CN109706203A - 一种高产率透明质酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于透明质酸制备技术领域，公开了一种高产率透明质酸的制备方法，包括以下步骤：步骤1）制备种子液，步骤2）发酵、醇沉，步骤3）离心，步骤4）板框过滤，步骤5）离心、干燥。本发明对透明质酸发酵条件进行了改进，提高了效率效率，收率和纯度也有所提高。

Description

一种高产率透明质酸的制备方法

技术领域

本发明属于透明质酸制备技术领域，具体涉及一种高产率透明质酸的制备方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid,HA)化学名称为糖醛(玻璃)酸,它是以D- 葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖单体为结构单元,通过β-1,4糖苷键反复交替连接而形成的链状高分子酸性粘多糖。HA通常溶于水,不溶于醇、酮、乙醚等有机溶剂,具有保湿、抗衰老、润滑等功能,广泛用于日化、保健食品、医药等领域；如在医药领域,HA在药物中可作为药物载体，可将各类药物靶向送至病理部位,具有促进骨折愈合及一定抗癌作用等功效。

透明质酸是一种性能优良的生化物质,应用极其广泛。其生产方法由最初的提取法发展到了微生物发酵法。这几十年来，发酵法生产透明质酸得到了迅速的发展，是现今透明质酸生产最主要的方法。目前，已经有一些研究对发酵法进行了改进，包括混合发酵技术、控制营养组分和发酵条件以提高透明质酸代谢产物的含量；申请人之前的专利技术“CN105368912A，一种喷雾逆流法提取透明质酸钠的方法”采用两菌株混合发酵，大大提高了发酵效率，但是该方法对培养条件要求较高，可能导致不能形成优势菌株，而且产生的透明质酸包括小、中、大三种分子量的透明质酸，不能形成纯度较高的单一产品，降低了产品附加值。

申请人之前的专利技术“一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法”，在发酵制备透明质酸的方法中，对多种因素进行优化和改进，包括添加甘油，能够对细胞膜空隙产生影响，从而会对糖链分泌的正向作用；超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；上述方法提高了透明质酸的产量、分子量。在上述研究的基础上，申请人继续对透明质酸的制备方法进行了阐明。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种高产率透明质酸的制备方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种高产率透明质酸的制备方法，包括以下步骤：

步骤1)制备种子液，步骤2)发酵、醇沉，步骤3)离心，步骤4)板框过滤，步骤5)离心、干燥。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

步骤1)制备种子液：将兽疫链球菌取出，接种于固体活化培养基，然后接种到种子培养基中培养得到兽疫链球菌种子液；

步骤2)发酵：将兽疫链球菌种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养6h，然后往发酵罐中添加甘油和乙醛，继续发酵培养8-10h，再进行超声处理，然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵培养过程中，通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L，控制发酵培养的温度为38-40℃，溶氧为2-4L/min；

步骤3)离心、醇沉：对发酵液进行离心，收集上清液，往上清液中加入3 倍体积的无水乙醇进行沉淀90min，收集沉淀得到湿物料A；

步骤4)板框过滤：往湿物料A中加2倍重量的纯水，加热至55℃，溶解后，再加入1-1.5％重量份的活性炭，并调节pH 6.8，100rpm搅拌3min，进行第一次板框过滤，收集湿物料B，加入55℃纯水再次溶解后，再添加1-1.5％重量份的硅藻土，100rpm搅拌3-5min，进行第二次板框过滤，收集湿物料C；

步骤5)离心、干燥：将湿物料C进行离心、真空冷冻干燥干燥、粉碎得到透明质酸。

优选地，

所述甘油的添加量为200-300mg/L。

优选地，

所述乙醛的添加量为20-30mg/L。

优选地，

所述超声处理的参数：超声功率分别为200-300w，超声的作用时间为每次 3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90s。

优选地，

所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨1g，硫酸镁1.8g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH 7.1。

优选地，

所述步骤3)中，离心速度为5000rpm，离心时间为5min。

优选地，

所述固体活化培养基的组分为：

按照重量百分比，10％蔗糖、2％蛋白胨、0.125％氯化钠、0.5％硫酸镁、2％磷酸氢二钾、2％琼脂、余量为无菌水。

优选地，

所述种子培养基的组分为：按照重量百分比，10％蔗糖、2％蛋白胨、0.125％氯化钠、0.5％硫酸镁、2％磷酸氢二钾、余量为无菌水。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明在发酵制备透明质酸的方法中，对多种因素进行优化和改进，提高了透明质酸的产量，并且纯度和收率较高。

