CN105709242B - 一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法。该方法步骤如下：(1)挑选发育正常的斑马鱼胚胎，放入含有培养液的培养容器中，加入钙黄绿素溶液；(2)恒温条件下避光孵育斑马鱼胚胎，然后用培养液清洗，制得标记后的斑马鱼胚胎；(3)将标记后的斑马鱼胚胎麻醉，利用图像采集工具，对斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道部分进行影像采集并保存。本发明首次对钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的影响因素进行了研究，发现对钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的影响因素与在骨骼沉积等方式进行染色的影响因素不相同，通过对相关条件进行优化后，获得了能够得到胃肠道轮廓清晰、清楚可见、易于辨识的结果的标记方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法，属于药物筛选技术领域。
背景技术
胃肠道是人体最大的免疫器官，也是人体最大的排毒器官。胃肠道指的是从胃幽门至肛门的消化管。肠是消化管中最长的一段，也是功能最重要的一段。自改革开放以来，随着经济的高速发展，社会竞争的日趋激烈，人们生活节奏的加快和工作压力的增大而导致的胃肠道类疾病问题日渐普遍。截止目前为止，该类疾病已成为临床的常见病和多发病，总发病率约占总人口的20％左右；年龄越大，该类疾病的发病率越高，且男性高于女性，如不及时治疗，长期反复发作，胃肠道类疾病极易转化为癌肿。胃肠类疾病历来被医家视为疑难之症，该类疾病越早被发现，患者的治愈率也将越高。因此以快速且有效的方法对活体模式生物的胃肠道进行特异性标记，将有助于胃肠道类疾病的早期诊断和特效药物的研发，也具有非常重要的社会效益和广阔的市场前景。
目前在人口健康领域应用最广泛的模式生物包括噬菌体、秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等。其中由于噬菌体、秀丽隐杆线虫和果蝇等模式生物与人类的亲缘关系较远；在基因水平及组织器官构成等方面，它们与人类也有着较大的差距；因此通常不利用以上三种模式生物作为实验动物对胃肠道进行研究。小鼠是一种小型啮齿类的哺乳动物，虽然在进化上与人类的距离较近，且解剖结构和发育过程等也与人类接近。但是由于小鼠属于体内受精、体内发育，且繁育周期较长。因此以其作为实验动物对胃肠道进行特异性标记及研究时，通常费时费力。小鼠胃肠道被特异性标记后，其结果的观察只能是将实验动物处死后，在体外进行；或是利用影像技术间接观察活体小鼠的胃肠道。以上过程均周期较长且成本较高，实验结果缺乏直观性。
中国专利文献CN103301480A(申请号201310181252.4)公开了一种斑马鱼肠蠕动模型的建立方法及筛选促胃肠动力药物的方法，包括(1)斑马鱼选取；(2)模型诱导及化合物处理；(3)荧光显微镜定量分析。该方法选择斑马鱼作为实验动物，利用尼罗红作为染料标记其胃肠道。但是该方法优选的标记时间为16h，整个实验周期较长。
鉴于以上研究方法的不足，建立一个可快速、特异性对活体模式生物胃肠道进行标记的方法；使得既缩短实验周期、降低研究成本，又能增加实验结果观察的可靠性和直观性是目前亟待解决的技术难题。
斑马鱼(Daniorerio)是源自印度、巴基斯坦淡水河流中的一种小型热带淡水鱼，属于鲤科，是生命科学领域的重要脊椎动物之一，现已被美国国家卫生研究院列为继人和小鼠之后的第三大模式生物。在基因组水平上，斑马鱼与人类具有高达87％的同源性，约70％的人类基因在斑马鱼中至少有一个明显的同源基因。在生理结构、信号通路传导和蛋白质功能等方面，斑马鱼与人类相比也表现出很高的保守性。与小鼠相比，斑马鱼体外受精、体外发育、胚胎透明，整个发育过程清晰可见，且产卵量高，发育周期短。因此以斑马鱼作为实验动物对胃肠道进行特异性标记及研究，既经济又快速，且结果直观，易于观察。
在胃肠道的细胞功能和解剖结构等方面，斑马鱼与人类非常相似，均由内皮细胞、结缔组织、环状肌和外纵肌组成。斑马鱼胚胎发育至26-126hpf，其肠道的管腔形成，并不断生长，功能性肠道上皮由内胚层逐渐分化形成。斑马鱼胚胎发育至72hpf，在未喂食状态下，其肠道首次出现不稳定的自发性收缩。伴随着胚胎发育的进行，至120-144hpf，斑马鱼胚胎的大部分卵黄囊被吸收，肠道自发的蠕动及摄食能力增强。由于斑马鱼胚胎体外发育且透明，因此在早期发育阶段，其胃肠道均易于观察。
钙黄绿素又名3,3'-双(甲胺二乙酸)荧光素。它是一种荧光指示剂，常用于络合滴定钙，也可用于检测镍、锶、铜、钡、钼、锰等元素。由于钙黄绿素具有很低的细胞毒性，且不会抑制任何的细胞功能，因此是一种常用的活细胞荧光染料。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用钙黄绿素作为荧光标记物特异性标记斑马鱼胃肠道的方法。本发明可以在不对模式生物造成机械伤害和强烈应激反应伤害的前提下，对活体动物的胃肠道进行快速且特异性的标记。
