CN111349158A

CN111349158A - 一种奶山羊性控精液制备方法

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Publication number: CN111349158A
Application number: CN202010153350.7A
Authority: CN
Inventors: 华松; 宋宇轩; 付明哲
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2040-03-06
Also published as: CN111349158B

Abstract

本发明公开了一种奶山羊性控精液制备方法。首先制备了负载SRY抗体的抗原结合片段的磷酸钙纳米颗粒，按照一定的免疫程序将纳米颗粒注射到性成熟前雄性奶山羊睾丸内，通过抗体在睾丸内缓慢释放，并利用抗原抗体反应与减数分裂后Y精子细胞上的SRY抗原结合，阻碍Y精子的成熟分化，在雄性奶山羊体成熟后通过采精即可获得含有较高比例X精子的新鲜精液。本发明具有低成本、简便、易操作优势，不影响受精后胚胎的发育，提高了性控胚胎的生产效率，促进了奶山羊的快速扩繁。

Description

一种奶山羊性控精液制备方法

技术领域

本发明涉及雌性奶山羊繁育，具体涉及一种奶山羊性控精液制备方法。

背景技术

性别控制(性控)是指通过人为干预并按照人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖技术。性别控制技术可使受性别限制的生产性状(如泌乳性状)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)获得更大的经济效益；同时，还能加强优良种畜的选种强度和提高育种效率，以获得最大的遗传进展。性别控制技术在畜牧业生产中的应用将产生巨大的经济价值和社会效益。实践证明，控制家畜性别最理想的方法是在受精前将X、Y精子分离，再根据需要性别的精子进行授精，得到预期的性别后代。

目前流式细胞仪法分离法是一种常用的X、Y精子分离方法。但是流式细胞仪分离法依赖价格高昂的仪器设备及较高水平的操作技术，而且分离速度较慢，对精子的损害比较明显，导致受胎率低下，因此，流式细胞仪法分离法无法得到全面推广。

研究证明，Y精子SRY基因从精原细胞开始，在整个精子发生期间都表达，在有丝分裂后表达水平相对较低，在成熟的精子中也有一定的表达。中国专利CN102499788A提出了SRY抗体的应用，其利用商业化的SRY抗体处理雄性哺乳动物精液，SRY抗体能单一的作用于Y精子携带的SRY蛋白，使Y精子活力降低或干扰Y精子与卵母细胞识别和结合能力，但是对X精子的功能没有影响，使所得胚胎的性别大部分为雌性，从而达到生产雌性胚胎的目的。除了SRY抗体的应用，中国专利CN105646707A提出了用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法及应用。考虑到哺乳动物精子在分化早期SRY基因高表达，而到了圆形精子后期SRY基因表达极低或不表达，因此，利用SRY抗体体外处理分化成熟的精子，不但效率低，而且更重要的问题是胚胎早期发育受到体外因素的影响，降低了利用体外胚胎移植或人工授精获得繁育种群的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种奶山羊性控精液制备方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种SRY抗体纳米颗粒，其制备方法包括以下步骤：

1)构建Y精子SRY抗原表达系统，所述表达系统表达的目的基因为SRY基因的编码序列；

2)利用步骤1)构建的Y精子SRY抗原表达系统制备Y精子SRY抗原重组蛋白；

3)利用Y精子SRY抗原重组蛋白制备抗Y精子SRY抗原的单克隆抗体；

4)将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，然后将酶切得到的SRY抗体的抗原结合片段(即SRY抗体的Fab，Anti-SRY Fab)分离；

5)制备负载所述抗原结合片段的磷酸钙纳米颗粒。

优选的，所述表达系统是以真核表达载体pcDNA3.1-His-C与所述目的基因构建重组载体并转化宿主细胞而得到。

优选的，所述SRY基因的编码序列是采用巢式PCR扩增得到，扩增的模板为提取自奶山羊的精子基因组DNA。

优选的，所述巢式PCR采用的扩增引物为：

内部上游引物：5'-TTGATGGGTTTGGGCTGACT-3'；

内部下游引物：5'-AAGAGCGCCTTTGTTAGCGA-3'；

外围上游引物：5'-ATCGTCTTACCTGTAATAGCC-3'；

外围下游引物：5'-GTGCTATTCACTAATCCGTGT-3'。

优选的，所述步骤5)具体包括以下步骤：将分离得到的SRY抗体的抗原结合片段加入磷酸钙纳米颗粒混悬液中，SRY抗体的抗原结合片段加入的终浓度为80～120μg/mL，然后于20～25℃条件下震荡吸附0.5～1h，再于4～8℃条件下震荡吸附1～2h，得到负载SRY抗体的抗原结合片段的磷酸钙纳米颗粒，即SRY抗体纳米颗粒。

上述SRY抗体纳米颗粒在制备奶山羊性控精液中的应用。

优选的，所述奶山羊性控精液是采用免疫性控方式获得的，所述免疫性控包括以下步骤：按照一定的免疫程序将SRY抗体纳米颗粒注射到性成熟前雄性奶山羊睾丸内，通过抗体在睾丸内缓慢释放，并利用抗原抗体反应与减数分裂后精子细胞上的SRY抗原结合，阻碍Y精子的成熟分化，在所述雄性奶山羊体成熟后通过采精即可获得含有较高比例X精子(相比于Y精子)的新鲜精液。

