CN105646707B - 用于牛、羊x/y精子快速分离的uty抗体纳米颗粒的制备方法及应用 - Google Patents

用于牛、羊x/y精子快速分离的uty抗体纳米颗粒的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法及应用：利用Y精子UTY抗原重组蛋白制备抗Y精子UTY抗原的单克隆抗体；将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，并分离得到抗UTY抗原的Fab’片段；制备包含Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒。本发明制备得到的UTY抗体纳米颗粒，具有在Y精子表面和进入其内部进行抗原抗体反应的能力，从而导致Y精子凝集，对X、Y精子的分离效率达到80～95％，具有X、Y精子分离简单、快速、廉价及效率高等特点，且损害极小。

Description

用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法 及应用
技术领域
本发明涉及家畜快速扩繁领域，具体涉及一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法及应用。
背景技术
家畜性别控制(性控)一旦能为人类精确掌握，畜牧业的经济效益就会成倍增长。在正常情况下，哺乳动物由携带Y染色体的精子(Y精子)与卵子结合受精，这种受精卵就向雄性发育；而由携带X染色体的精子(X精子)与卵子结合，受精卵即向雌性发育。因此，性的发育方向取决于参加受精的精子类型，人为地选用某一类精子与卵结合受精就可以达到控制家畜性别的目的。
常见的性别控制方法有X、Y精子分离法和早期胚胎性别鉴定法。由于早期胚胎性别鉴定法需要从胚胎上取下少量卵裂后的细胞，或多或少会对胚胎造成一定的损伤，会导致受胎率下降，还需要显微操作仪等昂贵的仪器设备和娴熟的显微操作技术，从而制约了该技术的广泛应用；而X、Y精子分离法在受精时就可以人为控制动物的性别，避免了胚胎的后期损伤，操作相对简单，因此只要能分离得到理想的X或Y精子，在生产上有选择性的输精即可控制动物后代的性别。
流式细胞仪分离X/Y精子需要昂贵的仪器设备和专业操作人员，并且精液在前期处理时会受到紫外线照射、机械损伤等损害。采用对Y精子具有特异性抗体进行精液分离，由于X、Y精子处在同一液体环境下，极易降低分离效率，同时在常规实验条件下可对X精子产生一定的负面作用，所以提高抗体的特异性，减少其在X精子上的聚集，有望进一步提高X、Y精子分离效率。
纳米颗粒是尺寸在1～1000nm的颗粒，纳米颗粒可以将抗体包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全高效的靶向抗体输送。雄性特异性组织相容性抗原(H-Y抗原)是由Y染色体上的基因编码，在雄性动物细胞中普遍表达(包括Y型精子、胚胎和滋养层细胞)。目前采用细胞毒性T淋巴细胞检测到H-Y抗原有多个抗原表位即抗原肽，这些肽由染色体上一段特异的DNA编码，并从胞内蛋白分离出来，由主要组织相容性复合分子结合呈递在细胞表面。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法及应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)构建Y精子H-Y抗原原核表达系统，所述原核表达系统表达的目的基因为UTY基因的编码序列；
2)利用步骤1)构建的Y精子H-Y抗原原核表达系统制备Y精子UTY抗原重组蛋白；
3)利用Y精子UTY抗原重组蛋白制备抗Y精子UTY抗原的单克隆抗体；
4)将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，然后将酶切得到的UTY抗体的抗原结合片段Fab’(即UTY抗体的Fab’片段)进行分离；
5)制备包含Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒。
所述目的基因采用反转录PCR扩增得到，扩增的模板为提取自牛或羊的精子中的总RNA。
所述扩增采用的引物为：
上游引物：5’-CAGAATTCACTTGGAAATTTGTTGTT-3’；
下游引物：5’-ATCTCGAGAAAGAGGTA ATCGTTACA-3’。
所述原核表达系统是以Pet-28a质粒与所述目的基因经基于限制性内切酶EcoR I及Xho I的双酶切法构建重组载体并转化宿主细胞而得到。
所述步骤4)具体包括以下步骤：将所述单克隆抗体以及胃蛋白酶加入酶切缓冲液中，并于37℃酶切1～2h，所述单克隆抗体与胃蛋白酶的质量比为80～100:l，利用碘乙酸钠终止酶切反应后通过柱层析分离得到UTY抗体的Fab’片段。
