CN114487315A - 一种利用斑马鱼幼鱼筛选影响生物节律行为药物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用斑马鱼幼鱼筛选影响生物节律行为药物的方法。具体方法：(1)将斑马鱼胚胎放置于培养液中培养，所述斑马鱼胚胎发育5‑6dpf成长为斑马幼鱼；(2)将步骤(1)中所得斑马幼鱼分为试验组和溶剂对照组，向试验组加入待筛选的药物，向溶剂对照组加入DMSO溶剂，并放入斑马鱼行为仪中；(3)在持续光照作用下对步骤(2)中试验组和溶剂对照组中的斑马幼鱼进行行为监测，绘制行为曲线，并分析曲线的周期、相位和振幅变化，并将试验组与溶剂对照组进行比较，筛选出所述影响生物节律行为药物。

Description

一种利用斑马鱼幼鱼筛选影响生物节律行为药物的方法
技术领域
本发明属于药物筛选技术领域，尤其是指一种利用斑马鱼幼鱼筛选影响生物节律行为药物的方法。
背景技术
生物钟是一种以接近昼夜24小时为周期的节律性生命活动，也称日节律(circadian rhythm)。所有生物体均受到生物钟的调控而产生行为和生理的节律变化，运动行为节律是反应生物节律的最可靠标志之一。2017年诺贝尔生理医学奖的获得者就是通过研究果蝇运动行为节律来揭示生物钟的重要性。研究小鼠生物钟节律行为的方法主要是在持续黑暗条件(DD)下记录小鼠转轮运动情况来获得周期、振幅和相位的变化。生物钟紊乱影响到肿瘤的发生、心血管疾病、代谢性疾病、精神疾病、生殖健康等多种疾病，因此筛选影响生物钟的药物就变得尤为迫切。先前对影响生物钟的药物筛选主要在小鼠细胞系中，但筛选出的一些药物很难运用到生物体中，而且在研究生物钟经典的活体动物如小鼠中很难进行大规模的药物筛选。
斑马鱼在发育生物学以及遗传学上存在多种优势，使得其逐渐成为研究生物节律的优势模式生物。针对斑马鱼发育生物学的优势，斑马鱼可进行体外受精，且胚胎发育也是在体外完成发育，而在受精后约2-3个月可达性成熟。成年雌鱼可每周产卵一次，每次能产卵大约400颗，受精率通常超过70％-80％。英国桑格研究所对斑马鱼25条染色体进行全基因组测序的工作，并且与人类基因组进行了比较发现：斑马鱼在生物学上与人类及其相似，斑马鱼体内30000个基因中与人类高度同源，占比达87％；其中斑马鱼体内存在70％人类蛋白质编码基因，而且84％的人类疾病相关基因也能在斑马鱼体内找到。在此基础上，该研究所还发现斑马鱼基因组拥有其他脊椎动物没有的独特特征：斑马鱼的基因组序列具有很高的拷贝数，而且具有影响性别决定的染色体区域。这对研究生物的基因进化过程具有重要意义。与小鼠和果蝇相比，药物筛选运用斑马鱼幼鱼的优势在于：斑马鱼生活在水中，药物可直接加入到斑马鱼幼鱼培养液中，而不需要注射或投喂；另外幼鱼缺乏成熟的血脑屏障，可以研究药物对神经系统的直接作用，还可以克服体外或细胞筛药不能重现整个生物的复杂环境的问题；且斑马鱼产卵量大，幼鱼体积小，可以在多孔板中进行筛选；最重要的是，与小鼠相比，斑马鱼的昼夜节律行为与人类更相似，都为昼行动物，而小鼠为夜行动物。除此之外，近几年斑马鱼的遗传学研究技术也在不断的发展，比如锌指核酸酶ZFN(Zinc fingernuclease)、TALEN和CRISPR/Cas9定向基因失活技术、以及Tol2转基因技术。因此斑马鱼为疾病研究、药物筛选、药物研发以及生物钟研究提供了新的研究方式。
由于斑马鱼产卵量高、胚胎体外发育、易于显微注射及胚胎透明等特点，研究者可以很好的利用遗传学手段建立斑马鱼幼鱼生物钟节律模型，利用斑马鱼模型可以进行快速、大规模的活体药物筛选。然而，到目前为止在国内及国际上尚未有利用斑马鱼幼鱼行为节律进行影响生物钟的药物筛选的报道。由于生物个体的复杂性，不同细胞、不同组织、不同器官之间有紧密的相关性，仅从细胞层面进行药物筛选不能反映生物个体对该药物的表现，并且细胞系在实验之前需要使用地塞米松或血清进行强制同步化，同步化的过程也会影响生物钟，采用细胞系进行筛选必须是使用生物钟基因的启动子(Per2或Per1等基因)进行筛选，筛选到的药物仅能说明药物影响特定生物钟基因的节律，并不能说明是否可以影响其他核心生物钟基因的节律。
生物钟与人类健康息息相关，但是几乎没有能应用到临床上的影响生物钟的药物，因此筛选能够影响生物钟周期、相位和振幅的药物显得至关重要。传统的筛选影响生物钟的方法是通过采用带有荧光素酶报告基因的细胞系来进行，但是细胞系的筛选需要先将细胞强制同步化处理，并且缺乏生物整体水平的影响因素，因此筛选到的药物很难应用到临床。斑马鱼是一种良好的药物筛选以及研究生物钟的模式动物，因此本发明主要解决的技术问题是利用斑马鱼幼鱼进行活体、高通量的影响生物钟的药物筛选技术。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用斑马鱼幼鱼筛选影响生物节律行为药物的方法。
一种利用斑马鱼幼鱼筛选影响生物节律行为药物的方法，包括以下步骤：
(1)将斑马鱼胚胎放置于培养液中培养，所述斑马鱼胚胎发育5-6dpf(受精后天数，days post fertilization)成长为斑马幼鱼；
(2)将步骤(1)中所得斑马幼鱼分为试验组和溶剂对照组，并放入斑马鱼行为仪中；
