CN1269844C - 壳聚糖衍生物及其制备方法与在制药中的应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
一种源于天然且可生物降解的N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖(I)及其制备方法，以及其作为毒性小、不会产生溶血反应且对难溶药物具增溶作用的纳米载体，在制备静脉注射药物中的应用；具体用于制备含难溶药物如紫杉醇或环孢素A的聚合物胶束型药物。
Description
技术领域
本发明属于源于天然且可生物降解的壳聚糖衍生物及其制备方法，以及其作为药物载体在制备药物中的应用；具体为两亲性的壳聚糖衍生物及其制备方法，以及作为药物纳米载体，用于制备对难溶药物有增溶作用的聚合物胶束。
背景技术
纳米技术和可生物降解材料均是当前发展药物传输系统的热点研究领域。聚合物胶束研究融合两者的优势，即可生物降解，又可形成药物纳米载体。聚合物胶束与脂质体、微球或微囊相比，聚合物胶束是由亲水的壳和疏水的核组成，既具备形成亲水胶体的药用性能，又适合疏水药物的增溶和包裹。而且，胶束粒径小至纳米级，其具有的由亲水的壳和疏水的核组成特征使其可以达到体内长循环、减少网状内皮细胞的吞噬的目的。聚合物可控制药物释放又可在体内降解(M.Jones，J.Leroux，Eur JPharm Biopharm，1999，48(2)：101-111.)
目前对生物降解聚合物胶束的研究主要集中在合成高分子材料主要是两亲性A-B嵌段、A-B-A嵌段共聚物或接枝共聚物的结构和胶束形成机理。A为亲水性组分，B为疏水性组分。由于可供共聚A、B组分及可生物降解的组分较少，在选择时存在较大困难，故疏水性组分通常局限在聚内酯，如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)(S.A.Hagan，G.A.Coombes，M.C.Garnett，Langmuir.1996，12：2153-2161)或聚氨基酸如聚天冬氨酸、聚谷氨酸等(M.Yokoyama，M，Miyauchi，N.Yamada，J.Control.Rel.1990，11，269-2783)；亲水性组分则多为聚乙二醇(PEG)。然而，聚氨基酸作为疏水段可能导致免疫反应，且肽键很容易被体内的酶断裂，对控制释药速率不是理想的选择。接枝共聚物主要是在亲水性的链如PEG、聚丙烯酸侧引入一些疏水基团(J.Youngchang.Macromolecules.2000，33：321-325)。胶束可通过化学偶联连接药物，而化学偶联法在制备特定官能团聚合物时困难较大，安全性较差。另外，无论嵌段共聚物或接枝共聚物的制备及表征均比较烦琐，生产条件苛刻。
壳聚糖是可生物降解的天然来源的聚合物，具有良好的生物相容性，且来源广泛，价格便宜。对于壳聚糖结构改性的研究虽然很多，但是主要涉及亲水性壳聚糖衍生物方面，例如：O-，N-羧甲基壳聚糖(Marguerite R.，Pham L.D.，Claude G.et al.Int.J.Biol.Macromol.[J]，1992，14：122-128)、N-羧甲基壳聚糖(R.A.A.Muzzarelli，F.Tanfani，M.Emanuelli，et al.Carbohydr.Res.1982，107：199-214)、O-羧甲基壳聚糖(RiccardoA.A.Muzzarelli，Carbohydrate Polymer，1988，8(1)，1-21)、N-磺酸化(K.R.Holme，A.S.Perlin.Carbohydr.Res.1997，302：173-179)、N-季铵化(Zhishen J.，Dongfen S.，Weiliang X.Carbohydr.Res.2001，333：1-6)等等。两亲性壳聚糖衍生物有2-羟基-3-(对壬基苯氧基)丙基-羧甲基壳聚糖(隋卫平，陈国华，高先池等.高等学校化学学报，2001，22(1)，133-135)等，但没有作为药用载体得到应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：用可生物降解的天然来源的壳聚糖作为原料，进行化学结构修饰，使其形成具有两亲性的聚合物分子，即一端含亲水基、另一端含亲脂基并且仍可在体内进行生物降解的聚合物，以适合用于药物、与药物组配或作为药物载体，尤其是作为毒性小、不会产生溶血反应的可静脉注射给药的药物载体。
本发明要解决的技术问题还包括：研究的两亲性质的壳聚糖衍生物，不但要可用于难溶药物的增溶和包裹，控制药物释放，而且可以在水中形成纳米级胶束。由于由亲水的壳和疏水的核组成的纳米胶束，可以延长体内循环、减少网状内皮细胞的吞噬，所以，最终提高治疗效果。
