CN110463626A - 一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及模型建立技术领域，特别是涉及一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，包括步骤一、斑马鱼的选取；步骤二、RV的培养与扩增；步骤三、病毒滴定测定；步骤四、SA‑11株感染方式和鱼龄的选择；步骤五、ELISA法检测RV感染斑马鱼肠道VP6抗原；步骤六：荧光sytoRNA标记的RV感染斑马鱼；通过模型建立可知，RV可感染5dpf至一月龄的斑马鱼，同时建立了RV感染斑马鱼脑病的模型，为研究RV感染，尤其是RV性脑病提供了技术平台。因此，利用本方法能够建立稳定可靠的RV感染斑马鱼的模型，为RV病理机制、抗病毒药物筛选等方面的研究提供强有力的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及模型建立技术领域，特别是涉及一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)属呼肠弧病毒科(Reoviridae)病毒，是引起婴幼儿严重腹泻的主要病原体，全世界每年因RV感染导致的婴幼儿死亡人数达20万人左右，但对其致病机理仍不明确，也尚未研发出治疗RV的特效药物，建立适宜的RV感染动物模型对深入探讨RV致病机制和相关新药筛选具有重要的意义。
目前，国内外相继建立了RV感染的实验动物模型，其中包括乳鼠、无菌猪、猴、犬、牛、羊、兔等动物模型，其中比较成熟的RV动物模型主要有RV乳鼠模型和RV无菌猪模型。众所周知，乳鼠模型存在子代乳鼠组间均一性差，子代乳鼠易受到母鼠的伤害、甚至咬死，出现研究样本的脱落等情况，以及不适合进行抗RV药物的高通量在体筛选等问题，而采用无菌猪等大型动物，成本较高。为此，建立一种经济实用而又简单易行的动物模型对研究RV的发病机制和筛选RV防治药物具有深远意义。
斑马鱼(Danio rerio)胚胎透明、易于养殖，约87％的基因与人类同源，有与哺乳动物相似的心血管、造血、神经及代谢系统等，具有实现组间均一性、在体动态观察、方便控制等独特优点。目前已建立了斑马鱼心血管疾病、肿瘤以及药物代谢、毒性评价等模型，成为重要的研究模式生物之一。同时斑马鱼也是发育生物学研究方面的重要模式动物之一，而RV感染主要发生在5岁以下的婴幼儿，具有显著的与生理发育相关的特点，采用斑马鱼模式动物研究RV感染有可能揭示RV感染与免疫、炎症等发育相关的重要病理机制，也可为在体药物筛选提供强有力的高通量、高内涵技术平台。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足之处而提供一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，该轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法能够建立稳定可靠的RV感染斑马鱼的模型，为RV病理机制、抗病毒药物筛选等方面的研究提供强有力的技术手段。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
提供一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，它包括以下步骤：
步骤一、斑马鱼的选取：选取5dpf、一月龄、三月龄的斑马鱼进行实验；
步骤二、RV的培养与扩增：在MA104细胞上进行SA-11株和Wa株RV的培养与扩增；
步骤三、病毒滴定测定：生长状态良好的MA104细胞，进行常规消化后离心，倒去液体，然后加培养基稀释计数后接种于孔板上进行培养，待细胞贴壁，将病毒株与胰酶混合孵育；将RV病毒液用无FBS的DMEM培养液稀释，取出贴壁的MA104细胞，用预热的PBS洗一遍，再用无FBS的DMEM培养液洗一遍，将预先孵育好的病毒液加入到孔板中，设置正常对照组，正常对照组加无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中孵育；一定时间后吸出病毒液，加入无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中培养；于不同时间点观察RV感染细胞后的病理状态，当观察最低稀释度病毒液的孔内不再出现CPE时，记录；同时，避光条件加入MTT试剂，用酶标仪检测490nm波长条件下样品吸光度，按照Reed and Muench的方法计算出病毒的TCID50；
步骤四、SA-11株感染方式和鱼龄的选择：分别通过腹腔注射、灌胃感染、浸泡感染三种方式，感染一月龄、三月龄的斑马鱼，每组各若干只，设正常对照组；每隔一定时间观察斑马鱼的外观体征，包括形态、活动情况、肛门处是否红肿，死亡情况；
步骤五、ELISA法检测RV感染斑马鱼肠道VP6抗原：按照步骤三的方法优选出最佳感染方式、鱼龄，进一步考察斑马鱼对SA-11株和Wa株的易感性，分别用两种病毒株对一月龄、三月龄斑马鱼按照最佳感染方式处理；感染1天后麻醉处死斑马鱼，解剖分离肠道部位，按照试剂盒说明书进行；
