CN105999303B - 一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法 - Google Patents

一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法。该方法包括胚胎准备、药物处理、活体标记、实验结果影像采集和结果分析及统计。本发明首次利用钙黄绿素作为荧光标记物对斑马鱼胃肠道进行标记，通过对斑马鱼胃肠道蠕动次数进行统计分析，进行胃肠道活性药物的筛选；通过对相关条件的优化，获得了稳定可靠、成功率高和重复性好的筛选方法；对高通量筛选调节胃肠动力化合物具有重要意义。

Description

一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法
技术领域
本发明涉及一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法，特别涉及一种钙黄绿素为标记物的筛选调节胃肠道动力化合物的方法，属于药物筛选技术领域。
背景技术
胃肠运动功能是消化道最主要的功能之一，其调节机制非常复杂。自改革开放以来，随着经济的高速发展，社会竞争的日趋激烈，人们生活节奏的加快和工作压力的增大而导致的胃肠动力障碍性疾病问题日渐普遍。截至目前为止，胃肠动力障碍性疾病已成为临床的常见病和多发病。在日常医疗工作中，约50％的患者会因消化道问题就诊，而其中约30％-40％的患者最终会被确诊为肠动力障碍。胃肠动力障碍性疾病主要的病理过程包括胃肠协调运动紊乱、胃排空延迟和小肠排空减慢等。其发病机制可能与饮食、神经心理、神经激素、胃酸和幽门螺旋杆菌感染等因素相关。胃肠动力障碍性疾病多属于功能性疾病，且目前尚无特效治疗方法，患者每年均需花费高额的治疗费用，且其生活质量亦受到不同程度的影响。因此如何以快速且有效的活体方法来筛选新型促胃肠动力药物，将具有非常重要的社会效益和广阔的市场前景。
目前筛选促胃肠动力药物的研究中，主要利用(1)离体器官进行药物筛选，观察受试物对离体胃、肠平滑肌等的影响，得到大量初步的结果。再利用(2)小型哺乳动物进行二次验证，即利用影像技术观察活体动物的胃肠动力；或是将实验动物处死后，检测受试物对实验动物胃排空、肠推动等的影响，从而验证大量初步结果。以上过程相当缓慢且成本较高，加上离体器官缺少周围神经反馈，无法准确模拟胃肠运动，不能准确反应药物在体内微环境下的活性，无法系统性解释药物毒性及活性；而小型哺乳动物模型又无法快速地验证其结果，且不适合高通量筛选。因此造成胃肠动力药物大量筛选出现了一个很大的断层。
斑马鱼(Daniorerio)是一种小型热带淡水鱼，属于鲤科，是一种理想的脊椎模式生物，现已被美国国家卫生研究院列为继人类和小鼠之后的第三大模式生物。斑马鱼与人类在基因水平具有高达87％的同源性，约70％的人类基因至少有一个明显的斑马鱼同源基因。在信号通路传导、蛋白质功能和生理结构等方面，斑马鱼与人类相比也表现出很高的保守性。与其他哺乳动物模型比，斑马鱼产卵量高，发育周期短，药物用量少，可重复性强，可直观地反应出药物的治疗效果及毒副作用，更适用于大规模的化合物筛选研究。
斑马鱼胃肠道在细胞功能和解剖学方面与人类相似，均由内皮细胞、结缔组织、外纵肌和环状肌组成。斑马鱼胚胎发育至26-126hpf，其肠道的管腔形成，并不断生长，内胚层分化形成有功能的肠道上皮。在未喂食情况下，斑马鱼胚胎发育至72hpf，肠道首次出现不稳定的自发收缩。伴随着发育的进行，第120-144hpf，大部分卵黄囊被吸收，斑马鱼肠道自发的蠕动及摄食能力增强。由于早期发育阶段斑马鱼全身透明，因此方便由透明的斑马鱼胚胎进行胃肠动力观察。
中国专利文献CN103301480A(申请号201310181252.4)公开了一种斑马鱼肠蠕动模型的建立方法及筛选促胃肠动力药物的方法，包括(1)斑马鱼选取；(2)模型诱导及化合物处理；(3)荧光显微镜定量分析。该方法选择斑马鱼作为实验动物，利用尼罗红作为染料标记其胃肠道，通过计算促肠蠕动排空率来研究胃肠蠕动情况。在该发明中，发明人优选的尼罗红染料标记斑马鱼胃肠道的时间为16h。因此应用该方法研究胃肠蠕动时，整个实验周期较长。除此之外，2016年发表于南方医科大学学报的《过度喂养建立斑马鱼幼鱼肥胖模型》一文中，作者发现尼罗红可以活体标记斑马鱼肝脏、胰腺等脏器内的脂肪细胞。由此可知，尼罗红染料可经斑马鱼胃肠道吸收，进入其体内。因此中国专利文献CN103301480A中定义的——尼罗红染色后计算促肠蠕动排空率，并不能准确反应胃肠道蠕动情况。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种基于钙黄绿素为标记物的筛选影响斑马鱼胃肠动力的化合物的方法。本发明可以方便、高效且快速的对影响胃肠动力的化合物进行定量评价。
本发明技术方案如下：
一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法，步骤如下：
(1)将斑马鱼受精卵置于培养容器中的胚胎培养水中，孵育108～132小时，挑选健康的斑马鱼胚胎，随机分组为受试组、阳性对照组和溶剂对照组；
(2)向受试组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入溶解于溶剂中的待筛选药物，向阳性对照组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入阳性对照药物，向溶剂对照组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入溶剂，继续孵育20～28小时；