本发明要解决的技术问题还包括：可用作药物载体的两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，以及在制备药物中的应用。具体有可工业化应用的制备方法；如何将研制的两亲性壳聚糖衍生物制备成适合药用的胶束，以及如何将其制备成含有难溶药物的胶束，尤其是毒性小、不会产生溶血反应的含难溶药物的聚合物胶束型药物制剂。因为只有毒性小、不会产生溶血反应，才可以用于静脉注射给药。
为解决上述技术问题，本发明提供技术解决方案如下。
由下述通式表示的N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖：
上述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖，其特征在于：优选n＝7；脱乙酰度为90～100％；N-辛基取代度为35～55％；磺酸基取代度为80～110％；其较好的脱乙酰度为95～98％；N-辛基取代度为45～50％；磺酸基取代度为90～100％。
前述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的制备方法，其特征在于用如下方法制备：
1)取壳聚糖加入甲醇或乙醇中，室温搅拌，加入7～12C的长链烷基醛，反应20～28小时后，加入KBH4水溶液，继续搅拌8～12小时，生成N-长链烷基壳聚糖；
2)取N-长链烷基壳聚糖加入DMF中搅拌8～12小时，再加入氯磺酸DMF液，在8～12℃和N2保护下反应18～28h，制得N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖。
所述的制备方法，其较好的技术特征在于：
1)取壳聚糖加入甲醇中室温搅拌，加入7～12C的长链烷基醛，反应23～25小时后，加入KBH4水溶液，继续搅拌10～11小时，生成N-长链烷基壳聚糖；
2)取N-长链烷基壳聚糖加入DMF中搅拌9～10小时，再加入氯磺酸DMF液，在9～11℃和N2保护下反应20～25h，制得N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖。
前述的制备方法，其特征在于：生成N-长链烷基壳聚糖的反应液用稀盐酸液中和，用甲醇沉淀，过滤，干燥；生成N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的反应液，用NaOH液中和pH至7，过滤，滤液用透析袋(MWCO 10000)透析，冷冻干燥。
所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的胶束制备方法，其特征在于：将N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖与水按重量/体积比，以6～30∶1的比例溶解，其优选比例为9～18∶1。
所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的药物组合物，其中含有治疗有效量的难溶性药物化合物和N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖。
一种含紫杉醇或环孢素A的药物组合物，其特征在于：基本上由治疗有效量的紫杉醇或环孢素A与权利要求1～3之一所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖组成。
一种含紫杉醇或环孢素A的药物组合物的制备方法，其特征在于：将紫杉醇或环孢素A用药学上可接受溶剂溶解后，与权利要求1～3之一所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖胶束混合后，经室温超声处理，制得含治疗有效量紫杉醇的粒径为100～300nm的聚合物胶束。
N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的合成路线图解：
本发明以壳聚糖为原料，m表示其聚合度。在壳聚糖的2-NH2接入疏水长链烷基(链长为7～12C)，在6-OH进行磺酸化(引入亲水基)，制得N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖，元素分析测得其脱乙酰度为90～100％；N-辛基取代度为35～55％；磺酸基取代度为80～110％；较好的乙酰度为95～100％；N-辛基取代度为45～50％；磺酸基取代度为90～100％。