步骤六：荧光sytoRNA标记的RV感染斑马鱼：用荧光染料sytoRNA标记的RV，感染5dpf的斑马鱼，斑马鱼在孔板中培养，每孔一只；分为正常组，syto-SA-11组，syto-WA组，每组3只，分别加入正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液，感染一定时间后更换成正常培养水，活细胞成像仪下观察荧光的分布。
上述技术方案中，所述步骤一中，所述斑马鱼为AB系，参照《The Zebrafish Book》一书中的标准化饲养程序(Westerfeld，2000)，在标准化的斑马鱼饲养繁殖系统中饲养繁殖，系统循环水的温度控制在28℃～29℃，pH为6.8～7.4，并给予14h光照/10h黑暗的人工光照周期。
上述技术方案中，所述步骤二中，在MA104细胞上进行SA-11株和Wa株RV的培养与扩增，具体为：将病毒从-75℃～-85℃冰箱中取出，放在3.5℃～4.5℃冰箱中溶解，将RV与10ug/mL的胰酶混合封闭，培养箱复苏30min，从细胞培养箱中取出生长达到单层的MA104细胞，将培养液吸出后用PBS冲洗一遍，再用无FBS的DMEM培养基润洗两遍后加入孵育好的RV病毒液1mL，然后向单层细胞继续添加3mL的含有1ug/mL胰酶的无血清DMEM病毒维持液，放入CO2培养箱常规培养，间隔6h、12h、18h、24h用倒置显微镜观察MA104细胞的CPE变化，直至在倒置显微镜下观察到细胞出现CPE达到+++～++++时，取出细胞培养瓶置于-18℃～-22℃冰箱过夜；次日将细胞培养瓶置于3.5℃～4.5℃自然溶解，反复冻融2～4次，于超净台内收集细胞冻融液于离心管中，用低温高速离心机3.5℃～4.5℃下11000r/min～13000r/min离心25min～35min，最后将上清病毒液收集并分装，标记后于-75℃～-85℃下保存。
上述技术方案中，所述步骤三中，生长状态良好的MA104细胞，进行常规消化后离心，倒去液体，加4～5mL培养基稀释计数后接种于96孔板上，每孔8000个细胞，培养12h，待细胞贴壁，将病毒株与10ug/mL的胰酶混合在37℃下孵育30min，将RV病毒液用无FBS的DMEM培养液以1：9～11的比例稀释6个梯度浓度，取出贴壁的MA104细胞，用预热的PBS洗一遍，再用无FBS的DMEM培养液洗一遍，将预先孵育好的病毒液加入到96孔板中，每孔100uL，每个梯度浓度9个孔，设置正常对照组，正常对照组加100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中孵育，1.5h～2.5h后吸出病毒液，加入100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中培养；于不同时间点观察RV感染细胞后的病理状态，当观察最低稀释度病毒液的孔内不再出现CPE时，记录；同时，避光条件加入MTT试剂，用酶标仪检测490nm波长条件下样品吸光度，按照Reed and Muench的方法计算出病毒的TCID50。
上述技术方案中，所述步骤四中，分别通过腹腔注射、灌胃、浸泡三种方式，感染一月龄、三月龄的斑马鱼，每组各15只，设正常对照组；每隔24、48、72、96h观察斑马鱼的外观体征，包括形态、活动情况、肛门处是否红肿，死亡情况；斑马鱼早晚各喂食一次，并于每天早晨收集相应的培养水100mL以用于相应的指标的检测，并更换新鲜培养水。
上述技术方案中，所述步骤四中，所述腹腔注射：分别给一月龄和三月龄的斑马鱼注射病毒液SA-11株5uL和10uL，正常对照组注射等量的DMEM，注射后立即放入斑马鱼养殖系统培养。
上述技术方案中，所述步骤四中，所述灌胃感染：分别给一月龄和三月龄斑马鱼灌胃5ul和10uL病毒液，正常对照组灌胃等量的DMEM培养基，灌胃立即放入斑马鱼养殖系统培养。
上述技术方案中，所述步骤四中，所述浸泡感染：一月龄和三月龄斑马鱼分别浸泡在10mL的SA-11株病毒液中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养，正常组浸泡在等量的DMEM中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养培养,病毒液的效价为104TCID50/mL。
上述技术方案中，所述步骤六中，用荧光染料sytoRNA标记的RV，感染5dpf的斑马鱼，斑马鱼在96孔板中培养，每孔一只；分为正常组，syto-SA-11组，syto-WA组，每组3只，分别加入正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液，感染3.5h～4.5h后更换成正常培养水，活细胞成像仪下观察荧光的分布；
其中，所述正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液的质量比为1:1:1。
上述技术方案中，所述步骤六中，所述5dpf的斑马鱼用0.003％的PTU处理以阻止黑色素产生；5dpf的斑马鱼在恒温培养箱中培养，控制昼夜时间14h：10h，温度为23℃～33℃，pH值为6.8～7.4。
本发明的有益效果：