(3)吸除受试组、阳性对照组和溶剂对照组中的液体，加入质量浓度为0.15～0.25％的钙黄绿素溶液，23～27℃标记8～12min，吸除液体，胚胎培养水清洗；
(4)将受试组、阳性对照组和溶剂对照组的斑马鱼胚胎进行麻醉，利用图像采集工具，对斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道部分进行影像采集，得到受试组斑马鱼胚胎、阳性对照组斑马鱼胚胎和溶剂对照组斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动影像；
(5)根据步骤(4)采集的影像，分别在相同时间内对受试组、阳性对照组和溶剂对照组的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行计数，并利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力进行统计学分析；
当受试组的胃肠道蠕动次数高于溶剂对照组，且T检验结果显示P≤0.05，则差异显著，待筛选药物具有显著促进胃肠道蠕动的作用；
当受试组的胃肠道蠕动次数高于溶剂对照组，且T检验结果显示P≤0.01，则差异非常显著，待筛选药物具有非常显著促进胃肠道蠕动的作用；
当受试组的胃肠道蠕动次数低于溶剂对照组，且T检验结果显示P≤0.05，则差异显著，待筛选药物具有显著抑制胃肠道蠕动的作用；
当受试组的胃肠道蠕动次数低于溶剂对照组，且T检验结果显示P≤0.01，则差异非常显著，待筛选药物具有非常显著抑制胃肠道蠕动的作用；
当受试组与溶剂对照组的胃肠道蠕动次数经T检验后，结果显示P>0.05，则统计学上差异不显著，待筛选药物对胃肠道蠕动没有作用。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中培养容器为标准规格的6孔或12孔细胞培养板。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中斑马鱼受精卵为健康成年AB系斑马鱼交配后产出的受精卵。
根据本发明优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中的孵育条件为：27～29℃，光照13～15小时/黑暗9～11小时的控光环境；进一步优选的，孵育条件为：28℃，光照14小时/黑暗10小时的控光环境；
优选的，所述胚胎培养水组分如下：
NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgSO4 0.16mM，去离子水配制。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中孵育时间为120小时。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中随机分组的条件为每组不低于15条斑马鱼胚胎。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中阳性药物为促进胃肠道蠕动的阳性对照药物或者抑制胃肠道蠕动的阳性对照药物；
进一步优选的，促进胃肠道蠕动的阳性对照药物为多潘立酮(Domperidonum)或是盐酸依托必利(Itopride HydrochlorideItopride)；抑制胃肠道蠕动的阳性对照药物为盐酸洛哌丁胺(loperamide hydrochloride)。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中溶剂为二甲基亚砜、甲醇或水。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中钙黄绿素的质量浓度为0.2％；
优选的，所述步骤(3)中标记的温度为25℃，时间为10min，环境为避光。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中胚胎培养水清洗2～3次。胚胎培养水清洗斑马鱼胚胎2～3次后看不到各培养孔中钙黄绿素的黄绿色荧光。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中麻醉为采用质量浓度为0.02％的三卡因(tricaine，ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)进行麻醉。在该条件下麻醉，斑马鱼胚胎完全进入麻醉状态，但其胃肠蠕动能力尚未受到影响。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中影像采集工具为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜；
根据本发明优选的，所述步骤(5)中计数的时间为1min。
有益效果
1、本发明首次利用钙黄绿素作为荧光标记物对斑马鱼胃肠道进行标记，通过对斑马鱼胃肠道蠕动次数进行统计分析，进行胃肠道活性药物的筛选；通过对相关条件的优化，获得了稳定可靠、成功率高和重复性好的筛选方法；
2、本发明所述筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法，该方法不仅具有成本低、操作简便的优点，而且具有灵敏度高、筛选速度快、高通量性等优点，可以准确反应药物在体内微环境下的活性，应用前景广阔。
附图说明
图1为不同浓度多潘立酮处理斑马鱼后，钙黄绿素胃肠道标记后的照片；
图中：A-C为溶剂对照组：A为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；B为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；C为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片；
