CN105838751A - 一种提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法，属于生物工程领域。该提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法，其特征是在发酵初期向发酵培养基中添加定量乙醛，同时通过加入NaOH使发酵液PH的处于弱碱性状态下，以提高芽孢杆菌的四甲基吡嗪产量。本发明的优点如下：通过在发酵初期加入乙醛提高了四甲基吡嗪的产量，另外弱碱性条件控制显著提高四甲基吡嗪产量，该方法不仅经济环保，而且生产成本低。

Description

一种提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法。
背景技术
四甲基吡嗪（TTMP），又名川芎嗪，是中药川芎中的有效活性成分，可以降血压，在治疗脑血管、肺水肿、肾脏疾病方面有显著疗效，并在医药合成中被广泛应用，已作为常备药品广泛应用于临床。TTMP又是一种重要的呈香物质，天然存在于白酒、可可豆、茶、牛羊猪肉、奶酪、坚果中，具有烤面包、烤肉等香气，国家标准GB2760-1996规定其为允许使用的食用香料。目前，在白酒行业中对吡嗪类化合物的研究已有较高的重视度，初步证实了白酒中TTMP除美拉德途径产生外，微生物代谢产物途径也能产生TTMP，但其代谢途径及调控机理尚不明确。
酿酒中产生吡嗪类化合物多以细菌发酵为主，尤其以芽孢杆菌类菌株中的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为主。由于酿酒中产生TTMP的合成机理尚不清晰，通过野生菌株利用自身代谢途径发酵生产TTMP的生产力较低；通过添加前体物质（3-羟基丁酮）可以有效强化代谢通路，但是生产成本较高、成本效益较低；通过发酵培养基和培养条件优化及对其发酵过程的调控，可有效提高发酵体系中TTMP的产量，但存在产物抑制等现象的束缚；通过对菌株进行基因改造也可有效提高TTMP的产量，但分子改造菌株应用于食品发酵类的生产，存在遗传稳定性和安全性的隐患，难以进行工业化生产。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种低生产成本芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法。
本发明所采用的具体技术方案如下：
一种提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法，以芽孢杆菌为出发菌株的摇瓶发酵培养，其特征是在发酵初期向发酵培养基中加入乙醛至1.0 g/L，且在发酵过程中从第72h开始，通过流加10mol/L NaOH控制发酵体pH处于弱碱条件下，发酵温度为37 ℃，继续发酵至TTMP达到峰值。
经实验,所述制作种子液和发酵过程pH为7.5时取得效果最好。
具体操作时，所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌（B.lincheniformis BL1）或枯草芽孢杆菌（B.subtilis BS2）任一株。
1．弱碱性条件控制提高TTMP产量
利用地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis BL1）、枯草芽孢杆菌（Baclicus subtilis BS2）利用发酵培养基摇瓶发酵生产TTMP的过程中，通过流加10mol/L NaOH控制发酵体系pH呈弱碱性条件，期间向装有200ml含70 g/L葡萄糖的YPG发酵培养基的500 mL三角瓶的发酵体系中，以每12 h补加5 mL浓度为1 mg/mL的葡萄糖溶液，发酵时间分别为168h、192h。
2. 发酵初期添加乙醛
(1) 在地衣芽孢杆菌（B.lincheniformis BL1）摇瓶发酵初期，向发酵培养基中加入乙醛至1.0 g/L的乙醛，发酵时间为168h。
(2) 在枯草芽孢杆菌（B.subtilis BS2）摇瓶发酵初期，向发酵培养基中加入乙醛至1.0 g/L，发酵时间为192h。
制作种子液，摇瓶制作种子液的培养基为LB培养基，LB培养基的各种成份g/L计：蛋白胨10、酵母浸粉5、氯化钠10，pH 7.0，121°C灭菌20min；培养方法：在无菌条件下，用接种环取一环活化好的芽孢杆菌种接种到装有50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养12 h，然后按接种量2 % （V/V）接到装有50 mL含10 g/L葡萄糖的LB培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养12 h，调整菌体生长量OD600 为0.05，作为种子液。