发酵制备透明质酸过程中，待菌株增殖到一定浓度后，氮源浓度降低，代谢不利于菌株增殖，此时再添加甘油，能够促进碳源合成透明质酸，使代谢向着有利于产物合成的方向进行，还能够增加细胞壁分泌孔隙和通透性，有助于大分子量的透明质酸合成和分泌；在发酵初期添加甘油，并不能提高透明质酸的表达量，可能在发酵初期，菌株增殖迅速，但是透明质酸的合成较少。

通过玉米浆来替代部分蛋白胨，可以降低成本，而且透明质酸产量有所提高。

大规模发酵培养中，会出现氧气不充足的情况，菌株会利用糖产生乙醛等，培养基中添加合适浓度的乙醛，会对乙醛代谢途径造成反馈抑制，使得糖酵解途径的流量最大限度进入透明质酸合成途径，合成较多及较高聚合度的透明质酸。

超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；选择合适的超声时间和强度，有利于透明质酸的生产。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种高产率透明质酸的制备方法，包括以下步骤：

将兽疫链球菌ATCC39920取出，接种于固体活化培养基(重量百分比，10％蔗糖、2％蛋白胨、0.125％氯化钠、0.5％硫酸镁、2％磷酸氢二钾、2％琼脂、余量为无菌水)，然后接种到种子培养基(重量百分比，10％蔗糖、2％蛋白胨、0.125％氯化钠、0.5％硫酸镁、2％磷酸氢二钾、余量为无菌水)中培养至菌株浓度10⁸cfu/ml 的种子液；

将种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨1g，硫酸镁1.8 g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH 7.1，温度38℃，溶氧3.2L/min；发酵培养6h，往发酵罐中添加甘油和乙醛，控制甘油的浓度为200mg/L，乙醛的浓度为30mg/L；继续发酵培养10h，然后超声处理，超声处理的参数：超声功率分别为200w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90s；然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵培养总时间为18h；发酵过程中，通过流加浓度为 100g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L；

采用高速碟片离心机对发酵液进行离心，离心速度为5000rpm，离心时间为 5min，收集上清液，往上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀90min，收集沉淀得到湿物料A；往湿物料中加2倍重量的纯水，加热至55℃，溶解后，再加入1％重量份的活性炭，并调节pH6.8，100rpm搅拌3min，进行第一次板框过滤，收集湿物料B，加入55℃纯水再次溶解后，再添加1％重量份的硅藻土，100rpm 搅拌3min，进行第二次板框过滤，收集湿物料C，将湿物料C进行离心、真空冷冻干燥干燥、粉碎得到透明质酸。

经检测，获得的透明质酸经过计算，收率为94.1％，纯度为99.3％，且外观洁白透亮，达到食品和化妆品级产品的要求。

实施例2

一种高产率透明质酸的制备方法，包括以下步骤：

将兽疫链球菌ATCC39920取出，接种于固体活化培养基(重量百分比，10％蔗糖、2％蛋白胨、0.125％氯化钠、0.5％硫酸镁、2％磷酸氢二钾、2％琼脂、余量为无菌水)，然后接种到种子培养基(重量百分比，10％蔗糖、2％蛋白胨、0.125％氯化钠、0.5％硫酸镁、2％磷酸氢二钾、余量为无菌水)中培养至菌株浓度10⁸cfu/ml 的种子液；

将种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨1g，硫酸镁1.8 g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH 7.1，温度39℃，溶氧3.2L/min；发酵培养6h，往发酵罐中添加甘油和乙醛，控制甘油的浓度为300mg/L，乙醛的浓度为20mg/L；继续发酵培养8h，然后超声处理，超声处理的参数：超声功率分别为300w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90s；然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵培养总时间为16h；发酵过程中，通过流加浓度为 100g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L；

