乙酸。根据本发明的纯化方法，对这些二氯乙酸进行纯化，能够使甲醛和二氯乙酸酐的含量降低至本发明的纯化方法的所期望的比率的范围内。
本发明的纯化方法可以在向甲醛和二氯乙酸酐中的两者或一者的含量超过上述比率的二氯乙酸中加入选自由脂肪族醇、脂肪族胺和水组成的组中的至少一种具有比二氯乙酸低的沸点的化合物之后，添加具有比二氯乙酸低的沸点的非质子性的非活性溶剂，也可以预先将具有比二氯乙酸低的沸点的非质子性的非活性溶剂添加至作为生成对象的二氯乙酸试剂中之后，加入具有比二氯乙酸低的沸点的选自由脂肪族醇、脂肪族胺和水组成的组中的至少一个化合物。
作为具有比二氯乙酸低的沸点的脂肪族醇和脂肪族胺，例如，可示例C1-C6的脂肪族醇和C1-C6的脂肪族胺化合物。作为C1-C6的脂肪族醇的例子，例如，可示例甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、正戊醇、正己醇等。作为具有比二氯乙酸低的沸点的脂肪族胺，可示例C1-C6的脂肪族胺化合物。具体而言，可示例甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺等。
就上述脂肪族醇、上述脂肪族胺和水或者它们的混合物的使用量而言，只要为对于使二氯乙酸酐降低至上述所期望的范围有效的量即可，没有特别限定。可以利用下述的二氯乙酸试剂中包含的二氯乙酸酐的分析方法对二氯乙酸酐的量进行分析，求出有效的量。
作为具有比二氯乙酸低的沸点的非质子性的非活性溶剂，例如，可举出具有181℃以下的沸点的非质子性的非活性溶剂，具体而言，可示例芳香族有机溶剂(例如，甲苯、二甲苯、单氯苯、和邻二氯苯等)、乙腈、二氯甲烷等。该溶剂的使用量没有特别限定，典型而言，相对于二氯乙酸，例如为0.5重量倍至20重量倍左右。
蒸馏除去时的浴温通常为20℃至120℃，可以为大气压下，也可以为减压下。以上述溶剂为主的低沸点成分的蒸馏除去无需将上述溶剂全部蒸馏除去，可以是一部分被蒸馏除去。蒸馏除去通常在被蒸馏除去的溶剂等的量为添加使用的溶剂的50％至75％的范围内进行。通过这样的方式，可得到所期望的二氯乙酸酐量和甲醛量的纯化二氯乙酸溶液。
在基于酰胺法的核酸分子合成中，作为纯化二氯乙酸，二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为10×10-5以下是优选，二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为50×10-6以下是更优选的。
作为纯化二氯乙酸，甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为41×10-5以下是优选的，甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-6以下是更优选的。
对二氯乙酸试剂中包含的二氯乙酸酐的分析方法进行说明。
上述分析方法通过下述方式实施：通常，使包含二氯乙酸酐的二氯乙酸试剂的样品以规定量在非活性溶剂中与芳基烷基胺反应，将二氯乙酸酐转化为对应的2,2-二氯-N-芳基烷基乙酰胺，利用高效液相色谱法(HPLC)对生成的上述酰胺进行分析。
作为芳基烷基胺，可示例上述式(I)的化合物，作为生成的2,2-二氯-N-芳基烷基乙酰胺，可示例上述式(II)的化合物。
式(I)和(II)中，作为R10、R20、R30或X10中的烷基，优选C1-C6的烷基，更优选甲基。作为X10中的烷氧基，优选C1-C6的烷氧基，更优选甲氧基。R10、R20、R30或X10优选为氢原子，n＝1。作为芳基烷基胺，优选苄胺。
相对于1摩尔的二氯乙酸，芳基烷基胺的使用量典型为0.01～3.0摩尔，优选为0.05～2.0摩尔，更优选为0.08～1.1摩尔。
典型而言，包含二氯乙酸酐的二氯乙酸试剂与芳基烷基胺的反应以乙腈作为溶剂来进行。
基于HPLC的2,2-二氯-N-芳基烷基乙酰胺的分析通常使用ODS柱来进行。作为流动相，例如，以使用甲酸水溶液作为流动相A、使用乙腈作为流动相B的梯度实施。UV检测波长典型为254nm。
接着，对核酸分子的制造方法进行说明，所述制造方法为基于酰胺法的核酸分子的制造方法，包括：准备甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-5以下、并且二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为20×10-5以下的纯化二氯乙酸的工序；和使上述纯化二氯乙酸与5’末端的羟基被保护的核酸分子反应，将上述保护基除去的工序。
所使用的纯化二氯乙酸利用上述的工序准备。在利用上述方法以外的方法得到的情况下，可以从中选择。
作为核酸分子的5’位的羟基的保护基，可示例下述G5表示的基团。作为5’位的羟基被保护的核酸化合物，可示例上述式(1)的核酸化合物。作为使上述纯化二氯乙酸溶液反应而生成的核酸化合物，可示例上述式(2)表示的核酸化合物。
上述式(1)和(2)中，作为呈现Q’所示的、相同或彼此不同且各自独立地与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基的化合物，具体而言可举出下述式(7)的LNA-1、LNA-2、或LNA-3所示的结构。
[化学式7]
(式中，Ba表示可以被保护的核酸碱基。)
作为Z所示的、具有由固相载体、及将固相载体与核酸分子的3’末端的核糖的2’位或3’位的羟基的氧原子连接的连接基团组成的结构的基团，更具体而言，可举出下述式(8)表示的结构。
[化学式8]
式(8)中，Sp表示间隔基。
作为间隔基(Sp)，例如，可示例具有下述式(9)所示的结构式的基团。
[化学式9]
接头(Linker)例如可以为下述式(10)所示的结构，或者也可以是式(10)的结构中不具有六亚甲基氨基部分的结构即氨基丙基键合于Si的结构。或者，接头(Linker)也可以是下述式(11)所示的结构。
[化学式10]
(式中，
A可以为羟基、烷氧基、或烷基中的任一者。作为烷氧基，例如可举出甲氧基和乙氧基。作为烷基，例如可举出甲基、乙基、异丙基、正丙基。Si表示与载体表面的羟基的氧键合。)
