CN107875403A

CN107875403A - 一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法与应用

Info

Publication number: CN107875403A
Application number: CN201711045035.7A
Authority: CN
Inventors: 郭新波; 王怀玲; 刘瑞海
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2018-04-06

Abstract

本发明公开了一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法与应用。涉及对植物化学物质、抗衰老药物及保健品等的性能评价方法。本发明在没有毒性的浓度下，评估待测物质的抗衰老效果。采用本评估方法，能够在短期内评价待测物质是否具有抗衰老活性。主要通过检测秀丽隐杆线虫的寿命，热应激能力，抗紫外辐照能力，抗氧化损伤能力，繁殖力，身体长度以及脂褐素含量来进行评价。本发明的优点在于模式生物秀丽隐杆线虫生长周期短，抗衰老效果在数周内可迅速观察，实验周期短，操作简便。

Description

一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法与应用

技术领域

本发明属于动物模型技术领域，具体涉及一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法与应用。

背景技术

衰老被定义为各项功能和对环境的适应能力的丢失。社会概念上的衰老包含由于行动力，意识和感觉功能等独立生活能力的丧失。衰老可导致疾病的发生包括肿瘤，心血管疾病，代谢疾病以及神经退行性疾病。由于这些条件的影响，人们对老年人的尊敬和崇拜已经被推迟，停止，甚至扭转。市场上推广的通过饮食，运动，补充和激素治疗可延缓衰老的副作用的抗药物受到广泛的关注。

衰老是一个受多方面因素调控的过程，许多理论试图去解释这一过程。目前为止，衰老的生物机制的研究尚不明确。氧化应激，细胞老化和慢性炎症都可能是诱导衰老的因素。自由基是产生细胞氧化应激的主要因素，自由基是氧气和氮气的中间态，可以损伤细胞膜和内部结构，1956年，Harman提出自由基在衰老中的作用。正常的细胞代谢可以产生自由基，并被细胞内自身的还原剂清除，如谷胱甘肽。在快速呼吸过程中，中性粒细胞释放大量的超氧离子形成过氧化氢和次氯酸以中和体内的入侵物质，如细菌，同时约1-2 %的氧气在呼吸作用过程中形成活性氧ROS。在呼吸作用过度或不正常激活的情况下，氧化剂与还原剂种类的比例提高可导致细胞损伤。这是由于中性粒细胞在调节ROS产生过程中信号转导级联介质cGMP和cAMP的不平衡导致的。并且50岁以上的人体细胞中前炎症因子cGMP的活性高于抗炎症因子cAMP。另外，ROS可影响蛋白质的稳态，促进细胞内损伤的蛋白积累可进一步导致蛋白的错误折叠和聚合，同时有研究表明胰岛素样生长因子信号通路可保护神经细胞免受蛋白毒性。

1961年，Hayflich首次阐述细胞衰老，对衰老机制的研究做出了重要贡献。在细胞复制过程中，由于DNA的不完全复制和末端的降解，总会有一小部分的端粒DNA的丢失，端粒DNA的长度随着复制代数的增加而缩短，当端粒DNA的长度缩短到一定的限度后，细胞就会出现不可逆的局限和停滞。由于细胞分化的缺陷，已经损伤细胞不可能被新的细胞替换，随之细胞出现衰老。另外由于端粒长度的缩减，DNA的损伤，肿瘤的形成，以及肿瘤抑制剂的刺激导致细胞的衰老。肿瘤抑制基因P53在肿瘤形成过程中也被激活。同时小鼠实验研究表明：P53的过表达可诱导衰老并且大大缩短了小鼠的寿命。

免疫系统可清除年轻个体中的衰老细胞，但是在衰老个体中衰老细胞被新的衰老细胞代替，使这一过程似乎停滞或淹没。人类对衰老机制的研究始于整体水平和器官水平，主要表现为机体形态结构和功能两方面出现的一系列退行性改变，细胞凋亡或坏死导致细胞数量减少，脏器萎缩，组织弹性减低等，从而进一步引起多种器官生理功能的逐步减退。各种学说认为无论是从生物个体水平，还是从细胞与分子水平，它们相互之间并非对立，而是互为因果、相互补充或同时作用，但都有其局限性。

