CN112106705B - 一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物评价与筛选的技术领域，针对现有评价肺炎的动物模型存在造模操作复杂，不利于后续肺炎治疗药物的评价与筛选工作，公开了一种肺炎动物模型的建立方法合理用该模型的评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，该肺炎动物模型通过将5dpf的斑马鱼置于水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)，给药浓度为≥50 ng/尾建立，在评价药物时采用炎症消退作用、巨噬细胞改善作用和相关基因RNA相对表达量作用评价指标。本发明的肺炎模型可用于评价已知药物的毒性或功效，还可用于筛选具有未知药物，能准确反映药物在体内的真实情况，可实现在体内高通量筛选或评价药物对病毒性肺炎的治疗功效，具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点。
Description
技术领域
本发明涉及药物评价与筛选的技术领域，具体涉及一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法。
背景技术
在非细菌性肺炎中，病毒性肺炎占25％-50％，常为吸入性感染，主要传染源是病人，通过飞沫和密切接触传染，可由上呼吸道病毒感染向下蔓延引起，也可继发于出疹性病毒感染，常伴气管-支气管感染，多发生于冬春季节，可散发或流行，多见于婴幼儿、老年人和原有慢性心肺疾病的病人。其中流行性感冒病毒是成年人和老人病毒性肺炎最为常见的病原，婴幼儿病毒性肺炎则常由呼吸道合胞病毒感染所致。其他如副流感病毒、巨细胞病毒、冠状病毒、腺病毒、鼻病毒和某些肠道病毒，如柯萨奇、埃可病毒等也可引起病毒性肺炎。近年来由于免疫抑制药物广泛应用于器官移植病人，以及爱滋病发病人数的增多，病毒性肺炎的发病率逐渐增多，而冠状病毒肺炎的爆发使得预防病毒性肺炎显得尤为重要。目前肺炎的治疗主要有：通气供氧、选用抗生素、糖皮质激素、外源性肺表面活性物质、血管扩张剂、相关酶等。但现有的肺炎治疗药物存在着或疗效不佳，或毒副作用较大或费用高等问题，因此开发新的肺炎治疗药物显得非常必要。
药物筛选是发现、开发药物过程中一个重要的环节，实验肺炎模型的建立对评价与筛选肺炎治疗药物至关重要。目前肺炎动物模型主要被用来研究肺炎的机制，但这些动物模型大多数是根据已知的诱发肺炎的危险因子复制的，例如脓毒血症、继发于骨折的脂肪栓塞、吸入酸性物质、肺或末端血管床的缺血-再灌注以及其他的临床危险因素。而且理想的肺炎实验动物模型应能够复制人类肺炎发生的机制和后果，但是目前为止没有任何一个实验动物模型可以完全复制人类肺炎的所有特征，大多肺炎实验动物模型只是针对人类肺炎的单个或少数几个病理生理特征进行复制，如换气功能异常、肺顺应性下降、肺实质损伤和肺泡毛细血管膜通透性增加等，并且这些动物模型均存在造模操作复杂、技术要求高、手术创伤大、肺炎发生率低、并发症和死亡率高、模型建立不稳定、可重复性差等缺点，实验周期长、费用高、工作量大，不利于后续肺炎治疗药物的评价与筛选工作。其他如体外细胞模型缺少药物在生物整体的代谢转化和体内的循环分布，不能反映药物在体内的真实情况。因此建立一种能很好的模拟药物在体内的过程，又能快速方便的评价与筛选肺炎治疗药物的动物模型具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有评价肺炎的动物模型存在造模操作复杂，不利于后续肺炎治疗药物的评价与筛选工作，本发明的目的在于提供一种肺炎动物模型的建立方法；
本发明的又一目的在于提供使用该肺炎动物模型来评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，可以快速、准确评价和筛选预防病毒性肺炎的药物。
本发明提供如下的技术方案：
一种肺炎动物模型的建立方法，将斑马鱼置于水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂，所用肺炎诱导剂为poly(I：C)，所述肺炎诱导剂的给药浓度为≥50ng/尾。
作为本发明方法的优选，所用斑马鱼为受精后5天斑马鱼。
poly(I:C)是一种人工合成的双链RNA(dsRNA)，因其结构类似于多种病毒在细胞内代谢所产生的核糖核酸，目前没有文献报道使用poly(I:C)建模斑马鱼病毒性肺炎。而现有的研究表面，斑马鱼与人类相似的药物代谢系统，药物对细胞色素P450及其亚酶CYP3A4家族所产生的效应与人体观察到的基本一致。发明人在研究者创新性的采用poly(I:C)作为诱导剂构建斑马鱼病毒性肺炎模型，使得建立的动物模型既能够尽量模拟临床，又能够相对稳定。
一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，包括上述肺炎动物模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：将斑马鱼置于水中培养；
(2)设置模型对照组：将步骤(1)同规格的斑马鱼置于水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)，造模，培养；