作为固相载体(Solid support)，可举出无机多孔质载体、有机系树脂载体等。无机多孔质载体例如可举出可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass：CPG)。有机系树脂载体例如可举出由聚苯乙烯形成的载体。
作为本发明中使用的核酸分子内所含的核苷(核糖、和脱氧核糖)，可示例DNA、RNA、2’-O-MOE(2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-Me、2’-F RNA、和上述的LNA，上述核苷不限于这些。
利用包括基于上述的纯化二氯乙酸溶液的脱保护工序的固相合成法进行的核酸分子的合成方法典型地包括以下的工序。
(1)对介由接头键合于固相载体的羟基经保护的核苷的5’位的羟基进行脱保护的工序；
(2)使上述工序中生成的5’位的羟基与亚磷酰胺化合物进行偶联反应而得到亚磷酸三酯化合物的工序；
(3)使上述工序中生成的亚磷酸三酯氧化转化为磷酸三酯而制造延伸的核酸分子的工序；或者转化为硫代磷酸三酯的任意工序；
(4)反复进行任意次数的下述一系列反应的循环，在固相载体上合成核酸分子的工序，前述一系列反应的循环由上述工序(1)～(3)、即：生成的核酸分子的5’位的羟基的脱保护工序、5’位的羟基与酰胺化合物的偶联工序、以及生成的亚磷酸三酯的氧化工序构成；和
(5)将工序(4)中生成的固相载体上的核酸分子供于切出和脱保护的工序，使其从固相载体游离，制造除去了保护基的核酸分子的工序。
其中，在上述核酸分子的合成方法中，继工序(2)或(3)之后，可以包括对未进行与亚磷酰胺化合物的偶联反应的5’位的羟基进行加帽的工序，也可以在构成工序(4)的一系列反应的循环的任意工序之间附加加帽工序。
更具体而言，上述(5)的工序通过下述方式实施：将工序(4)中生成的固相载体上的核酸分子按以下的工序(5-1)和(5-2)的反应顺序实施，接着供于工序(5-3)的反应。此处工序(5-1)的反应的实施可以是任意的，工序(5-2)的反应的实施也可以使用日本专利第4705716号公报中记载的方法。结果，能够制造从固相载体游离的核酸分子中除去了保护基的核酸分子、或者5’末端的羟基被保护的核酸分子。
(5-1)对核酸分子的5’末端的羟基的保护基进行脱保护的反应；
(5-2)从固相载体上切下核酸分子使其游离的反应；以及
(5-3)对构成核酸分子的核糖的2’位或3’末端的3’位的羟基的保护基进行脱保护的反应。
将上述工序(1)至(5)的路线示于图1。图1所示的工序(1)或工序(4)中的脱保护反应使用上述的纯化二氯乙酸溶液来实施。路线A中的化学式中的取代基的定义与上述定义相同。
对于上述式(1)的核酸化合物，可以进一步利用酰胺法使用核苷酸型或非核苷酸型的接头仅延伸任意的链长，并用于制造上述式(3)表示的核酸化合物。也可以从与上述式(3)的固相载体键合的核酸化合物中仅切出核酸化合物，进一步进行脱保护，得到上述式(5)表示的核酸分子。以下，对各式中的取代基进行进一步详细说明。
Ba表示的可被保护基保护的核酸碱基及Bc表示的核酸碱基没有特别限定。作为该核酸碱基，可举出腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、和1-甲基假尿嘧啶等。另外，该核酸碱基可以被取代基取代。作为这样的取代基，例如，可举出氟基、氯基、溴基、碘基这样的卤原子、乙酰基这样的酰基、甲基、乙基这样的烷基、苄基这样的芳烷基、甲氧基这样的烷氧基、甲氧基乙基这样的烷氧基烷基、氰基乙基这样的氰烷基、羟基、羟基烷基、酰氧基甲基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、及硝基等、以及上述中的两种以上的取代基的组合。
作为Ba表示的可被保护基保护的核酸碱基的保护基，没有特别限定，可以使用已知的核酸化学中使用的保护基，作为这样的保护基，例如，可举出苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、4-甲基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、及(二甲基氨基)亚甲基等、以及上述中的两种以上的保护基的组合。
更具体而言，Ba表示以下任一者所示的基团。
[化学式11]
(上述式中，
R4表示氢原子、甲基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或苯甲酰基，
R5表示氢原子、乙酰基、异丁酰基或苯甲酰基，
R6表示氢原子、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或异丁酰基，
R7表示2-氰基乙基，
R8表示氢原子、甲基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基或4-甲基苯甲酰基，并且，
R9表示二甲基氨基亚甲基。)。
作为Bc，更具体而言，可举出从上述Ba的具体例中除去保护基的基团。
G1和G5优选为以下的基团。
[化学式12]
(式中，
R1、R2和R3相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基。)
R1、R2和R3优选1个为氢原子、剩余的2个为相同或彼此不同(优选相同)的烷氧基，作为烷氧基，特别优选甲氧基。更优选G5为4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr基)。
作为G2，只要能够作为羟基的保护基发挥功能就可以没有特别限制地使用，可以广泛地使用酰胺化合物中使用的已知的保护基。作为G2，例如，可举出烷基、链烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基(cyclylalkylgroup)、羟基烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、杂环基链烯基、杂环基烷基、杂芳烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、单烷基甲硅烷基、二烷基甲硅烷基或三烷基甲硅烷基、单烷基甲硅烷氧基烷基、二烷基甲硅烷氧基烷基或三烷基甲硅烷氧基烷基等，它们可被1个以上的吸电子基团取代