优选的，所述新鲜精液中X精子的数量比例(与X、Y精子总数相比)≥87.8％。

优选的，所述新鲜精液中X精子的分离方法包括以下步骤：将精液与精液稀释液搅拌混合后静置，将静置中形成的位于上层的含有精子(主要为X精子)的液体离心。

上述SRY抗体纳米颗粒在制备用于阻碍奶山羊Y精子的成熟分化的靶向、缓释免疫注射剂中的应用。

一种奶山羊精液免疫性控注射剂，该注射剂包括上述SRY抗体纳米颗粒的混悬液(用水分散)，所述混悬液中含有浓度为180～220μg/mL的SRY抗体的抗原结合片段(即SRY抗体的Fab，Anti-SRY Fab)。

优选的，所述注射剂还包括体积分数≤15％的甘油。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过单克隆抗体技术获得奶山羊SRY抗体，并结合磷酸钙纳米颗粒载体，制备负载SRY抗体(具体指SRY抗体的抗原结合片段)的磷酸钙纳米颗粒，将其注射到性成熟前雄性奶山羊的睾丸，可通过抗体的释放，并利用抗原抗体反应原理，与精细胞上的SRY抗原结合，阻碍Y精子的成熟分化，从而可以得到含有高比例的X精子的精液，达到免疫性控目的。本发明具有低成本、简便、易操作优势，不影响受精后胚胎的发育，提高了性控胚胎的生产效率，促进了奶山羊的快速扩繁。

进一步的，本发明采用巢式PCR，从精子基因组中直接扩增SRY基因片段，所扩增区域为SRY基因的CDS区，无内含子，提高了抗体制作效率。

附图说明

图1为巢式PCR扩增关中奶山羊SRY基因的电泳图，其中，泳道1-4的条带来自关中奶山羊鲜精样品，泳道5-9的条带来自关中奶山羊冻精样品。

图2为Western blot结果图。

图3为磷酸钙纳米颗粒注射程序及采精时间示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明通过单克隆抗体技术制作关中奶山羊SRY抗体，结合磷酸钙纳米颗粒载体制作技术，制备负载SRY抗体的磷酸钙纳米颗粒悬液，按照一定的程序注射到性成熟前雄性羔羊的睾丸，通过抗体缓慢释放，利用抗原抗体反应原理，使SRY抗体与减数分裂后精子细胞上的SRY抗原结合，阻碍Y精子的成熟分化，待所述雄性羔羊体成熟后采精，精子经稀释液悬浮后分层，除去下层Y精子，得到高比例的X精子，达到制备奶山羊性控精液的目的，显著降低了流式细胞仪筛选等体外分选技术对精子的损害。

(一)单克隆抗体的制备

1.关中奶山羊SRY基因的PCR扩增

参考GenBank上的山羊SRY基因(Gene ID 108634533)，设计两对巢式PCR引物，预期扩增CDS区片段长度为920bp：

内部上游引物：5'-AGGATCCGATGCTGTTTGGGCTGACT-3'；

内部下游引物：5'-ACTCGAGAGGCTACATTGTTAGCTGA-3'；

外围上游引物：5'-ATCGTCTTACCTGTAATAGCC-3'；

外围下游引物：5'-GTGCTATTCACTAATCCGTGT-3'。

PCR反应体系：2×EasyTaq SuperMix 25μL，外围上、下游引物各2μL，内部上、下游引物各2μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至50μL。DNA模板为提取自关中奶山羊精液样本(采自陕西省杨凌西北农林科技大学种羊场，2017年3月)的精子基因组DNA(精子基因组的提取采用磁珠法，提取试剂盒为华大基因公司的NMG1501-5)，精液样本采集时间和地点。

PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，64℃退火35s，72℃延伸45min，30个循环；72℃继续延伸10min。

PCR反应结束后取4μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(120V恒压电泳30min)，经溴化乙锭染色后照相，发现所有样品PCR后，得到了大小统一的条带，参见图1。PCR扩增的片段与GeneBank中SRY基因同源性达到99.5％以上，序列分析结果显示无插入和缺失突变，表明SRY基因是十分保守的。

根据SRY基因编码区与原核表达质粒pET28a(Novagen公司，JR136105)设计一对带有XhoⅠ和BamH I酶切位点的引物(5'-AGGATCCTACCGTATCACTGA-3'；5'-ACTCGAGCCTAGTCAGCTCAG-3')，将扩增的SRY基因片段(上述巢式PCR)与pET28a经双酶切后4℃过夜连接，并转化入大肠杆菌BL21(Stratagene公司,LM-140378)中。

将通过菌液PCR、双酶切鉴定和测序正确的重组质粒，即原核表达载体pET28a-SRY在IPTG诱导下表达融合蛋白。具体步骤为：将阳性菌液以1:100的比例接种于含卡那霉素50mg/L的LB培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀＝0.5。取出培养物置室温冷却，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，于30℃下诱导培养5h。离心(5000r/min、3min)收菌，加入PBS(含0.8％NaCl、0.02％KCl、0.144％Na₂HPO₄及0.024％KH₂PO₄，pH＝7.6)离心漂洗。

