CN1259423C - 大规模液体深层发酵生产桑黄水提取物及多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
大规模液体深层发酵生产桑黄水提取物及多糖工艺。本发明以大规模液体深层发酵生产桑黄水提取物及多糖为目标，以中国微生物菌种保藏中心的桑黄真菌为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，最终发酵罐体积达1000-5000L。发酵结束后，将终了发酵液温度加热到60-100℃，搅拌速度为150-250rpm/min，维持2-4小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤，清液浓缩，喷雾干燥得到桑黄水提取物，如将清液浓缩后用适量乙醇沉淀，取沉淀物加适量水溶解，喷雾干燥可得桑黄多糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种大规模液体深层发酵生产桑黄水提取物及多糖的方法。
技术背景
桑黄(Phellinus igniarius)的现代科学名称为鲍氏层孔菌，也叫作桑耳、针裂蹄、裂蹄针层孔菌等，是一种寄生于腐烂桑树上的真菌，李时珍的《本草纲目》中就已将桑黄作为一味药材收载。20世纪90年代中期以后，韩国和日本的研究人员发现：桑黄的提取物对肿瘤等赘生物有出色的抑制作用。体外实验证实，桑黄水提取物可诱导癌细胞进入程序死亡。此外，桑黄还具有很强的抑制癌细胞转移作用。更令人振奋的是，桑黄提取物对人体无害，即使长期大剂量投予，对人或实验动物亦无任何毒副作用。桑黄的水提取物的主要活性成分为多糖类物质。
由于天然来源的桑黄数量非常稀少，难以成为稳定的工业产品来源。韩国一制药公司已率先开发出桑黄菌丝体培养技术，是将桑黄在特制的培养罐中进行发酵，最后将其提取物用冻干法加工成粉末。由于抗癌效果显著，桑黄提取物干粉在韩国市场的售价高达2000美元/g。据统计，2002年韩国和日本两国市场桑黄制剂的销售合计已过100亿日圆。而美国在2000年就已从日本进口桑黄制剂作为膳食补充剂。目前尚未见大规模液体深层发酵生产桑黄水提取物及多糖的报道。
发明内容
本发明的目的是以生产桑黄水提取物及多糖为目标，发明一种廉价高效的桑黄水提取物及多糖的大规模液体深层发酵工艺，为今后的产业化应用打下基础。
实现本发明的技术方案：以桑黄真菌为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养。在发酵结束后，将终了发酵液继续加热到一定温度，搅拌维持一定时间，发酵液经板框压滤，清液浓缩，喷雾干燥得到桑黄水提取物，或将清液浓缩后用适量乙醇沉淀，取沉淀物加适量水溶解，喷雾干燥可得桑黄多糖。
本菌株购自中国微生物菌种保藏中心的菌种，编号为AS 5.95。
实现本发明的具体步骤如下：
(1)取出斜面菌种接入配制的新鲜斜面培养基中，培养温度25-33℃，培养150-250小时。
(2)将步骤1中的斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，25-33℃培养，转速120-180rpm/min，培养80-120小时后进行摇瓶的扩大培养。
(3)将步骤2中的摇瓶菌种转接入装有摇瓶扩大培养基的摇瓶再进行扩大培养，25-33℃培养，转速120-180rpm/min，培养35-60小时后接入一级种子罐进行培养。
(4)将步骤3中的摇瓶菌种转接入一个装有种子培养基的一级种子罐中，接种量为4-10％，保持罐温25-33℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵30-55小时，然后转接入发酵罐发酵。
(5)将一级种子罐中的菌种转接入一个装有发酵培养基的发酵罐中，接种量为4-10％，保持罐温25-33℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150.rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵120-200小时。在发酵液还原糖含量降低到1.0-2.0％左右时为发酵终了，放罐。
本发明中斜面培养基的配方是(g/100ml)：马铃薯10-20，葡萄糖1-3，琼脂1.5-2.5，加水定容至所需体积，.pH值自然。
本发明中摇瓶培养基和摇瓶扩大培养基的配方是(g/100ml)：葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.5，麸皮汁1.0-2.5，KH2PO4 0.1-0.5，MgSO4 0.01-0.2，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0。
本发明中一级种子培养和发酵培养的培养基配方是(g/100ml)：葡萄糖2-4，蛋白胨0.03-0.7，玉米浆0.5-1.5，玉米粉0.5-2，麸皮汁1-3，KH2PO4 0.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需体积，pH值为4.0-5.0。
本发明步骤2和3中摇瓶培养基与摇瓶容积比为1∶5。
本发明步骤4中一级种子罐的容积为100-300L，在该一级种子罐中装有的一级种子培养基相应为50-180L；步骤5中发酵罐的容积为1000-5000L，在该发酵罐中装有的发酵培养基相应为500-3500L。
本发明的放罐标准是发酵液开始变得粘稠，还原糖含量降低到1.0-2.0％左右，镜检发现菌丝体开始衰老。
如需获取其水提取物及多糖，则在本发明所述的发酵终止后，将发酵终了液温度加热到60-100℃，搅拌速度为150-250rpm/min，维持2-4小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤，得清液。滤液经浓缩，使最后体积为原液的1/4-1/10，取浓缩液喷雾干燥得到桑黄水提取物。或清液浓缩后加入适量乙醇使乙醇浓度达75％，醇析20-30小时，取沉淀用去离子水溶解，喷雾干燥即得到桑黄多糖。