G2优选为经吸电子基团取代的烷基。作为该吸电子基团，例如，可举出氰基、硝基、烷基磺酰基、卤原子、芳基磺酰基、三卤代甲基、和三烷基氨基等，优选为氰基。
作为G2，特别优选以下的基团。
[化学式13]
上述R1、R2、R3和G2的定义中的烷基可以为直链状或支链状中的任意，优选为碳原子数1～12的烷基，更优选为碳原子数1～6的烷基。作为具体的烷基的例子，例如，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、和己基。构成上述取代基的定义中的烷氧基的烷基部分具有与此处的烷基的定义相同的定义。
另外，本发明的方法中，酰胺化合物可以以游离的状态或盐的状态使用。作为酰胺化合物的盐，可举出碱加成盐或酸加成盐，没有特别限制。作为碱加成盐，具体而言，可举出钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、铝盐等与无机碱形成的盐；与甲胺、乙胺、乙醇胺等有机碱形成的盐；与赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等碱性氨基酸形成的盐；及铵盐。作为酸加成盐，具体而言，可举出与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸等有机酸；及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸形成的酸加成盐。酰胺化合物也包括盐、水合物、溶剂化物、及多晶型等形态。
R优选表示经保护的羟基。R表示经保护的羟基时的保护基、或V所示的羟基的保护基只要能够用于酰胺法即可，例如，2’-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS基)、2’-双(2-乙酰氧基)甲基(ACE基)、2’-(三异丙基甲硅烷氧基)甲基(TOM基)、2’-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE基)、2’-(2-氰基乙氧基)甲基(CEM基)、2’-对甲苯磺酰基乙氧基甲基(TEM基)、2’-EMM基(国际公开第2006/022323号公报)之外，还可以使用国际公开第2013/027843号公报和国际公开第2019/208571号公报中记载的基团。V优选为2’-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS基)。另外，利用本发明的方法制造的核酸分子为核糖核酸(RNA)的情况等核酸分子内包含核糖的情况下，作为该核糖的2’位的羟基的保护基，可示例上述式(6)表示的保护基作为优选的保护基。进一步优选示例具有氰基作为EW所示的吸电子基团的式(12)表示的保护基。
[化学式14]
(式中，
q、Ra和Rb与上述式(6)中的定义相同。)
进一步优选示例出(12)所示的基团中q为1、Ra及Rb同时为氢原子的基团、以及q为1、Ra或Rb中的任一者为甲基、另一者为氢原子的基团。
式(12)表示的保护基例如可按照国际公开第2013/027843号公报和国际公开第2019/208571号公报的记载来合成，可以将具有该保护基的酰胺化合物用于核酸化合物的制造。
核酸的延伸反应可使用图1的路线A中记载的式(13)的酰胺化合物。
作为非核苷酸接头，可示例包含氨基酸骨架的接头(例如，日本专利第5157168号公报或日本专利第5554881号公报中记载的包含氨基酸骨架的接头)。具体而言，作为非限定性例子，例如，可示例式(A14-1)或(A14-2)或(A14-3)(例如，记载于国际公开第2019/074110号公报)表示的接头。这些接头之外，还可示例国际公开第2012/005368号公报、国际公开第2018/182008号公报或国际公开第2019/074110号公报中记载的接头。
[化学式15]
(式中，Y与前述相同。)
式(13)中的R基和式(5)中的R’基为羟基以外的取代基的核苷酸和酰胺也可以由利用日本专利第3745226号公报等中记载的已知的方法、国际公开第2001/053528号公报或日本特开2014-221817号公报和这些文献中引用的已知的方法而合成的核苷进行制造，此外，能够使用可作为市售品购入的物质，依照后述的实施例中记载的方法或利用对这些方法加以适当变更的方法进行制造。
G4表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子。作为碱金属离子，例如，可举出钠离子、和锂离子。另外，作为烷基铵离子，作为具体的烷基的例子，例如，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、和己基，更具体而言，例如，可举出二乙基铵离子、三乙基铵离子、四丁基铵离子、己基铵离子、和二丁基铵离子等。另外，作为羟基烷基铵离子，作为具体的羟基烷基部分的例子，例如，可举出羟基甲基、羟基乙基、羟基正丙基、羟基异丙基、羟基正丁基、和三羟基甲基，作为更具体的羟基烷基铵离子的例子，可举出三羟基甲基铵离子等。G4优选表示氢原子。
G5表示氢原子、或上述羟基的保护基，表示保护基的情况下，G1也表示相同的保护基。G5在经脱保护的情况下为氢原子，此时的核苷酸化合物也被供于一系列的核酸延伸反应的工序。
Y优选为氧原子。
就W1和X1而言，优选W1表示OZ基、并且X1表示R基。
就W2和X2而言，优选W2表示羟基、并且X2表示R基。
W3和X3优选分别各自独立地表示羟基。
R’优选为羟基。
对于基于上述工序(1)至(5)的酰胺法的核酸化合物的合成而言，图1的路线中的工序(1)或工序(5)中的、本发明涉及的脱保护工序以外，可以按照通常已知的方法(例如，上述的日本专利第5157168号公报或日本专利第5554881号公报中记载的方法)进行核酸延伸反应。以下，对各工序进行说明。
(核酸延伸反应)