本发明提供的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，包括步骤一、斑马鱼的选取；步骤二、RV的培养与扩增；步骤三、病毒滴定测定；步骤四、SA-11株感染方式和鱼龄的选择；步骤五、ELISA法检测RV感染斑马鱼肠道VP6抗原；步骤六：荧光sytoRNA标记的RV感染斑马鱼；通过模型建立可知，RV可感染5dpf至一月龄的斑马鱼，同时建立了RV感染斑马鱼脑病的模型，为研究RV感染，尤其是RV性脑病提供了技术平台。因此，利用本方法能够建立稳定可靠的RV感染斑马鱼的模型，为RV病理机制、抗病毒药物筛选等方面的研究提供强有力的技术手段。
附图说明
图1是浸泡感染SA-11株病毒的一月龄斑马鱼的粪便情况图。其中，左侧图为正常组：粪便为短棒状，橙黄色，不易散；右侧图为RV组：粪便为细棒状，絮状，质地松散，颜色偏白。
图2是浸泡感染SA-11株病毒的三月龄斑马鱼的粪便情况图。其中，左侧图为正常组：粪便为长条形或棒状，橙黄色，不易散；右侧图为RV组：粪便为棒状或短棒状，橙黄色，不易散。
图3是不同RV感染方式感染一月龄斑马鱼的生存曲线图。
图4是不同RV感染方式感染三月龄斑马鱼的生存曲线图。
图5是荧光sytoRNA标记的RV感染5dpf的斑马鱼的情况图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1。
本实施例的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，它包括以下步骤：
步骤一、斑马鱼的选取：选取5dpf、一月龄、三月龄的斑马鱼进行实验；
其中，斑马鱼为AB系，参照《The Zebrafish Book》一书中的标准化饲养程序(Westerfeld，2000)，在标准化的斑马鱼饲养繁殖系统中饲养繁殖，系统循环水的温度控制在28.5℃，pH为7.0，并给予14h光照/10h黑暗的人工光照周期；
步骤二、RV的培养与扩增：在MA104细胞上进行SA-11株和Wa株RV的培养与扩增，具体为：将病毒从-80℃冰箱中取出，放在4℃冰箱中溶解，将RV与10ug/mL的胰酶混合封闭，培养箱复苏30min，从细胞培养箱中取出生长达到单层的MA104细胞，将培养液吸出后用PBS冲洗一遍，再用无FBS的DMEM培养基润洗两遍后加入孵育好的RV病毒液1mL，然后向单层细胞继续添加3mL的含有1ug/mL胰酶的无血清DMEM病毒维持液，放入CO2培养箱常规培养，间隔6h、12h、18h、24h用倒置显微镜观察MA104细胞的CPE变化，直至在倒置显微镜下观察到细胞出现CPE达到+++～++++时，取出细胞培养瓶置于-20℃冰箱过夜；次日将细胞培养瓶置于4℃自然溶解，反复冻融3次，于超净台内收集细胞冻融液于离心管中，用低温高速离心机4℃下12000r/min离心30min，最后将上清病毒液收集并分装，标记后于-80℃下保存。
步骤三、病毒滴定测定：生长状态良好的MA104细胞，进行常规消化后离心，倒去液体，加4.5mL培养基稀释计数后接种于96孔板上，每孔8000个细胞，培养12h，待细胞贴壁，将病毒株与10ug/mL的胰酶混合在37℃下孵育30min，将RV病毒液用无FBS的DMEM培养液以1：10的比例稀释6个梯度浓度，取出贴壁的MA104细胞，用预热的PBS洗一遍，再用无FBS的DMEM培养液洗一遍，将预先孵育好的病毒液加入到96孔板中，每孔100uL，每个梯度浓度9个孔，设置正常对照组，正常对照组加100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中孵育，2h后吸出病毒液，加入100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中培养；于不同时间点观察RV感染细胞后的病理状态，当观察最低稀释度病毒液的孔内不再出现CPE时，记录；同时，避光条件加入MTT试剂，用酶标仪检测490nm波长条件下样品吸光度，按照Reed and Muench的方法计算出病毒的TCID50；
步骤四、SA-11株感染方式和鱼龄的选择：分别通过腹腔注射、灌胃、浸泡三种方式，感染一月龄、三月龄的斑马鱼，每组各15只，设正常对照组；每隔24、48、72、96h观察斑马鱼的外观体征，包括形态、活动情况、肛门处是否红肿，死亡情况；斑马鱼早晚各喂食一次，并于每天早晨收集相应的培养水100mL以用于相应的指标的检测，并更换新鲜培养水；
其中，腹腔注射：分别给一月龄和三月龄的斑马鱼注射病毒液SA-11株5uL和10uL，正常对照组注射等量的DMEM，注射后立即放入斑马鱼养殖系统培养；
其中，灌胃感染：分别给一月龄和三月龄斑马鱼灌胃5ul和10uL病毒液，正常对照组灌胃等量的DMEM培养基，灌胃立即放入斑马鱼养殖系统培养；
其中，浸泡感染：一月龄和三月龄斑马鱼分别浸泡在10mL的SA-11株病毒液中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养，正常组浸泡在等量的DMEM中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养培养,病毒液的效价为104TCID50/mL；