D-F为多潘立酮溶液浓度10μg/mL的处理组：D为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；E为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；F为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片；
G-I为多潘立酮溶液浓度30μg/mL的处理组：G为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；H为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；I为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片；
J-L为多潘立酮溶液浓度50μg/mL的处理组：J为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；K为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；L为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片。
图2为不同浓度多潘立酮溶液处理后，斑马鱼胃肠道蠕动能力的统计柱状图；
图中：*表示p<0.05；**表示p<0.01。
图3为不同浓度盐酸洛哌丁胺处理斑马鱼后，钙黄绿素胃肠道标记照片；
图中：A-C为溶剂对照组：A为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；B为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；C为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片；
D-F为盐酸洛哌丁胺溶液浓度5μg/mL的处理组：D为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；E为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；F为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片；
G-I为盐酸洛哌丁胺溶液浓度10μg/mL的处理组：G为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；H为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；I为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片。
图4为不同浓度盐酸洛哌丁胺溶液处理后，斑马鱼胃肠道蠕动能力统计柱状图；
图中：*表示p<0.05。
图5为不同浓度阿司匹林处理斑马鱼后，钙黄绿素胃肠道标记照片；
图中：A-C为溶剂对照组：A为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；B为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；C为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片；
D-F为多潘立酮溶液处理浓度50μg/mL的阳性对照组：D为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；E为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；F为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片；
G-I为阿司匹林溶液浓度30μg/mL的处理组：G为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；H为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；I为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片；
J-L为阿司匹林溶液浓度50μg/mL的处理组：J为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；K为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；L为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片；
M-O为阿司匹林溶液浓度100μg/mL的处理组：M为荧光条件下钙黄绿素胃肠道标记照片；N为可见光下钙黄绿素胃肠道标记照片；O为荧光与可见光同时存在下钙黄绿素胃肠道标记照片。
图6为不同浓度阿司匹林溶液处理后，斑马鱼胃肠道蠕动能力统计柱状图；