本说明书中，所谓“核酸延伸反应”，是指介由磷酸二酯键使核苷酸依次键合，由此使寡核苷酸延伸的反应。核酸延伸反应可以依照通常的亚磷酰胺法的步骤进行。核酸延伸反应也可以使用采用亚磷酰胺法的核酸自动合成装置等来进行。
核酸分子的链长例如可以为20mer以上(即，n≥19)、40mer以上(即，n≥39)、50mer以上(即，n≥49)、60mer以上(即，n≥59)、80mer以上(即，n≥79)、100mer以上(即，n≥99)、2～200mer(即，1≤n≤199)、10～150mer(即，9≤n≤149)、15～110mer(即，14≤n≤109)。
工序(1)的脱保护工序是对担载于固相载体上的寡核苷酸链末端的5’羟基的保护基进行脱保护的工序。作为通常的保护基，可使用4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr基)、4-单甲氧基三苯甲基、4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基。脱保护可以使用酸来进行。作为脱保护用的酸，例如，可举出三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸、和对甲苯磺酸等。
工序(2)的缩合工序是使图1的路线A中记载的下述式(13)所示的核苷亚磷酰胺与通过上述脱保护工序进行了脱保护的寡核苷酸链末端的5’羟基键合的反应。需要说明的是，作为核酸延伸中使用的亚磷酰胺，可示例式(13)、日本专利第5554881号公报的实施例2中记载的尿苷EMM酰胺、实施例3中记载的胞苷EMM酰胺、实施例4中记载的腺苷EMM酰胺、和实施例5中记载的鸟苷EMM酰胺、国际公开第2019/208571号记载的尿苷PMM酰胺、胞苷PMM酰胺、腺苷PMM酰胺、和鸟苷PMM酰胺。另外，作为其他可使用的亚磷酰胺，可举出2’-OMe、2’-F、2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-双(2-乙酰氧基)甲基(ACE基)、2’-(三异丙基甲硅烷氧基)甲基(TOM基)、2’-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE基)、2’-(2-氰基乙氧基)甲基(CEM基)、2’-对甲苯磺酰基乙氧基甲基(TEM基)、2’-H、和2’-氟-2’-脱氧-β-D-阿拉伯呋喃糖基等。作为上述核苷亚磷酰胺，使用5’羟基被保护基(例如DMTr基)保护的核苷亚磷酰胺。缩合工序可以使用将上述核苷亚磷酰胺活化的活化剂或缩合剂来进行。作为活化剂或缩合剂，例如，可举出5-苄硫基-1H-四氮唑(BTT)(也称为5-苄巯基-1H-四氮唑)、1H-四氮唑、4,5-二氰基咪唑(DCI)、5-乙硫基-1H-四氮唑(ETT)、N-甲基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-MeBIT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(BIT)、N-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-PhIMT)、咪唑鎓三氟甲磺酸盐(IMT)、5-硝基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(NBT)、1-羟基苯并三唑(HOBT)或5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1H-四氮唑等。
图1的路线A中记载的式(13)所示的核苷亚磷酰胺(以下称为酰胺)如下所示。
下式表示的化合物，
[化学式16]
(式中，
G1、G2、G3、Ba、和R与前述相同。)。
在缩合工序之后，可以适当对未反应的5’羟基进行加帽。加帽可以使用乙酸酐-四氢呋喃溶液、或苯氧基乙酸酐/N-甲基咪唑溶液等已知的加帽溶液来进行。
工序(3)的氧化工序是将通过上述缩合工序形成的亚磷酸基转化为磷酸基或硫代磷酸基的工序。本工序是使用氧化剂将3价的磷转化为5价的磷的反应，可以通过使氧化剂与担载于固相载体的寡核酸衍生物反应而实施。
在将亚磷酸基转化为磷酸基的情况下，作为“氧化剂”，例如，可以使用碘。该氧化剂可以以成为0.005～2M的浓度的方式制备而使用。作为氧化的氧源，可以使用水，作为使反应进行的碱，可以使用吡啶、N-甲基咪唑(NMI)、N-甲基吗啉、或三乙胺等。另外，作为溶剂，只要不参与反应即可，没有特别限定，可举出乙腈、四氢呋喃(THF)或它们的任意比例的混合溶剂。例如，可以使用碘/水/吡啶/乙腈、或者碘/水/吡啶、或者碘/水/吡啶/NMI、或者碘/水/吡啶/THF。反应温度优选为5℃～50℃。反应时间通常为1分钟～30分钟是适当的。相对于担载于固相载体上的化合物1mol而言，所使用的试剂的量优选为1～100mol，更优选为1～10mol。
将亚磷酸三酯基转化为硫代磷酸三酯基的情况下，作为“氧化剂”，例如，可以使用硫、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、[(N,N-二甲基氨基次甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮([(N,N-dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione，DDTT)、和苯乙酰二硫化物(PADS)。该氧化剂可以以成为0.001～2M的浓度的方式用适当的溶剂稀释后使用。作为反应中使用的溶剂，只要不参与反应即可，没有特别限定，例如，可举出二氯甲烷、乙腈、吡啶或它们的任意比例的混合溶剂。氧化工序可以在上述加帽操作之后进行，反之也可以在氧化工序之后进行加帽操作，其顺序没有限定。
工序(5-1)中，对于在延伸最后导入的核苷酸的5’位的羟基的保护基，可以在从后述的固相载体上切出和保护基的脱保护之后，用于以5’位的羟基的保护基为标签的柱纯化，也可以在柱纯化后对5’位的羟基的保护基进行脱保护。
