CN108102116A - 蛇床子素壳聚糖衍生物胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蛇床子素壳聚糖衍生物胶束及其制备方法和应用，所述胶束以具有两亲性的壳聚糖衍生物为载体，包封蛇床子素，包封率为55％～85％。本发明所述方法采用干燥的DMF，减少氯磺酸的用量，缩短磺酰化反应时间，省略抽滤步骤，整个制备过程时长较现有技术缩短一半；本发明所述胶束的产量提高，且包封率提高到55％～85％；本发明所述胶束兼具促进骨形成和抑制骨吸收的作用，水溶性好，性状稳定，为后续骨质疏松药物的疗效及机制研究提供可靠来源。

Description

蛇床子素壳聚糖衍生物胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及骨质疏松药物的制备，具体为蛇床子素壳聚糖衍生物胶束及其制备方法和应用。
背景技术
随着老龄化社会的到来，骨质疏松症已成为危害老龄人口健康的第四大因素。作为一种系统性骨病，骨质疏松的临床表现主要为骨量下降、骨微结构退化、骨脆性增加等。可引起全身关节酸痛，腰背疼痛甚至骨折，大大降低了患者的生活质量，同时也给家庭、社会带来巨大压力。如何预防和延迟骨质疏松的发生已经成为当下重要的健康课题。骨质疏松的发生在病理上与成骨细胞和破骨细胞功能的失衡有着密切的关系。
现代药理学研究证实蛇床子的主要有效成分蛇床子素(Osthol，OST)具有抗骨质疏松效应。然而，蛇床子素水溶性差不利于吸收，并且由于骨组织血流量低、渗透性差，药物难以顺利到达骨基质。因此，蛇床子素治疗指数较低，对非骨组织也可能产生毒副作用，从而在骨质疏松症防治的临床转化应用受到限制。
因此，选择来源于动物壳类的壳聚糖，并将其修饰作为蛇床子素的载体能有效地辅助蛇床子素作为抗骨质疏松新药开发的临床转化，本发明建立的一种兼具促进骨形成和抑制骨吸收的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束可有效解决蛇床子素水溶性差的问题，能够为蛇床子素在骨质疏松症防治中的临床转化应用提供研究基础，为进一步探索骨代谢疾病创造条件。
现有技术中公开了蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的部分制备方法，但存在DMF除水不彻底、磺酰化反应时间过长、调节pH值后抽滤导致产物随水流出损失等问题。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，优化制备方法，缩短反应时间，提高产量和包封率，本发明提供了蛇床子素壳聚糖衍生物胶束及其制备方法和应用。
技术方案：蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的制备方法，所述方法包括以下步骤：
第1步、合成壳聚糖衍生物：N-辛基-O-磺酰基壳聚糖(NOSC)
a、壳聚糖甲醇溶液依次与辛醛、硼氢化钾反应制备N-辛基壳聚糖，热甲醇洗涤；
b、步骤a中制备的N-辛基壳聚糖加入二甲基甲酰胺(DMF)中形成悬浮液，氯磺酸(ClSO3H)与二甲基甲酰胺形成复合物，二者在N2氛围下反应，中和pH值后透析，冷冻干燥法合成壳聚糖衍生物：N-辛基-O-磺酰基壳聚糖；
第2步、透析法制备蛇床子素壳聚糖衍生物胶束
c、第1步制备的N-辛基-O-磺酰基壳聚糖溶解在弱酸性水中，超声使其分散均匀，在磁力搅拌的条件下逐滴加入蛇床子素乙醇溶液，持续搅拌；
d、将步骤c得到的溶液转移到透析袋中，在磁力搅拌条件下透析，制备蛇床子素壳聚糖衍生物胶束。
化学反应如下：
优选的，步骤a中壳聚糖甲醇溶液浓度为3％～5％，辛醛与壳聚糖甲醇溶液体积比为4～5:50，硼氢化钾溶液浓度为8％～10％。
优选的，步骤b中二甲基甲酰胺为无水，且氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为1:4～1:2，磺酰化反应温度为60～80℃，时间为4～6h，N-辛基取代度为50％～80％，磺酰基取代度为150％～160％，磺酰基/辛基为2～3。
优选的，步骤c中弱酸性水的水的pH为5.5～6.5，超声时间为1～2分钟，蛇床子素与N-辛基-O-磺酰基壳聚糖的比例为1～2:10。
优选的，步骤d中透析时长为6～12h。
以上任一所述方法制备获得的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束。
优选的，所述胶束以具有两亲性的壳聚糖衍生物为载体，包封蛇床子素，包封率为55％～85％。
以上所述蛇床子素壳聚糖衍生物胶束在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