将菌体沉淀重悬于2mL冰预冷的裂解缓冲液(含50mmol/L NaH₂PO₄、300mmol/LNaCl、0.1mg/mL溶菌酶及1mmol/L PMSF，pH＝8.0)中，冰浴15min，超声破碎裂解细胞(输出功率为10W，2×50s)，4℃离心(1 2000r/min)30min。分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE。在剩余上清中加入Triton X-100至终浓度2％，经孔径0.45μm微孔滤膜过滤，再加入NaN₃至终浓度0.02％，存放于4℃。

经SDS-PAGE电泳后出现了分子量约为33.9kD大小的特异性蛋白，进一步通过western blot验证后确定是SRY蛋白(图2)，而阴性对照组(pET28a质粒)未出现该蛋白。

以上实验表明成功地克隆了关中奶山羊精子SRY基因编码序列。

2.重组质粒表达产物的纯化

确定SRY蛋白存在于上清中后，将上清过Ni⁺²-NTA琼脂糖层析柱(北京博尔西科技公司，BTR206Q)进行纯化：先用二倍于柱体积的STE裂解液4mL平衡层析柱，上清以25mL/h流速过柱，依次用4mL洗涤缓冲液(裂解缓冲液中加入0.1％Tween-20及20mmol/L咪唑，pH＝8.0)洗涤，用4.5mL洗脱缓冲液(裂解缓冲液中加250mmol/L咪唑，pH＝8.0)洗脱结合的蛋白。取各过柱成分进行SDS-PAGE，薄层分析测定蛋白纯度在88％以上，用Bradford法测定纯化后蛋白的浓度0.29mg/mL，纯化后蛋白用于ELISA检测时作为抗原包被用。

3.SRY基因克隆载体pMD19-T-SRY的构建

利用凝胶回收试剂盒对巢式PCR扩增的SRY基因片段进行回收，按照载体说明书与pMD-19T载体(大连TAKARA公司，D102A)4℃过夜连接。转化感受态细胞后，进行pMD19-T-SRY阳性克隆的蓝白斑筛选，在转化的平板上挑取数个单个白色菌落，分别接种于含有50μg/mLAmp+的1.5mL的LB离心管中，37℃、200rpm/min恒温振荡过夜，即完成了载体pMD19-T-SRY的构建和扩增。4.pMD-19T-SRY载体的检测及测序将含重组质粒pMD-19T-SRY菌液活化，继续培养，在对数生长期提取质粒，用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，双酶切的结果与预期的大小片段一致(920bp)。同时将pMD-19T-SRY质粒送上海生物工程有限公司测序，结果通过比对，发现序列与原基因序列一致。

5.pcDNA3.1-His-C-SRY真核表达载体的构建

(1)SRY基因扩增

以含有SRY基因的质粒pMD-19T-SRY为模板，用primer 5.0设计上、下游引物P1、P2(包含信号肽部分)用于目的基因的扩增。克隆试剂盒(Thermo Scientific^TM克隆试剂盒，K1231)中自带的引物P3、P4用于检测目的基因与载体是否连接，P5、P6为测序引物。

表1.真核表达载体各类引物

根据设定的反应条件对目的基因进行扩增。扩增结束后，取6μL扩增产物与上样缓冲液混匀，制备成上样样品。用1.5％的琼脂糖凝胶，每个点样孔加10μL上样样品，在电压120V下电泳50min。用凝胶成像仪记录结果，并分析。

将DNA回收后，用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，同时用BamH I和Xho I双酶切pcDNA3.1-His-C载体(INVITROGEN公司，V385-20)，然后按照快速DNA连接试剂盒(上海生工生物技术公司，B522241-0020)说明，将酶切产物配制连接体系，轻轻混匀，在室温下静置5min，即可完成目的基因与载体的连接。将连接产物放置在-20℃下保存备用。

(2)重组载体的转化和筛选

将连接产物转入大肠杆菌BL21(Stratagene公司,LM-140378)中。扩大培养后，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的平板培养基，筛选阳性克隆，提取重组载体。取出2μL菌落培养液，使用引物P1、P2进行PCR扩增，若出现预期的片段，表明载体上连有目的基因(SRY基因片段)。使用引物P3、P4进行PCR鉴定，确定基因已经连接到了载体的正确位置。用引物P1、P4进行PCR鉴定，确保基因与载体的连接方向正确(若无目的条带出现，表明目的基因与载体反向连接)。将鉴定连接正确的阳性克隆接种到菌液中扩大培养，按照试剂盒的操作步骤提取连有目的基因的重组质粒，并将重组质粒命名为pcDNA3.1-His-C-SRY，于-20℃下保存备用。