(3)在持续光照作用下对步骤(2)中试验组和溶剂对照组中的斑马幼鱼进行行为监测，绘制行为曲线，并分析曲线的周期、相位和振幅变化，并将试验组与溶剂对照组进行比较，筛选出所述影响生物节律行为药物。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述培养液为E3培养液或Holt Buffer。
在本发明的一个实施例中，所述Holt Buffer的成分为NaCl、KCl、NaHCO3和CaCl2；所述E3培养液成分为NaCl、KCl、CaCl2和MgSO4。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述培养的温度为28.5±1℃。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，向所述试验组加入待筛选的药物，向溶剂对照组加入溶剂。
在本发明的一个实施例中，所述溶剂为DMSO。
在本发明的一个实施例中，所述药物为神经信号相关小分子药物、抗感染小分子药物、抗癌化合物或代谢相关药物。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述试验组和溶剂对照组各设置至少4个复孔。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述药物浓度为5-20μM。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，光照条件10-30lux。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，行为监测的时间为5dpf-8dpf。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述试验组相比于溶剂对照组，所述曲线的周期的差值大于1小时或相位差值大于2小时或振幅改变倍数超过1.5。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
斑马鱼是一种良好的药物筛选以及研究生物钟的模式动物，传统的筛选影响生物钟的药物的方法是通过细胞系的筛选方法，并不能反映生物整体水平的影响；而利用斑马鱼进行药物筛选则多聚焦于造血、免疫等相关疾病的筛选，并无在生物钟领域的筛选。由于生物钟相关的表型需要在持续黑暗或持续光照条件下进行连续多天的观察，一般情况下很难进行大规模的活体药物筛选。本发明是在多次不同条件的行为实验后得到的最优策略，即能保证对照斑马鱼幼鱼在持续弱光条件下均有明显且稳定的行为节律，又能保证快速、高通量活体药物筛选的目的。因此本发明主要解决的技术问题是利用斑马鱼幼鱼进行活体、高通量的影响生物钟的药物筛选技术。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明斑马鱼幼鱼筛选影响生物钟的药物方法模式图。
图2是本发明筛选的4种药物(p04a1:Sitagliptinphosphate monohydrate，p04a2:Vildagliptin(LAF-237)，p04a3:Alogliptin(SYR-322)，p04a4:Atazanavirsulfate(BMS-232632-05))和DMSO组连续72小时持续弱光条件下的运动距离曲线图。纵轴为平均运动距离(单位为毫米/10分钟)，横轴为时间(单位为小时)。
图3是本发明筛选的第5-9种药物(p04a5:Marimastat，p04a6:GM 6001，p04a7:Doxycycline hyclate，p04a8:17-AAG(KOS953)，p04a9:AT13387)组连续72小时持续弱光条件下的运动距离曲线图。纵轴为平均运动距离(单位为毫米/10分钟)，横轴为时间(单位为小时)。
图4是本发明筛选的另外2种药物(p04a10:Elvitegravir(GS-9137)，p04a11:Fluorouracil(Adrucil))连续72小时持续弱光条件下的运动距离曲线图，纵轴为平均运动距离(单位为毫米/10分钟)，横轴为时间(单位为小时)。
图5是本发明p04a1-p04a11这十一种药物筛选行为节律热图。
图6是本发明p04a1-p04a11这十一种药物筛选行为相位分析结果。
图7是本发明p04a1-p04a11这十一种药物筛选行为周期分析结果。
图8是本发明p04a1-p04a11这十一种药物筛选行为振幅分析结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例
1，斑马鱼饲养
选取6-12月龄野生型斑马鱼成鱼，采用专业的饲养系统进行饲养，水温维持在28.5±1℃，pH值为7.2-7.6之间，鱼房的光照周期为14小时光照/10小时黑暗，即14L：10D，每天早晚喂食丰年虾，中午喂食干饲料。
2，斑马鱼胚胎及幼鱼的获得
第一天晚上将一对斑马鱼成鱼放置于交配盒中，中间用挡板将雌雄分开。第二天鱼房灯亮后将挡板抽掉，一小时后收集胚胎，胚胎放置于带有E3培养液的培养皿中，每个培养皿里的胚胎数为30-100枚。将未受精胚胎挑出后，剩余胚胎放置于光暗条件(14L：10D，300lux)，28.5℃条件培养箱中进行培养。斑马鱼幼鱼发育至5dpf时待用。
3，幼鱼行为