所述步骤5)具体包括以下步骤：将分离得到的UTY抗体Fab’片段加入磷酸钙纳米颗粒混悬液中，UTY抗体Fab’片段加入的终浓度为80～100μg/mL，然后于20～25℃条件下震荡吸附0.5～1h，再于4～8℃条件下震荡吸附1～2h，得到包含UTY抗体Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒。
所述磷酸钙纳米颗粒混悬液中的磷酸钙纳米颗粒为针状，粒径大小在50～80nm。
上述用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒在牛、羊快速扩繁中的应用。
本发明的有益效果体现在：
本发明利用UTY抗体的Fab’片段与磷酸钙纳米颗粒制备得到UTY抗体靶向纳米颗粒，具有在Y精子表面和进入其内部进行抗原抗体反应的能力，从而导致精液中Y精子凝集，经过离心即可得到高比例的X精子的精液。由于1)：UTY抗体Fab’片段具有相对分子质量小、特异性强和免疫原性低等优点；以及2)：磷酸钙具有生物相容性、生物降解性、可吸收性、无毒廉价等优点。故本发明具有X、Y精子分离简单、快速、廉价及效率高等特点。与现有技术相比，本发明制备以及分离的操作简单，不需要昂贵的仪器设备，分离后的精子中X精子的比例达到80～95％，且对分离得到的X精子损害极小。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明。
申请人经过严格对比发现抗原肽UTY在绵羊、山羊和牛上雄性来源的细胞同源性极高，随后将其编码基因作为H-Y抗原的候选基因，该候选基因位于Y染色体的非重组区，仅在雄性组织中表达。因此，实验建立了包裹单克隆抗体的纳米颗粒平台，并将针对Y精子高表达的UTY抗原具有高度特异性的单克隆抗体(anti-UTY)的抗原结合片段Fab’进行分离，然后将其和纳米颗粒交联形成UTY抗原特异性的单克隆抗体纳米颗粒。
一.UTY抗体纳米颗粒的制备
1.克隆UTY基因
由于牛、绵羊和山羊之间UTY基因序列高度保守，其编码区为3319bp，编码1079个氨基酸。因此，设计针对该基因编码区的PCR引物，就可以获得UTY基因的cDNA。同时在设计上下游引物时，添加限制性内切酶EcoR I及Xho I双酶切位点。上游引物为5’-CA GAATTCACTTGGAAAT TTGTTGTT-3’，下游引物为5’-AT CTCGAG AAAGAGGTA ATCGTTACA-3’，引物序列中下划线部分为酶切位点。用RNA提取试剂盒从绵羊(小尾寒羊，宝鸡市麟游县原种羊场，2013年10月)、山羊(关中奶山羊，西北农林科技大学奶山羊场，2013年10月)和牛(中国荷斯坦种公牛，杨凌法斯特奶牛场，2013年10月)的精子细胞中提取RNA，纯化、稀释后(分子克隆实验指南(第4版))进行反转录PCR，将扩增结果进行DNA序列测定。结果发现三种UTY基因序列同源性达98％以上，而氨基酸序列无差异，因此，抗体是绵羊、山羊和牛通用的。
2.酶切Pet-28a载体并与目的基因相连
将扩增的UTY基因片段用EcoR I及Xho I双酶切，回收目的片段，与用相同限制性内切酶消化的pET-28a载体片段按摩尔比4：1的比例，在T4DNA连接酶催化下，4℃连接过夜，然后转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，在含卡那霉素25mg/L的LB琼脂板上置37℃温育15h。随机挑取单个克隆，经增菌后，提取重组质粒(OMEGA质粒提取试剂盒，D6922-01)，用EcoR I及Xho I双酶切鉴定。电泳后发现酶切鉴定结果与预期的完全一致(预期片段3290bp和5340bp)。
3.重组蛋白的诱导表达
将上述经酶切鉴定为阳性的重组质粒重新转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单个克隆，接种于5mL含卡那霉素50mg/L的LB培养液中，37℃振荡培养过夜。次日以1：100比例(体积比)分别转接于2mL含卡那霉素50mg/L的LB培养液中，37℃继续培养3h，生长至对数期。加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度0.3mmol/L，于30℃条件下诱导培养3h，再以5000r/min离心3min收菌，收集的菌体1mL加100μL蒸馏水重悬，然后再加100μL的loading buffer(SDS凝胶加样缓冲液)煮沸，然后进行SDS-PAGE(5％浓缩胶，12％分离胶)，鉴定重组质粒表达情况(根据分子克隆实验指南(第4版)，鉴定依据是蛋白杂交western-blot)。通过western-blot发现诱导表达的重组蛋白大小为110KDa，与预期的大小相符合。
4.重组蛋白的纯化