工序(5-2)中，对磷酸保护基进行脱保护的工序在具有所期望的序列的核酸的合成完成之后，使胺化合物发挥作用以对磷酸部分的保护基进行脱保护。作为胺化合物，例如，可举出日本专利第4705716号公报中记载的二乙胺等。
对于工序(5-2)中的在固相载体上延伸至所期望链长的核酸分子从固相载体的切出而言，通常使用浓氨水作为切出剂来实施。
进一步使用氨或胺化合物等，例如，从固相载体上切断寡核苷酸链并进行回收。作为胺化合物，例如，可举出甲胺、乙胺、异丙胺、乙二胺、或二乙胺等。
工序(5-3)中，工序(5-2)中从固相载体切出的核酸化合物(4)的核糖的2’位或3’位的羟基的保护基可以按照国际公开第2006/022323号公报)、国际公开第2013/027843号公报、或国际公开第2019/208571号公报中记载的方法除去，从而得到经脱保护的核酸分子(5)。
作为使用本发明的制造方法可制造的核酸分子，可举出核酸分子内包含的核苷是RNA、DNA、以及具有2’-O-MOE、2’-O-Me、2’-F的RNA、和LNA的核酸分子，但不限于这些。例如，可举出Xiulong,Shen等著、Nucleic Acids Research,2018,Vol.46,No.46,1584-1600、和Daniel O’Reilly等著、Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2,546-558中记载的各种核苷的例子。由本发明的方法制造的核酸分子优选为RNA。
对于本发明的制造方法中可使用的核酸分子的典型例而言，除了实施例中记载的例子以外，还示出下述的例子，但不限于这些。
以下，序列的说明中，U表示尿苷，C表示胞苷，A表示腺苷，另外G表示鸟苷。
可举出国际公开第2019/060442号公报中记载的、具有下述序列(A)和(B)的核酸分子。
序列(A)：5’-AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT-3’(反义)(序列号1)21mer
序列(B)：5’-GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmd TdT-3’(正义)(序列号2)21mer
序列(A)和(B)中，Um表示2’-O-甲基尿苷，Cm表示2’-O-甲基胞苷，另外dT表示胸苷。
可举出Daniel O’Reilly等著、Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2,546-558中记载的核酸分子(参见553页)。作为典型例，可举出具有下述序列(C)的核酸分子。
序列(C)：5’-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUA UGCUGU-3’(序列号3)36mer
可举出日本专利第4965745号公报中记载的核酸分子。作为典型例，可举出具有下述序列(D)的核酸分子。
序列(D)：5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUG UUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’(序列号4、5)49mer
序列(D)中，“P”由在以下的式(A5)中使用波浪线划分的局部结构表示。
需要说明的是，序列表中的序列号4的记载表示从序列(D)的5’末端至“P”之前为止的下述序列(D1)的碱基序列，序列号5的记载表示从序列(D)的“P”之后至3’末端为止的下述序列(D2)的碱基序列。
序列(D1)：5’-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3’(序列号4)23mer
序列(D2)：5’-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3’(序列号5)25mer
可举出Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2:547中记载的、具有下述序列(E)的核酸分子。
序列(E)：5’-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUC CGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’(序列号6)67mer
可举出日本特表2015-523856号公报第173页中记载的具有下述序列(F)的核酸分子。
序列(F)：5’-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3’(序列号7)94mer
可举出日本特表2017-537626号公报中记载的核酸分子。作为典型例，可举出具有下述的序列(G)、(H)、(K)、和(J)的核酸分子。
序列(G)：5’-AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3’(序列号8)100mer
序列(H)：5’-GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’(序列号9)113mer
序列(K)：5’-dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3’(序列号10)113mer
序列(K)中，dT表示胸苷，dC表示2’-脱氧胞苷，dA表示2’-脱氧腺苷，另外dG表示2’-脱氧鸟苷。
序列(J)：5’-AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU-3’(序列号11)113mer
序列(J)中，Um表示2’-O-甲基尿苷，Am表示2’-O-甲基腺苷，Gm表示2’-O-甲基鸟苷，另外s表示硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰。
实施例
以下，利用实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不限于这些例子。
＜测定方法＞
首先，以下示出以下的试验中使用的各种测定方法。