(3)重组质粒在真核细胞中的瞬时表达

大量提取、纯化pcDNA3.1-His-C-SRY，利用脂质体方法转染Hela细胞(上海通派生物科技公司)，按Lipofectamine试剂盒说明书进行操作。将转染pcDNA3.1-His-C、未经任何转染的Hela细胞设为阴性对照组。在转染后96h，收获细胞。用Trizol(一步法)提取细胞总RNA，转录得到cDNA，然后用SRY特异性引物(5'-GATGCTGTTTGGGCTGACT-3'；5'-AGGCTACATTGTTAGCTGA-3'；上游引物中加入了EcoRⅠ酶切位点与翻译起始密码子ATG，在下游引物中加上了酶切位点XbaⅠ与翻译终止密码子TGA)进行PCR，检测Hela细胞中SRY基因的表达。同时，在转染后96h，收集实验组与对照组的细胞培养液上清，与ELISA包被液按1:6的体积比例混合，包被96孔板，用ELISA的方法检测细胞培养液上清中的SRY蛋白表达量。

为了大量制备SRY蛋白，将获得的阳性Hela细胞大量培养，收集上清液，SDS-PAGE电泳验证表达情况。在剩余上清中加入Triton X-100终浓度2％，经孔径0.45μm微孔滤膜过滤，再加入NaN₃至终浓度0.02％，存放于4℃。

(4)重组蛋白的纯化

确定上清中存在SRY蛋白后，将上清过Ni⁺²-NTA琼脂糖层析柱进行纯化。先用二倍于柱体积的STE裂解液4mL平衡层析柱，上清以25mL/h流速过柱，依次用4mL洗涤缓冲液(裂解缓冲液中加入0.1％Tween-20及20mmol/L咪唑，pH＝8.0)洗涤，用4.5mL洗脱缓冲液(裂解缓冲液中加250mmol/L咪唑，pH＝8.0)洗脱结合的蛋白。取各过柱成分进行SDS-PAGE，薄层分析测定蛋白纯度在90％以上，用Bradford法测定纯化后蛋白的浓度0.27mg/mL。

6.免疫小鼠

将获得的真核表达的SRY蛋白作为抗原免疫小鼠，先将目的蛋白溶于生理盐水(约2.0mg/mL)。取7周龄雌性BALB/c小鼠6只，选腹股沟和腹腔两侧共4个注射点，75％乙醇消毒，每个注射点皮下注射0.05mL抗原。首次免疫与福氏完全佐剂按1:1混合，2周后进行加强免疫(不用佐剂)。尾静脉采血，以SRY重组蛋白为检测抗原，用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平。免疫合格的标准是免疫小鼠抗体滴度达到1:4000以上，即可表明小鼠获得良好免疫效果。免疫合格后，用不加佐剂的SRY蛋白进行第三次免疫，每只肌肉注射100μg(0.2mL)，5d后分离培养脾脏细胞，做脾细胞融合。本发明发现真核表达的SRY蛋白免疫效果要明显优于原核表达的SRY蛋白。因此下面的试验都采用真核表达来源的SRY蛋白。

7.与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞

采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，将其挤压研磨，加无血清RPMI-1640培养液进行匀浆，200目筛网过滤，用淋巴细胞分离液分离B细胞，从一个鼠脾得到的活细胞数约为5×10⁷个即可。将SP2/0骨髓瘤细胞提前一周用完全培养液作传代培养，48h左右即进入对数生长期开始融合，骨髓瘤细胞的密度约为0.5～1×10⁹。融合时先将淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1混合，离心去上清液，置于37℃水浴中加入50％聚乙二醇(PEG)0.2mL，静置2min，离心(600r/min，5min)，加无血清培养液与完全培养液各5mL，混匀中止反应，离心去上清，加入选择性培养液HAT(含RPMI-1640 10.4mg/mL、丙酮酸钠0.11mg/mL、碳酸氢钠1.8mg/mL、3％的L-谷氨酰胺25μL/mL、犊牛血清150μL/mL、次磺嘌呤1.36mg/mL、胸腺嘧啶核苷0.39mg/mL，及氨基喋呤0.02mg/mL)，混匀，接种于96孔培养板，置于37℃含5％CO₂培养箱中进行培养。培养3天，未经融合的骨髓瘤细胞相继死去，而杂交瘤细胞可逐渐长成细胞集落，8天后停用HAT培养液，改用HT培养基(不含氨基喋呤的HAT培养液)再培养2周，改用一般培养液(不含次磺嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨基喋呤的HAT培养液)，每2天一次半量换液。在杂交瘤细胞布满孔底1/10～1/5面积时，即可开始检测特异性抗体。

8.杂交瘤细胞株的建立

用制备的重组蛋白包板，以100ng/孔按行包被酶标板，按列分别加入特异性单克隆细胞培养液和阴(Sp2/0细胞上清液)、阳血清(免疫小鼠血清)，用间接ELISA法筛选阳性克隆，阳性克隆经3次克隆化后，阳性率接近100％。此时，一部分细胞冻存，一部分扩大培养。

9.抗体制备

向健康雌性BALB/c小鼠腹腔内注射无菌石蜡油，每只0.5mL。9天后，再向其腹腔注射经筛选后的杂交瘤细胞，每只0.5mL(细胞浓度为2.0×10⁶个/mL)。14d后，开始收集腹腔积液，采用二氧化硅法去除脂肪和石蜡油，收集澄清腹腔积液。

