CN113203865A - 一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法 - Google Patents

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曹艳桃
余四九
陈豪泰
徐庚全
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Abstract

本发明属于生物基因技术领域，公开了一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，引物设计与合成；重组质粒的构建；EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定；EPF重组蛋白表达条件优化；多克隆抗体的制备及鉴定。本发明通过原核表达系统，表达并纯化牦牛早孕因子(Early pregnancy factor，EPF)重组蛋白，用纯化后蛋白免疫小鼠诱导其产生EPF多克隆抗体。实验结果表明，本发明成功构建了牦牛早孕因子重组质粒，通过原核表达系统表达了EPF蛋白，用重组EPF蛋白免疫小鼠，得到了牦牛早孕因子多克隆抗体，该抗体具有免疫原性。

Description

一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法
技术领域
本发明属于生物基因技术领域，尤其涉及一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法。
背景技术
目前，早孕因子已被鉴定为热休克蛋白10(Hsp10)的细胞外同源物，位于妊娠期间细胞外，在妊娠第一阶段释放来参与妊娠的成功建立。在正常生理条件下，EPF只在怀孕期间被发现，可能是妊娠期间接促进胚胎发育的重要因素。所有妊娠期的生殖组织如：卵巢，输卵管，胎盘都显示有EPF的特异性表达。EPF由两个亚单位组成，分别叫做EPF-A和EPFB，它们有不同的合成位点。 EPF-A是在发情和怀孕期间在输卵管内合成的，在输卵管中，EPF在纤毛分泌上皮细胞和纤毛细胞的纤毛中表达。EPFB只与怀孕有关，在着床前由卵巢产生，在卵巢中的表达以卵泡型叶黄素细胞为主，其功能是作为一种黄体营养因子；在着床后由胚胎产生，在胎盘中的中胚层绒毛膜尿囊和内胚层上皮表达。实验数据表明，EPFB是成功怀孕的重要因素，它既可作为生长因子，也可以作为一种促进母体免疫系统对异体胎儿耐受的免疫抑制剂，充当着床期滋养细胞的自分泌和旁分泌生长因子，诱导免疫细胞如CD4+，CD25+调节性T细胞的分化并增强他们的免疫抑制活性，这可能是母体怀孕期间抑制免疫应答的重要机制。 EPF作为细胞因子平衡中的一个重要调节因子，确保一个合适的免疫环境来进行妊娠，也可以保护受精卵一直到胎盘形成，并能够产生高密度脂蛋白以维持这种抑制的免疫状态。因此，EPF被认为是直接或间接参与导致成功妊娠的复杂相互作用的重要分子。
牦牛是生活在高原地区的一种非常独特的畜种，它从生理生化及结构上都稳定的遗传了高原地区动物的低氧适应能力。即便如此，牦牛的繁殖活动也受到高原低氧恶劣环境的影响，为了适应这种影响牦牛自身获得繁衍对策模式-季节性繁殖。然而由于牦牛的粗放管理，配种时间难掌握，早期妊娠诊断滞后等原因，使牦牛出现繁殖率低，生产效益差的劣势。因此，具备一项能通过更简便的方法在牦牛怀孕早期就可确诊的妊娠诊断技术是牦牛产业高效发展的迫切要求。同时，现有技术中关于早孕因子原核表达、重组蛋白纯化的多克隆抗体制备的技术方案尚未见报道。因此，亟需一种关于早孕因子原核表达、重组蛋白纯化的多克隆抗体制备的相关技术方案。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)由于牦牛的粗放管理，配种时间难掌握，早期妊娠诊断滞后等原因，使牦牛出现繁殖率低，生产效益差的劣势。
(2)现有技术中关于早孕因子原核表达、重组蛋白纯化及多克隆抗体制备的技术方案尚未见报道。
解决以上问题及缺陷的难度为：
本实验中需要采取妊娠期牦牛胎盘及卵巢组织，以及孕期牦牛的血清，由于牦牛妊检方式的滞后，较难判断牦牛是否属于妊娠期，所以采样会有一定难度。
由于实验室仪器设备有限，在实验进行过程中会有些困难。
解决以上问题及缺陷的意义为：
在牦牛养殖业中，目前为止妊娠诊断技术研究依然比较滞后。早孕因子 (EPF)作为超早孕诊断指标，其准确率可达88％。因此，本项目通过制备EPF 抗体，希望可以建立一种可快速准确检测牦牛早孕的方法。期待这种较为理想的早期妊娠诊断方法应用于牦牛产业中，促进牦牛产业的发展。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，尤其涉及一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法。