步骤五、ELISA法检测RV感染斑马鱼肠道VP6抗原：按照步骤三的方法优选出最佳感染方式、鱼龄，进一步考察斑马鱼对SA-11株和Wa株的易感性，分别用两种病毒株对一月龄、三月龄斑马鱼按照最佳感染方式处理；感染1天后麻醉处死斑马鱼，解剖分离肠道部位，按照试剂盒说明书进行；
步骤六：荧光sytoRNA标记的RV感染斑马鱼：用荧光染料sytoRNA标记的RV，感染5dpf的斑马鱼，斑马鱼在96孔板中培养，每孔一只；分为正常组，syto-SA-11组，syto-WA组，每组3只，分别加入正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液，感染4h后更换成正常培养水，活细胞成像仪下观察荧光的分布；
其中，所述正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液的质量比为1:1:1；
其中，5dpf的斑马鱼用0.003％的PTU处理以阻止黑色素产生；5dpf的斑马鱼在恒温培养箱中培养，控制昼夜时间14h：10h，温度为28℃，pH值为7.0。
实施例2。
本实施例的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，它包括以下步骤：
步骤一、斑马鱼的选取：选取5dpf、一月龄、三月龄的斑马鱼进行实验；
其中，斑马鱼为AB系，参照《The Zebrafish Book》一书中的标准化饲养程序(Westerfeld，2000)，在标准化的斑马鱼饲养繁殖系统中饲养繁殖，系统循环水的温度控制在28℃～29℃，pH为6.8～7.4，并给予14h光照/10h黑暗的人工光照周期；
步骤二、RV的培养与扩增：在MA104细胞上进行SA-11株和Wa株RV的培养与扩增，具体为：将病毒从-75℃～-85℃冰箱中取出，放在3.5℃～4.5℃冰箱中溶解，将RV与10ug/mL的胰酶混合封闭，培养箱复苏30min，从细胞培养箱中取出生长达到单层的MA104细胞，将培养液吸出后用PBS冲洗一遍，再用无FBS的DMEM培养基润洗两遍后加入孵育好的RV病毒液1mL，然后向单层细胞继续添加3mL的含有1ug/mL胰酶的无血清DMEM病毒维持液，放入CO2培养箱常规培养，间隔6h、12h、18h、24h用倒置显微镜观察MA104细胞的CPE变化，直至在倒置显微镜下观察到细胞出现CPE达到+++～++++时，取出细胞培养瓶置于-18℃冰箱过夜；次日将细胞培养瓶置于3.5℃自然溶解，反复冻融2次，于超净台内收集细胞冻融液于离心管中，用低温高速离心机3.5℃下11000r/min离心35min，最后将上清病毒液收集并分装，标记后于-75℃下保存。
步骤三、病毒滴定测定：生长状态良好的MA104细胞，进行常规消化后离心，倒去液体，加4mL培养基稀释计数后接种于96孔板上，每孔8000个细胞，培养12h，待细胞贴壁，将病毒株与10ug/mL的胰酶混合在37℃下孵育30min，将RV病毒液用无FBS的DMEM培养液以1：9的比例稀释6个梯度浓度，取出贴壁的MA104细胞，用预热的PBS洗一遍，再用无FBS的DMEM培养液洗一遍，将预先孵育好的病毒液加入到96孔板中，每孔100uL，每个梯度浓度9个孔，设置正常对照组，正常对照组加100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中孵育，1.5h后吸出病毒液，加入100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中培养；于不同时间点观察RV感染细胞后的病理状态，当观察最低稀释度病毒液的孔内不再出现CPE时，记录；同时，避光条件加入MTT试剂，用酶标仪检测490nm波长条件下样品吸光度，按照Reed and Muench的方法计算出病毒的TCID50；
步骤四、SA-11株感染方式和鱼龄的选择：分别通过腹腔注射、灌胃、浸泡三种方式，感染一月龄、三月龄的斑马鱼，每组各15只，设正常对照组；每隔24、48、72、96h观察斑马鱼的外观体征，包括形态、活动情况、肛门处是否红肿，死亡情况；斑马鱼早晚各喂食一次，并于每天早晨收集相应的培养水100mL以用于相应的指标的检测，并更换新鲜培养水；
其中，腹腔注射：分别给一月龄和三月龄的斑马鱼注射病毒液SA-11株5uL和10uL，正常对照组注射等量的DMEM，注射后立即放入斑马鱼养殖系统培养；
其中，灌胃感染：分别给一月龄和三月龄斑马鱼灌胃5ul和10uL病毒液，正常对照组灌胃等量的DMEM培养基，灌胃立即放入斑马鱼养殖系统培养；
其中，浸泡感染：一月龄和三月龄斑马鱼分别浸泡在10mL的SA-11株病毒液中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养，正常组浸泡在等量的DMEM中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养培养,病毒液的效价为104TCID50/mL；