图中：阳性对照为多潘立酮溶液浓度50μg/mL的处理组，*表示p<0.05；**表示p<0.01。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实验动物：所用野生型AB系健康斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中心，雌雄斑马鱼在28℃，14h光照/10h黑暗条件下分开养殖，每日于9：30(am)和4:30(pm)分别喂食两次丰年虫。用卵时，于前日将健康成熟斑马鱼按雌雄比1：1或1：2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵。排卵后半小时将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗，随后将受精卵置于28℃培养箱内，保持14h光照/10h黑暗周期培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。
试剂配制：阿司匹林标准品购自中国食品药品检定研究院；多潘立酮标准品购自加拿大TRC公司；盐酸洛哌丁胺标准品购自德国DR Ehrentorfer公司。以上三种标准品均用二甲基亚枫(DMSO)溶解后，配制为10mg/mL的储液。
胚胎培养水组分如下：
NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgSO4 0.16mM，去离子水配制。
实施例1：多潘立酮对斑马鱼胃肠蠕动的影响
1.斑马鱼胚胎的获得与使用
采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1：1或1：2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼捞出，将排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗；随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下、14h光照/10h黑暗周期下，控光培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后5天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每组3个平行孔。
2.化合物处理
设置四个实验组：1个溶剂对照组，3个多潘立酮处理组。移除6孔板中的胚胎培养水，溶剂对照组加入6ml含体积浓度0.5％二甲基亚砜的培养水溶液；多潘立酮处理组6ml培养水中分别加入浓度为10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL的多潘立酮溶液，由培养水与相应浓度的多潘立酮储液配制获得；将以上各实验组斑马鱼胚胎分别放入28℃恒温培养箱中，14h光照/10h黑暗周期下培养24小时。
3.活体标记
施药24小时后，将上述四组6孔板中的药液吸除，加入质量浓度为0.2％的钙黄绿素溶液，25℃条件下，恒温避光孵育斑马鱼胚胎10min。10min标记结束后，将钙黄绿素溶液吸除，加胚胎培养水清洗各组斑马鱼胚胎3次，至看不到各培养孔中钙黄绿素的黄绿色荧光为止。
4.实验结果影像采集
利用质量浓度为0.02％的三卡因溶液将上述四组斑马鱼胚胎麻醉。在荧光显微镜下采集斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道蠕动影像，结果如图1所示。
5.结果分析及统计
根据采集影像，在1min内分别对溶剂对照组、10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL的多潘立酮溶液处理组的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行统计。结果显示，溶剂对照组1min内胃肠道平均蠕动次数为11.5；三种浓度多潘立酮药物处理组(10μg/mL、30μg/mL和50μg/mL)的斑马鱼胃肠道1min内平均蠕动次数分别为：12、15和21.3，如表1所示。
表1
注：*表示p<0.05；**表示p<0.01；
由表1可以看出，随着多潘立酮浓度的增加，斑马鱼的胃肠道蠕动能力增加。
利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力进行统计学分析，结果显示多潘立酮药物浓度为30μg/mL时，与溶剂对照组(0.5％二甲基亚砜)相比较，其胃肠道蠕动能力显著增加，且差异具有统计学意义(P<0.05)，如图2所示；多潘立酮药物浓度为50μg/mL时，与溶剂对照组(0.5％二甲基亚砜处理组)相比较，斑马鱼胃肠道蠕动能力增加更为明显，且具有非常显著的差异(P<0.01)，如图2所示。
实施例2：盐酸洛哌丁胺对斑马鱼胃肠蠕动的影响
1.斑马鱼胚胎的获得与使用
采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1：1或1：2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼捞出，将排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗；随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃、14h光照/10h黑暗周期下控光培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后5天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每组3个平行孔。
2.化合物处理
设置四个实验组：1个溶剂对照组，3个盐酸洛哌丁胺处理组。移除6孔板中的培养水，溶剂对照组加入6ml含体积浓度0.5％二甲基亚砜的培养水溶液，盐酸洛哌丁胺处理组6ml培养水中分别加入浓度为5μg/mL、10μg/mL和30μg/mL的盐酸洛哌丁胺溶液，由培养水与相应浓度的多潘立酮储液配制获得；将以上各实验组斑马鱼胚胎分别放入28℃恒温培养箱中，14h光照/10h黑暗周期下培养24小时。