(3)设置供试品组：将步骤(1)同规格的斑马鱼置于水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)和待测试药物，培养；
(4)检测评价：取上述正常对照组、模型对照组和待测试药物组的斑马鱼进行检测，比较待测试药物组和模型对照组的评价指标，评价待测试药物预防病毒性肺炎的效果；
所述评价指标为中性粒细胞改善作用、巨噬细胞改善作用和TNF-α基因的RNA相对表达量、IL-1β基因的RNA相对表达量中的至少一种。
现有的研究发现，肺泡被感染后会引起中性粒细胞的聚集，随后中性粒细胞会释放颗粒蛋白或活性氧簇(ROS)等物质，这些物质会进一步加快ALI/ARDS的进程。斑马鱼与人类同源基因相似性达到85％，表现出类人行为。发明人研究确认，在斑马鱼建立肺炎模型后，斑马鱼体内也会引起中性粒细胞的聚集，通过分析中性粒细胞的个数可以更加直观和准确的衡量肺炎程度，从而标准待测药物的预防效果。进一步的，发明人在研究中还确认，伴随斑马鱼肺炎模型建立，斑马鱼体内的巨噬细胞荧光强度表现出增强趋势，而施加干预和治疗手段减轻肺炎症状后，巨噬细胞荧光强度减弱，表现出相关性。同时，发明人还开创性的将TNF-α基因的RNA相对表达量、IL-1β基因的RNA相对表达量与肺炎程度关联起来，从而提供第三种指标，通过研究分析发现，三种指标具有一致的指向性，当肺炎程度加深时，观测到的中性粒细胞数量增加、巨噬细胞荧光强度增强，而RNA相对表达量上升。
作为本发明方法的优选，所述评价指标为中性粒细胞改善作用时，所用斑马鱼为转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼。对中性粒细胞与肺炎关联性的研究的一大阻碍就是目前动物模型无法为研究者提供对肺泡中性粒细胞行为进行动态观察的便利条件。发明人选择中性粒细胞绿色荧光转基因斑马鱼，斑马鱼经药物处理后，借助荧光显微镜，可以无创伤地在实验设置的任何时间点实时动态观察中性粒细胞的行为学特点，实现哺乳动物不可能完成的操作。
作为本发明方法的优选，所述水的pH值为6.9～7.2，总硬度为53.7～71.6mg/LCaCO3，每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm。
作为本发明方法的优选，所述中性粒细胞改善作用计算公式如下：
其中，S1(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值，S1(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值。
鱼鳔作为鱼类浮力调节的重要器官，已经被大量的研究在解剖学、形态学和转录组学等不同水平证实同陆生动物的肺为同源器官。目前用活体斑马鱼鳔作为动物模型开展肺疾病研究的相关文献尚未见报道。发明人选择以鱼鳔作为斑马鱼模拟人体肺的器官，考察上述制备在鱼鳔中的变化，能够更真实的反应待测药物的效果。
作为本发明方法的优选，所述巨噬细胞胞改善作用计算公式如下：
其中，S2(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的巨噬细胞个数统计值，S2(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的巨噬细胞个数统计值。
作为本发明方法的优选，TNF-α与IL-1β基因的RNA相对表达量的计算公式如下：
RNA相对表达量＝2^ΔΔC(t)
ΔC(t)＝C(t)目的基因-C(t)β-actin。
上式中，使用经典Trizol法提取各实验组斑马鱼总RNA后，利用Thermo超微量分光
光度计对总RNA浓度和纯度进行测定。取2μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20μL cDNA置于-20℃保存，用β-actin作为基因表达的内参，计算TNF-α和IL-1β基因的RNA相对表达量，其中：
C(t)目的基因表示目的基因TNF-α或IL-1β的扩增次数，C(t)β-actin表示内参基因β-actin的扩增次数，
是poly(I:C)的相对的扩增次数，ΔC(t)供试品组表示供试品目的基因相对于内参的扩增次数，ΔΔC(t)表示供试品组相对于模型的相对扩增次数，RNA相对表达量为相对于模型对照组的相对表达量。
作为本发明方法的优选，评价标准如下：
当供试品组的评价指标相对于模型对照组的显著性差异水平p＜0.05时，药物有明显预防病毒性肺炎效果，否则，药物不具有预防病毒性肺炎效果或预防效果不明显。
本发明的有益效果如下：