为了获得能够形成聚合物胶束以及能够包裹药物尤其是难溶性药物的聚合物胶束，除了考虑毒性、溶血反应以外，必须筛选合适的能够接入的疏水及亲水性基团。并不是所有只要形成亲水亲脂性的两亲性壳聚糖衍生物都适合作为药物配体或药物载体的，亲水、亲脂都有一个度，且亲水、亲脂基团之间必须有一平衡，这平衡既与基团亲水、亲脂程度有关，亦与其所带电荷有关，还与其体积甚至立体结构有关。
N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的制备方法较详细说明如下：
一、N-长链烷基-壳聚糖的制备
(参见文献：Baba Y，Hirakawa H.Chem Lett 1992，10，1905-1908)
取壳聚糖加入甲醇中室温搅拌，加入8～12C的长链烷基醛，反应20～28小时后，加入KBH4水溶液，继续搅拌8～12小时，即生成N-长链烷基壳聚糖，反应液用稀盐酸液中和，用甲醇沉淀，过滤，滤渣即为N-长链烷基壳聚糖，干燥后，得到浅黄色粉末。
二、N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的制备
(参见文献：Hirano S，Tanaka Y，Hasegawa M，et al.Carbohydr.Res.1985，137，205-215)
取N-长链烷基壳聚糖加入DMF中搅拌8～12小时，再加入氯磺酸DMF液，在8～12℃和N2保护下反应18～28h，制得N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖。反应液用NaOH液中和pH至7，过滤，滤液用透析袋(MWCO 10000)透析，以去除分子量小于10,000的小分子，冷冻干燥，得浅棕色N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖。
三、N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖胶束制备方法
按每ml水中溶解6～30mg的N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的比例，可以每ml水中溶解8～18mg的N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖，亦可以每ml水中溶解9～12mg的N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖，将制得的N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖溶于水中，制备成粒径为100～300nm的N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖胶束。
四、N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖作为载体，制备含难溶药物的药物组合物
N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖胶束形成后，将难溶性药物如紫杉醇、环孢素A用适当溶剂溶解，与N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖胶束混合，经室温超声处理，制得粒径为100～300nm的聚合物胶束。所谓适用溶剂，指药学上使用的能溶解药物的溶剂。
五、N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖作为载体制备的药物组合物，对难溶药物有增溶作用
可使用N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖作为载体的难溶药物有：紫杉醇、环孢素AA、替尼泊甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇，灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素、柔红霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤，尤其是对紫杉醇、环孢素AA、替尼泊甙、羟基喜树碱、喜树碱、长春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇有增溶效果。