有益效果：(1)本发明所述方法采用干燥的DMF，减少氯磺酸的用量，缩短磺酰化反应时间，省略抽滤步骤，整个制备过程时长较现有技术缩短一半；(2)本发明所述胶束的产量提高，且包封率提高到55％～85％；(3)本发明所述胶束兼具促进骨形成和抑制骨吸收的作用，水溶性好，性状稳定，为后续骨质疏松药物的疗效及机制研究提供可靠来源。
附图说明
图1是NOSC的红外图谱，其中a为壳聚糖的红外图谱，b为NOSC的红外图谱；
图2是NOSC的NMR分析图谱，其中图2A为NOSC的1H NMR图谱，图2B为NOSC的13C NMR图谱，a为壳聚糖的NMR图谱，b为NOSC的NMR图谱；
图3是NOSC的X-衍射图谱，其中a为壳聚糖的X-衍射图谱，b为NOSC的X-衍射图谱；
图4是NOSC的热重分析图谱(TG)，其中a为壳聚糖的TG图谱，b为NOSC的TG图谱；
图5是透析法制备的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束示意图；
图6是蛇床子素壳聚糖衍生物胶束载药比/包封率图；
图7是蛇床子素壳聚糖衍生物胶束对成骨细胞增殖的作用图，其中*表示与对照组相比P<0.05，#表示与β-雌二醇组相比P<0.05；
图8是蛇床子素壳聚糖衍生物胶束对成骨细胞碱性磷酸酶活力的影响图，其中*表示P<0.05；
图9是破骨细胞在蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的作用下对破骨细胞形成的影响图，其中图9A为48h后破骨细胞形成影响图，图9B为96h后破骨细胞形成影响图，*表示P<0.05，**表示P<0.01；
图10是破骨细胞在蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的作用下对骨吸收陷窝面积的影响图，其中，图10A为48h相对骨吸收陷窝面积影响图，图10B为96h相对骨吸收陷窝面积影响图，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1制备蛇床子素壳聚糖衍生物胶束
a、N-辛基-O-磺酰基壳聚糖(NOSC)的合成
(1)还原亚胺反应
3g壳聚糖悬浮在100mL甲醇中，加入8.4mL辛醛，30℃搅拌24h，用硼氢化钾水溶液(1.5g KBH4/15mL H2O)还原亚胺，持续反应24h，过滤沉淀。反复用热甲醇洗涤，得到3.6g还原产物。
(2)上载磺酰基
3g N-辛基壳聚糖悬浮在80mL N,N二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌过夜。将20mL氯磺酸(ClSO3H)在N2氛围下，缓慢滴加入80mL干燥DMF中，机械搅拌，冰浴。1h滴加完毕。将壳聚糖的DMF悬浮液倾进ClSO3H与DMF的复合物中。搅拌使溶，继续通N2于70℃反应6h，停止搅拌，用NaOH溶液中和至pH＝7，在去离子水中透析3天后，冷冻干燥，得到0.6g NOSC。
b、N-辛基-O-磺酰基壳聚糖(NOSC)的结构鉴定
称取适量NOSC分别进行元素分析、红外分析、NMR分析、X-衍射分析和生物热重分析。结果如下：
(1)元素分析：[C6H9NO4(SO3H)1.6(H)0.815(C8H17)0.5(C2H3O)0.085·(H2O)1.7]n测试值：C：31.88；N：3.54；H：5.77。计算值：C：32.18；N：3.69；H：5.99。由上述反应方法制得的NOSC的取代度由元素分析获得，N-辛基取代度为50％，磺酰基取代度为160％。磺酰基/辛基为3.2。
(2)红外分析：结果如图1。2957,2858,1467,1380,800cm-1归属为辛基长链，1260,1221和1002cm-1为O＝S＝O基团的振动峰，1590cm-1的–NH2振动峰消失。表明磺酰化衍生物中具有辛基长链及磺酰化基团，C2-NH2被取代。
(3)NMR分析：结果如图2。与壳聚糖(F3CCOOD/D2O)相比，NOSC的1H NMR(D2O)谱则显示δ3.0～3.2(m,2H)它是烷基长链中与氨基相连的亚甲基即(-NH-CH2-(CH2)6-CH3)，另六个亚甲基化学位移在δ1.0～2.2(m,6H)。δ0.81归属为其甲基中的氢。而NOSC与壳聚糖13C NMR谱相比，在壳聚糖的13C NMR(F3CCOOD/D2O)中有δ55.6、60、70、75、76.5和97.5分别归属为C2、C6、C3、C5、C4、C1峰。NOSC碳谱(D2O)中的13.5，13.7归属为烷基链中的甲基，与氨基相邻的亚甲基的化学位移为δ48.3，其余的六个亚甲基峰则在δ21.9～31.4。化学位移δ55、61.4、66.8、75.4、76.4和97分别归属为壳聚糖主链上的六个碳原子C2、C6、C3、C5、C4和C1。