上述摇瓶发酵培养基也可以采用YPG培养基，所用YPG培养基每L含葡萄糖100 g，蛋白胨30 g，酵母浸粉10 g，磷酸氢二铵30 g，pH调至7.5，121°C。
发酵培养方法：将种子液按4 %的接种量（V/V）接种到装有200ml含70 g/L葡萄糖的YPG培养基的500 mL三角瓶中，37℃、200r/min振荡培养，期间每12h补加5ml浓度为1mg/ml的葡萄糖溶液。从第72h开始，通过流加10mol/L NaOH控制发酵体系pH均为7.5，继续发酵至TTMP达到峰值。
本发明提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法的有益效果：生产过程操作简单，绿色环保，反应温和、且成本低，仅需要在发酵初期添加乙醛就可以调控提高发酵产物3-羟基丁酮，四甲基吡嗪（TTMP）的产量。另外乙醛做为国家标准GB2760-1996规定的允许使用的食用添加剂，本发明提高芽孢杆菌产四甲基吡嗪产量的作用优越于培养基及发酵条件的优化方法，比通过分子改造菌株提高TTMP产量更安全稳定，对环境无污染、无毒害，低用量、无公害，操作简单，用途广等优点。该技术符合我国节能减排的要求，并且可以变通运用除地衣、枯草芽孢杆菌之外的类似机理的生物发酵产业当中去，具有广阔的应用前景，且适于工业化生产。
附图说明
图 1 葡萄糖在BL1和BS2两种芽孢杆菌中生成3-羟基丁酮和TTMP的共通代谢途径。
图 2 添加乙醛调控（实心）对B.lincheniformis BL1的TTMP产量(▲)菌体量(●)和葡萄糖利用率(■)的影响。
图 3添加乙醛调控（实心）对B.subtilis BS2的TTMP产量(▲)菌体量(●)和葡萄糖利用率(■)的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明, 本发明利用芽孢杆菌生产四甲基吡嗪的方法，以芽孢杆菌为出发菌株的摇瓶发酵培养，其特征是在发酵初期向发酵培养基中加入乙醛至1.0 g/L，且在发酵过程中从第72h开始，通过流加10mol/L NaOH控制发酵体pH处于弱碱条件下，发酵温度为37 ℃，继续发酵至TTMP达到峰值。
实施例一：应用pH控制发酵提高芽孢杆菌产TTMP的能力
步骤一：种子液的准备：在无菌条件下，用接种环取一环活化好的芽孢杆菌种接种到装有50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养12 h，然后按接种量2 % （V/V）接到装有50 mL含10 g/L葡萄糖的LB培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养12 h，调整菌体浓度（OD600）为0.05，作为种子液。
步骤二：将种子液按4 %的接种量（V/V）接种到装有200ml含70 g/L葡萄糖的YPG培养基的500 mL三角瓶中，37℃、200r/min振荡培养，期间每12h补加5ml浓度为1mg/ml的葡萄糖溶液，从第72h开始，通过流加10mol/L NaOH控制发酵体系pH为6.5-8.5，继续发酵至TTMP达到峰值，发酵过程中间隔一定时间取样分析发酵液中菌体浓度（OD600）、TTMP和3-羟基丁酮的含量。不同pH控制值下地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis BL1）、枯草芽孢杆菌（Baclicus subtilis BS2）的菌体浓度（OD600）、TTMP和3-羟基丁酮的最大产量分别如表1所示，当控制发酵液pH值为7.5时，地衣芽孢杆菌（B.lincheniformis BL1）和枯草芽孢杆菌（B.subtilis BS2）的菌体浓度（OD600）、TTMP和3-羟基丁酮的产量均能达到最大值。
表1培养条件中pH对B.lincheniformis BL1和B.subtilis BS2产物3-羟基丁酮和TTMP的影响
a从接种到3-羟基丁酮产量达到最高时的发酵时间。
b 从接种到TTMP产量达到最高时的发酵时间。
数据是三组实验的平均值和标准偏差。
实施例二：应用发酵初期添加乙醛调控TTMP产量的能力
按照实施例1中的种子液制备及控制发酵液pH值为7.5时的发酵方法，在发酵初期向培养基加入梯度浓度的乙醛：1.0，2.0，4.0和8.0 g/L，进行发酵试验至TTMP达到峰值，发酵过程中间隔一定时间取样分析发酵液中菌体浓度（OD600）、TTMP和3-羟基丁酮的含量。