N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖胶束对难溶性药物紫杉醇、环孢素A具有较好增溶作用，尤其是N-辛基-O-磺酸基壳聚糖对紫杉醇有明显的增溶效果，当其水溶液浓度为0.56％时，提高紫杉醇的溶解度达1.95～2.01mg/ml。
六、N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖作为载体较原料壳聚糖毒性低，且溶血反应符合静脉注射药用辅料标准
下述对于小鼠静脉注射的急性毒性试验数据表明：：N-辛基-O-磺酸基壳聚糖急性毒性较原料壳聚糖有明显降低。下述溶血实验表明：N-辛基-O-磺酸基壳聚糖在用生理盐水稀释至适当浓度，进行静脉注射给药，不会引起机体的溶血反应。
(一)载体急性毒性
1.配制方法：
载体静脉注射溶液配置：正确称取N-辛基-O-磺酸基壳聚糖650mg，先用20ml生理盐水将其溶解，然后加至26ml，得26ml浓度为25mg/ml的N-辛基-O-磺酸基壳聚糖注射溶液，以25mg/ml的药液作为本次实验的最高浓度，并以1∶0.8的比例依此作递减稀释，配制20，16，12.8和10.24mg/ml共5个浓度的药液，给药体积为0.2ml/10g，单次iv给药。将原料壳聚糖对照(400mg/kg)，同上体积，单次iv给药。
昆明种小白鼠，雌雄各半，18-22g，由东大医学院动物中心提供，合格证为苏动(质)97002。动物数：N-辛基-O-磺酸基壳聚糖静脉给药组，10只/组，5个剂量组。原料壳聚糖对照1个剂量组。
(1).N-辛基-O-磺酸基壳聚糖静脉给药对小鼠的急性毒性：小鼠50只，随机分为5组，10只/组，受试前禁食12小时。根据预试，确定本次实验最高剂量为500mg/kg，并以1∶0.8的剂距依此递减为400，320，256和204.8mg/kg共5个剂量组。
(2).壳聚糖原料对照400mg/kg，1个剂量组。
2.实验结果
(1).N-辛基-O-磺酸基壳聚糖静脉给药对小鼠的急性毒性
较高剂量给药后即进入挣扎、昏迷，窒息而迅速死亡，中、低剂量给药后多有短暂的呼吸抑制，呼吸困难、急促，部分小鼠最终也因肺部的病变死亡。死亡小鼠剖体检查可见肺部不规则得出血性改变，稍晚死亡小鼠除肺部出血性改变外，部分可见肝脏脂肪样变，余未见明显异常。死亡原因可能系主要系肺部出血所致。本品小鼠静脉给药的死亡情况，LD50及95％可信限见表1，表2。
(2).壳聚糖原料对照400mg/kg，在给药后8小时即全部死亡。
3.结论
N-辛基-O-磺酸基壳聚糖小鼠静脉注射的LD50及95％可信限分别为315.69(276.48～360.47)mg/kg。较原料壳聚糖有明显降低。
表1、N-辛基-O-磺酸基壳聚糖小鼠静脉注射的死亡记录
| 受试品剂量mg/kg | 动物数(只) | 每天动物死亡数(只) | |||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14(天) | ||
| 500400320256204.8 | 1010101010 | 44000 | 62210 | 01011 | 00100 | 00110 | 00000 | 00000 | 00000 | 00000 | 00000 | 00000 | 00000 | 00000 | 00000 |
表2、Bliss法计算A多糖小鼠静脉注射的LD50及95％可信限
| 受试品剂量mg/kg | 对数剂量(x) | 动物数(只) | 死亡动物数(只) | 死亡率(％) | 机率单位(Y) | LD50值及95％可信限(mg/kg) |
| 500400320256204.8 | 2.6992.6022.5052.4082.311 | 1010101010 | 107431 | 10070403010 | 6.8655.5134.7504.4863.729 | 315.69(276.48～360.47) |
(二)载体溶血试验
1.试验方法：常规制备2％的兔红细胞悬液适量备用。进行A，B，C三次溶血试验，A，B，C三次试验内容相同，但在A试验中N-辛基-O-磺酸基壳聚糖浓度为10mg/ml，C试验中载体浓度为1mg/ml(稀释用0.9％生理盐水)，实验按表3数据进行。
表3、载体10mg/ml，3mg/ml，1mg/ml三组溶液溶血试验
| 试管编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 2％红细胞混悬液(ml) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 生理盐水(ml) | 2.0 | 2.1 | 2.2 | 2.3 | 2.4 | 2.5 |