本发明的有益效果：本发明适用于大规模液体深层发酵生产桑黄水提取物及多糖，对于今后的工业化生产和相关的应用产业的发展具有重要意义。本发明所得桑黄水提取物和多糖颜色为褐色。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：
在斜面培养基中接种购自中国微生物菌种保藏中心(菌种编号：5.95)的桑黄菌丝体，培养温度28℃，培养时间180小时。将新鲜的斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床培养100小时，摇床转速150rpm/min。然后将所得摇瓶菌种转接入装有100ml培养基的500ml三角摇瓶中进行扩大培养，28℃摇床培养45小时，摇床转速150rpm/min。然后将三角瓶扩大的菌种2200ml转接入装有50L种子培养基的100L一级种子罐中，保持罐温28℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间45小时。将一级种子罐菌种转接入装有800L发酵培养基的1500L发酵罐中，保持罐温28℃，罐压0.7kPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间144小时，发酵液中菌丝体以干重计为2.9％，多糖含量为30％。
本实施例1中斜面培养基组成是(g/100ml)：马铃薯15，葡萄糖2，琼脂2，加水定容至所需体积，pH值为自然。
本实施例1中摇瓶培养基和摇瓶扩大培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖3，蛋白胨0.2，麸皮汁2，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.1，加水定容至所需体积，pH值为自然。
本实施例1中100L一级种子罐的培养基组成是(g/100ml)：葡萄糖3，蛋白胨0.2，玉米浆1，玉米粉1.5，麸皮汁2，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.1，加水定容至50L，pH值为4.5。
本实施例1中1500L发酵罐的培养基配方是(g/100ml)：葡萄糖3，蛋白胨0.2，玉米浆1.0，玉米粉1.5，麸皮汁2，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.1，加水定容至800L，pH值为4.5。
本实施例中发酵结束标准是：发酵液开始变得粘稠，还原糖含量降低到1.5％，镜检发现菌丝体开始衰老。
获取桑黄水提取物及多糖的方法是：在本发明所述的发酵终止后，将温度加热到90℃，搅拌速度为220rpm/min，维持3小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤，滤液经浓缩，使最后体积为原液的1/5，取浓缩液喷雾干燥得到桑黄水提取物。如需获取多糖，则将浓缩液加入适量乙醇使乙醇浓度达75％，醇析24小时，取沉淀用去离子水溶解，喷雾干燥得到桑黄多糖。
Claims (1)
1、一种液体深层发酵生产桑黄水提取物或多糖的方法，其特征如下：
(1)以购自中国微生物菌种保藏中心的桑黄真菌AS 5.95为出发菌株；
(2)斜面菌种培养，培养基组成以g/100ml计：马铃薯10-20，葡萄糖1-3，琼脂1.5-2.5，加水定容至所需体积，pH值为自然，斜面菌种培养温度25-33℃，培养150-250小时；
(3)摇瓶培养，培养基组成以g/100ml计：葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.5，麸皮汁1.0-2.5，KH2PO4 0.1-0.5，MgSO4 0.01-0.2，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0，培养条件是：培养温度25-33℃，转速120-180rpm/min，培养80-120小时，然后转接入摇瓶进行扩大培养；
(4)摇瓶扩大培养，培养基组成以g/100ml计：葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.5，麸皮汁1.0-2.5，KH2PO4 0.1-0.5，MgSO4 0.01-0.2，加水定容至所需体积，pH值为4.5-5.0，培养条件是：培养温度25-33℃，转速120-180rpm/min，培养35-60小时，然后转接入一级种子培养；
(5)一级种子培养，培养基组成以g/100ml计：葡萄糖2-4，蛋白胨0.03-0.7，玉米浆0.5-1.5，玉米粉0.5-2，麸皮汁1-3，KH2PO4 0.1-0.5，MgSO4 0.01-0.2，加水定容至所需体积，pH值为4.0-5.0，接种量为4-10％，培养条件是：培养温度25-33℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵30-55小时，然后转接入发酵罐发酵；
(6)发酵培养，发酵培养基组成以g/100ml计：葡萄糖2-4，蛋白胨0.03-0.7，玉米浆0.5-1.5，玉米粉0.5-2，麸皮汁1-3，KH2PO4 0.1-0.5，MgSO4 0.01-0.2，加水定容至所需体积，pH值为4.0-5.0，接种量为4-10％，培养条件是：培养温度25-33℃，罐压0.5-0.9kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵120-200小时，当发酵液还原糖含量降到1.0-2.0％时，为发酵终了；
(7)将终了发酵液温度加热到60-100℃，搅拌速度为150-250rpm/min，维持2-4小时，用泵将发酵液输送到贮罐中，经板框压滤得到清液，清液浓缩至体积为原体积1/4-1/10，喷雾干燥得到桑黄水提取物；或将清液浓缩后用适量乙醇沉淀，醇析液乙醇浓度为75％，醇析20-30小时，取沉淀物加适量水溶解，喷雾干燥可得桑黄多糖。
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