寡核苷酸纯度使用HPLC来测定。
HPLC测定条件示于下述表1。
(测定方法1：寡核苷酸纯度的测定)
[表1]
表1
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(测定方法2：寡核苷酸收量的测定)
测定粗产物的OD260。所谓OD260，表示1mL溶液(pH＝7.5)中的每10mm光程的UV260nm的吸光度。通常已知RNA为1OD＝40μg，因此基于上述OD260的测定值算出收量。
(测定方法3：甲醛浓度的测定)
二氯乙酸溶液中的甲醛浓度测定方法有高效液相色谱法。高效液相色谱法中，使甲醛与乙酰丙酮反应，测定所得到的3,5-二乙酰基-1,4-二氢二甲基吡啶的量，算出甲醛的浓度。
HPLC测定条件示于下述表2。
[表2]
表2
(测定方法4：二氯乙酸酐浓度的测定)
二氯乙酸溶液中的二氯乙酸酐浓度测定方法有高效液相色谱法。在高效液相色谱法中，使二氯乙酸酐与苄胺反应，测定所得到的N-苄基-2,2-二氯乙酰胺的量，算出二氯乙酸酐的浓度。HPLC测定条件示于下述表3。
[表3]
表3
＜二氯乙酸溶液的制备＞
以下的实施例4至6中使用的二氯乙酸溶液是将二氯乙酸与甲醛的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)为16×10-4、并且二氯乙酸酐与二氯乙酸的摩尔比为25×10-5的市售的二氯乙酸分别如实施例1至3中记载的进行处理、并向得到的二氯乙酸中添加甲苯来制备的。所制备的二氯乙酸的甲苯溶液中的二氯乙酸与甲醛的摩尔比(甲醛mol/二氯乙酸mol)以及二氯乙酸酐与二氯乙酸的摩尔比如表5所示。二氯乙酸的摩尔数以称取试剂的量为基准进行计算。需要说明的是，通过GC-MS确认了不含三氯乙醛。另外，其它市售的二氯乙酸中，将甲醛、二氯乙酸酐的摩尔比作为参考示于下表。
[表4]
表4
实施例1
向上述的市售的二氯乙酸92.4g中加入甲醇1.17g、甲苯51.2g，于40℃搅拌2小时后，用蒸发仪减压至33hPa将低沸点成分蒸馏除去。向得到的二氯乙酸中加入甲苯，制备3v/v％二氯乙酸溶液。实施例4中使用该溶液。甲醛(mol)/二氯乙酸(mol)、和二氯乙酸酐(mol)/二氯乙酸(mol)示于表5。
比较例1
向上述的市售的二氯乙酸93.1g中加入甲醇1.17g、甲苯1687g，制备3v/v％二氯乙酸溶液，于室温静置。比较例4中使用该溶液。
实施例2
向上述的市售的二氯乙酸92.7g中加入水1.17g、甲苯50.6g，于40℃搅拌2小时后，用蒸发仪减压至33hPa将低沸点成分蒸馏除去。向得到的二氯乙酸中加入甲苯，制备3v/v％二氯乙酸溶液。实施例5中使用该溶液。
比较例2
向上述的市售的二氯乙酸92.5g中加入水1.17g、甲苯1687g，制备3v/v％二氯乙酸溶液，于室温静置。比较例5中使用该溶液。
实施例3
向上述的市售的二氯乙酸92.0g中加入丙胺1.17g、甲苯52.3g，于40℃搅拌2小时后，用蒸发仪减压至33hPa将低沸点成分蒸馏除去。向得到的二氯乙酸中加入甲苯，制备3v/v％二氯乙酸溶液。实施例6中使用该溶液。
比较例3
用120℃的油浴对上述的市售的二氯乙酸217.0g进行加热，以40hPa蒸馏至馏分超过50％，向得到的釜残留物中加入甲苯，制备3v/v％二氯乙酸溶液。比较例6中使用该溶液。
＜寡核苷酸50mer的固相合成＞
序列(I)：
5’-AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCG AGUCGGUGCUUUU-3’(序列号12)
上述序列(I)中，“A”由以下的式(A1)中用波浪线划分的局部结构表示。“C”由以下的式(A2)中用波浪线划分的局部结构表示。“G”由以下的式(A3)中用波浪线划分的局部结构表示。U由以下的式(A4)中用波浪线划分的局部结构表示。需要说明的是，3’末端的“U”由以下的式(A8)中用波浪线划分的局部结构表示。另外，序列(I)中，5’末端的“A”由以下的式(A7)中用波浪线划分的局部结构表示。
[化学式17]
[化学式18]
[化学式19]
[化学式20]
[化学式21]
[化学式22]
[化学式23]
/>
合成使用上述的国际公开第2019/208571号记载的尿苷PMM酰胺、胞苷PMM酰胺、腺苷PMM酰胺、和鸟苷PMM酰胺。
以下的实施例和比较例中记载的尿苷衍生物是指下述的结构式所示的化合物。下述结构式中图示的圆圈示意性地示出了CPG。
[化学式24]
(实施例4)
使用担载了1.0μmol的尿苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和PMM酰胺，利用NTS M-4MX-E(Nihon Techno Service Co.，LTD.制)从3’侧向5’侧自动合成核酸分子。自动合成的步骤中，首先，将实施例1中制备的3％二氯乙酸甲苯溶液送液至CPG，对5’位的三苯甲基保护基进行脱保护。接着，将各种酰胺和作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑送液至CPG，使5’位的羟基进行偶联反应。接着，对包含50mM碘的氧化溶液进行送液，将亚磷酸基转化为磷酸基。接着，作为加帽溶液，使用0.1M苯氧基乙酸酐乙腈溶液和10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液，对未进行偶联的反应点实施加帽。进一步将这些工序合计重复49次后，用3％二氯乙酸甲苯溶液将5’末端的碱基中的保护基(DMTr基)脱保护，从而在CPG载体上合成核酸寡核苷酸。之后，针对担载了1.0μmol量的寡核苷酸的CPG载体，流入28％氨水1.5mL和乙醇0.5mL，将混合物于40℃保温4小时，由此使核酸分子从固相载体游离，然后通过浓缩除去溶剂。接着，将游离寡核苷酸溶解于二甲基亚砜1.5mL中后，加入乙腈1.0mL、硝基甲烷20μL和搅拌子后，在基于搅拌器的搅拌下，于室温流入将利用分子筛4A实施了脱水处理的1M的四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液2.08mL，将混合物于33℃保温4小时，由此进行2’位保护基的脱保护。之后，通过沉淀操作，得到核酸分子的产物。针对得到的产物，使用上述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果纯度为67％。另外，使用上述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为6068μg。结果示于表5。