| 37℃ | 恒温 | 半小时 | ||||
| 药液(ml) | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 | 0.1 | 0 |
| 37℃ | 恒温 | 4小时 | ||||
| 2000rpm，5min，540nm测定吸收度 | ||||||
2.结果
在N-辛基-O-磺酸基壳聚糖试验中，10mg/ml各管均可发生溶血反应，3mg/ml在第四、五管无明显溶血，1mg/ml各管内无溶血。
表4、载体10mg/ml，3mg/ml，1mg/ml三组溶液溶血试验结果
| 试管编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 载体10mg/ml3mg/ml1mg/ml | 溶血部分溶血未溶血 | 溶血部分溶血未溶血 | 溶血部分溶血未溶血 | 部分溶血未溶血未溶血 | 部分溶血未溶血未溶血 | 未溶血未溶血未溶血 |
3.结论
N-辛基-O-磺酸基壳聚糖在用生理盐水稀释至适当浓度，进行静脉注射给药，不会引起机体的溶血反应。
综上所述，本发明用可生物降解的天然来源的壳聚糖作为原料，进行化学结构修饰，使其形成具有两亲性的聚合物分子，即一端含亲水基、另一端含亲脂基并且仍可在体内进行生物降解的聚合物，适合用于药物、与药物组配或作为药物载体，尤其是作为毒性小、不会产生溶血反应的可静脉注射给药的药物载体。
本发明研究的两亲性质的壳聚糖衍生物，不但要可用于难溶药物的增溶和包裹，控制药物释放，而且可以在水中形成纳米级胶束。由于由亲水的壳和疏水的核组成的纳米胶束，可以延长体内循环、减少网状内皮细胞的吞噬，所以，最终提高治疗效果。
本发明研究了可用作药物载体的两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，以及在制备药物中的应用。本发明的两亲性壳聚糖衍生物，对难溶药物有显著增溶作用。本发明将研制的两亲性壳聚糖衍生物制备成适合药用的胶束，并将其制备成含有难溶药物的胶束，尤其是毒性小、不会产生溶血反应的含难溶药物的聚合物胶束型药物制剂。
具体实施方式
壳聚糖(南通双林生物制品有限公司提供)，脱乙酰度90％以上，粘均分子量60,000。
辛醛：进口试剂，Fluka公司，含量＞98％
癸醛：进口试剂，Fluka公司，含量＞98％
月桂醛：进口试剂，Fluka公司，含量＞98％
硼氢化钾：上海申宇制药原料厂，含量＞99％
氯磺酸：上海亭新化工试剂厂，化学纯
透析袋(MWCO 10000)：美国进口。
其余试剂均为分析纯和化学纯。
仪器：FTIR Nicolet Impact410型红外光谱仪，KBr压片；Bruker(AVACE)AV-300，AV-500核磁共振仪；Element Vario EL III元素分析仪。
实施例1：
1、N-辛基壳聚糖的制备(参见文献：Baba Y，Hirakawa H.Chem Lett 1992，10，1905-1908)
壳聚糖(1.0g)悬浮在50ml甲醇中室温搅拌，加入辛醛(1.02g)，继续反应24小时后，加入KBH4(0.5g)的5ml水溶液，继续搅拌过夜，反应液用2N的盐酸溶液中和，用甲醇沉淀，过滤，滤渣用甲醇和水重复洗涤3次，用真空烘箱于60℃下干燥过夜，得浅黄色粉末N-辛基壳聚糖1.0g。
2、N-辛基-O-磺酸基壳聚糖的制备(参见文献：Hirano S，Tanaka Y，Hasegawa M，et al.Carbohy dr.Res.1985，137，205-215)
N-辛基壳聚糖(1.5g)悬浮在DMF(40ml)中机械搅拌过夜，氯磺酸(20ml)，在0℃，N2保护和搅拌下，慢慢滴加至40ml DMF(N，N-二甲酰胺)中，滴加完毕，继续搅拌1h。然后加入上述的N-辛基壳聚糖的DMF溶液，在10℃和N2保护下反应24h。反应液用20％NaOH中和pH至7，过滤，滤液用透析袋(MWCO 10000)在蒸馏水中透析四天，以去除分子量小于10,000的小分子，冷冻干燥，得浅棕色0.5g N-辛基-O-磺酸基壳聚糖。
FT-IR：2957，2858，1467，1380，800cm-1(长链烷基)，1260，1221 1002cm-1(O＝S＝O)
1H-NMR(D2O)：δ(ppm)：3.0～3.2(m，2H)(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)；1.0～2.2(m，6H)(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)，0.81(tri，3H)(-NH-CH2-(CH2)6-CH3).