秀丽隐杆线虫是一种常见的、自由生活的小型土壤线虫。在理想的条件下（充足食物，20℃）生命周期很短，大约为4天。秀丽隐杆线虫成体长1-1.5 mm，体宽约70 μm，全身透明，以细菌为食，全身共有959个细胞。卵在通过受精囊时受精形成一层坚硬的几丁质的外壳，在母体内就开始分裂。从母体产出的卵大约处于30个细胞期。胚胎发生很有规律，从卵中孵化出约有550个细胞的幼虫。从孵化到成虫，线虫要经历4个幼虫阶段（L1～L4）和4次蜕皮，这个过程中身体大小和细胞数目两方面都有增长。蜕皮的时间（20℃）分别是孵化后13、21.5、29.5和41 h；身体长度分别是350、470、640和890 μm。秀丽隐杆线虫孵化后约50 h开始产卵，每个雌雄同体可产200到300卵。研究用的通常是秀丽隐杆线虫野生型（N2）。秀丽隐杆线虫性别是由常染色体和性染色体组的比例决定，有两种性别形式：雌雄同体和雄虫。雌雄同体的性染色体为XX，而雄虫性染色体为X0。雌雄同体的秀丽隐杆线虫既产生卵，又产生精子，可以与雄体交配，也可以自体受精进行繁殖，但雌雄同体之间不能异体受精。在雌雄同体自交繁殖中以0.2 %的频率产生雄体（是减数分裂时性染色体不分开造成的）；而雄体与雌雄同体交配其后代两种性别比例为1:1。

从1965年开始，Sydney Brenner以线虫为材料研究发育和神经生物学，现在已经成为经典模式生物之一。1974年Sydney Brenner绘制了秀丽隐杆线虫的基因图谱。此后进行了一系列对秀丽隐杆线虫生物学功能的研究包括细胞程序化死亡的分析、全DNA序列的解码以及基因组系统克隆等方面。在过去的30年间，衰老分子机制的研究慢慢成为研究工作的焦点，而秀丽隐杆线虫成为主要的模式生物，从最初的对增寿单基因突变的鉴定，到对胰岛素样生长因子信号通路影响寿命作用的发现，为当前许多对衰老分子机制的理解提供了基础和最初的观察。秀丽隐杆线虫之所以可以作为研究衰老调控机制十分有用的模式生物，主要在于线虫随着年龄的增加，会表现出行为迟缓，生理功能减退等现象，这一点与高等哺乳动物十分相似，当然也包括人类。当秀丽隐杆线虫逐渐衰老，会出现肌肉萎缩，肌组织逐渐受损，体内氧化蛋白和脂褐质的逐渐积累，衰老的特征普遍与其他物种类似。在衰老相关的基因与蛋白水平，秀丽隐杆线虫与人类具有80%的同源性。其生命周期短暂，适合短期内构建验证实验。同时秀丽隐杆线虫也是研究药物药理学和药物影响基因表达的理想的模式生物。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法。

本发明的另一目的在于提供上述抗衰老评价方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现。

一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，包括如下步骤：向涂布有大肠杆菌OP50的NGM培养板中加入待测物质，再加入秀丽隐杆线虫培养，观察秀丽隐杆线虫的生存状况。

优选的，所述待测物质的用量为100 μL。

优选的，所述待测物质的浓度为50 mg/mL，100 mg/mL和200 mg/mL。

优选的，所述加入待测物质的方式是液体给药。

优选的，所述液体给药的具体方式为：在挑取秀丽隐杆线虫之前半个小时，取待测物质加到NGM培养板的大肠杆菌OP50上。

优选的，所述待测物质为蓝莓提取物。

优选的，所述秀丽隐杆线虫是年轻成虫期的秀丽隐杆线虫。

优选的，所述培养的温度为20℃。

优选的，所述观察秀丽隐杆线虫的生存状况包括观察秀丽隐杆线虫的寿命，热应激能力，抗紫外辐照能力，抗氧化损伤能力，繁殖力，身体长度以及脂褐素含量，再确定模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老模型构建方法的稳定性和可靠性，确定最佳的实验条件，即获得低损伤性，高效，稳定，可靠的模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老模型。