(比较例4)
在实施例4的实验中，作为3％二氯乙酸甲苯溶液使用比较例1中制备的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到核酸分子。使用上述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为51％。另外，使用上述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为5303μg。结果示于表5。
(实施例5)
在实施例4的实验中，作为3％二氯乙酸甲苯溶液，使用实施例2中制备的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到核酸分子。使用上述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为70％。另外，使用上述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为6034μg。结果示于表5。
(比较例5)
在实施例4的实验中，作为3％二氯乙酸甲苯溶液，使用比较例2中制备的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到核酸分子。使用上述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为37％。另外，使用上述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为4003μg。结果示于表5。
(实施例6)
在实施例4的实验中，作为3％二氯乙酸甲苯溶液使用实施例3中制备的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到核酸分子。使用上述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为65％。另外，使用上述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为6144μg。结果示于表5。
(比较例6)
在实施例4的实验中，作为3％二氯乙酸甲苯溶液使用比较例3中制备的3％二氯乙酸甲苯溶液，除此以外，利用同样的方法得到核酸分子。使用上述测定方法1中记载的方法，测定寡核苷酸的纯度，结果产物的纯度为43％。另外，使用上述测定方法2中记载的方法，测定寡核苷酸的收量，结果收量为4492μg。结果示于表5。
[表5]
表5
A：甲醛(mol)/二氯乙酸(mol)
B：二氯乙酸酐(mol)/二氯乙酸(mol)
根据上述表5的结果，就使用了本发明的二氯乙酸的实施例4～6而言，与使用了比较例4～6的二氯乙酸的情况相比，以高收率且高的纯度得到核酸分子。
产业上的可利用性
本发明提供纯化二氯乙酸的制造方法和使用其的高效的核酸分子的制造方法。另外，可期待按照核酸分子的制造方法制造的核酸分子的收率提高。
[序列表自由文本]
序列表的序列号1～12表示按照本发明的制造方法制造的寡核苷酸的碱基序列。

Claims (29)

1.纯化二氯乙酸的制造方法，其是制造甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-5以下、并且二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为20×10-5以下的纯化二氯乙酸的方法，
使甲醛和二氯乙酸酐中的两者或一者的含量超过所述比率的二氯乙酸、与选自由脂肪族醇、脂肪族胺和水组成的组中的至少一种具有比二氯乙酸低的沸点的化合物接触，在具有比二氯乙酸低的沸点的非质子性的非活性溶剂的共存下，从生成的混合液中蒸馏除去含有所述溶剂的馏分。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中，所述非质子性的非活性溶剂为具有181℃以下的沸点的非质子性的非活性溶剂。
3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述非质子性的非活性溶剂为二氯甲烷、乙腈或芳香族有机溶剂。
4.如权利要求3所述的制造方法，其中，芳香族有机溶剂为甲苯。
5.如权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，脂肪族醇为C1-C6的脂肪族醇。
6.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，所述纯化二氯乙酸中，甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为41×10-5以下。
7.如权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，所述纯化二氯乙酸中，二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为10×10-5以下。
8.如权利要求1～7中任一项所述的制造方法，其中，所述纯化二氯乙酸中，甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-6以下。
9.如权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，所述纯化二氯乙酸中，二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为50×10-6以下。
10.核酸分子的制造方法，其为基于酰胺法的核酸分子的制造方法，包括：