13C-NMR(D2O)δ(ppm)：13.5～13.7(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)；21.9～31.4(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)；48.3(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)；55(C2)，61.4(C6)，66.8(C3)，75.4(C5)，76.4(C4)，97(C1)。
元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，N-辛基取代度为的取代度为50％，磺酸基的取代度为100％.[C6H8NO4(SO3H)1.6(H)0.815(C8H17)0.5(C2H3O)0.085·(H2O)1.7]n：Anal：C，31.88；N，3.54；H，5.77.Found：C，32.18；N，3.69；H，5.99。
实施例2
1、N-癸基壳聚糖的制备
用癸醛和壳聚糖反应，制备方法同N-辛基壳聚糖。
2、N-癸基-O-磺酸基壳聚糖的制备
用N-癸基壳聚糖和氯磺酸反应制备，方法同N-辛基-O-磺酸基壳聚糖。
FT-IR：2950，2860，1462，1385，800cm-1(长链烷基)，1260，1221 1002cm-1(O＝S＝O)。
1H-NMR(D2O)：δ(ppm)：3.0～3.3(m，2H)(-NH-CH2-(CH2)8-CH3)；1.0～2.5(m，8H)(-NH-CH2-(CH2)8-CH3)，0.81(tri，3H)(-NH-CH2-(CH2)8-CH3)。
13C-NMR(D2O)δ(ppm)：13.5～13.7(-NH-CH2-(CH2)8-CH3)；22.3～34.2(-NH-CH2-(CH2)8-CH3)；48.0(-NH-CH2-(CH2)8-CH3)；55.3(C2)，62.1(C6)，65.9(C3)，75.7(C5)，77.1(C4)，97.5(C1)。
元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，N-癸基取代度为50％，磺酸基的取代度为100％.[C6H8NO4(SO3H)1.6(H)0.815(C10H21)0.5(C2H3O)0.085]n：Anal：C，36.96；N，3.86；H，5.88.Found：C，37.12；N，3.79；H，6.02。
实施例3
1、N-十二烷基-壳聚糖的制备
用月桂醛和壳聚糖反应，制备方法同N-辛基壳聚糖。
2、N-十二烷基-O-磺酸基壳聚糖的制备
用N-十二烷基壳聚糖和氯磺酸反应制备，方法同N-辛基-O-磺酸基壳聚糖。
FT-IR：2952，2865，1462，1385，810cm-1(长链烷基)，1265，12211005cm-1(O＝S＝O)
1H-NMR(D2O)：δ(ppm)：2.6.0～3.4(m，2H)(-NH-CH2-(CH2)10-CH3)；0.8～3.3(m，6H)(-NH-CH2-(CH2)10-CH3)，0.83(tri，3H)(-NH-CH2-(CH2)10-CH3).
13C-NMR(D2O)δ(ppm)：13.5～13.9(-NH-CH2-(CH2)10-CH3)；22.1～33.5(-NH-CH2-(CH2)10-CH3)；48.7(-NH-CH2-(CH2)10-CH3)；55(C2)，61.8(C6)，67(C3)，75.4(C5)，76.9(C4)and 97(C1)。
元素分析测得脱乙酰化度为91.5％，N-十二烷基的取代度为50％，磺酸基的取代度为100％.[C6H8NO4(SO3H)16(H)0.815(C12H25)0.5(C2H3O)0085]n：Anal：C，38.77；N，3.71；H，6.20.Found：C，38.58；N，3.69；H，6.13。
实施例4
N-辛基-O-磺酸基壳聚糖胶束的制备及胶束粒径的测定(参见文献Sung BL，Teruo O，Kazunori K.J Pharm.Sci.1996，80(1)：85-90)
将N-辛基-O-磺酸基壳聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃搅拌30min，然后室温超声30min后，用Zetasizer 3000HS instrument(Malvern Instruments，Malvem，UK)在633nm，25℃，He-Ne激光测定胶束粒径为100-300nm。
实施例5：
1、包含紫杉醇的N-辛基-O-磺酸基壳聚糖胶束的制备
(1).透析法：
N-辛基-O-磺酸基壳聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃搅拌30min。紫杉醇30mg溶解在1ml乙醇中。然后二者溶液混合，在室温超声30min后，用透析袋(MWCO 10000)在蒸馏水中室温透析过夜，离心(3000rpm)5min，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(2).溶剂挥发法：
N-辛基-O-磺酸基壳聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃搅拌30min，紫杉醇30mg溶解在1ml氯仿中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm)5min，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(3).搅拌法：
N-辛基-O-磺酸基壳聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃搅拌30min后，加入30mg紫杉醇，继续室温搅拌2小时，离心(3000rpm)5min，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、N-辛基-O-磺酸基壳聚糖胶束中紫杉醇含量的测定(参见文献：张景京力、张志荣，罗恒。华西药学杂志，2001，16(2)，96-97)