10.间接ELISA测定腹腔积液效价

用肠激酶切除His-Tag(按照肠激酶试剂盒说明进行，Sigma公司产品)，用原核表达制备的SRY抗原(100ng/孔)包被ELISA板，腹水从1:1000开始作10个梯度稀释。标记抗体为HRP标记的兔抗鼠IgG。间接ELISA法检测抗体水平，使用双波长(测定波长为450nm，参考波长为630nm)测定吸光值，OD值大于阴性对照组值2.0倍以上者为阳性。结果发现腹腔积液效价为10⁹以上。

11.单克隆抗体亚型的测定

单克隆抗体的亚型采用兔抗小鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM酶标抗体的间接ELISA试验检测(小鼠单抗Ig亚类鉴定用ELISA试剂盒为Sigma公司)。结果发现单克隆抗体的亚型为IgG1。

12.抗体蛋白浓度和纯度的测定

将腹腔积液采用ProteinG柱亲和纯化获得单克隆抗体，浓度测定采用公式OD280×1.45-OD260×0.74＝蛋白(mg/mL)。采用SDS-PAGE凝胶电泳分析单克隆抗体纯度。结果发现单克隆抗体浓度为1.32mg/mL，纯度在99.0％以上。

(二)Anti-SRY Fab的制备

酶切SRY单克隆抗体：在酶切缓冲液(含20mM Na₂HPO₄、20mM NaH₂PO₄、150mM NaCl、10mM半胱氨酸及2mM EDTA，pH＝7.0)中37℃酶切2h，其中，SRY单克隆抗体和胃蛋白酶(Pepsin，Sigma公司)质量比＝100:l。然后以1:100的比例(体积比)加入0.3M碘乙酸钠终止反应。用Protein-G柱纯化：首先用增强液Binding buffer(含20mM Na₂HPO₄、20mM NaH₂PO₄及150mM NaCI，pH＝7.0)增加洗脱柱对抗体的结合活性，再用洗脱液Elution buffer(20mM柠檬酸，pH＝3.0)将抗体洗脱出来，随后收集含有Fab流穿液。将流穿液过G25柱(缓冲液为20mM醋酸，pH＝5.0)，然后过Mono-S柱：增强液A为20mM醋酸，pH＝5.0；洗脱液B(elutionbuffer)为20mM醋酸和l.0M NaCI，pH＝5.0；按8倍柱体积，A液与B液混合并以B液占0％到30％的比例，进行梯度洗脱，收集洗脱液，得到Anti-SRY Fab(SRY抗体的抗原结合片段)。

(三)包含Anti-SRY Fab的磷酸钙纳米颗粒的制备

1.磷酸钙纳米颗粒的制备

A液的制备：取29.5mg Ca(NO₃)₂·4H₂O加入50mL超纯水中溶解，室温搅拌15min；然后再加入2g PEG4000溶解，并调pH到10.0；将溶液置于室温下搅拌30min。

B液的制备：取16.5mg(NH₄)₂HPO₄溶于50mL超纯水，调pH到10.0。

将B液缓慢滴加到A液中，滴加完后继续搅拌10min，再将A、B混合液在40℃、10000r/min的条件下离心20min；弃上清，将沉淀颗粒用超纯水洗三次，最后重悬于超纯水中，得磷酸钙纳米颗粒混悬液。

采用智能型颗粒测量仪Mastersizer 3000对磷酸钙纳米颗粒混悬液进行颗粒测定，测定重复三次，结果使用Malvem Dispersion Technology Software 3.2软件进行分析并取平均值。结果发现，制备的磷酸钙纳米颗粒分散均匀，呈针状，直径在65.3±9.1nm。

2.磷酸钙纳米颗粒毒性试验

准备精液稀释液(含无水葡萄糖10g/L、柠檬酸钠23g/L、100mL/L鲜卵黄、青霉素10万单位，及链霉素10万单位)，取0.5mL精液稀释液与新鲜精液进行1:1(体积比)稀释，再加入25μL磷酸钙纳米颗粒混悬液，混匀，同时用未加磷酸钙纳米颗粒混悬液的精液稀释液作对照，60min、120min后，用迈朗ML-608动物精子分析仪检测精子质量。

表2.精子质量参数

结果发现，在60min和120min后，精子7个代表性的质量参数(表2)在纳米颗粒组、对照组都无显著性变化，说明所获得的纳米颗粒无毒性。

3.负载抗体的纳米颗粒的制备

在制备的磷酸钙纳米颗粒混悬液中加入Anti-SRY Fab，使其终浓度为100μg/mL或200μg/mL，分别在25℃和4℃条件下摇床震荡吸附0.5h和2h，离心，将负载有Anti-SRY Fab的磷酸钙纳米颗粒重悬于超纯水，获得磷酸钙纳米混悬液。优化制备条件为：Anti-SRY Fab加入的终浓度为100μg/mL，于25℃条件下震荡吸附0.5h，再于4℃条件下震荡吸附2h。