由以上所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法在筛选抗衰老药物或保健品中的应用。

优选的，一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，包含如下步骤：

1、大肠杆菌OP50的活化和涂平板

（1）打开超净工作台的紫外灯5 min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取一个无菌的15mL离心管，用移液器加入10 mL LB液体培养基，再向其中加入100 μL大肠杆菌OP50。将15mL离心管放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（8～12 h）。

（2）大肠杆菌OP50涂平板

大肠杆菌OP50振荡培养过夜后，操作之前打开超净工作台的紫外灯5 min进行灭菌操作。用移液器取100 μL菌液加入到NGM培养基平板中，轻微转动平板使菌液散开。将接种后的平板置于37℃恒温培养箱中培养8 h。

2、NGM培养板中接种秀丽隐杆线虫

线虫的传代，20℃生化培养箱培养，超净台无菌操作，生长在NGM培养基中，杜绝培养基的微生物污染。大批量线虫传代时，配制新鲜NGM培养基，均匀的涂布OP50大肠杆菌，然后用灭菌手术刀切取一小块含有线虫的旧培养基，倒置贴附在新鲜培养基的表面，20℃静置培养即可。

3、待测物质浓度筛选

将上述准备好的涂布有OP50的NGM培养板加入100 μL不同浓度待测物质，培养基含150μM浓度的五氟尿嘧啶。并且在准备挑虫子前加入不同浓度的待测物质。每板挑30条秀丽隐杆线虫，每组3板。观察秀丽隐杆线虫的生存状况。

4、秀丽隐杆线虫的寿命实验

收集同期化L4期秀丽隐杆线虫，配制涂布OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的不同浓度待测物质的NGM培养基，设空白对照组，培养基含150 μM浓度的五氟尿嘧啶，抑制秀丽隐杆线虫繁殖。挑取秀丽隐杆线虫至NGM培养基上，每板40条，每组3板。同期化L4期给药记为寿命d0，每1天定点计数1次，挑出正常死亡的秀丽隐杆线虫，剔除异常的秀丽隐杆线虫。直至秀丽隐杆线虫全部死亡为止，停止计数，实验重复3次，绘制秀丽隐杆线虫寿命曲线。

5、待测物质对秀丽隐杆线虫体内脂褐素含量和身体长度的影响

收集同期化L4期秀丽隐杆线虫到配制涂布OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的不同浓度的待测物质的NGM培养基，设空白对照组，以下培养基含150 μM的五氟尿嘧啶，抑制秀丽隐杆线虫繁殖。20℃培养6~7 d。

配制1wt %浓度的琼脂糖凝胶，在载玻片上压出一层薄平面，滴加20 μL 0.5 mM浓度的NaN₃溶液，每个平面挑取3~5条线虫，荧光显微镜下，正常视野拍摄秀丽隐杆线虫图片，分析处理秀丽隐杆线虫长度和脂褐素含量。每组8条秀丽隐杆线虫，实验重复3次。

在倒置荧光显微镜紫外滤光片下可见秀丽隐杆线虫体内脂褐素自发绿色荧光，由待测物质处理4天的秀丽隐杆线虫脂褐素荧光图像及相对荧光值可得，随着寿命的增长，秀丽隐杆线虫体内的脂褐素含量日渐增多，造成秀丽隐杆线虫机体的损伤。

6、待测物质对秀丽隐杆线虫繁殖力的影响

收集同期化L4期秀丽隐杆线虫至配制涂布OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的不同浓度NGM培养基，设空白对照组。每个NGM培养板上挑取1条虫子，在20℃培养，在实验后每天进行转至新的培养板，并保留旧的培养板，在第二天对第一天的板进行计数，接下来几天依次进行如上操作，记录每条虫子的总的产卵量。实验总共进行5天，实验重复3次，统计不同浓度处理组及空白组秀丽隐杆线虫不同时期繁殖幼虫数量。秀丽隐杆线虫一般在L4期开始的前4d具有繁殖能力，且随着寿命的增长，繁殖力是逐渐降低直至丧失。