将表达阳性的原菌液以1：100(体积比)的比例接种于含卡那霉素50mg/L的LB培养液中，37℃振荡培养至A600＝0.5。取出培养物置室温冷却，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，于30℃条件下诱导培养5h。离心(5 000r/min，3min)收菌，加入PBS(含0.8％NaCl，0.02％KCl，0.144％Na2HPO4，0.024％KH2PO4，pH＝7.6)离心漂洗菌体。将菌体沉淀重悬于2mL冰预冷的裂解缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，0.1mg/mL溶菌酶，1mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)，pH＝8.0)中，冰浴15min，超声破碎裂解细胞，输出功率为10W，2×50s，4℃，离心(1 2000r/min，4℃，30min)。收集上清液，一部分进行SDS-PAGE确定是否为重组蛋白，另一部分上清中加入Triton X-100至终浓度2％，经孔径0.45μm微孔滤膜过滤，再加入NaN3至终浓度0.02％，存放于4℃。确定UTY蛋白(重组蛋白)在上清中存在后，将上清过Ni+2-NTA琼脂糖层析柱进行纯化，具体为：先用二倍于柱体积的STE裂解液(根据分子克隆实验指南(第4版)上的配方进行配置、保存)4mL平衡层析柱，上清以25mL/h流速过柱，用4mL洗涤缓冲液(裂解缓冲液中另加入0.1％Tween-20、20mmol/L咪唑，pH＝8.0)洗涤，再用4mL洗脱缓冲液(裂解缓冲液中另加入250mmol/L咪唑，pH＝8.0)洗脱结合的蛋白。取过柱成分进行SDS-PAGE，薄层分析测定蛋白纯度在85％以上，用Bradford法测定纯化后蛋白的浓度0.33mg/mL。
5.免疫动物
将上面获得的UTY蛋白免疫小鼠：先将目的蛋白(洗脱后就得到了蛋白溶液，进一步蒸发就是固体蛋白)溶于生理盐水，约2.0mg/mL，作为抗原。取7周龄雌性BALB/c小鼠4只，选腹股沟和腹腔两侧为注射点，75％乙醇消毒，每只注射4个部位，每个部位皮下注射0.05mL抗原。首次免疫以福氏完全佐剂乳化抗原，加强免疫以福氏不完全佐剂乳化，每次免疫间隔2周，共免疫3次，最后1次免疫14d后尾静脉采血并分离血清，用间接ELISA法检测血清抗体效价，效价达到1:16000以上进行细胞融合。融合前3d，再以每只0.02mL抗原量进行加强免疫。
6.细胞融合
采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，将其挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞(Sp2/0)与小鼠脾细胞按1:3细胞个数比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇(PEG)，诱导淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
7.选择培养
经HAT培养液(RPMI-164010.4mg/mL，丙酮酸钠0.11mg/mL，碳酸氢钠1.8mg/mL，3％的L-谷氨酰胺25μL/mL，犊牛血清150μL/mL，次磺嘌呤1.36mg/mL，胸腺嘧啶核苷0.39mg/mL，氨基喋呤0.02mg/mL)培养3天(37℃、5％CO2、饱和湿度)，未经融合的骨髓瘤细胞相继死去，而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落，8天后停用HAT培养液，改用HT培养基(不含氨基喋呤的HAT培养液)，再维持2周，改用一般培养液(HAT培养液不含次磺嘌呤、胸腺嘧啶核苷和氨基喋呤)。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10～1/5面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，每2天一次半量换液。
8.杂交瘤细胞株的建立
用重组蛋白(含有His-tag)包板，以100ng/孔按行包被酶标板，按列分别加入特异性单克隆细胞培养液(就是上一步筛选得到的杂交瘤细胞系)和阴(Sp2/0细胞上清液)、阳(免疫小鼠血清)血清，用间接ELISA法筛选阳性克隆，阳性克隆经3次克隆化后，阳性率接近100％。此时，一部分细胞被冻存，一部分被扩大培养。
9.抗体制备
向健康雌性BALB/c小鼠腹腔内注射高压灭菌后的石蜡油，每只0.5mL。9天后，再向其腹腔注射能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞(就是步骤8扩大培养的那部分)，每只0.5mL(细胞浓度为2.0×106个/mL)。14d后，开始收集腹腔积液，采用二氧化硅法去除脂肪和石蜡油，收集澄清腹腔积液。