3.活体标记
施药24小时后，将上述四组6孔板中的药液吸除，加入质量浓度为0.2％的钙黄绿素溶液；25℃条件下，恒温避光孵育斑马鱼胚胎10min。10min标记结束后，将钙黄绿素溶液吸除，加胚胎培养水清洗各组斑马鱼胚胎2次，至看不到各培养孔中钙黄绿素的黄绿色荧光为止。
4.实验结果影像采集
利用质量浓度为0.02％的三卡因溶液将上述四组斑马鱼胚胎麻醉。在荧光显微镜下采集斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道蠕动影像，结果如图3所示。
5.结果分析及统计
根据采集影像，在1min内对溶剂对照组、5μg/mL、10μg/mL和30μg/mL的盐酸洛哌丁胺溶液处理组的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行统计，结果如表2所示。
表2
注：*表示p<0.05；
由表2可以看出，当盐酸洛哌丁胺溶液浓度为30μg/mL时，6孔板中20条斑马鱼胚胎全部死亡。这表明在该浓度下，盐酸洛哌丁胺对斑马鱼胚胎具有较大毒害作用。但是盐酸洛哌丁胺溶液浓度为5μg/mL和10μg/mL时，20条斑马鱼胚胎正常存活。溶剂对照组1min内胃肠道平均蠕动次数为11.7；5μg/mL盐酸洛哌丁胺药物处理组，斑马鱼胃肠道1min内平均蠕动次数为11.3；10μg/mL盐酸洛哌丁胺药物处理组，斑马鱼胃肠道1min内平均蠕动次数为8.2。
以上结果表明，在浓度小于30μg/mL时，随着盐酸洛哌丁胺浓度的增加，斑马鱼的胃肠道蠕动能力降低。利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力进行统计学分析，盐酸洛哌丁胺浓度为10μg/mL时，与溶剂对照组(0.5％二甲基亚砜处理组)相比较，斑马鱼胃肠道蠕动能力显著降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)，结果如图4所示。
实施例3：阿司匹林对斑马鱼胃肠道蠕动的影响
1.斑马鱼胚胎的获得与使用
采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1：1或1：2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼捞出，将排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗；随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃、14h光照/10h黑暗周期下，控光培养。中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后5天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每组3个平行孔。
2.化合物处理
设置六个实验组：1个溶剂对照组，1个阳性对照组，3个待测化合物处理组。移除6孔板中的培养水，溶剂对照组加入6ml含体积浓度0.5％二甲基亚砜的培养水溶液；阳性对照组加入6ml含浓度为50μg/mL的多潘立酮培养水溶液；三个待测化合物处理组分别在6ml培养水中加入浓度为30μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的阿司匹林溶液。将以上各实验组斑马鱼胚胎分别放入28℃恒温培养箱中，14h光照/10h黑暗周期下培养24小时。
3.活体标记
施药24小时后，将上述六组6孔板中的药液吸除，加入质量浓度为0.2％的钙黄绿素溶液；25℃条件下，恒温避光孵育斑马鱼胚胎10min。10min标记结束后，将钙黄绿素溶液吸除，加胚胎培养水清洗各组斑马鱼胚胎3次，至看不到各培养孔中钙黄绿素的黄绿色荧光为止。
4.实验结果影像采集
利用质量浓度为0.02％的三卡因溶液将上述六组斑马鱼胚胎麻醉。在荧光显微镜下采集斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道蠕动影像，结果如图5所示。
5.结果分析及统计
根据采集影像，在1min内对溶剂对照组、阳性对照组和三个浓度的阿司匹林处理组(30μg/mL、50μg/mL和100μg/mL)的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行计数。结果显示，溶剂对照组和阳性对照组1min内胃肠道平均蠕动次数分别为10.2和21，三种浓度阿司匹林处理组(30μg/mL、50μg/mL和100μg/mL)的斑马鱼胃肠道，1min内平均蠕动次数分别为11、13.3和11.2，如表3所示。
表3
注：*表示p<0.05；**表示p<0.01；
由表3可以看出，在阿司匹林浓度为30μg/mL和100μg/mL时，斑马鱼的胃肠道蠕动能力未受明显影响。利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力进行统计学分析，结果显示，阿司匹林浓度为50μg/mL时，与溶剂对照组(0.5％二甲基亚砜处理组)相比较，斑马鱼的胃肠道蠕动能力增加，且差异具有统计学意义(P<0.05)，结果如图6所示。
由上述实施例的结果可以看出，与现有的筛选影响胃肠动力药物的筛选技术相比，本发明所述的基于活体斑马鱼的胃肠动力药物筛选技术具有以下优点：(1)首次利用钙黄绿素将斑马鱼的胃肠道进行了特异性标记。标记后的胃肠道清晰可见，便于结果观察。(2)钙黄绿素安全可靠。0.2％浓度下，该标记物对活体动物不具毒害作用，标记结束后活体动物可以继续培育，并不影响后续实验。(3)钙黄绿素进入体内特异性标记胃肠道，是通过直接加入养鱼水中进行的，因此操作简便。(4)钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道时间相对较短，有效的缩短了实验周期。