步骤五、ELISA法检测RV感染斑马鱼肠道VP6抗原：按照步骤三的方法优选出最佳感染方式、鱼龄，进一步考察斑马鱼对SA-11株和Wa株的易感性，分别用两种病毒株对一月龄、三月龄斑马鱼按照最佳感染方式处理；感染1天后麻醉处死斑马鱼，解剖分离肠道部位，按照试剂盒说明书进行；
步骤六：荧光sytoRNA标记的RV感染斑马鱼：用荧光染料sytoRNA标记的RV，感染5dpf的斑马鱼，斑马鱼在96孔板中培养，每孔一只；分为正常组，syto-SA-11组，syto-WA组，每组3只，分别加入正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液，感染3.5h后更换成正常培养水，活细胞成像仪下观察荧光的分布；
其中，所述正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液的质量比为1:1:1；
其中，5dpf的斑马鱼用0.003％的PTU处理以阻止黑色素产生；5dpf的斑马鱼在恒温培养箱中培养，控制昼夜时间14h：10h，温度为23℃，pH值为6.8。
实施例3。
本实施例的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，它包括以下步骤：
步骤一、斑马鱼的选取：选取5dpf、一月龄、三月龄的斑马鱼进行实验；
其中，斑马鱼为AB系，参照《The Zebrafish Book》一书中的标准化饲养程序(Westerfeld，2000)，在标准化的斑马鱼饲养繁殖系统中饲养繁殖，系统循环水的温度控制在29℃，pH为7.4，并给予14h光照/10h黑暗的人工光照周期；
步骤二、RV的培养与扩增：在MA104细胞上进行SA-11株和Wa株RV的培养与扩增，具体为：将病毒从-85℃冰箱中取出，放在4.5℃冰箱中溶解，将RV与10ug/mL的胰酶混合封闭，培养箱复苏30min，从细胞培养箱中取出生长达到单层的MA104细胞，将培养液吸出后用PBS冲洗一遍，再用无FBS的DMEM培养基润洗两遍后加入孵育好的RV病毒液1mL，然后向单层细胞继续添加3mL的含有1ug/mL胰酶的无血清DMEM病毒维持液，放入CO2培养箱常规培养，间隔6h、12h、18h、24h用倒置显微镜观察MA104细胞的CPE变化，直至在倒置显微镜下观察到细胞出现CPE达到+++～++++时，取出细胞培养瓶置于-22℃冰箱过夜；次日将细胞培养瓶置于4.5℃自然溶解，反复冻融4次，于超净台内收集细胞冻融液于离心管中，用低温高速离心机4.5℃下13000r/min离心25min，最后将上清病毒液收集并分装，标记后于-75℃下保存。
步骤三、病毒滴定测定：生长状态良好的MA104细胞，进行常规消化后离心，倒去液体，加4mL培养基稀释计数后接种于96孔板上，每孔8000个细胞，培养12h，待细胞贴壁，将病毒株与10ug/mL的胰酶混合在37℃下孵育30min，将RV病毒液用无FBS的DMEM培养液以1：11的比例稀释6个梯度浓度，取出贴壁的MA104细胞，用预热的PBS洗一遍，再用无FBS的DMEM培养液洗一遍，将预先孵育好的病毒液加入到96孔板中，每孔100uL，每个梯度浓度9个孔，设置正常对照组，正常对照组加100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中孵育，2.5h后吸出病毒液，加入100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中培养；于不同时间点观察RV感染细胞后的病理状态，当观察最低稀释度病毒液的孔内不再出现CPE时，记录；同时，避光条件加入MTT试剂，用酶标仪检测490nm波长条件下样品吸光度，按照Reed and Muench的方法计算出病毒的TCID50；
步骤四、SA-11株感染方式和鱼龄的选择：分别通过腹腔注射、灌胃、浸泡三种方式，感染一月龄、三月龄的斑马鱼，每组各15只，设正常对照组；每隔24、48、72、96h观察斑马鱼的外观体征，包括形态、活动情况、肛门处是否红肿，死亡情况；斑马鱼早晚各喂食一次，并于每天早晨收集相应的培养水100mL以用于相应的指标的检测，并更换新鲜培养水；
其中，腹腔注射：分别给一月龄和三月龄的斑马鱼注射病毒液SA-11株5uL和10uL，正常对照组注射等量的DMEM，注射后立即放入斑马鱼养殖系统培养；
其中，灌胃感染：分别给一月龄和三月龄斑马鱼灌胃5ul和10uL病毒液，正常对照组灌胃等量的DMEM培养基，灌胃立即放入斑马鱼养殖系统培养；
其中，浸泡感染：一月龄和三月龄斑马鱼分别浸泡在10mL的SA-11株病毒液中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养，正常组浸泡在等量的DMEM中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养培养,病毒液的效价为104TCID50/mL；
步骤五、ELISA法检测RV感染斑马鱼肠道VP6抗原：按照步骤三的方法优选出最佳感染方式、鱼龄，进一步考察斑马鱼对SA-11株和Wa株的易感性，分别用两种病毒株对一月龄、三月龄斑马鱼按照最佳感染方式处理；感染1天后麻醉处死斑马鱼，解剖分离肠道部位，按照试剂盒说明书进行；