10.间接ELISA测定腹腔积液效价
用肠激酶切除His-Tag(按照肠激酶试剂盒说明进行，Sigma公司产品)，包被ELISA板(100ng/孔)，将步骤9收集的澄清腹腔积液从1:1000开始作10个梯度稀释。标记抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG。间接ELISA法检测抗体水平，使用双波长(测定波长为450nm，参考波长为630nm)测定吸光值，OD值大于阴性对照组值2.5倍以上者为阳性。结果发现腹腔积液效价为108以上。
11.单克隆抗体亚型的测定
单克隆抗体的亚型采用兔抗小鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM酶标抗体的间接ELISA试验检测(小鼠单抗Ig亚类鉴定用ELISA试剂盒为Sigma公司)。结果发现单克隆抗体的亚型为IgG1。
12.抗体蛋白浓度和纯度的测定
将步骤9收集得到的澄清腹腔积液采用ProteinG柱亲和纯化获得抗体，浓度测定采用公式OD280×1.45-OD260×0.74＝蛋白(mg/mL)。抗体纯度测定采用SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果发现抗体浓度为1.2mg/mL，纯度在99.5％以上。
13.单克隆抗体的大量制备
取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5mL液体石腊进行预处理。9天后，腹腔内接种杂交瘤细胞(0.5mL/只，细胞浓度为2.0×106个/mL)。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。14天后用注射器抽取腹腔积液，即可获得大量单克隆抗体，再按照上述同样的方法(指步骤12中的方法)进行纯化和检测。
14.Anti-UTY Fab’片段(即UTY抗体的抗原结合部位)的制备
酶切单克隆抗体：在酶切缓冲液(20mM Na2HPO4，20mM NaH2PO4，150mM NaCl，10mM半胱氨酸，2mM EDTA，pH＝7.0)中，单克隆抗体和pepsin(胃蛋白酶，Sigma公司)以100:l(质量比)在37℃酶切2h。然后加入1/100(总体积1％)的0.3M碘乙酸钠终止反应。
用Protein-G柱(金斯瑞生物科技有限公司)纯化(具体操作按照操作说明进行)，收集流穿液。将流穿液过G25柱(缓冲液为20mM醋酸，pH＝5.0)，然后过Mono-S柱：缓冲液A(binding buffer：20mM醋酸，pH＝5.0)；缓冲液B(elution buffer：20mM醋酸+lM NaCl，pH＝5.0)；按8倍柱体积，缓冲液A与B混合以缓冲液B占0％到30％的比例，进行梯度洗脱，收集洗脱液，得到Anti-UTY的Fab’片段。
15.磷酸钙纳米颗粒的制备(试剂都为Sigma公司)
取29.5mg四水硝酸钙加入50mL双蒸水中，室温搅拌15min。然后加入2g PEG4000溶解，并用NaOH调pH到10.0。将溶液置在室温下揽拌30min(溶液A)。取16.5mg磷酸氢二氨溶于50mL双蒸纯水中，用NaOH调pH到10.0(溶液B)，然后将溶液B缓慢滴加到溶液A中，滴加完后继续搅拌10min。将反应后的溶液在4℃，l0000r/min的条件下离心20min。弃上清，将沉淀颗粒用双蒸水洗3次，最后重悬于双蒸水中(磷酸钙纳米颗粒混悬液)。
16.磷酸钙纳米颗粒外表分析
采用智能型颗粒测量仪Mastersizer 3000对磷酸钙纳米颗粒混悬液进行颗粒测定。结果发现获得的纳米颗粒分散均匀，针状，大小在50～80nm。
17.磷酸钙纳米颗粒毒性试验
将磷酸钙纳米颗粒混悬液25μL加入0.5mL精液稀释液(无水葡萄糖10g/L，柠檬酸钠23g/L，100mL/L鲜卵黄，青、链霉素各10万单位)，再将其对新鲜精液进行1:1(体积比)稀释，同时用精液稀释液作对照，30min后观察精子活力。结果发现30min后精子活力都在0.7左右，说明所获得的纳米颗粒几乎无毒性。
18.包含Anti-UTY Fab’纳米颗粒(AntiUTY Fab磷酸钙纳米颗粒)的制备
磷酸钙纳米混悬液(浓度为0.1～0.6mg/mL)中加入Anti-UTY Fab’，使Anti-UTYFab’终浓度分别为0、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL，分别在25℃和4℃条件下摇床震荡吸附0、0.5h、1h、2h和3h，离心，弃上清，将沉淀颗粒用双蒸水洗3次，最后重悬于双蒸水，AntiUTYFab磷酸钙纳米颗粒浓度0.5～0.8mg/mL，BCA蛋白试剂盒检测Anti-UTY Fab’的吸附率，每个样品重复3次，筛选制备纳米磷酸钙吸附Anti-UTY Fab’的最优吸附条件为：100μg/mL，25℃条件下震荡吸附0.5h，再于4℃条件下震荡吸附2h。
