CN1807625A - 基于h－y抗原分选奶牛x精子的免疫磁珠负筛选法 - Google Patents

基于h－y抗原分选奶牛x精子的免疫磁珠负筛选法 Download PDF

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Abstract

一种基于H－Y抗原分选奶牛X精子的免疫磁珠负筛选法，选择H－Y抗原所特有的4个抗原决定簇，利用反转录聚合酶链反应法扩增后连接，获得只编码这4个抗原决定簇的基因重组体并将其亚克隆入表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21中诱导表达、Histrap柱纯化后获得一分子量为37kDa的融合蛋白。将融合蛋白免疫圈养鸡，从蛋黄中提取多克隆抗H－Y抗原的鸡IgY抗体并用纳米级磁珠标记，在新鲜奶牛精子中加入磁珠标记的抗体，反应后的精子缓慢通过放置于磁场中的磁柱，未吸附在磁柱上的精子即为X精子。本发明不需特殊的设备，成本低廉，获得的特异性抗体对X精子不会造成损伤，可在短时间内大批量进行精子分选。

Description

基于H-Y抗原分选奶牛X精子的免疫磁珠负筛选法
技术领域
本发明涉及一种分选奶牛X精子的方法，具体涉及一种基于Y染色体表达的H-Y抗原分选奶牛X精子的免疫磁珠负筛选法，适用于畜牧业及奶牛养殖业中的家畜性别控制。
背景技术
家畜性别控制是指通过人为地干预或操作使母畜按照人们的愿望繁殖所需性别后代的一门生物技术。在自然条件下，新出生的奶牛雌雄比例接近1∶1，而以产奶为主要手段的奶牛养殖业则希望多生母牛，以提高其经济效益，故性别控制技术在奶牛养殖及畜牧生产上具有重要的意义。国内外许多研究者在性别控制技术方面进行了广泛的研究。人们利用怀孕早期性别鉴定技术，及时终止妊娠；或用各种方法对精子进行分离：如根据X和Y染色体之间DNA的微小差异，染色后流式细胞仪分选或密度梯度离心；还有人试图根据Y精子比X精子的泳动速度快的特点，挑选跑得比较慢的X-精子(详见文献：Johnson LA.Sexing mammalian sperm for production of offspring：the state-of-the-art.AnimReprod Sci，Jul 2000；60-61：93-107；姜忠玲，王国志.奶牛性别控制的研究途径与现状黑龙江动物繁殖2004；12(2)：10-12)。这些方法中，除对精子染色后再行流式细胞术可对精子有效分选外，其它方法均未获成功。然而，运用流式细胞术也存在着不容回避的问题，如核酸染料对基因的致畸作用，流式细胞仪分选精子时激光对精子的损伤，还有昂贵的设备等。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于H-Y抗原分选奶牛X精子的免疫磁珠负筛选法，通过免疫学的方法，另辟蹊径，从而将奶牛的X精子从精液中分选出来。
为实现这一目的，本发明根据H-Y抗原是一种由Y染色体上的SMCY基因编码的雄性特异性组织相容性抗原，存在于所有含有Y染色体包括Y精子的细胞表面，而X精子由于不含有Y染色体，所以不编码H-Y抗原的特征，首次提出利用抗H-Y抗原的抗体从精液中分选得到X-精子的方法。本发明首先选择H-Y抗原所特有的4个抗原决定簇，利用反转录聚合酶链反应法扩增并连接这4个DNA序列，获得只编码这4个抗原决定簇的基因重组体并将其亚克隆入表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21中诱导表达、Histrap柱纯化后获得一分子量为37kDa的融合蛋白，再将融合蛋白免疫圈养鸡，从蛋黄中提取多克隆抗H-Y抗原的鸡IgY抗体并用纳米级磁珠标记，在新鲜奶牛精子中加入磁珠标记的抗体，反应后的精子缓慢通过放置于磁场中的磁柱，未吸附在磁柱上的精子即为X精子。
本发明的方法具体包括如下步骤：