第一，采用活性斑马鱼作为模型动物和受试动物，能够真实反映药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，真正反映药物的整体生物活性；其中斑马鱼体型小，只有1～4毫米，可以在标准的6～384的孔板内进行分析，试验周期段，使斑马鱼成为一种能进行高通量自动化体内药物致敏性评价的理想模型，表现在：(1)斑马鱼的基因与人类基因的相似度高达85％左右，其生物学功能与哺乳动物及人类高度相似，实验结果可比性强，预测性好；(2)可在1天内完成；而豚鼠常需要数周到数月的时间，犬常需要数月至数年的时间。斑马鱼在第一个72小时以内完成胚胎发育。多数的内部器官，包括心血管系统、肠、肝脏和肾，在24-48小时内快速成型，传统的实验载体老鼠和猴子则分别需要21天和9个月方可完成胚胎发育；(3)化合物用量少，通常只需几毫克，而传统的筛选实验则需几毫克以上的化合物；(4)所需费用低，以犬为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于10美元，以豚鼠为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于1美元，而以斑马鱼为实验载体的筛选实验每只每天耗费小于0.01美元；(5)斑马鱼发育周期短，单次产卵数量高，同一亲本子代的差异性小，可以批量试验，基于统计学方法获得试验结果，消除个体差异，因此稳定性高、重复性好，本发明重复实验十几次，所获实验结果基本相同，而且实验过程操作简单，可进行定量分析此药物的致敏性，而传统动物实验操作过程复杂，判断指标主观，容易产生假阳性结果。
第二，选择合适用量的化学药物poly(I:C)作为诱导剂来构建斑马鱼模型，目前对poly(I:C)诱发病毒性肺炎仅在哺乳动物模型上证明；在斑马鱼体内用poly(I:C)诱发病毒性肺炎中的建模方法系本发明原创。
第三，采用中性粒细胞、巨噬细胞和相关基因的RNA相对表达量作为测试指标，提供了比较稳定可靠的观测标准。
第四，本发明构建的斑马鱼病毒性肺炎模型，既可用于评价已知药物(如结构公开、药效明确的诱导剂、治疗剂)的毒性或功效，还可用于筛选具有未知药物(如结构全新、药效不明的化合物，常用于first、me-better、me-too等等的新药开发)的毒性或功效，应用广泛，意义重大。
第五：发明人在建立了斑马鱼病毒性肺炎模型的基础上，提供了一种利用该模型筛选或评价抗病毒性肺炎药物的方法，这是一种全新的药物评价模型与评价方法，能准确反映药物在体内的真实情况，可实现在体内高通量筛选或评价药物对病毒性肺炎的治疗功效，具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点。
附图说明
图1是实施例1与对比例1～3不同诱导剂用量下斑马鱼鱼鳔部位中性粒细胞个数图。
图2是实施例1与对比例4的不同发育阶段斑马鱼的鱼鳔部位中性粒细胞个数图。
图3是实施例1与对比例4的不同发育阶段斑马鱼的中性粒细胞增加率对比图。
图4是实施例2中不同吲哚美辛剂量下斑马鱼鱼鳔部位中性粒细胞个数图。
图5是实施例2中不同吲哚美辛剂量下斑马鱼的炎症消退作用对比图。
图6是实施例2中不同吲哚美辛剂量下斑马鱼鱼鳔部位巨噬细胞荧光强度对比图。
图7是实施例2中不同吲哚美辛剂量下斑马鱼鱼鳔部位巨噬细胞改善作用对比图。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
下述实施例中所用斑马鱼均为中性粒细胞转基因绿色荧光斑马鱼。
下述实施例中所用水的pH值为7.2，总硬度为53.7mg/L CaCO3，每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为500μS/cm。
实施例1
一种肺炎动物模型的建立方法，将受精后5天的中性粒细胞转基因绿色荧光斑马鱼30尾置于3mL水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)，给药浓度为100ng/尾，28℃下恒温培养3h，得到模型组；
同时设置正常对照组，与模型组相比，省略肺炎诱导剂。
对比例1
与实施例1不同之处在于，肺炎诱导剂poly(I:C)的给药浓度为12.5ng/尾。
对比例2
与实施例1不同之处在于，肺炎诱导剂poly(I:C)的给药浓度为25ng/尾。
对比例3
与实施例1不同之处在于，肺炎诱导剂poly(I:C)的给药浓度为50ng/尾。
对比例4
与实施例1不同之处在于，所用斑马鱼为受精后4天斑马鱼，即4pdf斑马鱼。
将上述实施例1中的模型组、正常对照组和对比例1～4中处理后的斑马鱼置于荧光显微镜下拍摄鱼鳔部位中性粒个数，并计算中性粒细胞增加率，结果见图1、2和图3所示。
从图1可知，浓度为12.5、25、50和100ng/尾的poly(I:C)诱发的斑马鱼鱼鳔部位中性粒细胞个数分别为4、6、12和14个，与正常对照组的4个比较，基于方差分析和T分布检验，12.5和25μg/mL浓度组p＞0.05，50和100μg/mL浓度组p＜0.001。
所以，合理的造模浓度应为≥50ng/尾。
结合图2和图3可知，4dpf阶段：正常对照组斑马鱼鱼鳔部位中性粒数目为3个，诱导剂处理组斑马鱼鱼鳔部位中性粒数目为6个，中性粒细胞增加率为100％，与正常对照组相比p＞0.05，证明模型建立不成功，因此模型不可行。
5dpf阶段：正常对照组斑马鱼鱼鳔部位中性粒数目为3个，诱导剂处理组斑马鱼鱼鳔部位中性粒数目为13个，中性粒细胞增加率为333％，与正常对照组相比p＜0.05，证明模型建立成功，因此模型可行。
综上，确定斑马鱼的最佳发育阶段为5dpf。
实施例2