7、待测物质对热急性损伤秀丽隐杆线虫的保护作用

同期化收集L4期秀丽隐杆线虫至挑取线虫至含待测物质并接种OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的NGM培养基中，培养基含150 μM浓度的五氟尿嘧啶，每板40条，每组3板。20℃给药培养4~5 d后，挑取秀丽隐杆线虫转移到新的NGM培养基中，37℃培养。每小时计数1次，挑出死亡秀丽隐杆线虫并计数。直至秀丽隐杆线虫全部死亡为止，实验重复3次，绘制秀丽隐杆线虫寿命曲线。

8、待测物质对紫外辐射损伤秀丽隐杆线虫的保护作用

收期化收集L4期秀丽隐杆线虫至挑取秀丽隐杆线虫至涂布含待测物质并涂有OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的NGM培养基上，每板30条，每组3板。给药培养4~5 d后，挑取秀丽隐杆线虫转移到空白的新鲜NGM培养基中。将秀丽隐杆线虫置于辐射强度为120 mj/cm²紫外线UVB下辐照。每1小时计数1次，挑出死亡秀丽隐杆线虫并计数。直至秀丽隐杆线虫全部死亡为止，实验重复3次，绘制秀丽隐杆线虫寿命曲线。

蓝莓提取物可明显延长秀丽隐杆线虫的寿命，不同浓度蓝莓提取物溶液可明显减低秀丽隐杆线虫体内脂褐素的含量，同时秀丽隐杆线虫的身体有不同程度的缩短。

本发明的原理：秀丽隐杆线虫的生命周期短，繁殖力强。在20℃的生长环境下，从卵发育成成虫需要60 h左右，正常生长环境下，整个生命周期大约在20天左右，对外界环境要求不高，相对容易培养。根据其整个生长周期的生长变化，随着寿命的延长，体内脂褐素的含量也会升高，可以作为评价秀丽隐杆线虫额衰老程度的指标。

本发明评估待测物质是否具有抗衰老活性要经过以下几种方法来确定，第一，该浓度下对秀丽隐杆线虫无毒性；第二，该浓度下是否可以延长秀丽隐杆线虫的寿命；第三，该浓度下在同一时间点秀丽隐杆线虫体内的脂褐素的含量是否低于正常对照物；第四，该浓度下秀丽隐杆线虫的热应激能力是否提高；第五，该浓度下秀丽隐杆线虫的抗辐射能力是否提高；第六，该浓度下秀丽隐杆线虫在同一时间内体内的抗氧化酶的含量是否提高；第七，该浓度下秀丽隐杆线虫应对氧化损伤的能力是否提高。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明的模式生物秀丽隐杆线虫具有生命周期短，抗衰老效果在数周内可迅速观察，实验周期短，操作简便，易于培养，成本低的特点。

2、本发明主要通过检测待测物质对秀丽隐杆线虫的寿命的影响，就能够在短期内评价待测物质是否具有抗衰老活性。其准确性，快速性是现有评价方法无法比拟的，该抗衰老模型可广泛应用于筛选抗衰老药物及保健品中。

附图说明

图1是秀丽隐杆线虫的寿命曲线图。

图2a、图2b、图2c、图2d是秀丽隐杆线虫的体长照片。

图3a、图3b、图3c、图3d是秀丽隐杆线虫的脂褐素含量照片。

图4是秀丽隐杆线虫的繁殖力图。

图5是秀丽隐杆线虫的急性热应激曲线图。

图6是秀丽隐杆线虫的紫外辐照损伤曲线图。

图7是秀丽隐杆线虫的氧化损伤曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

所述的培养基为 NGM培养基， 100 mL NGM（Nematode Growth Medium）培养基的配制方法如下：NaCl 0.3 g，胰蛋白胨 0.25 g，琼脂粉1.7 g，加入蒸馏水97.2 mL，121℃灭菌30 min，70℃恒温10 min，然后加入下列溶液（均已高温灭菌）：1mol/L的CaCl₂溶液（取1.11 g CaCl₂加l0 mL蒸馏水）0.1 mL，1 mol/L的MgSO₄溶液（取2.46 g MgSO₄•7H₂O加l0 mL蒸馏水）0.1 mL，1 mol/L磷酸钾缓冲液 (取K₂HPO₄•3H₂O 2.33 g，KH₂PO₄ 5.42 g加50 mL蒸馏水，调pH至6.0) 2.5 mL，5 mg/mL的胆固醇无水乙醇溶液（取0.05 g胆固醇加l0 mL无水乙醇，抽滤除菌）0.2 mL。