Claims (15)

1.一种筛选具有调节斑马鱼胃肠动力活性化合物的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将斑马鱼受精卵置于培养容器中的胚胎培养水中，孵育108～132小时，挑选健康的斑马鱼胚胎，随机分组为受试组、阳性对照组和溶剂对照组；
（2）向受试组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入溶解于溶剂中的待筛选药物，向阳性对照组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入阳性对照药物，向溶剂对照组斑马鱼胚胎的胚胎培养水中加入溶剂，继续孵育20～28小时；
（3）吸除受试组、阳性对照组和溶剂对照组中的液体，加入质量浓度为0.2%的钙黄绿素溶液，25℃标记10min，吸除液体，胚胎培养水清洗；
（4）将受试组、阳性对照组和溶剂对照组的斑马鱼胚胎进行麻醉，利用图像采集工具，对斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道部分进行影像采集，得到受试组斑马鱼胚胎、阳性对照组斑马鱼胚胎和溶剂对照组斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动影像；
（5）根据步骤（4）采集的影像，分别在相同时间内对受试组、阳性对照组和溶剂对照组的斑马鱼胚胎的胃肠道蠕动次数进行计数，并利用T检验对斑马鱼胃肠道的蠕动能力进行统计学分析；
当受试组的胃肠道蠕动次数高于溶剂对照组，且T检验结果显示P≤0.05，则差异显著，待筛选药物具有显著促进胃肠道蠕动的作用；
当受试组的胃肠道蠕动次数高于溶剂对照组，且T检验结果显示P≤0.01，则差异非常显著，待筛选药物具有非常显著促进胃肠道蠕动的作用；
当受试组的胃肠道蠕动次数低于溶剂对照组，且T检验结果显示P≤0.05，则差异显著，待筛选药物具有显著抑制胃肠道蠕动的作用；
当受试组的胃肠道蠕动次数低于溶剂对照组，且T检验结果显示P≤0.01，则差异非常显著，待筛选药物具有非常显著抑制胃肠道蠕动的作用；
当受试组与溶剂对照组的胃肠道蠕动次数经T检验后，结果显示P>0.05，则统计学上差异不显著，待筛选药物对胃肠道蠕动没有作用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中培养容器为标准规格的6孔或12孔细胞培养板。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中斑马鱼受精卵为健康成年AB系斑马鱼交配后产出的受精卵。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中的孵育条件为：27～29℃，光照13～15小时/黑暗9～11小时的控光环境。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中的孵育条件为：28℃，光照14小时/黑暗10小时的控光环境。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎培养水组分如下：
NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgSO4 0.16mM，去离子水配制。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中孵育时间为120小时。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中随机分组的条件为每组不低于15条斑马鱼胚胎。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中阳性药物为促进胃肠道蠕动的阳性对照药物或者抑制胃肠道蠕动的阳性对照药物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，促进胃肠道蠕动的阳性对照药物为多潘立酮（Domperidonum）或是盐酸依托必利（Itopride HydrochlorideItopride）；抑制胃肠道蠕动的阳性对照药物为盐酸洛哌丁胺（loperamide hydrochloride）。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中溶剂为二甲基亚砜、甲醇或水。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中胚胎培养水清洗2～3次。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中麻醉为采用质量浓度为0.02%的三卡因（tricaine，ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate）进行麻醉。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中影像采集工具为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中计数的时间为1min。
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