一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，待评价药物为吲哚美辛，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：将5dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾置于3mL水中28℃下恒温培养3h；
(2)设置模型对照组：将步骤(1)同规格的斑马鱼10尾置于3mL水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾；
(3)设置供试品组：将步骤(1)同规格的斑马鱼150尾均分为5组各置于3mL水中培养，并向每组斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，并以水溶方式同时加入吲哚美辛，吲哚美辛浓度依次为7.5、15、30、60和120μM，观察斑马鱼的活动状况；
(4)检测评价：取上述正常对照组、模型对照组和待测试药物组的斑马鱼置于荧光显微镜下拍摄鱼鳔部位，基于方差分析和T分布检验分析，统计中性粒细胞个数和巨噬细胞荧光强度，计算待测试药物组与模型对照组的中性粒细胞改善作用、巨噬细胞改善作用的显著性差异，结果见图4～5和图6～7所述。
从图4～5可知，模型对照组斑马鱼鱼鳔内中性粒细胞个数为15个，与正常对照组(3个)比较p＜0.001，造模成功。浓度为7.5、15、30和60μM的吲哚美辛处理组斑马鱼鱼鳔内中性粒细胞个数分别为16、13、11和8个，与模型对照组比较，7.5、15、30和60μM浓度组p＞0.05、p＞0.05、p＜0.05、p＜0.001，抗病毒性肺炎作用分别为7％、13％、27％和47％，另外，120μM吲哚美辛处理组斑马鱼10尾死亡。
从图6～图7可知，模型对照组斑马鱼鱼鳔内巨噬细胞荧光强度总和为773568像素，与正常对照组(131580像素)比较p＜0.001，造模成功。浓度为7.5、15、30和60μM的吲哚美辛处理组斑马鱼鱼鳔内中性粒细胞个数分别为764000、679967、606498和438294像素，与模型对照组(773568像素)比较，7.5、15、30和60μM浓度组p＞0.05、p＞0.05、p＜0.05、p＜0.001，抗病毒性肺炎作用分别为1％、12％、22％和43％；
综上可知，当吲哚美辛的给药浓度≥30μM时，可以明显起到抗病毒性肺炎的作用。
实施例3
一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，待评价药物双黄连口服液、板蓝根颗粒和复方穿心莲片，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：将5dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾置于3mL水中28℃下恒温培养3h；
(2)设置模型对照组：将步骤(1)同规格的斑马鱼30尾置于3mL水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，按照正常对照组培养；
(3)设置供试品组：将步骤(1)同规格的斑马鱼420尾均分为14小组各置于3mL水中培养，其中5小组为双黄连口服液组、5小组为板蓝根颗粒组、4小组为复方穿心莲片组，每小组均注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，同时，双黄连口服液组中5小组分别水溶方式给予浓度为1.25、2.5、5、10、20μL/mL的双黄连口服液，板蓝根颗粒组中5小组分别水溶方式给予浓度为830、1670、3340、6667、13300μg/mL的板蓝根颗粒，复方穿心莲片组中4小组分别给予水溶浓度为540、1080、2150、4300μg/mL的复方穿心莲片；按照正常对照组培养；
(4)检测评价：随机取上述各测试组的斑马鱼15尾置于荧光显微镜下拍摄鱼鳔部位，基于方差分析和T分布检验分析，统计中性粒细胞个数，并计算待测试药物组与模型对照组的中性粒细胞改善作用的显著性差异，其中性粒细胞改善作用计算公式如下：
其中，S1(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值，S1(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值。
结果如表1所示。
表1双黄连口服液等三种药物的横向测试评价结果(n＝15)
与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
从表1中可以看出，实验浓度下，双黄连口服液在不超过2.5μL/mL时具有显著的预防病毒性肺炎的作用，板蓝根颗粒在浓度不超过6667μg/mL时具有显著的预防病毒性肺炎的作用，而复方穿心莲片在实验浓度范围内均具有明显的预防病毒性肺炎的作用。
实施例4
一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，待评价药物为金银花提取物、薏苡仁提取物、黄精提取物，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：将5dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾置于3mL水中28℃下恒温培养3h；