为实现本发明的目的，发明人提供如下技术方案：
一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法，步骤如下：
(1)挑选受精120～144hpf发育正常的斑马鱼胚胎，放入含有培养液的培养容器中，加入钙黄绿素溶液，调钙黄绿素的质量浓度为0.15％～0.25％；
(2)在23℃～27℃的恒温条件下避光孵育斑马鱼胚胎9～11min，然后用培养液清洗，制得标记后的斑马鱼胚胎；
(3)将步骤(2)制得的标记后的斑马鱼胚胎麻醉，利用图像采集工具，对斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道部分进行影像采集并保存。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所述斑马鱼胚胎为健康野生型AB系斑马鱼胚胎。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，斑马鱼胚胎为受精144hpf发育正常的斑马鱼胚胎。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，培养容器为标准规格的细胞培养板；进一步优选的，所述培养容器为标准规格的6孔或12孔细胞培养板。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所用钙黄绿素溶液的质量浓度为0.2％。
根据本发明优选的，所述步骤(1)和(2)中，所述培养液为胚胎培养水，包括如下组分：
NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgSO4 0.16mM，去离子水配制。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，避光孵育的恒温条件为25℃。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，避光孵育斑马鱼胚胎的时间为10min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，培养液清洗次数为2～3次。清洗2～3次后培养孔中看不到钙黄绿素的黄绿色荧光。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，麻醉采用的麻醉剂为三卡因(tricaine，ethyl3-aminobenzoate methanesulfonate)。
根据本发明进一步优选的，上述麻醉剂的使用质量浓度为0.02％。在该麻醉剂的浓度下，斑马鱼胚胎完全进入麻醉状态，便于结果观察。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，影像采集工具为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
有益效果
1、本发明首次利用钙黄绿素作为荧光标记物对斑马鱼胃肠道进行标记，该标记物安全可靠、毒性极低，可以在不对活体模式生物造成机械伤害或强烈应激反应伤害的前提下，对胃肠道进行快速且特异性的标记；
2、本发明首次对钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的影响因素进行了研究，发现对钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的影响因素与在骨骼沉积等方式进行染色的影响因素不相同，通过对相关条件进行优化后，获得了能够得到胃肠道轮廓清晰、清楚可见、易于辨识的结果的标记方法；
3、本发明所述的一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法，具有操作快速、简便、稳定可靠、成功率高和重复性好等优点，可使活体模式生物胃肠道的观察更为直观、便捷，提高胃肠道类药物研发的准确性和可靠性。
4、本发明选择发育至120-144hpf的斑马鱼胚胎，其大部分卵黄囊被吸收，肠道自发的蠕动及摄食能力增强；将此发育阶段的斑马鱼胚胎暴露于钙黄绿素溶液中，活体胚胎的胃肠道可被钙黄绿素特异性标记，发出绿色荧光，整个胃肠道轮廓清晰，易于辨认。
附图说明
图1为不同浓度钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道后荧光显微镜下的照片；
图中：A为空白对照组的照片，方框中标记的为胃肠道部分；
B为钙黄绿素质量浓度为0.1％的标记组的照片，方框中标记的为胃肠道部分；
C为钙黄绿素质量浓度为0.2％的标记组的照片，方框中标记的为胃肠道部分；
D为钙黄绿素质量浓度为0.4％的标记组的照片，方框中标记的为胃肠道部分，星号表示除胃肠道外其他被钙黄绿素标记的部位；