步骤六：荧光sytoRNA标记的RV感染斑马鱼：用荧光染料sytoRNA标记的RV，感染5dpf的斑马鱼，斑马鱼在96孔板中培养，每孔一只；分为正常组，syto-SA-11组，syto-WA组，每组3只，分别加入正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液，感染4.5h后更换成正常培养水，活细胞成像仪下观察荧光的分布；
其中，所述正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液的质量比为1:1:1；
其中，5dpf的斑马鱼用0.003％的PTU处理以阻止黑色素产生；5dpf的斑马鱼在恒温培养箱中培养，控制昼夜时间14h：10h，温度为33℃，pH值为7.4。
本发明涉及的材料如下：
1.1实验用病毒株和动物
Wa株和SA-11株RV由第三军医大学免疫研究所提供，野生AB系斑马鱼，购于南京一树梨花生物科技有限公司，MA104细胞株来源于中山大学细胞库。
1.2实验材料
1.2.1主要试剂
RV抗原检测ELISA试剂盒(上海茁彩生物科技有限公司)；SYTOTM 82OrangeFluorescent Nucleic Acid Stain(上海宾智生物科技有限公司)；1×PBS磷酸盐缓冲液(江苏碧云天生物技术研究所)；不含EDTA0.25％胰蛋白酶消化液，含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液，1×PBS磷酸缓冲液，抗青链霉素，二甲基亚砜(Solarbio公司)；胎牛血清，高糖DMEM培养基(美国GIBCO公司)；细胞培养皿，细胞培养瓶(美国Corning-Coster公司)。
1.2.2主要试剂的配制
幼鱼麻醉剂：Tricaine(三卡因)用超纯水配置，工作浓度为200ug/ml，用于幼鱼的麻醉，使其暂时失去活动能力。
RV生长维持液：将不含EDTA的胰酶加入到无FBS的DMEM培养液中，使得胰酶的终浓度为1ug/mL。
含10％胎牛血清的DMEM培养液：在超净台内将胎牛血清50mL、青链霉素双抗5mL加入到450mL的高糖DMEM培养液中，充分混匀后分装到50mL的离心管中，标记封口，4℃保存。
1％甲基纤维素固定液：甲基纤维素用超纯水配制，先50ml水加热到70℃加入100mg的甲基纤维素粉末搅拌均匀后再加入4℃冷水50ml，分装，放4℃冰箱储存。
胚胎培养基：5mmol/L NaCl,0.17mmol/L KCl,0.33mmol/L CaCl2,0.33mmol/LMgSO4,超纯水补足至1L，完全溶解后高压灭菌30min。
亚甲基蓝溶液：用胚胎培养基配制，工作浓度为0.5mg/L，用于鱼卵孵化之前抑制水中细菌和霉菌的滋生。
1.2.3主要仪器
普通光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；倒置荧光显微镜(XLB-1A公司)；微量进样器(上海高鸽工贸有限公司)；微量移液器(2.5、10、20、100、1000ul,德国Eppendorf公司)；-20℃冰箱(美的公司)；-80℃超低温冰箱，CO2培养箱(Thermo Scientific公司)；高压灭菌锅(日本Sanyo公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术公司SW-CJ-2F型)；去离子水纯化仪(德国Merck Millipore公司)；电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；多功能酶标仪(GeneCompany Linited公司)。
1.2.4斑马鱼的品系
本实验所用斑马鱼为AB系，由南京一树梨花生物科技有限公司提供，参照《TheZebrafish Book》一书中的标准化饲养程序(Westerfeld，2000)。在标准化的斑马鱼饲养繁殖系统中饲养繁殖，系统循环水的温度控制在28.5℃，pH为6.8～7.4，并给予14h光照/10h黑暗的人工光照周期。斑马鱼的实验均严格按照《广东省实验动物管理条例》的标准及广东医科大学实验动物伦理委员会的审批要求进行。
结果分析：
1.4.1斑马鱼体征情况
SA株腹腔注射、灌胃和浸泡三种感染方式对三月龄斑马鱼的活动、粪便等无明显影响。与正常组相比，SA株感染组粪便为长条形或棒状，颜色为橙黄色，触之不易散，同时两组斑马鱼进食情况良好，游动能力无明显差异。
SA株腹腔注射、灌胃和浸泡三种感染方式对一月龄斑马鱼的进食情况和游动能力无明显影响。但与正常组相比，SA株灌胃组斑马鱼出现排泄物较多，细棒状或分散成细颗粒状，松散，颜色偏白，水质浑浊等；SA浸泡组斑马鱼排泄物较多，细棒状，絮状，质地松散，颜色偏白，水质浑浊等。
其中，浸泡感染SA-11株病毒的一月龄斑马鱼的粪便情况，如图1所示。浸泡感染SA-11株病毒的三月龄斑马鱼的粪便情况，如图2所示。
1.4.2生存时间分析
不同RV感染方式感染一月龄斑马鱼的生存曲线，见图1。图1结果表明，腹腔注射方式对一月龄正常组斑马鱼和RV组斑马鱼都有高的致死率，说明腹腔注射方式对一月龄斑马鱼的损伤比较大。而灌胃感染方式的生存率较高，约在80％，但是一月龄斑马鱼灌胃操作难度过大，且有漏液的情况，而浸泡感染组的斑马鱼全部存活，且浸泡感染方式较易操作，因此采取浸泡的方式感染斑马鱼。