(4)X-衍射分析：结果如图3。壳聚糖有三个衍射角分别为2θ＝11°,2θ＝20°,2θ＝22°，其中2θ＝11°是壳聚糖的结晶形式I，较强的2θ＝20°是其结晶形式II。而NOSC只有2θ＝20°一个宽峰。结果显示壳聚糖经过衍生化其形成氢键的能力大大降低，NOSC变为无定形。
(5)生物热重分析：结果如图4。在壳聚糖的TG图中，140到200℃为一些小分子的降解，从200到310℃质量损失较多，这是由于一些大分子的降解。而在NOSC的TG图中，此衍生物质量损失较快，在170到230℃就降解完。这是由于在实验的后处理中通过透析已去除一部分小分子化合物。
c、透析法制备蛇床子素壳聚糖衍生物胶束
定量称取NOSC溶解在pH＝6的水中，超声1～2分钟，使其分散均匀。在磁力搅拌的条件下，逐滴加入蛇床子素的乙醇溶液后，持续搅拌30s，将液体转移到透析袋中。磁力搅拌条件下透析6h左右，得到蛇床子素壳聚糖衍生物胶束，如图5。计算蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的包封率，筛选药载比。结果如图6，包封率随载药比升高而下降，载药比1/10时包封率最高，为85％以上，载药比升至2/10时明显下降至30％，因此优化筛选1/10的载药比为胶束制备处方。
实施例2蛇床子素壳聚糖衍生物胶束对成骨细胞增殖和分化的促进能力
a、实验分组
取实施例1中的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束，新生大鼠颅顶成骨细胞随机分为4组：对照组、β-雌二醇组、蛇床子素组、蛇床子素壳聚糖衍生物胶束(NOSC-OST)组。β-雌二醇组中β-雌二醇浓度为10-8M，蛇床子素组中蛇床子素浓度为10-5M、NOSC-OST组中蛇床子素浓度为10-5M。
b、CCK-8细胞增殖实验
将第二代细胞消化后用低糖DMEM培养基重悬细胞，按每孔2000个接种于96孔板上，第二天更换为各组完全培养基培养。培养1～4天后将培养基更换为100μL低糖DMEM培养基，每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育2h，用酶标仪检测并记录450nm处吸光度值，按上述方法再次检测2d、3d及4d的吸光度值。
结果如图7：给药后1d，与对照组比较，各组相对增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。给药后2d，与对照组相比蛇床子素组成骨细胞增殖受到抑制(*P<0.05)，与β-雌二醇组相比，蛇床子素组抑制增殖效果更强(#P<0.05)。给药后3d，与对照组相比，各组成骨细胞增殖均受到抑制(*P<0.05)，与β-雌二醇组相比，蛇床子素组和NOSC-OST组抑制增殖效果更强(#P<0.05)。给药后4d，各组成骨细胞相对增殖率均低于对照组(*P<0.05)，并且蛇床子素组相对增殖率较β-雌二醇组更低(#P<0.05)，表明蛇床子素壳聚糖衍生物胶束能有效抑制成骨细胞增殖。
c、碱性磷酸酶染色
各组条件培养基培养7天后，弃培养基，PBS润洗，95％乙醇固定10min，弃乙醇，双蒸水润洗，将萘酚AS-MX磷酸盐1mg、固蓝BB盐6mg溶于50μL N，N-二甲基甲酰胺中，并用0.2M的Tris-HCl缓冲液(PH＝8.5)稀释至10mL制成染液，加入固定后的细胞中，摇床上避光孵育1h，弃染液，双蒸水润洗，甩干后摄片。
结果显示如图8，NOSC-OST组成骨细胞碱性磷酸酶活力增强(*P<0.05)，但是蛇床子素组成骨细胞碱性磷酸酶活力低于β-雌二醇组和NOSC-OST组(P<0.05)。β-雌二醇组成骨细胞碱性磷酸酶活力虽然较对照组高，但是差异无统计学意义(P>0.05)，表明蛇床子素壳聚糖衍生物能有效促进成骨细胞合成碱性磷酸酶。
实施例3蛇床子素壳聚糖衍生物胶束对破骨细胞形成和凋亡的促进能力
a、实验分组
大鼠骨髓单核细胞分为对照组、β-雌二醇组、蛇床子素组、NOSC-OST组共4组，采用用含25ng/mL的M-CSF、100ng/mL的RANKL的培养基使其诱导成为破骨细胞。
b、TRAP阳性细胞计数
各组细胞诱导48～96h后，按照TRAP染色试剂盒说明进行染色。倒置显微镜下观察，计算TRAP阳性多核细胞数(100倍下随机选取5个视野，计数细胞核≥3，重复三次)。结果如图9，培养48h后，蛇床子素组、NOSC-OST组破骨细胞数量低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。96h时，β-雌二醇组、蛇床子素组、NOSC-OST组破骨细胞数均低于空白对照组(P＜0.05或P＜0.01)，表明β-雌二醇、蛇床子素与NOSC-OST均能降低破骨细胞的数量，其中10-5mol/L蛇床子素与10-5mol/L NOSC-OST作用较为明显，但两组间差异不明显。c、骨吸收陷窝面积分析