二.AntiUTYFab磷酸钙纳米颗粒在X、Y精子分离中的应用
1.AntiUTYFab磷酸钙纳米颗粒凝固Y精子
按照常规方法采集绵羊、山羊和牛精液，用AntiUTYFab磷酸钙纳米颗粒(浓度为0.5mg/mL)等量(体积)混合后，于25℃条件下放置5分钟，然后以500r/min离心3分钟。去掉底部Y精子形成的胶冻状物质，将上部含有X精子的液体分成三部分(分别用于进行以下部分2、3、4)。
2.流式细胞仪分选检测
先在生物学显微镜下观察精子的活率，用0.5μg/mL的Hoechst 33342将精子染色30min，加入含4％卵黄的TALP(参考文献[1])和0.002％food dye使精子密度达到200个/106mL。选用基本分选指标为50psi，150mW，90％纯度，然后采用流式细胞分离仪(SX MoFlo@,DakoCytomation Inc，FortCollins，CO，USA)检测X、Y精子的比例。结果发现检测的5个精液样品中X精子的比例为99.3±3.2％。说明该方法分离得到的X精子比例非常高，完全可以用于畜牧业生产上进行牛、羊后代的性别控制。
3.体外受精及胚胎培养
从屠宰场收集山羊、绵羊及牛的卵巢，放入装有35℃灭菌生理盐水(含有青、链霉素各100IU/mL)的保温瓶中，3h内运回实验室。用38℃灭菌生理盐水冲洗卵巢3次，用带有12号针头的注射器抽吸卵巢表面上直径为3～8mm卵泡中的卵母细胞。在体视镜下挑出卵丘细胞完整、卵母细胞细胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。用成熟培养液(TCM199+10％FBS+10μg/mL FSH+10μg/mL LH+1μg/mL E2)洗3次，按照常规成熟培养方法将COCs放入成熟培养液中(用凹皿培养，覆盖石蜡)于细胞培养箱中(5％CO2、38℃、饱和湿度)成熟培养22h。
先将第一次离心后的上部分精子以1500r/min离心1min，吸弃上清液，留下底部约100μL精子沉淀，加入到140μL精子获能液(5mg/mL BSA+0.5mg/mL咖啡因+0.3mg/mL谷胱甘肽+20μg/mL肝素)中获能处理15min，并调整精子的浓度至1～2×106个/mL，备用。将体外培养成熟的卵丘-卵母细胞复合体用受精液洗涤3次，移入受精液(SOF+6mg/mL BSA)微滴(提前在CO2培养箱中放置2h)，加入已准备的精子，置培养箱中精卵共同培养20h。
把受精处理后的卵子(卵丘-卵母细胞复合体)用SOFaa培养液(参考文献[2])洗涤3次，移入含有SOFaa液的凹皿中培养至第2天，每隔1天半量换SOFaa培养液，继续培养至第5天(牛胚胎继续培养至第7天)。培养条件同卵丘-卵母细胞复合体的成熟培养。
选择小尾寒羊、关中奶山羊各18匹，中国荷斯坦奶牛12头，条件是体况接近、健康无疾病，处于泌乳后期进行同期发情处理：关中奶山羊的处理方法参考文献[3]，小尾寒羊的处理方法参考文献[4]，牛的处理方法参考文献[5]。撤栓12h后公羊开始试情，24h后每4小时试情一次并记录、观察发情情况，确定发情后每头颈部肌肉注射人绒毛膜促性腺素500单位。麻醉绑定母羊，利用腹腔镜微创手术对绵羊、山羊进行胚胎移植，随机选择两枚囊胚移到卵巢上有黄体的一侧子宫角；如果两侧都有黄体，则每个子宫角移1枚胚胎。牛胚胎移植采用非手术法移植(参考文献[5])。
将AntiUTYFab磷酸钙纳米颗粒处理过的精液重复受精、胚胎移植等过程3次，观察发情并记录妊娠率和分娩率。
表1.体外受精、胚胎移植后产羔/犊记录表
4.人工受精
选择自然发情的小尾寒羊(30匹)、关中奶山羊(28匹)及荷斯坦奶牛(25头)，羊采用子宫颈口输精，牛采用传统的输精器输精。然后观察返情及妊娠情况，直到分娩。
表2.人工受精后产羔/犊记录表
从表1以及表2可以看出，使用该方法分离得到的绵羊、山羊和牛X精子无论是进行体外受精还是传统的体内受精，产生雌性后代的比例都在96％以上，进一步说明本发明中的精子分离方法对于控制牛、羊后代的性别具有实用和推广价值。
三.参考文献
[1]Coy P,Gadea J,Romar R,et al.Effect of in vitro fertilizationmedium on the acrosome reaction,cortical reaction,zona pellucida hardeningand in vitro development in pigs.Reproduction 2002,124,279-288.