不同RV感染方式感染三月龄斑马鱼的生存曲线，见图2。图2结果表明，三月龄斑马鱼的正常组生存率均为100％，RV腹腔注射、灌胃和浸泡三种感染方式对三月龄斑马鱼的生存率没有明显差异，生存率均大于80％。
1.4.3 ELISA法检测浸泡感染24h后一月龄、三月龄斑马鱼肠道RV抗原VP6
结果表明，一月龄斑马鱼感染SA-11和WA株24h后的肠道中均能检测到RV的VP6抗原的存在，三月龄斑马鱼感染SA-11和WA株24h后的肠道中并未检测出RV抗原。
1.4.4荧光sytoRNA标记的RV感染5dpf的斑马鱼
荧光sytoRNA标记的RV感染5dpf的斑马鱼的情况，如图5所示。斑马鱼由于早期胚胎透明的特点，对病毒用荧光进行标记再感染斑马鱼，可以在斑马鱼体内对病毒进行实时示踪定位。近年来用于荧光标记病毒的标记物主要分为荧光蛋白、有机荧光染料以及半导体纳米材料量子点。鉴于SYTO系列染料的荧光量子产率高，具备较好的膜通透性，可标记活细胞或活病毒，生物相容性好，毒性小。对于标记核酸的染料，具备在结合核酸后荧光增强的特点，是非常理想的核酸标记物。为此，我们课题组选择有机荧光染料SYTO系列作为标记物，并在成功标记RV。
将RV用荧光染料标记后感染5dpf的斑马鱼，活细胞成像仪中实时观察成像。与正常组相比，SYTO-SA感染组和SYTO-Wa感染组斑马鱼游动变少，对光较不敏感。
SYTO-SA-11感染斑马鱼后4h可见红色荧光逐步聚集在肠道，6h在斑马鱼肠道、大脑顶端，10h后红色荧光在脑部逐渐增强，肠道RV荧光逐步减弱，14h脑部荧光明显。显示了SYTO-SA-11株病毒可通关肠道转移至富集至脑部。
SYTO-Wa感染斑马鱼后4h可见红色荧光聚集在肠道、脑部，10h、12h红色荧光主要转移至脑部，并持续聚集在脑部。该感染模型为研究RV脑病提供了技术手段。
上述研究结果表明，RV可感染5dpf和一月龄的斑马鱼，同时建立了RV感染5dpf斑马鱼脑病的模型，为研究RV性脑病提供了技术平台。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一、斑马鱼的选取：选取5dpf、一月龄、三月龄的斑马鱼进行实验；
步骤二、RV的培养与扩增：在MA104细胞上进行SA-11株和Wa株RV的培养与扩增；
步骤三、病毒滴定测定：生长状态良好的MA104细胞，进行常规消化后离心，倒去液体，然后加培养基稀释计数后接种于孔板上进行培养，待细胞贴壁，将病毒株与胰酶混合孵育；将RV病毒液用无FBS的DMEM培养液稀释，取出贴壁的MA104细胞，用预热的PBS洗一遍，再用无FBS的DMEM培养液洗一遍，将预先孵育好的病毒液加入到孔板中，设置正常对照组，正常对照组加无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中孵育；一定时间后吸出病毒液，加入无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中培养；于不同时间点观察RV感染细胞后的病理状态，当观察最低稀释度病毒液的孔内不再出现CPE时，记录；同时，避光条件加入MTT试剂，用酶标仪检测490nm波长条件下样品吸光度，按照Reed and Muench的方法计算出病毒的TCID50；
步骤四、SA-11株感染方式和鱼龄的选择：分别通过腹腔注射、灌胃感染、浸泡感染三种方式，感染一月龄、三月龄的斑马鱼，每组各若干只，设正常对照组；每隔一定时间观察斑马鱼的外观体征，包括形态、活动情况、肛门处是否红肿，死亡情况；
步骤五、ELISA法检测RV感染斑马鱼肠道VP6抗原：按照步骤三的方法优选出最佳感染方式、鱼龄，进一步考察斑马鱼对SA-11株和Wa株的易感性，分别用两种病毒株对一月龄、三月龄斑马鱼按照最佳感染方式处理；感染1天后麻醉处死斑马鱼，解剖分离肠道部位，按照试剂盒说明书进行；
步骤六：荧光sytoRNA标记的RV感染斑马鱼：用荧光染料sytoRNA标记的RV，感染5dpf的斑马鱼，斑马鱼在孔板中培养，每孔一只；分为正常组，syto-SA-11组，syto-WA组，每组3只，分别加入正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液，感染一定时间后更换成正常培养水，活细胞成像仪下观察荧光的分布。
2.根据权利要求1所述的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：所述步骤一中，所述斑马鱼为AB系，参照《The Zebrafish Book》一书中的标准化饲养程序(Westerfeld，2000)，在标准化的斑马鱼饲养繁殖系统中饲养繁殖，系统循环水的温度控制在28℃～29℃，pH为6.8～7.4，并给予14h光照/10h黑暗的人工光照周期。