4.磷酸钙纳米颗粒抗体负载率和包封率的测定

取100μL负载有Anti-SRY Fab的磷酸钙纳米颗粒(即上述磷酸钙纳米混悬液)，在12000r/min、4℃的条件下离心10min，弃去上清，再用超纯水洗三次。然后用0.5M pH为5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(即MES buffer)溶解颗粒，在室温下反应1h，12000r/min离心10min，取上清。

上清的蛋白浓度使用生工生物工程(上海)股份有限公司改良型Bradford法测定。取6个离心管，将BSA蛋白质标准液(1mg/mL)配成0、100、150、200、250和300μL/mL的标准蛋白样品。

将待测样品用超纯水稀释10倍，待测样品和标准样品每个取20μL加入到96孔板，再在每孔加入200μL Bradford试剂，迅速震荡混匀。混匀后，室温静置10min。以0号管为空白对照，在酶标仪上测各孔的A570值。每隔30min检测一次，以标准样品的A570值为纵坐标，对应的标准蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。颗粒的质量通过称量用冻干机冻干后的颗粒来确定。

负载率的计算公式为：

(颗粒负载的Anti-SRY Fab质量/颗粒总质量)×100％

包封率的计算公式为：

(颗粒负载的Anti-SRY Fab质量/Anti-SRY Fab总投料质量)×100％

结果发现，磷酸钙纳米体系的载药率(Anti-SRY Fab负载率)随着添加Anti-SRYFab后的时间间隔的增长而逐渐增高，但是90min内几乎到达饱和，并基本保持不变；同时，其与最初添加Anti-SRY Fab的量无关，添加100μg/mL组负载率为37.3±2.4％，添加200μg/mL组负载率为36.5±3.2％，差异不显著。此外，90min后添加100μg/mL组包封率为75.6±3.1％，而添加200μg/mL组包封率为38.7±2.4％，前者刚好是后者的两倍，进一步说明了该的负载是饱和的。

最终确定磷酸钙纳米混悬液中Anti-SRY Fab的浓度为180～220μg/mL。

5.细胞对磷酸钙纳米颗粒的摄取率

在24孔板中接种山羊卵巢颗粒细胞，接种密度为10×10⁴细胞/mL，培养基为添加20％胎牛血清的DMEM，每孔0.5mL，在5％CO₂、37℃的条件下培养24h，至细胞贴壁。将上述磷酸钙纳米混悬液以100μL/mL和200μL/mL的浓度加入到每孔，培养2h、8h、16h、24h后，收集培养基，采用Bradford法蛋白定量试剂盒对其进行定量分析，按以下公式计算摄取率。

摄取率＝(颗粒总质量×负载率-上清液中抗体蛋白质量)/负载率或(颗粒负载的SRY蛋白质量-上清液中抗体蛋白质量)/负载率。

结果发现，培养2h、8h、16h和24h后，100μL/mL浓度组的摄取率分别为63.3％、71.2％、84.6％和93.5％，200μL/mL浓度组的摄取率分别为68.3％、76.2％、87.6％和98.5％。这个结果表明，无论以多大浓度添加，24h后细胞摄取纳米颗粒都在90％以上。

6.磷酸钙纳米颗粒抗体的释放

将摄取了纳米颗粒的卵巢颗粒细胞(培养24h后的)进一步作为细胞模型。待细胞铺满培养瓶底部，用胰蛋白酶消化，800×g离心5min后去上清。然后加入适量培养液，悬浮后接种于培养瓶，于37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养5～7d，细胞铺满培养瓶底部，传代一次，同时收集上清液，采用Bradford法蛋白定量试剂盒对其进行定量分析。随着细胞传代而重复定量分析，直至释放抗体(具体指Anti-SRY Fab)接近零为止，每个样品设置3个平行样。

结果发现，抗体在细胞内的释放是缓慢进行的，并且速度比较均匀，需要10周的时间才能完全释放。同时发现，利用不同纳米颗粒浓度制备的细胞模型，抗体(具体指Anti-SRY Fab)的释放率没有明显差异，进一步说明本实验制备的磷酸钙纳米颗粒稳定性好。

7.负载抗体的磷酸钙纳米颗粒表征

取少量磷酸钙纳米混悬液用透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察颗粒的形态。通过透射电镜可以观察到，该颗粒中心部分为颜色较深的致密实心内核，外周颜色浅。而通过扫描电镜可以看出，颗粒为均匀的球形。

8.负载抗体的磷酸钙纳米颗粒稳定性分析

取100μL磷酸钙纳米混悬液，离心后重悬于超纯水中，分装于20μL的小管，一部分置于25℃恒温箱，在2h、4h、6h、12h时间梯度下通过智能型颗粒测量仪Mastersizer3000对颗粒直径进行测定；同时一部分置于-20℃的冰箱，在2d、4d、6d、12d时间梯度下用同样的方法分别测定颗粒直径。

表3.负载抗体的磷酸钙纳米颗粒于不同温度下的稳定性比较

根据表3，在12h内及常温下，以及在12d内及-20℃条件下，颗粒保持稳定。

(四)利用包含Anti-SRY Fab的磷酸钙纳米颗粒对奶山羊进行性控繁殖

1.负载抗体的纳米颗粒的保存

实验发现制备的磷酸钙纳米混悬液常温下保存2d，对其所含的纳米颗粒无影响，但常温下保存对纳米颗粒中抗体(具体指Anti-SRY Fab)的影响是存在的，因此，与常温保存相比，保存在-20℃中是比较理想的。