LB (100 mL)液体培养基的配制：胰蛋白胨1 g，NaCl 1 g，酵母粉0.5 g，加入蒸馏水至l00 mL，调节pH至7.0，121℃灭菌30 min。LB固体培养基需在LB (100 mL)液体培养基的配制过程中另外加入1.5 g琼脂粉。

实施例1

一、蓝莓提取物制备

选取蓝莓鲜果，将表面擦净，避免造成破损。称取20 g洗净的蓝莓鲜果和体积分数为80%的丙酮溶液200 mL混合，用组织捣碎机破碎提取蓝莓鲜果中的活性成分5 min，然后将溶质和渣滓转移到烧杯中，再用均质机均质3 min，转速6000 r/min。旋转蒸发后用25 mL体积分数为70%的酒精定容，分装后-40℃存放。

二、基于模式生物水平秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法

1、大肠杆菌OP50的活化和涂平板

（1）打开超净工作台的紫外灯5 min，之后关闭紫外灯开始无菌操作。取一个灭菌后的15 mL离心管，用移液器向其加入灭菌后的10 mL LB液体培养基，再向其中加入100 μL大肠杆菌OP50。将15 mL离心管放入37℃恒温摇床中振荡培养过夜（10 h）。获得大肠杆菌培菌液，测定OD600在0.8-1.2之间。

（2）大肠杆菌OP50涂平板

大肠杆菌OP50振荡培养过夜后，操作之前打开超净工作台的紫外灯5 min进行灭菌操作。用移液枪移取100 μL菌液加入到NGM培养板中，轻微转动平板使菌液散开。将接种后的平板置于37℃恒温培养箱中培养8 h。

（3）在含OP50的NGM培养板中加入不同浓度的蓝莓提取物

将上述准备好的NGM培养板加入不同浓度蓝莓提取物，每个NGM培养板中加入100 μL不同浓度蓝莓提取物加在菌液上，并轻微转动平板使蓝莓提取物在菌液上均匀散开。在准备挑秀丽隐杆线虫（以下秀丽隐杆线虫称为线虫）前进行加药处理。

2、NGM培养板中接种秀丽隐杆线虫

3、蓝莓提取物浓度的筛选

收集同期化的L4期的秀丽隐杆线虫，筛选蓝莓提取物的浓度，稀释一系列浓度，浓度分别为1g/mL，750 mg/mL，500 mg/mL，400 mg/mL，300 mg/mL，200 mg/mL，100 mg/mL，50 mg/mL，每个涂布OP50的NGM培养板加100 μL蓝莓提取物。每个NGM培养板上挑取40条秀丽隐杆线虫，观察线虫的行动力，存活能力。连续观察5天。

实验结果可知，当蓝莓提取物的浓度＞500 mg/mL时，作用于秀丽隐杆线虫1 d后，秀丽隐杆线虫的行动力明显下降，用铂金丝轻触碰秀丽隐杆线虫的头部和尾部，反应明显迟缓，蓝莓提取物作用2 d后，用铂金丝轻触秀丽隐杆线虫无反应。当蓝莓提取物作用2 d时，其浓度＞200 mg/mL时，用铂金丝轻触秀丽隐杆线虫的头部时反应迟缓，在作用4d时，用铂金丝轻触秀丽隐杆线虫的头部和尾部无明显的反应。根据以上结果可知，当蓝莓提取物的浓度＞200 mg/mL时，均会影响秀丽隐杆线虫的正常生活状态，故最后确定的蓝莓提取物的浓度为200 mg/mL，100 mg/mL，50mg/mL。