3.根据权利要求1所述的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：所述步骤二中，在MA104细胞上进行SA-11株和Wa株RV的培养与扩增，具体为：将病毒从-75℃～-85℃冰箱中取出，放在3.5℃～4.5℃冰箱中溶解，将RV与10ug/mL的胰酶混合封闭，培养箱复苏30min，从细胞培养箱中取出生长达到单层的MA104细胞，将培养液吸出后用PBS冲洗一遍，再用无FBS的DMEM培养基润洗两遍后加入孵育好的RV病毒液1mL，然后向单层细胞继续添加3mL的含有1ug/mL胰酶的无血清DMEM病毒维持液，放入CO2培养箱常规培养，间隔6h、12h、18h、24h用倒置显微镜观察MA104细胞的CPE变化，直至在倒置显微镜下观察到细胞出现CPE达到+++～++++时，取出细胞培养瓶置于-18℃～-22℃冰箱过夜；次日将细胞培养瓶置于3.5℃～4.5℃自然溶解，反复冻融2～4次，于超净台内收集细胞冻融液于离心管中，用低温高速离心机3.5℃～4.5℃下11000r/min～13000r/min离心25min～35min，最后将上清病毒液收集并分装，标记后于-75℃～-85℃下保存。
4.根据权利要求1所述的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：所述步骤三中，生长状态良好的MA104细胞，进行常规消化后离心，倒去液体，加4～5mL培养基稀释计数后接种于96孔板上，每孔8000个细胞，培养12h，待细胞贴壁，将病毒株与10ug/mL的胰酶混合在37℃下孵育30min，将RV病毒液用无FBS的DMEM培养液以1：9～11的比例稀释6个梯度浓度，取出贴壁的MA104细胞，用预热的PBS洗一遍，再用无FBS的DMEM培养液洗一遍，将预先孵育好的病毒液加入到96孔板中，每孔100uL，每个梯度浓度9个孔，设置正常对照组，正常对照组加100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中孵育，1.5h～2.5h后吸出病毒液，加入100uL的无FBS的DMEM培养液，放入培养箱中培养；于不同时间点观察RV感染细胞后的病理状态，当观察最低稀释度病毒液的孔内不再出现CPE时，记录；同时，避光条件加入MTT试剂，用酶标仪检测490nm波长条件下样品吸光度，按照Reed and Muench的方法计算出病毒的TCID50。
5.根据权利要求1所述的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：所述步骤四中，分别通过腹腔注射、灌胃、浸泡三种方式，感染一月龄、三月龄的斑马鱼，每组各15只，设正常对照组；每隔24、48、72、96h观察斑马鱼的外观体征，包括形态、活动情况、肛门处是否红肿，死亡情况；斑马鱼早晚各喂食一次，并于每天早晨收集相应的培养水100mL以用于相应的指标的检测，并更换新鲜培养水。
6.根据权利要求1所述的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：所述步骤四中，所述腹腔注射：分别给一月龄和三月龄的斑马鱼注射病毒液SA-11株5uL和10uL，正常对照组注射等量的DMEM，注射后立即放入斑马鱼养殖系统培养。
7.根据权利要求1所述的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：所述步骤四中，所述灌胃感染：分别给一月龄和三月龄斑马鱼灌胃5ul和10uL病毒液，正常对照组灌胃等量的DMEM培养基，灌胃立即放入斑马鱼养殖系统培养。
8.根据权利要求1所述的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：所述步骤四中，所述浸泡感染：一月龄和三月龄斑马鱼分别浸泡在10mL的SA-11株病毒液中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养，正常组浸泡在等量的DMEM中1h后立即放入斑马鱼养殖系统培养培养,病毒液的效价为104TCID50/mL。
9.根据权利要求1所述的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：所述步骤六中，用荧光染料sytoRNA标记的RV，感染5dpf的斑马鱼，斑马鱼在96孔板中培养，每孔一只；分为正常组，syto-SA-11组，syto-WA组，每组3只，分别加入正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液，感染3.5h～4.5h后更换成正常培养水，活细胞成像仪下观察荧光的分布；
其中，所述正常培养水、syto-SA-11病毒液和syto-WA病毒液的质量比为1:1:1。
10.根据权利要求1所述的一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法，其特征在于：所述步骤六中，所述5dpf的斑马鱼用0.003％的PTU处理以阻止黑色素产生；5dpf的斑马鱼在恒温培养箱中培养，控制昼夜时间14h：10h，温度为23℃～33℃，pH值为6.8～7.4。
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