各组细胞接种于牛骨片上，诱导48～96h后，2.5％的戊二醛固定5min，氨水超声清洗3min，自然晾干，1％的甲苯胺蓝染色3min，蒸馏水清洗后显微镜下观察分析(100倍下随机选取5个视野，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行骨吸收陷窝的面积分析)。结果如图10，破骨细胞在骨片上形成骨吸收陷窝，经甲苯胺蓝染色后呈蓝色，骨吸收陷窝呈圆形、椭圆形或不规则形。培养48h时，β-雌二醇组、蛇床子素组、NOSC-OST组骨陷窝面积低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；培养96h后，β-雌二醇组、蛇床子素组、NOSC-OST组骨陷窝面积均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，而β-雌二醇组、蛇床子素组、NOSC-OST组三组间差异无统计学意义(P＞0.05)。
综上所述，通过实施例1所述方法制备的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束具有水溶性好、性状稳定的优点，载药比1:10时蛇床子素包封率最优。通过实施例2、3验证了实施例1制备的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束兼具促进骨形成和抑制骨吸收的作用，能够为骨质疏松疗效及机制的基础研究提供可靠的药物来源。

Claims (8)

1.蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
第1步、合成壳聚糖衍生物：N-辛基-O-磺酰基壳聚糖
a、壳聚糖甲醇溶液依次与辛醛、硼氢化钾反应制备N-辛基壳聚糖，热甲醇洗涤；
b、步骤a中制备的N-辛基壳聚糖加入二甲基甲酰胺中形成悬浮液，氯磺酸与二甲基甲酰胺形成复合物，二者在N2氛围下反应，中和pH值后透析，冷冻干燥法合成壳聚糖衍生物：N-辛基-O-磺酰基壳聚糖；
第2步、透析法制备蛇床子素壳聚糖衍生物胶束
c、第1步制备的N-辛基-O-磺酰基壳聚糖溶解在弱酸性水中，超声使其分散均匀，在磁力搅拌的条件下逐滴加入蛇床子素乙醇溶液，持续搅拌；
d、将步骤c得到的溶液转移到透析袋中，在磁力搅拌条件下透析，制备蛇床子素壳聚糖衍生物胶束。
2.根据权利要求1所述的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的制备方法，其特征在于，步骤a中壳聚糖甲醇溶液浓度为3％～5％，辛醛与壳聚糖甲醇溶液体积比为4～5:50，硼氢化钾溶液浓度为8％～10％。
3.根据权利要求1所述的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的制备方法，其特征在于，步骤b中二甲基甲酰胺为无水，且氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为1:4～1:2，磺酰化反应温度为60～80℃，时间为4～6h，N-辛基取代度为50％～80％，磺酰基取代度为150％～160％，磺酰基/辛基为2～3。
4.根据权利要求1所述的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的制备方法，其特征在于，步骤c中弱酸性水的水的pH为5.5～6.5，超声时间为1～2分钟，蛇床子素与N-辛基-O-磺酰基壳聚糖的比例为1～2:10。
5.根据权利要求1所述的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束的制备方法，其特征在于，步骤d中透析时长为6～12h。
6.权利要求1～5任一所述方法制备获得的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束。
7.根据权利要求6所述的蛇床子素壳聚糖衍生物胶束，其特征在于，所述胶束以具有两亲性的壳聚糖衍生物为载体，包封蛇床子素，包封率为55％～85％。
8.权利要求6所述蛇床子素壳聚糖衍生物胶束在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
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