1、根据H-Y抗原的特征，本发明首先选择了H-Y抗原所特有的4个抗原决定簇，利用反转录聚合酶链反应法分别扩增这4个抗原决定簇的DNA序列，并将这4个DNA序列连接在一起，从而获得了一个新的、只编码这4个HY-抗原决定簇的基因重组体。该重组体经DNA序列分析证实总长1079bp，编码所选定的4个H-Y抗原决定簇。
2、将该重组体经亚克隆入表达载体pET28a后，在大肠杆菌(BL21)中诱导表达、Histrap柱纯化后获得了一分子量约为37kDa的融合蛋白，其分子量与预期值相符。
3、将上述获得的融合蛋白免疫圈养鸡，共3次，每次间隔14天，末次免疫10天后开始收集鸡蛋。用氯仿-聚乙二醇法从蛋黄中提取多克隆抗H-Y抗原的鸡IgY抗体。通过琼脂糖双扩散法测定该抗体的滴度、Western-blot法、免疫组化法、流式细胞术及聚合酶链反应等方法证实该抗体可特异性的结合于奶牛精子的头尾结合部。
4、将上述获得的抗H-Y抗原的鸡IgY抗体用纳米级的磁珠标记，然后取新鲜奶牛精子样本，每108个精子细胞中加入0.5mg磁珠标记的抗体，充分反应后，将精子样本缓慢通过放置于磁场中的磁柱，收集未吸附在磁柱上的精子，即得到奶牛的X精子。
本发明相对于其他精子分离法，具有如下特点：
1、由于Y染色体上的SMCY与X染色体上的SMCX的序列来源相同，本发明有针对性地选择了H-Y抗原的4个特异的抗原决定簇，利用基因重组的方法将这4个抗原决定簇的DNA序列连接在一起，从而获得了一个新的、只编码这4个抗原决定簇的基因重组体。这样，避免了与其它抗原的交叉反应。
2、由于H-Y抗原是个弱抗原，所以本发明选择了与哺乳动物的亲缘关系较远的鸡，以期得到反应性较强的抗体。因此本发明将上述重组H-Y抗原免疫圈养鸡，获得了特异性很高的抗体。
3、没有核酸染色剂对DNA的损伤，抗体作用于Y-精子而对X-精子不会造成损伤，同时不需要特殊的设备、操作容易、成本低廉、可在短时间内大批量进行精子分选。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
1、H-Y抗原基因重组体的克隆及其鉴定
根据H-Y抗原的特征，首先选择了H-Y抗原所特有的4个抗原决定簇，设计了3对引物。第一对引物上下游分别添加BamHI和SacI的酶切位点，第二对引物上下游分别添加SacI和SalI的酶切位点，第三对引物上下游分别添加SalI和EaeI的酶切位点，引物序列(F1 GGA TCC TGT TAT GAC TGT CCA GAT AG；R1GAG CTC AAA ATG GGC CTT TTC CTC CCA；F2 GAG CTC CAC AGT TTTGAA CCT TGT ATG；R2 GTC GAC ATC ACA GAG CAG AAA CTT ATC；F3GTC GAC CAG GAT GAA TTG AGA CAT AAG；R3 TGG CCA CCT TTC TTCATT TAG TAC CAA C)。其中，第1个片断中含有H-Y抗原的第1～2个抗原决定簇，第2个片断中含第3个抗原决定簇，第3个片断中含第4个抗原决定簇。
将6周龄的雄性小鼠处死，无菌取其大脑组织，TRIzol试剂盒提取总RNA后，反转录多聚酶链法(RT-PCR)分别扩增上述3个片断后，将纯化回收的PCR产物分别与pMD18-T载体连接，转化入JM109。蓝白斑反应阳性的克隆经测序鉴定，其序列与原序列完全同源。将这3个片段连接后重新克隆入pMD18-T载体，再行序列测定，证实总长1079bp，编码所选定的4个H-Y抗原决定簇。
2、H-Y抗原重组蛋白的表达
将上述含有4个H-Y抗原决定簇的DNA片段，亚克隆入原核表达质粒pET-28a，导入感受态大肠杆菌BL21中，卡那霉素筛选后，挑选阳性重组质粒。以终浓度为1mMol/L异丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达融合蛋白，溶菌酶加去污法裂解诱导表达后的细菌培养物，Histrap柱纯化后获得一分子量为37kDa的融合蛋白。这一蛋白与预期蛋白的分子量相符。
3、抗H-Y抗原多克隆抗体鸡IgY的制备