(2)设置模型对照组：将步骤(1)同规格的斑马鱼30尾置于3mL水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，按照正常对照组培养；
(3)设置供试品组：将步骤(1)同规格的斑马鱼420尾均分为14小组各置于3mL水中培养，其中4小组为金银花提取物组、5小组为薏苡仁提取物组、5小组为黄精提取物组，每小组均注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，同时，金银花提取物组中4小组分别水溶方式给予浓度为100、500、1000、2500μg/mL的金银花提取物，薏苡仁提取物组中5小组分别以水溶方式给予浓度为100、500、1000、2500、5000μg/mL的薏苡仁提取物，黄精提取物组中5小组分别以水溶方式给予浓度为100、500、1000、2500、5000μg/mL的黄精提取物；按照正常对照组培养；
(4)检测评价：随机取上述各测试组的斑马鱼15尾置于荧光显微镜下拍摄鱼鳔部位，基于方差分析和T分布检验分析，统计中性粒细胞个数，并计算待测试药物组与模型对照组的中性粒细胞改善作用的显著性差异，其中性粒细胞改善作用计算公式如下：
其中，S1(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值，S1(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值。
结果如表2所示。
表2金银花提取物等三种提取物的横向测试评价结果(n＝15)
与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
从上表中可以看出，试验浓度下，金银花提取物在试验浓度范围内具有显著的预防病毒性肺炎的作用，而黄精提取物组在浓度≥500μg/mL时效果较为明显。薏苡仁提取物有一定的预防病毒性效果，但是效果不明显。
实施例5
一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，待评价药物为芦根提取物，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：将5dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾置于3mL水中28℃下恒温培养3h；
(2)设置模型对照组：将步骤(1)同规格的斑马鱼30尾置于3mL水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，按照正常对照组培养；
(3)设置供试品组：将步骤(1)同规格的斑马鱼150尾均分为5小组各置于3mL水中培养，每小组均注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，并同时分别以水溶方式给予不同浓度的芦根提取物，给予浓度依次为100、500、1000、2500、5000μg/mL，按照正常对照组培养；
(4)检测评价：随机取上述各测试组的斑马鱼10尾置于荧光显微镜下拍摄鱼鳔部位，基于方差分析和T分布检验分析，统计中性粒细胞个数，并计算待测试药物组与模型对照组的中性粒细胞改善作用的显著性差异，其中性粒细胞改善作用计算公式如下：
其中，S1(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值，S1(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值。
结果如表3所示。
表3芦根提取物评价结果(n＝10)
与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
从上表中可以看出，在试验浓度范围内，芦根提取物均具有显著的预防病毒性肺炎的作用。
实施例6
一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，待评价药物为菌粉提取物，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：将5dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾置于3mL水中28℃下恒温培养3h；
(2)设置模型对照组：将步骤(1)同规格的斑马鱼30尾置于3mL水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，按照正常对照组培养；
(3)设置供试品组：将步骤(1)同规格的斑马鱼150尾均分为5小组各置于3mL水中培养，每小组均注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，并同时分别以水溶方式给予不同浓度的菊粉提取物，给予浓度依次为100、500、1000、2500、5000μg/mL，按照正常对照组培养；