[2]Gardner DK,Lane M,Spitzer A.et al.Enhanced rates of cleavage anddevelopment for sheep zygotes cultured to the blastocyst stage in vitro inthe absence of serum and somatic cells:amino acids,vitamins,and culturingembryos in groups stimulate development.Biol.Reprod.1994,50,390-400.
[3]田万强,等.非繁殖季节奶山羊同期发情处理效果研究[J].畜牧兽医杂志,2014,33(6):28-31.
[4]张长兴,等.新型孕激素阴道栓—孕激素棉栓在小尾寒羊同期发情效果上的研究[J].畜牧与兽医,2013,45(11):41-43.
[5]赵康,等.三种同期发情方案对奶牛胚胎移植效果的影响[J].中国奶牛,2014,8:20-22.

Claims (6)

1.一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)构建Y精子H-Y抗原原核表达系统，所述原核表达系统表达的目的基因为UTY基因的编码序列；
2)利用步骤1)构建的Y精子H-Y抗原原核表达系统制备Y精子UTY抗原重组蛋白；
3)利用Y精子UTY抗原重组蛋白制备抗Y精子UTY抗原的单克隆抗体；
4)将所述单克隆抗体用胃蛋白酶进行酶切，将酶切得到的UTY抗体的抗原结合片段Fab’进行分离；
5)制备包含Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒；
所述步骤5)具体包括以下步骤：将分离得到的UTY抗体的Fab’片段加入磷酸钙纳米颗粒混悬液中，所述Fab’片段加入的终浓度为80～100μg/mL，然后于20～25℃条件下震荡吸附0.5～1h，再于4～8℃条件下震荡吸附1～2h，得到包含所述Fab’片段的磷酸钙纳米颗粒；
所述磷酸钙纳米颗粒混悬液中的磷酸钙纳米颗粒为针状，粒径大小在50～80nm。
2.根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述目的基因采用反转录PCR扩增得到，扩增的模板为提取自牛或羊的精子中的总RNA。
3.根据权利要求2所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述扩增采用的引物为：
上游引物：5’-CAGAATTCACTTGGAAATTTGTTGTT-3’；
下游引物：5’-ATCTCGAGAAAGAGGTA ATCGTTACA-3’。
4.根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述原核表达系统是以Pet-28a质粒与所述目的基因经基于限制性内切酶EcoR I及Xho I的双酶切法构建重组载体并转化宿主细胞而得到。
5.根据权利要求1所述一种用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤4)具体包括以下步骤：将所述单克隆抗体以及胃蛋白酶加入酶切缓冲液中，并于37℃酶切1～2h，所述单克隆抗体与胃蛋白酶的质量比为80～100:l，利用碘乙酸钠终止酶切反应后通过柱层析分离得到UTY抗体的Fab’片段。
6.一种如权利要求1所述方法制备得到的用于牛、羊X/Y精子快速分离的UTY抗体纳米颗粒在牛、羊快速扩繁中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1306805A (zh) * 2000-02-01 2001-08-08 杨承权 牛x、y精子流动分离法
CN1562354A (zh) * 2004-04-07 2005-01-12 魏宏泉 一种基于h－y抗原的哺乳动物生雌性控方法
CN1667118A (zh) * 2004-08-31 2005-09-14 广西大学 一种分离哺乳动物xy精子的方法
CN1807625A (zh) * 2006-01-26 2006-07-26 上海交通大学 基于h－y抗原分选奶牛x精子的免疫磁珠负筛选法

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