纳米颗粒含有一定比例的水，在冷冻过程中形成的冰晶会损害所负载的抗体蛋白(具体指Anti-SRY Fab)，即-20℃下也不能长期保存。为了解决低温长期保存面临的问题，本发明将甘油作为保护剂进行了试验。将无菌甘油以不同比例(添加后的体积分数0～15％)添加到磷酸钙纳米混悬液中，混匀后常温放置1h，接着在6℃放置1h，在4℃放置1h后再0℃放置2h，最后保存于-20℃。间隔不同的时间取出(水浴解冻，37℃30～60s)，采用间接ELISA方法进行抗体(具体指Anti-SRY Fab)活性检测，重复三次，将吸光值直接与未冷冻的纳米颗粒吸光值相除，取平均值。

表4.-20℃条件下不同比例甘油(体积分数)作为保护剂的效果对比

注：同一行不同的小写字母表示差异显著，P<0.05。

从表4可以发现，不同的甘油比例对纳米颗粒中的抗体(具体指Anti-SRY Fab)的冷冻保护作用是有显著差异的，添加2.5％的甘油作为冷冻保护剂的效果显著高于其它组(5％、10％、15％)和对照组(0％)，并且甘油浓度越高，越不利于冷冻保存。因此，2.5％的甘油作为磷酸钙纳米混悬液的冷冻保护剂是最理想的，如果是短期保存，将添加有甘油的磷酸钙纳米混悬液置于-20℃即可。此外，如果是长期保存，可以在-20℃放置2h后于-80℃放置2h，之后可置于液氮中保存。液氮中保存后的抗体(具体指Anti-SRY Fab)活性平均值为85.2±2.4％。

2.负载抗体的纳米颗粒的睾丸注射

解冻后的纳米颗粒以10000r/min离心10min，弃上清，去掉甘油，将沉淀重悬于超纯水中，所含Anti-SRY Fab的浓度调节到与冷冻前未加甘油时的浓度相同，即相当于磷酸钙纳米混悬液。

最迟在种公羊16周龄前(一般奶山羊性成熟在20周左右)采用睾丸注射的方法进行纳米颗粒注射，如果第一次注射时间晚于16周，那么性成熟后获得首批精子中，X精子比例会下降。

注射纳米颗粒前，采用硬膜外麻醉方法将浓度2％的普鲁卡因注射于腰荐椎之间的硬脊膜外间隙。利用配7号针头的10mL注射器吸入5mL普鲁卡因，在羊的腰荐椎之间消毒，将针头垂直插入，缓慢推进，当感觉针头的阻力突然消失立即停止，此时针头刚好进入硬膜外腔，缓慢匀速注入5mL普鲁卡因。普鲁卡因发挥作用后，羊的整个后驱对刺激没有反应。

注射纳米颗粒时，先从一侧睾丸精索往下，触摸到睾丸，使表面的阴囊皮肤绷紧，常规消毒，利用配4.5号针头的5mL注射器配吸入3mL磷酸钙纳米混悬液，选择血管少的部位，将针头从睾丸最顶端刺入睾丸，将磷酸钙纳米混悬液注入睾丸内。采用同样的方法对另一侧睾丸进行注射。

参见图3，第一次注射磷酸钙纳米混悬液后间隔1周重复注射一次，然后每隔9周注射一次(抗体作用经过10周后会显著降低，为了在每个精子生成波中都有抗体存在，每9周注射一次，抑制Y精子的发育成熟，获得稳定的高X精子比例的精液)。第一次注射后的13周(体成熟)开始，按照假阴道采精法采集精子，每周的一、三、五各采精一次，采用流式细胞仪进行X/Y精子比例鉴定，并且检测精子质量。

3.精子质量及X/Y精子分选检测

用迈朗ML-608动物精子分析仪检测精子质量，精子密度为3.2～6.0×10⁶个/mL，活力为59.3％～61.2％。

用0.5μg/mL的Hoechst 33342将精子染色30min，加入等量的精液稀释液(含无水葡萄糖10g/L、柠檬酸钠23g/L、100mL/L鲜卵黄、青霉素10万单位，及链霉素10万单位)和0.002％food dye，调整精子密度达到10×10⁶个/mL。选用基本分选指标(50psi，150mW，90％纯度)，然后采用流式细胞分离仪(SX MoFlo^@，DakoCytomation Inc，FortCollins，CO，USA)检测X、Y精子的比例。结果发现检测的6个精液样品中X精子的比例为87.8±3.5％，而一般奶山羊精液X精子比例为48.2±3.7％(第29、35、44、53、62、71周的周一、三、五采精，根据统计获得的平均数)。