图2为质量浓度0.2％的钙黄绿素在不同温度下标记斑马鱼胃肠道后的照片；
图中：A为空白对照组的照片，方框中标记的为胃肠道部分；
B为在20℃避光孵育10min的照片，方框中标记的为胃肠道部分；
C为在25℃避光孵育10min的照片，方框中标记的为胃肠道部分；
D为在30℃避光孵育10min的照片，方框中标记的为胃肠道部分；星号表示除胃肠道外，其他被钙黄绿素标记的部位；
图3为质量浓度0.2％的钙黄绿素在不同时间内，标记斑马鱼胃肠道后的照片；
图中：A为空白对照组的照片；方框中标记的为胃肠道部分；
B为质量浓度0.2％钙黄绿素标记5min后的照片；方框中标记的为胃肠道部分；
C为质量浓度0.2％钙黄绿素标记10min后的照片；方框中标记的为胃肠道部分；
D为质量浓度0.2％钙黄绿素标记15min后的照片：方框中标记的为胃肠道部分，星号表示除胃肠道外，其他被钙黄绿素标记的部位。
图4为质量浓度0.2％的钙黄绿素在25℃条件下，标记斑马鱼胃肠道10min后的照片；
图中：A为空白对照组的照片；方框中标记的为胃肠道部分；
B为质量浓度0.2％钙黄绿素25℃条件下，标记10min后的照片；方框中标记的为胃肠道部分；
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实验动物：所用野生型AB系健康斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中心，雌雄斑马鱼在28℃，14h光照/10h黑暗条件下分开养殖，每日于9：30(am)和4:30(pm)分别喂食两次丰年虫。用卵时，于前日将健康成熟斑马鱼按雌雄比1：1或1：2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵。排卵后半小时将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗，随后将受精卵置于28℃培养箱内，保持14h光照/10h黑暗周期培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。
试剂配制：钙黄绿素购自美国Sigma公司，用胚胎培养水溶解后，配制成质量浓度为1％的储液。
胚胎培养水组分如下：
NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgSO4 0.16mM，去离子水配制。
实施例1：不同浓度钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道
1、斑马鱼样本前处理：
采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1：1或1：2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼捞出，将排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗；随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎培养用水中，28℃下、14h光照/10h黑暗周期下控光培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后6天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每组3个平行孔。
2、斑马鱼样本活体标记
设置四个实验组：1个空白对照组，3个钙黄绿素标记组。移除6孔板中的培养水，空白对照组添加6ml新的胚胎培养水；钙黄绿素标记组添加6ml新的胚胎培养水，并分别加入质量浓度为0.1％、0.2％和0.4％的钙黄绿素溶液，由培养水与相应浓度的钙黄绿素储液配制获得；将以上各实验组斑马鱼胚胎分别放入25℃恒温培养箱中，恒温避光孵育10min。
3、清洗多余荧光标记物
10min标记结束后，将各钙黄绿素标记组胚胎中的钙黄绿素溶液吸除，加胚胎培养水分别清洗空白对照组和钙黄绿素标记组斑马鱼胚胎2-3次，至看不到各培养孔中钙黄绿素的黄绿色荧光为止。
4.斑马鱼胃肠道观察
利用质量浓度为0.02％的三卡因溶液将上述四组斑马鱼胚胎麻醉。在荧光显微镜的可见光与荧光同时开启条件下，观察并采集斑马鱼胚胎胃肠道部位的图像，结果如图1所示。
由图1A可以看出，空白对照组斑马鱼未经钙黄绿素标记，因此其胃肠道不呈现绿色荧光；
由图1B可以看出，斑马鱼被质量浓度为0.1％的钙黄绿素标记后，部分胃肠道呈现绿色荧光；
由图1C可以看出，斑马鱼被质量浓度为0.2％的钙黄绿素标记后，整个胃肠道均呈现绿色荧光，且整个胃肠道标记均匀，轮廓清晰，易于辨识；
由图1D可以看出，斑马鱼被质量浓度为0.4％的钙黄绿素标记后，其胃肠道整体均呈现绿色荧光，但是除胃肠道外，斑马鱼的其他部位亦呈现绿色荧光。
实施例2：质量浓度0.2％的钙黄绿素不同温度下标记斑马鱼胃肠道
1、斑马鱼样本前处理：