采用高速碟片离心机对发酵液进行离心，离心速度为5000rpm，离心时间为 5min，收集上清液，往上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀90min，收集沉淀得到湿物料A；往湿物料中加2倍重量的纯水，加热至55℃，溶解后，再加入1.5％重量份的活性炭，并调节pH 6.8，100rpm搅拌3min，进行第一次板框过滤，收集湿物料B，加入55℃纯水再次溶解后，再添加1.5％重量份的硅藻土， 100rpm搅拌5min，进行第二次板框过滤，收集湿物料C，将湿物料C进行离心、真空冷冻干燥干燥、粉碎得到透明质酸。

经检测，获得的透明质酸经粘度计测定粘度。根据公式[η]＝0.36M^0.78计算透明质酸分子量，其分子量为2430KDa，收率为94.0％，纯度为99.5％，且外观洁白透亮，达到食品和化妆品级产品的要求。

实施例3

采用正交实验检测甘油和乙醛添加量对透明质酸产量的影响：

以实施例1的发酵条件为例，设置多个甘油浓度组别，分别是0mg/L，100mg/L，200mg/L，300mg/L，400mg/L，500mg/L；设置多个乙醛浓度组别，分别是0 mg/L，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L，设置为其余同实施例1。检测发酵液中透明质酸的产量，具体见表1：

表1

结论：如表1所示，在发酵中期，通过添加甘油和乙醛可以提高透明质酸的产量，通过正交试验可知，200-300mg/L添加量的甘油与20-30mg/L添加量的乙醛进行组合，对透明质酸产量的提高幅度最大。

本发明还检测了透明质酸的分子量，分子量约为240万Da；甘油可以提高透明质酸的分子量，乙醛对透明质酸的分子量没有影响。

实施例4

采用正交试验检测超声处理强度和时间对透明质酸产量的影响：

以实施例1为例，设置多个超声强度组别，分别是0，100w，200w，300w，400w， 500w，设置多个超声强度时间，分别是30s，60s，90s，120s。检测发酵液中透明质酸的产量，具体见表2：

表2

结论：超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；如表2所示，随着超声强度和时间的增加，透明质酸的产量先升后降，可能是超声波能够改变细胞膜结构，对细菌产生不利影响，从而导致透明质酸产量提高，但是随着强度和时间的增加，对菌株造成了损害，导致透明质酸的产量下降。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种高产率透明质酸的制备方法，包括以下步骤：

步骤1）制备种子液，步骤2）发酵、醇沉，步骤3）离心，步骤4）板框过滤，步骤5）离心、干燥。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1）制备种子液：将兽疫链球菌取出，接种于固体活化培养基，然后接种到种子培养基中培养得到兽疫链球菌种子液；

步骤2）发酵：将兽疫链球菌种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵培养6h，然后往发酵罐中添加甘油和乙醛，继续发酵培养8-10h，再进行超声处理，然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵培养过程中，通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在不低于20g/L，控制发酵培养的温度为38-40℃，溶氧为2-4L/min；

步骤3）离心、醇沉：对发酵液进行离心，收集上清液，往上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀90min，收集沉淀得到湿物料A；

步骤4）板框过滤：往湿物料A中加2倍重量的纯水，加热至55℃，溶解后，再加入1-1.5%重量份的活性炭，并调节pH 6.8，100rpm搅拌3min，进行第一次板框过滤，收集湿物料B，加入55℃纯水再次溶解后，再添加1-1.5%重量份的硅藻土，100rpm搅拌3-5min，进行第二次板框过滤，收集湿物料C；

步骤5）离心、干燥：将湿物料C进行离心、真空冷冻干燥干燥、粉碎得到透明质酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述甘油的添加量为200-300mg/L。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乙醛的添加量为20-30mg/L。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超声处理的参数：超声功率分别为200-300w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90s。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖50g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨1g，硫酸镁1.8 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，pH 7.1。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，离心速度为5000rpm，离心时间为5min。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固体活化培养基的组分为：

按照重量百分比，10%蔗糖、2%蛋白胨、0.125%氯化钠、0.5%硫酸镁、2%磷酸氢二钾、2%琼脂、余量为无菌水。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的组分为：按照重量百分比，10%蔗糖、2%蛋白胨、0.125% 氯化钠、0.5%硫酸镁、2%磷酸氢二钾、余量为无菌水。