用HPLC(LC-6A，Shimadzu，Japan)流动相为甲醇∶乙睛∶水＝30∶40∶32(v/v).色谱柱为DiamohsilTM C18(250×4.6mm)，柱子粒径为5μm.流速为1.0ml/min，检测波长为227nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃.注射样品体积为20μl。结果见表5。
实施例6：
1、包含环孢素A的N-辛基-O-磺酸基壳聚糖胶束的制备
(1).透析法
N-辛基-O-磺酸基壳聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃搅拌30min。环孢素A30mg溶解在1ml乙醇中。然后二者溶液混合，在室温超声30min后，用透析袋(MWCO 10000)在蒸馏水中室温透析过夜，离心(3000rpm)5min，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(2).溶剂挥发法
N-辛基-O-磺酸基壳聚糖40mg溶解在7ml水中于50℃搅拌30min，环孢素A30mg溶解在2ml氯仿中。然后在室温搅拌下将二者溶液混合，继续搅拌过夜，使氯仿挥发，离心(3000rpm)5min，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(3).搅拌法：
N-辛基-O-磺酸基壳聚糖40mg溶解在7m1水中于50℃搅拌30min后，加入30mg环孢素A，继续室温搅拌2小时，离心(3000rpm)5min，用0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、N-辛基-O-磺酸基壳聚糖胶束中环孢素A含量的测定[参见文献：吴涛，郭健新，平其能等。药学学报，2001，36(5)，381-385]
用HPLC(LC-6A，Shimadzu，Japan)流动相为甲醇∶乙醚∶水∶磷酸＝350∶10∶140∶1(v/v).色谱柱为Spherisorb C8(150×4.6mm)，柱子粒径为5μm.流速为1.2ml/min，检测波长为210nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱温为70℃.注射样品体积为20μl.。结果见表5。
表5不同胶束溶液中药物含量
| 载体浓度(g/100ml) | 紫杉醇(μg/ml) | 环孢素A(μg/ml) | ||||
| 透析法 | 挥发法 | 搅拌法 | 透析法 | 挥发法 | 搅拌法 | |
| 0.5680.5540.2520.063 | 201019501540120 | 556503321230 | 3423118 | 57554716 | 2623145 | 9741 |
Claims (10)
1、由下述通式表示的N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖：
2、根据权利要求1所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖，其特征在于：n＝7；脱乙酰度为90～100％；N-辛基取代度为35～55％；磺酸基取代度为80～110％。
3、根据权利要求2所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖，其特征在于：脱乙酰度为95～98％；N-辛基取代度为45～50％；磺酸基取代度为90～100％。
4、权利要求1所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的制备方法，其特征在于用如下方法制备：
1)取壳聚糖加入甲醇或乙醇中，室温搅拌，加入7～12C的长链烷基醛，反应20～28小时后，加入KBH4水溶液，继续搅拌8～12小时，生成N-长链烷基壳聚糖；
2)取N-长链烷基壳聚糖加入DMF中搅拌8～12小时，再加入氯磺酸DMF液，在8～12℃和N2保护下反应18～28h，制得N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖。
5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
1)取壳聚糖加入甲醇中室温搅拌，加入7～12C的长链烷基醛，反应23～25小时后，加入KBH4水溶液，继续搅拌10～11小时，生成N-长链烷基壳聚糖；
2)取N-长链烷基壳聚糖加入DMF中搅拌9～10小时，再加入氯磺酸DMF液，在9～11℃和N2保护下反应20～25h，制得N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖。
6、根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：生成N-长链烷基壳聚糖的反应液用稀盐酸液中和，用甲醇沉淀，过滤，干燥；生成N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的反应液，用NaOH液中和pH至7，过滤，滤液用透析袋MWCO 10000透析，冷冻干燥。
7、权利要求1所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的胶束制备方法，其特征在于：将N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖与水按重量/体积比，以6～30∶1的比例溶解，其比例为9～18∶1。
8、含权利要求1～3之一所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖的药物组合物，其中含有治疗有效量的难溶性药物化合物和N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖。
9、一种含紫杉醇或环孢素A的药物组合物，其特征在于：基本上由治疗有效量的紫杉醇或环孢素A与权利要求1～3之一所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖组成。
10、一种含紫杉醇或环孢素A的药物组合物的制备方法，其特征在于：将紫杉醇或环孢素A用药学上可接受溶剂溶解后，与权利要求1～3之一所述N-长链烷基-O-磺酸基壳聚糖胶束混合后，经室温超声处理，制得含治疗有效量紫杉醇的粒径为100～300nm的聚合物胶束。
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