(4)检测评价：随机取上述各测试组的斑马鱼10尾置于荧光显微镜下拍摄鱼鳔部位，基于方差分析和T分布检验分析，统计中性粒细胞个数，并计算待测试药物组与模型对照组的中性粒细胞改善作用的显著性差异，其中性粒细胞改善作用计算公式如下：
其中，S1(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值，S1(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值。
结果如表4所示。
表4菊粉提取物评价结果(n＝10)
从商标证可以看出，当测试浓度≥500μg/mL使，测试浓度范围内，菊粉提取物均有明显的预防病毒性肺炎的作用。
实施例7
一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，待评价药物为桑椹提取物、香菇提取物、麦冬提取物，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：将5dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾置于3mL水中28℃下恒温培养3h；
(2)设置模型对照组：将步骤(1)同规格的斑马鱼30尾置于3mL水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，按照正常对照组培养；
(3)设置供试品组：将步骤(1)同规格的斑马鱼420尾均分为14小组各置于3mL水中培养，其中4小组香菇提取物组、5小组为桑葚提取物组、5小组为麦冬提取物组，每小组均注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，同时，香菇提取物组中4小组分别水溶方式给予浓度为100、500、1000、2500μg/mL的金银花提取物，桑葚提取物组中5小组分别以水溶方式给予浓度为100、500、1000、2500、5000μg/mL的薏苡仁提取物，麦冬提取物组中5小组分别以水溶方式给予浓度为100、500、1000、2500、5000μg/mL的黄精提取物；按正常对照组培养；
(4)检测评价：随机取上述各测试组的斑马鱼15尾置于荧光显微镜下拍摄鱼鳔部位，基于方差分析和T分布检验分析，统计中性粒细胞个数，并计算待测试药物组与模型对照组的中性粒细胞改善作用的显著性差异，其中性粒细胞改善作用计算公式如下：
其中，S1(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值，S1(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值。
结果如表5所示。
表5桑椹提取物等三种提取物的横向测试评价结果(n＝10)
与模型对照组比较，**p＜0.01，***p＜0.001。
从表中可知，在测试浓度范围内，三种提取物均匀明显的预防病毒性肺炎的作用。
实施例8
一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，待评价药物复方穿心莲片，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：将5dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼30尾置于3mL水中28℃下恒温培养3h；
(2)设置模型对照组：将步骤(1)同规格的斑马鱼30尾置于3mL水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，按照正常对照组培养；
(3)设置阳性对照组：将步骤(1)同规格的斑马鱼30尾置于3mL水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，并同时以水溶方式给予吲哚美辛60μM，按照正常对照组培养；
(4)设置供试品组：将步骤(1)同规格的斑马鱼150尾均分为3组各置于3mL水中培养，每小组均注射肺炎诱导剂poly(I:C)100ng/尾，并同时分别以水溶方式给予复方穿心莲片，给予浓度依次为：33.3、100和300μg/mL；按照正常对照组培养；
(4)检测评价：随机取上述各测试组的斑马鱼15尾置于荧光显微镜下拍摄鱼鳔部位，基于方差分析和T分布检验分析，统计中性粒细胞个数、巨噬细胞荧光强度以及TNF-α与IL-1β基因的RNA相对表达量，计算待测试药物组与模型对照组的中性粒细胞改善作用、巨噬细胞改善作用和RNA相对表达量的显著性差异，其中：
性粒细胞改善作用计算公式如下：
其中，S1(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值，S1(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值；
巨噬细胞胞改善作用计算公式如下：
其中，S2(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的巨噬细胞荧光强度统计值，S2(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的巨噬细胞荧光强度统计值。