4、秀丽隐杆线虫的寿命实验

收集同期化L4期线虫，配制涂布OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的不同浓度蓝莓提取物（200 mg/mL，100 mg/mL，50mg/mL）的NGM培养基，设空白对照组，培养基含150 μM浓度的五氟尿嘧啶，抑制线虫繁殖。挑取线虫至NGM培养基上，每板40条，每组3板。同期化L4期给药记为寿命d0，每1天定点计数1次，挑出正常死亡的线虫，剔除异常的线虫。直至线虫全部死亡为止，停止计数，实验重复3次，绘制线虫寿命曲线。判断秀丽隐杆线虫死亡的标准为：用铂金丝连续几次轻触秀丽隐杆线虫的尾部和头部，无反应，即判断为死亡。

由线虫寿命曲线以及寿命数据统计表可得，蓝莓提取物溶液组线虫的平均寿命和最高寿命均高于空白对照组（control），且随着蓝莓提取物溶液浓度的升高，线虫寿命逐步延长，其中最高浓度200 mg/mL的平均寿命分别较对照组延长了36.4 %，其他两组的寿命分别延长了27.3%和22.7%（P<0.05）。数据表明浓度为200 mg/mL，100 mg/mL，50mg/mL的蓝莓提取物溶液能够有效的延缓线虫衰老，延长寿命，并且具有一定的浓度依赖性。实验结果见图1。

5、蓝莓提取物对秀丽隐杆线虫体内脂褐素含量和身体长度的影响

收集同期化L4期线虫到配制涂布OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的不同浓度的待测物质的NGM培养基，设空白对照组，以下培养基含150 μM的五氟尿嘧啶，抑制线虫繁殖。20℃培养5 d。

配制1wt%浓度的琼脂糖凝胶，在载玻片上压出一层薄平面，滴加20 μL 0.5 mM浓度的NaN₃溶液，每个平面挑取5条线虫，荧光显微镜下，正常视野拍摄线虫图片，分析处理线虫长度和脂褐素含量。每组8条线虫，实验重复3次。

在倒置荧光显微镜紫外滤光片下可见线虫体内脂褐素自发绿色荧光，由待测物质处理4天的线虫脂褐素荧光图像及相对荧光值可得，随着寿命的增长，线虫体内的脂褐素含量日渐增多，造成线虫机体的损伤。

研究表明在秀丽隐杆线虫上，根据衰老学说，随着寿命的延长会出现生物体体长的减小以及身体长度的降低，给药4d的线虫身体长度较空白对照组均缩短，由低到高剂量组线虫体长分别减少了6.4 %，13.5 %（P<0.05）及25.6 %（P<0.05）。实验结果见图2a、图2b、图2c、图2d。

秀丽隐杆线虫中的脂褐素的含量变化如下，在空白组中，脂褐素的含量最高，随着蓝莓提取物的浓度的增加，脂褐素的含量减少。当蓝莓提取物的浓度为200 mg/mL时，脂褐素的含量最低。实验结果见图3a、图3b、图3c、图3d。

6、蓝莓提取物对秀丽隐杆线虫繁殖力的影响

收集同期化L4期线虫至配制涂布OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的不同浓度NGM培养基，设空白对照组。每个NGM培养板上挑取1条虫子，在20℃培养，在实验后每天进行转至新的培养板，并保留旧的培养板，在第二天对第一天的板进行计数，接下来几天依次进行如上操作，记录每条虫子的总的产卵量。实验总共进行5d，实验重复3次，统计不同浓度处理组及空白组线虫不同时期繁殖幼虫数量。线虫一般在L4期开始的前4 d具有繁殖能力，且随着寿命的增长，繁殖力是逐渐降低直至丧失。

整体水平上，蓝莓提取物处理组线虫的总繁殖子代的数量低于对照组，其中蓝莓提取物剂量组线虫总繁殖力较对照组分别减少了10.3 %、16.9 %（P<0.05）及26.8 %（P<0.05）。实验结果见图4。