本发明是这样实现的，一种多克隆抗体在制备用于检测畜类怀孕早期药物上的应用。
一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，引物设计与合成；
步骤二，重组质粒的构建；
步骤三，EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定；
步骤四，EPF重组蛋白表达条件优化；
步骤五，多克隆抗体的制备及鉴定。
进一步，步骤一中，所述引物设计与合成，包括：
利用软件Prime premier5设计引物，两端选择Sac1和Xho1酶切位点，引物大小为309bp。
进一步，步骤一中，所述引物序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步，步骤二中，所述重组质粒的构建，包括：
(1)目的基因扩增
使用Trizol法从牦牛胎盘组织中提取RNA后按反转录试剂盒步骤反转录为 cDAN，以cDAN为扩增模板扩增EPF目的基因；
(2)重组质粒构建
使用DNA凝胶回收试剂盒对扩增出的EPF基因回收，并将该目的产物和载体pET28-His10-Sumo分别用SacI内切酶和XhoI内切酶于37℃水浴酶切2h，用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收；将回收后的目的产物，空载体， T4DNA连接酶体系用封口膜封口于16℃连接过夜；连接产物转化至DH5α感受态细胞中：将4ul产物加入50ul感受态中冰浴30min，42℃热激90s，迅速放入碎冰冰浴2min，加入400ul LB于37℃摇床培养1h，取50ul涂在含卡那的LB 固体培养基上，37℃过夜倒置培养；使用QIAprep Spin Miniprep Kit 50提质粒，并进行重组质粒菌液PCR鉴定和测序验证。
进一步，步骤(1)中，总体系为25ul：上下游引物各1ul，模板1ul，1-5TM2X High-Fidelity Master Mix12.5ul，用高压后的去离子水补至25ul；
PCR反应程序为：预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火55℃，15s，延伸72℃，30s，循环数为34，重延伸72℃，5min，4℃保存。
进一步，步骤(2)中，酶切体系为：10X CutSmart Buffer 4ul，SacI和XhoI 各1ul，目的产物/载体8ul，26ul的dd水；
连接体系为：10X T4 DNA ligase Buffer 1ul，T4 DNA ligase 1ul，目的片段6ul，载体2ul。
进一步，步骤三中，所述EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定，包括：
将阳性质粒转化至BL21即DE3感受态细胞中；涂板培养后挑取单克隆于 37℃震荡培养13～16h收集于4℃冰箱保存备用；将保存的EPF重组菌液按1： 200接种于37℃震荡培养，2～3h后加入IPTG过夜诱导，次日收集菌液，用超声波细胞破碎仪进行破菌处理后取部分菌液进行SDS-PAGE电泳；剩余菌液离心，分别收集上清和包涵体进行Western Blot实验。
进一步，步骤四中，所述EPF重组蛋白表达条件优化，包括：
(1)诱导剂浓度优化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h 后分别加入0nmol/L、100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L、500nmol/L、700nmol/L、 900nmol/L IPTG在37℃下过夜诱导，次日各取1ml菌液制备蛋白样品，进行 SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定最佳诱导剂浓度；
(2)诱导温度优化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h 后加入300nmol/L IPTG分别放在16℃、26℃、30℃、37℃过夜诱导，次日各取 1ml菌液制备蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定诱导表达的最佳温度；
(3)诱导时间优化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h 后加入300nmol/L IPTG在37℃下诱导，从0h开始，隔2h收集一次菌液，到诱导时间达8h时各取1ml菌液处理蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定最佳时间；