采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1：1或1：2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼捞出，将排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗；随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎培养用水中，28℃下、14h光照/10h黑暗周期下控光培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后6天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每组3个平行孔。
2、斑马鱼样本活体标记
设置四个实验组：1个空白对照组，三个钙黄绿素标记组。移除6孔板中的培养水，空白对照组添加6ml新的胚胎培养水；钙黄绿素标记组添加6ml新的胚胎培养水，并分别加入质量浓度为0.2％的钙黄绿素溶液，由培养水与相应浓度的钙黄绿素储液配制获得；将以上各钙黄绿素标记组斑马鱼胚胎分别放入20℃、25℃和30℃的恒温培养箱中，空白对照组斑马鱼胚胎放入30℃恒温培养箱中。以上各实验组斑马鱼胚胎分别恒温避光孵育10min。
3、清洗多余荧光标记物
10min标记结束后，将各钙黄绿素标记组胚胎中的钙黄绿素溶液吸除，加胚胎培养水分别清洗空白对照组和钙黄绿素标记组斑马鱼胚胎2-3次，至看不到各培养孔中钙黄绿素的黄绿色荧光为止。
4.斑马鱼胃肠道观察
利用质量浓度为0.02％的三卡因溶液，将上述五组斑马鱼胚胎麻醉。在荧光显微镜的可见光与荧光同时开启条件下，观察并采集斑马鱼胚胎胃肠道部位的图像，结果如图2所示。
由图2A可以看出，空白对照组中，发育6天斑马鱼未经钙黄绿素标记，30℃避光孵育10min后，其胃肠道不呈现绿色荧光，显微镜下轮廓模糊，不易与其它脏器相互区分。
由图2B可以看出，斑马鱼胚胎20℃条件下经钙黄绿素标记10min后，其胃肠道部分被特异性标记，呈现绿色荧光。显微镜下显示，此时靠近斑马鱼胚胎前端的胃肠道可特异性呈现荧光，该位置的胃肠道轮廓清晰，易于观察。越靠近斑马鱼胚胎的尾端，其胃肠道呈现的荧光强度越低，该位置的胃肠道轮廓也越模糊，不易观察。
由图2C可以看出，斑马鱼胚胎25℃条件下经钙黄绿素标记10min后，其胃肠道整体均被特异性标记，呈现较强绿色荧光。显微镜下显示，此时斑马鱼胚胎整个胃肠道中荧光分布均匀特异，胃肠道轮廓清晰，易于辨识。
由图2D可以看出，斑马鱼胚胎30℃条件下经钙黄绿素标记10min后，其胃肠道整体均被特异性标记，呈现绿色荧光；但是除胃肠道，斑马鱼胚胎的其他部位，特别是其硬骨部分亦呈现绿色荧光。
实施例3：质量浓度0.2％的钙黄绿素不同时间内标记斑马鱼胃肠道
1、斑马鱼胚胎的获得与使用
采用健康性成熟的AB系斑马鱼，按雌雄1：1或1：2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵半小时后将成鱼捞出，将排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，并用新的斑马鱼胚胎培养水冲洗3遍，对受精卵进行消毒和清洗；随后将受精卵移入干净的斑马鱼胚胎培养用水中，28℃，14h光照/10h黑暗周期下控光培养，中间每24h换约1/3水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后6天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼胚胎，放入6孔板中，每孔20尾，每组3个平行孔。
2、斑马鱼样本活体标记
设置四个实验组：1个空白对照组，3个钙黄绿素标记组。移除6孔板中的培养水，空白对照组添加6ml新的胚胎培养水；钙黄绿素标记组添加6ml新的胚胎培养水，并分别加入质量浓度为0.2％的钙黄绿素溶液，由培养水与相应浓度的钙黄绿素储液配制获得；将以上各实验组斑马鱼胚胎分别放入25℃恒温培养箱中，空白对照组斑马鱼胚胎恒温避光孵育15min；3组钙黄绿素标记组斑马鱼胚胎分别恒温避光孵育5min、10min及15min。
3、清洗多余荧光标记物
标记结束后，将各钙黄绿素标记组胚胎中的钙黄绿素溶液吸除，加胚胎培养水分别清洗空白对照组和钙黄绿素标记组斑马鱼胚胎2-3次，至看不到各培养孔中钙黄绿素的黄绿色荧光为止。
4、斑马鱼胃肠道观察
利用质量浓度为0.02％的三卡因溶液将上述四组斑马鱼胚胎麻醉。在荧光显微镜的可见光与荧光同时开启条件下，观察并采集斑马鱼胚胎胃肠道部位的图像，结果如图3所示。
由图3A可以看出，空白对照组斑马鱼未经钙黄绿素标记，25℃避光孵育15min后，其胃肠道不呈现绿色荧光；
由图3B可以看出，用质量浓度为0.2％的钙黄绿素标记5min后，斑马鱼的部分胃肠道被标记，呈现绿色荧光；
由图3C可以看出，用质量浓度为0.2％的钙黄绿素标记10min后，斑马鱼整个胃肠道均被特异性标记，呈现绿色荧光，且胃肠道中的荧光分布均匀，胃肠道轮廓清晰，易于辨识；