7、蓝莓提取物对热急性损伤秀丽隐杆线虫的保护作用

同期化收集L4期线虫至挑取线虫至含待测物质并接种OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的NGM培养基中，培养基含150 μM浓度的五氟尿嘧啶，每板30条，每组3板。20℃给药培养5 d后，挑取线虫转移到新的NGM培养基中，37℃培养。每小时计数1次，挑出死亡线虫并计数。直至线虫全部死亡为止，实验重复3次，绘制线虫寿命曲线。

研究表明，线虫寿命延长的同时其热应激的耐受能力也会有一定程度的提升，数据显示50、100、200 mg/ml 蓝莓处理组秀丽线虫在37℃高温环境中的平均存活时间分别为17、17.5、19小时，与对照组相比，其寿命分别延长了41.6 %，5.8 %和58.3 %。表明蓝莓提取物延长线虫寿命的同时提高线虫的热应激耐受能力。实验结果见图5。

8、蓝莓提取物对紫外辐射损伤秀丽隐杆线虫的保护作用

收期化收集L4期线虫至挑取线虫至涂布含待测物质并涂有OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌的NGM培养基上，每板30条，每组3板。给药培养5 d后，挑取线虫转移到空白的新鲜NGM培养基中。将秀丽线虫置于辐射强度为120 mj/cm²紫外线UVB下辐照。每1小时计数1次，挑出死亡线虫并计数。直至线虫全部死亡为止，实验重复3次，绘制线虫寿命曲线。

研究证明线虫寿命的延长同时可能伴随多种氧化应激耐受能力的提高，包括紫外辐射的耐受能力。线虫存活时间曲线显示，50 mg/mL的存活时间与对照组相比无明显差别均为3 h，在低浓度50 mg/mL时对秀丽隐杆线虫的寿命影响不大。但是100、200 mg/mL蓝莓提取物剂量组线虫的平均存活寿命较空白对照组分别延长了1 h，实验结果见图6。

9、蓝莓提取物对百草枯氧化损伤秀丽隐杆线虫的保护作用

同期化收集L4期线虫，用M9 缓冲液进行冲洗一次，并配制涂布OP50尿嘧啶缺陷型大肠杆菌NGM培养基，培养基含150 μM浓度的五氟尿嘧啶。将收集的线虫放在百草枯溶液中（终浓度为50 mM）作用4 h。挑取秀丽隐杆线虫至培养基上，每板30条，每组3板。每4 h天定点计数1次，挑出死亡线虫并计数。直至线虫全部死亡为止，实验重复3次，绘制线虫寿命曲线。

实验结果证明线虫多种氧化应激耐受能力的提高同时可能伴随寿命的延长，包括氧化损伤的耐受能力。线虫存活时间曲线显示，50 mg/mL的平均存活时间与对照组相比存在明显差别，其寿命延长了20.8%，在较高浓度100 mg/mL和200 mg/mL时对秀丽隐杆线虫的寿命也明显延长，但是两个浓度下寿命延长率变化不大，为25%。实验结果见图7。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，包括如下步骤：向涂布有大肠杆菌OP50的NGM培养板中加入待测物质，再加入秀丽隐杆线虫培养，观察秀丽隐杆线虫的生存状况。

2.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述待测物质的用量为100 μL。

3.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述待测物质的浓度为50 mg/mL，100 mg/mL和200 mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述加入待测物质的方式是液体给药。

5.根据权利要求4所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述液体给药的具体方式为：在挑取秀丽隐杆线虫之前半个小时，取待测物质加到NGM培养板的大肠杆菌OP50上。

6.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述待测物质为蓝莓提取物。

7.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述秀丽隐杆线虫是年轻成虫期的秀丽隐杆线虫。

8.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述培养的温度为20℃。

9.根据权利要求1所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法，其特征在于，所述观察秀丽隐杆线虫的生存状况包括观察秀丽隐杆线虫的寿命，热应激能力，抗紫外辐照能力，抗氧化损伤能力，繁殖力，身体长度以及脂褐素含量。

10.由权利要求1-9任一项所述的一种基于模式生物秀丽隐杆线虫的抗衰老评价方法在筛选抗衰老药物或保健品中的应用。