实验仪器为斑马鱼行为分析仪(Daniovison,Noldus Information Technology)。仪器内有红外高速摄像头，可捕捉每个孔的幼鱼运动参数。将5dpf斑马鱼幼鱼放置于48孔板中，每个孔放置一条幼鱼。将每个孔的E3培养液用吸管和枪头吸干，然后每个孔加入1mL带有草履虫的E3培养液，加入20微摩(2μL)的药物，本实施例的药物文库选取APExBIO的L1021-FDA-approved-Drug-Library的第四块板子A排，总共为P04A1-A11这11种药物，具体名称见下表1，四孔重复，即每块48孔板可筛选12个药物，其中最后一个药物为DMSO对照组。去掉48孔板的盖子，将48孔板放入行为仪中。选择仪器实时监测功能，录像采集帧数为1秒钟25帧；分辨率为800×600，采取持续弱光(DD，30lux)条件进行实验，即光照设定条件为实验开始立即1％的光72小时。实验时间为连续三天即5dpf-8dpf。
表1实施例所用来筛选的药物清单
Figure BDA0003424701200000061
4，结果及统计分析
斑马鱼行为分析仪捕获的数据先用系统自带的分析软件进行分析(Ethovision10.0software，Noldus Information Technology)，数据的获取均使用10分钟作为时间间隔，主要以运动距离作为量化依据，得到每种药物4条斑马鱼幼鱼(N＝4)在以每10分钟为时间间隔的总共72小时的数据，生成的数据表示为平均值±标准误差。再使用Biodare2(https://biodare2.ed.ac.uk/)采用Classic-JTK方法分析其节律的周期、相位和振幅变化。实验结果见图2-8。
如图2-3所示，得到的数据绘制连续运动曲线图可以看出DMSO对照组以及9种药物均有明显的以大约24小时为周期的节律，并且活动量总体变化不大，表明该方法可以很好的反映斑马鱼幼鱼的内在生物钟的特点。而如图4所示，同一批筛选的药物里面有p04a10和p04a11两种药物造成幼鱼死亡从而无生物钟特点，因此这两种药物需要降低至5μM再次筛选。除了这两种药物以外，其余9种药物以及DMSO组均表现出明显的节律(也可通过图5的热图观察出)，因此进一步分析其周期、相位和振幅。采取MFourFit分析方法，参数设置为nodtrmin-max p(20.0-28.0)，结果见图6-8，根据所设定标准可见p04a7的振幅为DMSO对照组的0.28倍，周期增加超过4小时，相位改变超过5小时，为显著影响生物钟的药物；另外p04a3周期和相位也改变超过设定标准，但振幅在正常范围内，此药物也可作为影响生物的潜在药物。除此以外，其余药物均在设定范围内，为不影响生物钟的药物。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种利用斑马鱼幼鱼筛选影响生物节律行为药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将斑马鱼胚胎放置于培养液中培养，所述斑马鱼胚胎发育5-6dpf成长为斑马幼鱼；
(2)将步骤(1)中所得斑马幼鱼分为试验组、溶剂对照组，并放入斑马鱼行为仪中；
(3)在持续光照作用下对步骤(2)中试验组和溶剂对照组中的斑马幼鱼进行行为监测，绘制行为曲线，并分析曲线的周期、相位和振幅变化，并将试验组与溶剂对照组进行比较，筛选出所述影响生物节律行为药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养液为E3培养液或HoltBuffer。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Holt Buffer的成分为NaCl、KCl、NaHCO3和CaCl2；所述E3培养液成分为NaCl、KCl、CaCl2和MgSO4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养的温度为28.5±1℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述试验组中加入待筛选的药物，向溶剂对照组加入溶剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述药物为神经信号相关小分子药物、抗感染小分子药物、抗癌化合物或代谢相关化合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述试验组和溶剂对照组各设置至少4个复孔。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述药物浓度为5-20μM。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，光照条件为10-30lux。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，行为监测的时间为5dpf-8dpf。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述试验组相比于溶剂对照组，所述曲线的周期的差值大于1小时或相位差值大于2小时或振幅改变倍数超过1.5。
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