准备甲醛相对于二氯乙酸而言的摩尔比为81×10-5以下、并且二氯乙酸酐相对于二氯乙酸而言的摩尔比为20×10-5以下的纯化二氯乙酸的工序；和
使所述纯化二氯乙酸与5’末端的羟基被保护的核酸分子反应，将所述羟基的保护基除去的工序。
11.如权利要求10所述的制造方法，其中，所述准备工序为权利要求1～9中任一项所述的方法。
12.如权利要求10或11所述的制造方法，其中，5’末端的羟基被保护的核酸分子为式(1)表示的核酸分子，
[化学式1]
式(1)中，
G2表示羟基的保护基，
Ba相同或彼此不同，各自独立地表示可被保护基保护的核酸碱基，
R1、R2和R3相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基，
R相同或彼此不同，各自独立地表示经保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’相同或彼此不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子键合的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子键合的乙叉基，
Y相同或彼此不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，
n表示1～200中的任一整数，
W1表示OZ基，且X1表示R基，或者
W1表示OV基，且X1表示OZ基，
V表示羟基的保护基，
Z为具有由固相载体和连接基团组成的结构的基团；
并且，n为2以上的整数时，式(1)表示的核酸分子可以在各核苷酸之间组入非核苷酸接头；
经脱保护的核酸分子为式(2)表示的核酸分子，
[化学式2]
式(2)中，
G2、Ba、R、Y、X1、W1和n与前述相同，并且，
可以以式(1)中所定义的方式，在核苷酸之间组入非核苷酸接头。
13.式(2’)表示的核酸分子的制造方法，其包括：
权利要求12所述的工序；
进一步从该工序中生成的式(2)表示的核酸分子除去Z表示的基团的工序；以及
除去羟基和核酸碱基的保护基的工序，
[化学式3]
式(2’)中，
Y和n与前述相同，
Bc相同或彼此不同，各自独立地表示核酸碱基，
G4相同或彼此不同，各自独立地表示氢离子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子、或羟基烷基铵离子，
R’相同或彼此不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或OQ’基，
Q’与前述相同，并且，
X3和W3各自独立地表示羟基，或者
X3表示R’基，且W3表示羟基；并且，
可以以式(1)中所定义的方式，在核苷酸之间组入非核苷酸接头。
14.如权利要求10～13中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为包含核糖核酸(RNA)的核酸分子。
15.如权利要求14所述的制造方法，其中，核酸分子为核糖核酸(RNA)，其核糖的2’位的羟基的保护基为式(6)表示的保护基，
式(6)：
[化学式4]
式(6)中，
q表示0～5中的任一整数，
Ra和Rb相同或彼此不同，各自独立地表示甲基、乙基或氢原子，＊标记表示与源自核糖的2’位的羟基的氧原子的键合点，并且，
EW表示吸电子基团。
16.如权利要求15所述的制造方法，其中，Ra或Rb中的任一者为甲基，另一者为氢原子，并且，Ew为氰基。
17.如权利要求10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为40链长以上的寡聚物。
18.如权利要求10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为50链长以上的寡聚物。
19.如权利要求10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为60链长以上的寡聚物。
20.如权利要求10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为80链长以上的寡聚物。
21.如权利要求10～16中任一项所述的制造方法，其中，核酸分子为100链长以上的寡聚物。
22.二氯乙酸试剂中包含的二氯乙酸酐的分析方法，其中，使包含二氯乙酸酐的二氯乙酸试剂与芳基烷基胺反应，将二氯乙酸酐转化为对应的2,2-二氯-N-芳基烷基乙酰胺，利用高效液相色谱法对生成的所述酰胺进行分析。
23.如权利要求22所述的分析方法，其中，芳基烷基胺为式(I)的化合物，
[化学式5]
式(I)中，
R10、R20和R30相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子或烷基，
X10表示氢原子、烷基或烷氧基，
n为1～5中的任一整数；
2,2-二氯-N-芳基烷基乙酰胺为式(II)的酰胺化合物，
[化学式6]
式(II)中，R10、R20、R30、X10和n与前述相同。
24.如权利要求23所述的分析方法，其中，R10、R20和R30相同或彼此不同，各自独立地为氢原子或C1-C6的烷基，X10为氢原子、C1-C6的烷基、或C1-C6的烷氧基。
25.如权利要求22～24中任一项所述的分析方法，其中，相对于1摩尔的二氯乙酸，使用0.01～3.0摩尔的芳基烷基胺。
26.如权利要求22～24中任一项所述的分析方法，其中，相对于1摩尔的二氯乙酸，使用0.05～2.0摩尔的芳基烷基胺。
27.如权利要求22～24中任一项所述的分析方法，其中，相对于1摩尔的二氯乙酸，使用0.08～1.1摩尔的芳基烷基胺。
28.如权利要求22～27中任一项所述的分析方法，其中，芳基烷基胺为苄胺，酰胺化合物为2,2-二氯-N-苄基乙酰胺。
29.如权利要求22～28中任一项所述的分析方法，其中，包含二氯乙酸酐的二氯乙酸试剂与芳基烷基胺的反应以乙腈为溶剂来进行。
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