(4)EPF重组蛋白纯化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于锥形瓶大量摇菌1L，2～3h后加入浓度为300nmol/L的IPTG 1ml在37℃下诱导6h；离心收集上清，用超声波细胞破碎仪进行破菌处理：超声开5s，关10s，250W超声60min；离心收集上清用过滤器过滤后与Ni Sepharose6Fast Flow His标签蛋白纯化填料结合4h；用不同浓度洗脱液洗脱，收集洗脱液制备蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。
进一步，步骤(4)中，所述洗脱液的浓度为：20、40、60、80、150、500mmol/L。
进一步，步骤五中，所述多克隆抗体的制备及鉴定，包括：
利用纯化后的EPF重组蛋白免疫小鼠；四免后采集小鼠血液，置于4℃冰箱，次日离心收集血清；将小鼠多抗血清以1：2000用1％脱脂奶粉稀释，HRP 标记的羊抗鼠二抗工作浓度按1：10000稀释；纯化后的EPF重组蛋白作为抗原进行Western Blot检测。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，通过原核表达系统，表达并纯化牦牛早孕因子(Earlypregnancy factor，EPF)重组蛋白，用纯化后蛋白免疫小鼠诱导其产生EPF多克隆抗体。本发明成功构建了牦牛早孕因子重组质粒，通过原核表达系统表达了EPF蛋白，用重组EPF蛋白免疫小鼠，得到了牦牛早孕因子多克隆抗体，该抗体具有免疫原性。
本发明通过RT-PCR的方法，以牦牛胎盘组织中提取的RNA反转录的cDNA 为模板对EPF基因进行扩增，并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo 上，构建pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒，经鉴定后将阳性重组质粒转化至 BL21(DE3)感受态中；用IPTG诱导表达并优化表达条件，使用His标签镍柱纯化重组EPF蛋白，纯化后蛋白免疫小鼠制备抗体。实验结果表明，经PCR扩增的目的条带在300bp左右，与预期结果相符；pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒构建成功，转化后经诱导剂IPTG的诱导，表达分子质量大小为29KD的蛋白 (其中早孕因子蛋白为10KD，标签蛋白为19KD)，且蛋白表达量在37℃，诱导剂浓度为300nM诱导6h时最高；Western blot结果显示蛋白在上清和包涵体中都有表达，免疫后的抗血清能与纯化后的重组蛋白反应。因此，原核表达了重组EPF蛋白并产生了相应抗体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的牦牛EPF基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳示意图；
图中：M表示2000bp DNA Mark，泳道1和泳道2表示目的基因PCR扩增产物，泳道3表示空白对照。
图3是本发明实施例提供的重组质粒pET28-His10-Sumo-EPF扩增产物琼脂糖凝胶电泳示意图；
图中：M表示5000bp DNA Mark，泳道1表示1号菌落PCR产物，泳道2 表示2号菌落PCR产物，泳道3表示1号重组质粒PCR产物，泳道4表示2号重组质粒PCR产物，泳道5表示空白对照，泳道6表示重组质粒。
图4是本发明实施例提供的上清中表达蛋白的Western Blot检测示意图。
图5是本发明实施例提供的包涵体中表达蛋白的Western Blot检测示意图。
图6是本发明实施例提供的EPF重组蛋白诱导剂IPTG浓度优化示意图；
图中：M表示蛋白分子质量标准，1表示0nmol/L，2表示100nmol/L，3表示300nmol/L，4表示500nmol/L，5表示700nmol/L，6表示900nmol/L。
图7是本发明实施例提供的EPF重组蛋白诱导温度优化示意图；
图中：M表示蛋白分子质量标准，1表示16℃，2表示26℃，3表示30℃， 4表示37℃。
图8是本发明实施例提供的EPF重组蛋白诱导时间优化示意图；
图中：M表示蛋白分子质量标准，表示0h，2表示8h，3表示6h，4表示 5h，5表示4h，6表示3h，7表示2h，8表示1h。
图9是本发明实施例提供的纯化的EPF重组蛋白SDS-PAGE分析示意图；
图中：M表示蛋白分子质量标准，1表示纯化前破菌后上清，2表示20mmol/L 洗脱液，3表示40mmol/L洗脱液，4表示60mmol/L洗脱液，5表示80mmol/L 洗脱液，6表示100mmol/L洗脱液，7表示150mmol/L洗脱液，8表示500mmol/L 洗脱液。