用完全福氏佐剂与含有H-Y抗原决定簇的融合蛋白混匀后，免疫圈养隐性白鸡，之后每14天用不完全福氏佐剂混合含有H-Y抗原决定簇的融合蛋白加强免疫2次，并于末次免疫10天后开始收集鸡蛋。共收集鸡蛋200余个。
分离蛋黄，氯仿-聚乙二醇(分子量6000)法提取鸡抗H-Y抗原的抗体IgY。取抗H-Y抗原的IgY，1∶1、1∶2、1∶4和1∶8稀释后，以雄牛脑组织作为抗原，琼脂糖免疫双扩散法测定其效价，当抗体稀释至1∶8时，仍可见清晰的反应沉淀线。而雌性奶牛未见反应。
Western-blot检测结果在雄牛脑组织可以检测到H-Y抗原，而雌牛脑组织中未检测到。说明此多克隆IgY抗体可以特异性的与雄性组织中的H-Y抗原结合。
取一个多聚赖氨酸包被的盖玻片，将200μl中含有105个奶牛精子的溶液覆盖，室温下湿盒中孵育2小时，PBS洗涤3次。再在37℃下与1∶30稀释的抗H-Y抗原IgY抗体反应1小时，最后用1∶50稀释的FITC(荧光素异硫氰酸酯)标记的兔抗鸡IgG在37℃孵育30分钟，然后在荧光显微镜下观察，结果在精子的头部与尾部的交界处可见荧光。说明此抗H-Y抗原IgY的抗体可以特异性的与精子细胞膜表面的H-Y抗原结合。
奶牛精子样本，与1∶5稀释的抗H-Y抗原IgY抗体37℃孵育下1小时，PBS洗2次。然后再加入FITC标记的兔抗鸡IgG37℃孵育30分钟，PBS洗2次。重悬于PBS中的精子细胞用流式细胞仪进行检测，分选，并且回收分选后的精子细胞。流式细胞仪结果显示，阳性细胞所占比例为38.7％，排除机器本身的噪音干扰，阳性细胞与阴性细胞之间的比例接近与1∶1。回收后的阳性细胞和阴性细胞分别提取基因组DNA，然后用ZFY和ZFX的引物进行PCR反应，PCR结果证实，在H-Y抗体标记阳性的精子细胞中可以检测到ZFY，而在阴性精子细胞中检测不到ZFY。说明该抗体可以用于分选精子。
4、精子的分选
将上述获得的抗H-Y抗原的鸡IgY抗体用纳米级的磁珠标记，然后取新鲜奶牛精子样本，每108个精子细胞中加入0.5mg磁珠标记的抗体，充分反应后，将精子样本缓慢通过放置于磁场中的磁柱，标记有磁珠的精子被吸附在磁柱当中，未被磁珠标记的精子细胞用离心管收集。将收集到的精子再重复过磁柱1次，分别收集吸附/未被吸附于磁柱上的精子。吸附于磁柱上的精子为H-Y阳性精子，为Y-精子，反之为H-Y阴性精子，即X-精子。
上述H-Y阴性精子中加入FITC标记的二抗，37℃孵育30分钟后，流式细胞仪检测，结果最终收集到的精子细胞悬液当中H-Y抗体的阳性率为3.10～8.4％，平均为7.8。说明经免疫磁珠负筛选法分离得到的精子细胞当中，X精子的比例已经达到了90％以上。
上述分选得到的精子，提取基因组DNA，然后用ZFY和ZFX的引物进行PCR反应检测，H-Y阳性精子可以检测到ZFY，而H-Y阴性细胞则只能检测到极少量的ZFY，说明其绝大部分为X精子。
上述各实施例充分说明，用本发明的方法可以从精液中去除Y精子。

Claims (1)

1.一种基于H-Y抗原分选奶牛X精子的免疫磁珠负筛选法，其特征在于包括如下步骤：
1)选择H-Y抗原所特有的4个抗原决定簇，利用反转录聚合酶链反应法分别扩增这4个抗原决定簇的DNA序列，并将这4个DNA序列连接在一起，从而获得一个总长1079bp、编码所选定的4个H-Y抗原决定簇的基因重组体；
2)将该基因重组体经亚克隆入表达载体pET28a后，在大肠杆菌BL21中诱导表达、Histrap柱纯化后获得一分子量为37kDa的融合蛋白；
3)将上述获得的融合蛋白免疫圈养鸡，共3次，每次间隔14天，末次免疫10天后开始收集鸡蛋；用氯仿-聚乙二醇法从蛋黄中提取多克隆抗H-Y抗原的鸡IgY抗体；
4)将上述获得的抗H-Y抗原的鸡IgY抗体用纳米级的磁珠标记，然后取新鲜奶牛精子样本，每108个精子细胞中加入0.5mg磁珠标记的抗体，充分反应后，将精子样本缓慢通过放置于磁场中的磁柱，收集未吸附在磁柱上的精子，即得到奶牛的X精子。
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