由图3D可以看出，用质量浓度为0.2％的钙黄绿素标记15min后，斑马鱼胃肠道整体均呈现绿色荧光，但是其他部位亦被绿色荧光所标记。
实施例4:一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法，步骤如下：
1、挑选受精144hpf发育正常的健康野生型AB系斑马鱼胚胎，放入含有胚胎培养水的标准规格的12孔细胞培养板中，加入钙黄绿素溶液，调钙黄绿素的质量浓度为0.2％；
2、在25℃的恒温条件下避光孵育斑马鱼胚胎10min，然后用胚胎培养水清洗2～3次，制得标记后的斑马鱼胚胎；
3、将步骤2制得的标记后的斑马鱼胚胎用质量浓度为0.02％的三卡因麻醉，利用荧光显微镜对斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道部分进行影像采集并保存，结果如图4所示。
由图4A可以看出，空白对照组斑马鱼未经钙黄绿素标记，25℃避光孵育10min后，其胃肠道不呈现绿色荧光；
由图4B可以看出，25℃条件下，用质量浓度为0.2％的钙黄绿素标记10min后，斑马鱼胃肠道整体均被特异性标记，呈现绿色荧光。显微镜下显示，此时斑马鱼胚胎整个胃肠道中荧光分布均匀特异，胃肠道轮廓清晰，易于辨识。
由上述实施例的结果可以看出，本发明所述的利用钙黄绿素在活体斑马鱼中特异性标记胃肠道的方法具有以下优点：(1)首次利用钙黄绿素将斑马鱼的胃肠道进行了特异性标记。钙黄绿素0.2％的质量浓度下，25℃恒温避光标记10min后，活体斑马鱼的胃肠道可被特异性标记。标记后的胃肠道清晰可见，便于结果观察。(2)钙黄绿素安全可靠。质量浓度0.2％时，该标记物对活体动物不具毒害作用，标记结束后活体动物可以继续培育，并不影响后续实验。(3)钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道10min内即可完成，时间较短，有效的缩短了实验周期。(4)钙黄绿素进入体内特异性标记胃肠道，是通过直接加入养鱼水中进行的，因此操作简便。
Claims (12)
1.一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）挑选受精144hpf发育正常的斑马鱼胚胎，放入含有培养液的培养容器中，加入钙黄绿素溶液，调钙黄绿素的质量浓度为0.15%～0.25%；
（2）在23℃～27℃的恒温条件下避光孵育斑马鱼胚胎9～11min，然后用培养液清洗，制得标记后的斑马鱼胚胎；
（3）将步骤（2）制得的标记后的斑马鱼胚胎麻醉，利用图像采集工具，对斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道部分进行影像采集并保存。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述斑马鱼胚胎为健康野生型AB系斑马鱼胚胎。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，培养容器为标准规格的细胞培养板。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养容器为标准规格的6孔或12孔细胞培养板。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所用钙黄绿素溶液的质量浓度为0.2%。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和（2）中，所述培养液为胚胎培养水，包括如下组分：
NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgSO4 0.16mM，去离子水配制。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，避光孵育的恒温条件为25℃。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，避光孵育斑马鱼胚胎的时间为10min。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，培养液清洗次数为2～3次。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，麻醉采用的麻醉剂为三卡因。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述麻醉剂的使用质量浓度为0.02%。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，影像采集工具为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
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