RNA相对表达量的测试和计算过程如下：
使用经典Trizol法提取各实验组斑马鱼总RNA后，利用Thermo超微量分光光度计对总RNA浓度和纯度进行测定。取2μg斑马鱼样品总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明操作，合成20μL cDNA置于-20℃保存。用β-actin作为基因表达的内参，计算TNF-α和IL-1β基因的RNA相对表达量，以评价该治疗剂对病毒性肺炎的保护作用，计算公式如下：
RNA相对表达量＝2^ΔΔC(t)
ΔC(t)＝C(t)目的基因-C(t)β-actin。
上式中，C(t)目的基因表示目的基因TNF-α或IL-1β的扩增次数，C(t)β-actin是内参基因β-actin的扩增次数，
是poly(I:C)的相对的扩增次数，ΔC(t)供试品组表示目的基因相对于内参的扩增次数，ΔΔC(t)表示供试品组相对于模型的相对扩增次数，RNA相对表达量为相对于模型对照组的相对表达量。
结果如下：
复方穿心莲浓度为33.3、100和300μg/mL时，斑马鱼炎症部位中性粒细胞数分别为8、10和10个，与模型对照组(14个)比较p＜0.001&p＜0.05&p＜0.05，其炎症消退作用分别为43％、29％和29％，说明复方穿心莲在本实验浓度条件下对Poly(I:C)诱发的病毒性肺炎斑马鱼有明显抗炎作用。
复方穿心莲浓度为33.3、100和300μg/mL时，斑马鱼炎症部位荧光信号强度分别为199385、189848和336167像素，与模型对照组(289859像素)比较p＜0.01&p＜0.01&p＞0.05，其巨噬细胞改善作用分别为31％、35％和-16％，说明复方穿心莲在本实验浓度条件下对Poly(I:C)诱发的病毒性肺炎斑马鱼有明显巨噬细胞改善作用。
根据基因相对表达量公式计算，模型对照组TNF-α基因相对表达量为1.86，与正常对照组(1.01)比较p＜0.01，说明Poly(I:C)诱发斑马鱼肺炎模型成功；60μM吲哚美辛组TNF-α基因相对表达量为1.08，与模型对照组(1.86)比较p＜0.01，说明60μM吲哚美辛组TNF-α基因表达显著下降；复方穿心莲33.3、100和300μg/mL浓度组TNF-α相对表达量分别为1.37、1.13和1.52，与模型对照组(1.86)比较p＜0.05&p＜0.01&p＞0.05，说明复方穿心莲显著抑制TNF-α基因表达。
根据基因相对表达量公式计算，模型对照组IL-1β基因相对表达量为4.31，与正常对照组(1.01)比较p＜0.001，说明Poly(I:C)诱发斑马鱼肺炎模型成功；60μM吲哚美辛组IL-1β基因相对表达量为3.58，与模型对照组(4.31)比较p＜0.01，说明60μM吲哚美辛组IL-1β基因表达显著下降；复方穿心莲33.3、100和300μg/mL浓度组IL-1β相对表达量分别为4.15、3.41和5.22，与模型对照组(4.31)比较p＞0.05&p＜0.001&p＞0.05，说明复方穿心莲能显著抑制IL-1β基因表达。
通过上述结果可知，三个指标可以相互印证，具有相同的指向性，能够指示药物预防病毒性肺炎作用。
Claims (8)
1.一种肺炎动物模型的建立方法，其特征在于，将斑马鱼置于水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂，所用肺炎诱导剂为poly(I:C)，所述肺炎诱导剂的给药浓度为≥50 ng/尾；
所用斑马鱼为受精后5天斑马鱼。
2.一种评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，包括权利要求1所述的肺炎动物模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）设置正常对照组：将斑马鱼置于水中培养；
（2）设置模型对照组：将步骤（1）同规格的斑马鱼置于水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)，培养；
（3）设置供试品组：将步骤（1）同规格的斑马鱼置于水中培养，并向斑马鱼注射肺炎诱导剂poly(I:C)和待测试药物，培养；
（4）检测评价：取上述正常对照组、模型对照组和待测试药物组的斑马鱼进行检测，比较待测试药物组和模型对照组的评价指标，评价待测试药物预防病毒性肺炎的效果；
所述评价指标为炎症消退作用、巨噬细胞改善作用和TNF-α基因的RNA相对表达量、IL-1β基因的RNA相对表达量中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，其特征在于，所述评价指标为炎症消退作用时，所用斑马鱼为转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼。
4.根据权利要求2所述的评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，其特征在于，所述水的pH值为6.9～7.2，总硬度为53.7～71.6 mg/L CaCO3，每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480～510 μS/cm。