1）随着乙醛添加量由0 g/L增加到1.0 g/L，地衣芽孢杆菌（B.lincheniformis BL1）产TTMP的最高产量由37.89 g/L提高到43.13 g/L。当培养基中乙醛的添加量提高到1.0 g/L以上时，发酵产物TTMP的产量不再增加并且随着乙醛添加量的增加有所减少。同时，随着添加乙醛量的增加，细胞生长受到较大影响。乙醛的添加，可以提高TTMP和3-羟基丁酮的产量，对菌体细胞生长量有较大抑制作用，对葡萄糖利用率也有影响，见表2，图2。综合考虑发酵时间以及乙醛添加量、产物量，可见，乙醛调控地衣芽孢杆菌（B.lincheniformis BL1）发酵产物，最佳添加量为1.0 g/L，发酵168h可以得到43.13 g/L TTMP的产量。总体上，添加乙醛调控3-羟基丁酮和TTMP的产量影响有一致性，针对地衣芽孢杆菌（B.lincheniformis BL1）的发酵生产是有效可行的。
2）随着乙醛添加量由0 g/L增加到1.0 g/L，枯草芽孢杆菌（B.subtilis BS2）产TTMP的最高产量由21.84 g/L提高到27.64 g/L。TTMP的合成受添加乙醛的影响，当培养基中乙醛的添加量提高到1.0 g/L以上时，发酵产物TTMP的产量不再增加并且随着乙醛添加量的增加有较大降低，当乙醛的添加量提高到8.0 g/L时，TTMP和3-羟基丁酮的产量都降到1.0 g/L以下。同时，随着乙醛添加量的增加，细胞生长受到较大影响。乙醛的添加，可以提高TTMP和3-羟基丁酮的产量，对菌体细胞生长量有很大的抑制作用，对葡萄糖利用率也有影响，见表2，图3。综合考虑发酵时间以及乙醛添加量、产物量，可见，乙醛调控枯草芽孢杆菌（B.subtilis BS2）发酵产物，最佳添加量为1.0 g/L，发酵192h可以得到27.64 g/L TTMP的产量。总体上，添加乙醛调控3-羟基丁酮和TTMP的产量影响有一致性，针对枯草芽孢杆菌（B.subtilis BS2）的发酵生产是有效可行的。
表2乙醛调控对B.lincheniformis BL1和B.subtilis BS2产物3-羟基丁酮和TTMP的影响
a从接种到3-羟基丁酮产量达到最高时的发酵时间。
b 从接种到TTMP产量达到最高时的发酵时间。
数据是三组实验的平均值和标准偏差。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非以限定本发明，对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做出其它各种相应的改变和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
在研究中发现，发酵初期定量添加乙醛能够将地衣芽孢杆菌（B.lincheniformis BL1）TTMP的产量提高13.8 %，达到43.13 g/L；能够将枯草芽孢杆菌（B.subtilis BS2）的TTMP产量提高26.6 %，达到27.64 g/L，同时也能提高两种芽孢杆菌3-羟基丁酮的产量。研究人员推测发酵初期添加乙醛可能对催化3-羟基丁酮生成乙醛的3-羟基丁酮脱氢酶系活性具有抑制作用，阻遏自身乙醛的合成，从而减少消耗3-羟基丁酮形成乙醛的程度，同时能够增强乙醛向乙酰辅酶A的代谢生成，间接反馈抑制丙酮酸向乙酰辅酶A的代谢支路，增强丙酮酸向3-羟基丁酮的代谢支路，增大TTMP的前体物质3-羟基丁酮的积累量，从而提高TTMP的产量，两种芽孢杆菌的共通代谢途径如图1所示。

Claims (3)

1.一种提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法，以芽孢杆菌为出发菌株的摇瓶发酵培养，其特征是在发酵初期向发酵培养基中加入乙醛至1.0 g/L，且在发酵过程中从第72h开始，通过流加10mol/L NaOH控制发酵体pH处于弱碱条件下，发酵温度为37 ℃，继续发酵至TTMP达到峰值。
2.如权利要求1所述的提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法，其特征是:所述制作种子液和发酵过程pH为7.5。
3.如权利要求1所述的提高芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪产率的方法，其特征是:所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌（B.lincheniformis BL1）或枯草芽孢杆菌（B.subtilis BS2）任一株。
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