4.体外受精及胚胎培养

从屠宰场收集山羊的卵巢，放入装有35℃灭菌生理盐水(含有青、链霉素各100IU/mL)的保温瓶中，3h内运回实验室。用38℃灭菌生理盐水冲洗卵巢3次，用带有12号针头的注射器抽吸卵巢表面上直径为3～8mm卵泡中的卵母细胞。在体视镜下挑出卵丘细胞完整、卵母细胞细胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。用成熟培养液(TCM199中加入有10％FBS、10μg/mL FSH、10μg/mL LH，及1μg/mL E2)洗3次，将COCs放入成熟培养液中(用凹皿培养，覆盖石蜡)后置于CO₂培养箱中体外成熟培养24h。

将第30周采集的鲜精移入精液稀释液中，自然悬浮15min(自然悬浮就是将精液稀释后静置)，等精子明显的分为上下两层后(活精子具有向上游动的特点，而已经死亡的精子会逐渐下沉)，吸取上层精子(上层大部分是X精子，而发育不全的和死亡的Y精子都在底层)。未进行睾丸注射，精液中的XY精子无法通过自然悬浮分层。

将上层精子以1500r/min离心1min，吸弃上清液，留下底部约100μL精子沉淀，加入到140μL精子获能液(含5mg/mL BSA、0.5mg/mL咖啡因、0.3mg/mL谷胱甘肽，20μg/mL肝素)中获能处理15min，并调整精子的浓度至1.0×10⁶个/mL，再与培养成熟的卵丘卵母细胞复合体混合，置培养箱精卵共同培养20h。隔天半量更换培养液，继续培养至第5天，换液时观察并计算胚胎发育率。

表5.体外受精后胚胎发育率

从表5中可以看出，经过睾丸注射纳米颗粒处理奶山羊个体，其精子无论是在受精率、还是囊胚发育率方面，与对照组(未睾丸注射的种公羊精子受精组)无显著性差异。说明负载抗体的磷酸钙纳米颗粒对精子的受精性能无影响。

选择健康、繁殖性能正常的成年雌性关中奶山羊，随机分为两组。采用阴道栓的方法进行同期发情处理，放栓后第13天下午撤栓，第14天早上利用公羊试情，记录发情情况，确定发情后利用腹腔镜微创手术对奶山羊进行胚胎移植，随机选择两枚囊胚移到卵巢上有黄体的一侧子宫角；如果两侧都有黄体，则每个子宫角移1枚胚胎，记录产羔数，实验重复三次。

表6.胚胎移植后产羔记录表

从表6可以看出，胚胎移植后，在妊娠率上实验组稍低于对照组，而产羔率方面差异不显著，但是雌性羔羊比例上，实验组显著高于对照组。

总之，本发明制备了鼠抗羊SRY单克隆抗体(抗体浓度为1.32mg/mL)，进而通过酶解和纳米技术制备了负载SRY抗体(具体指Anti-SRY Fab)的磷酸钙纳米颗粒(负载率为37.5％)；本发明根据雄性奶山羊生理特点和精子发育分化规律，摸索了针对该纳米颗粒的睾丸注射程序，最终使采集获得的奶山羊精液中X精子比例为87.8％以上。通过体外受精发现负载SRY抗体(具体指Anti-SRY Fab)的磷酸钙纳米颗粒对精细胞无毒性，且对胚胎早期发育影响小，在显著提高奶山羊的生产效率的同时，雌性羔羊的比例可达到90.1％。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种奶山羊性控精液制备方法

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<213> 人工合成

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Claims

1.一种SRY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

4)将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，然后将酶切得到的SRY抗体的抗原结合片段分离；

5)将所述抗原结合片段负载于磷酸钙纳米颗粒，得到SRY抗体纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述一种SRY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述表达系统是以真核表达载体与SRY基因的编码序列构建重组载体并转化宿主细胞而得到。

3.根据权利要求1所述一种SRY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述SRY基因的编码序列是采用巢式PCR扩增得到，扩增的模板为提取自奶山羊的精子基因组DNA。

4.一种SRY抗体纳米颗粒在制备奶山羊性控精液中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述奶山羊性控精液是采用免疫性控方式获得的，所述免疫性控包括以下步骤：按照一定的免疫程序将SRY抗体纳米颗粒注射到性成熟前雄性奶山羊睾丸内，通过抗体在睾丸内缓慢释放，并利用抗原抗体反应与减数分裂后精子细胞上的SRY抗原结合，阻碍Y精子的成熟分化，在所述雄性奶山羊体成熟后通过采精即可获得含有较高比例X精子的新鲜精液。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述新鲜精液中X精子的数量比例≥87.8％。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述新鲜精液中X精子的分离方法包括以下步骤：将精液与精液稀释液搅拌混合后静置，将静置中形成的位于上层的含有精子的液体离心。

8.一种SRY抗体纳米颗粒在制备用于阻碍奶山羊Y精子的成熟分化的免疫注射剂中的应用。

9.一种奶山羊精液免疫性控注射剂，其特征在于：该注射剂包括SRY抗体纳米颗粒的混悬液，所述混悬液中含有浓度为180～220μg/mL的SRY抗体的抗原结合片段。

10.根据权利要求9所述一种奶山羊精液免疫性控注射剂，其特征在于：所述注射剂还包括体积分数≤15％的甘油。