5.根据权利要求2所述的评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，其特征在于，所述炎症消退作用计算公式如下：
其中，S1(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值，S1(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的中性粒细胞个数统计值。
6.根据权利要求2所述的评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，其特征在于，所述巨噬细胞改善作用计算公式如下：
其中，S2(模型对照组)为模型对照组斑马鱼的鱼鳔部位的巨噬细胞荧光强度统计值，S2(供试品组)为供试品组斑马鱼的鱼鳔部位的巨噬细胞荧光强度统计值。
7.根据权利要求2所述的评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，其特征在于，TNF-α与IL-1β基因的RNA相对表达量的计算公式如下：
其中，
表示目的基因TNF-α或IL-1β的扩增次数，
表示内参基因β-actin的扩增次数，
表示poly(I:C)的相对的扩增次数，
表示目的基因相对于内参的扩增次数，
表示供试品组相对于模型的相对扩增次数。
8.根据权利要求2所述的评价药物预防病毒性肺炎效果的方法，其特征在于，评价标准如下：
当供试品组的评价指标相对于模型对照组的显著性差异水平p<0.05时，药物有明显预防病毒性肺炎效果，否则，药物不具有预防病毒性肺炎效果或预防效果不明显。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104174029A (zh) * | 2014-07-21 | 2014-12-03 | 武汉星垣生物技术有限公司 | 呼肠孤病毒dsRNA在医用内源性干扰素诱导剂制备中的应用 |
| CN106492232A (zh) * | 2016-11-03 | 2017-03-15 | 杭州环特生物科技股份有限公司 | 一种用斑马鱼评价心肌损伤诱导剂毒性与治疗剂功效的方法 |
| CN106729763A (zh) * | 2015-11-24 | 2017-05-31 | 宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司 | 聚肌胞苷酸对介导肺部组织对肺炎链球菌清除的i型干扰素通路有激活作用 |
| CN106729714A (zh) * | 2015-11-24 | 2017-05-31 | 宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司 | 聚肌胞苷酸给药与ifni表达之间的关系 |
| WO2019124666A2 (ko) * | 2017-12-19 | 2019-06-27 | 포항공과대학교 산학협력단 | 인터류킨-17 억제제 및 종양괴사인자-알파 억제제를 유효성분으로 포함하는 호중구성 폐 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
| CN110463626A (zh) * | 2019-08-19 | 2019-11-19 | 广东医科大学 | 一种轮状病毒感染斑马鱼模型建立的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN104174029A (zh) * | 2014-07-21 | 2014-12-03 | 武汉星垣生物技术有限公司 | 呼肠孤病毒dsRNA在医用内源性干扰素诱导剂制备中的应用 |
| CN106729763A (zh) * | 2015-11-24 | 2017-05-31 | 宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司 | 聚肌胞苷酸对介导肺部组织对肺炎链球菌清除的i型干扰素通路有激活作用 |
| CN106729714A (zh) * | 2015-11-24 | 2017-05-31 | 宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司 | 聚肌胞苷酸给药与ifni表达之间的关系 |
| CN106492232A (zh) * | 2016-11-03 | 2017-03-15 | 杭州环特生物科技股份有限公司 | 一种用斑马鱼评价心肌损伤诱导剂毒性与治疗剂功效的方法 |
| WO2019124666A2 (ko) * | 2017-12-19 | 2019-06-27 | 포항공과대학교 산학협력단 | 인터류킨-17 억제제 및 종양괴사인자-알파 억제제를 유효성분으로 포함하는 호중구성 폐 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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