图10是本发明实施例提供的EPF重组蛋白透析后SDS-PAGE分析结果示意图；
图中：M表示蛋白分子质量标准，1表示EPF重组蛋白未经IPTG诱导时菌液，2表示EPF重组蛋白经IPTG诱导表达后菌液，3表示纯化前上清，4表示包涵体，5表示透析后的纯化EPF重组蛋白。
图11是Western Blot检测EPF抗血清与EPF反应性结果示意图；
图中：M表示蛋白分子质量标准，1表示EPF抗血清和EPF重组蛋白反应条带，2表示载体对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描；述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法包括以下步骤：
S101，引物设计与合成；
S102，重组质粒的构建；
S103，EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定；
S104，EPF重组蛋白表达条件优化；
S105，多克隆抗体的制备及鉴定。
所述抗体的序列为：
GCCTGTGGCGTGAGAGCAGGGTACGAACTGCGGCAGCCGGAGTCATGGCAGGACAGGCATTTAGAAAGT TTCTTCCCCTCTTTGACCGAGTATTAGTTGAAAGAAGTGCGGCCGAAACTGTAACCAAAGGAGGGATTATGCTTCCA GAAAAATCACAAGGAAAAGTATTGCAAGCAACGGTGGTAGCTGTTGGATCAGGCTCTAAAGGAAAGGGTGGAGAGAT TCAACCAGTTAGTGTGAAAGTTGGAGATAAAGTTCTTCTCCCAGAATATGGAGGCACCAAAGTAGTTCTAGACGACA AGGATTATTTCTTATTTAGAGATGGTGACATTCTTGGGAAATATGTCGACTGAAATAAGTCACTATTGAAATGGCAT CACGTGAAGCTGCCCATTCCACTGAAGTTCTGAAATCTTTCATCATGTAAATAATTTCCATGTTTCTCTTTTATAAT AAACTAACGATATCCAAGCTAATGAAAAA
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
1、材料
1.1样品、菌株、质粒
实验所需的牦牛胎盘组织样品采集于2019年11月青海省西宁市乐家湾屠宰场；原核表达载体pET28-His10-Sumo于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫防控技术团队提供；大肠杆菌感受态DH5α和BL21(DE3)均购自北京擎科新业生物技术有限公司。
1.2实验试剂
GoScriptTM Reverse Transcription System购自美国Promega公司；QIAprepSpin Miniprep Kit(50)购自上海凯杰企业管理有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、 1-5TM2XHigh-Fidelity Master Mix均购自北京擎科新业生物技术有限公司； DL500 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker购自日本Takara 公司；Ni Sepharose 6FastFlow His标签蛋白纯化填料购自爱必信(上海)生物科技有限公司；限制性核酸内切酶Xho1、Sac1、T4 DNA连接酶均购自美国NEB； IPTG购自北京天根生化科技有限公司；THETMHis Tag Antibody[HRP]抗体购自金斯瑞生物科技有限公司。
2、方法
2.1引物设计与合成
利用软件Prime premier5设计引物，两端选择Sac1和Xho1酶切位点，引物大小为309bp。引物送于上海生工生物股份有限公司合成。引物序列为：
EPF-F：CGAGCTCATGGCAGGACAGGCATTTAGAA
EPF-R：CCCTCGAGTCAGTCGACATATTTCCCAAGAATGTCA
2.2重组质粒的构建
2.2.1目的基因扩增
使用Trizol法从牦牛胎盘组织中提取RNA后按反转录试剂盒步骤反转录为 cDAN，以cDAN为扩增模板扩增EPF目的基因。总体系为25ul：上下游引物各1ul，模板1ul，1-5TM2XHigh-Fidelity Master Mix12.5ul，用高压后的去离子水补至25ul。PCR反应程序为：预变性98℃，2分钟，变性98℃，10秒，退火 55℃，15秒，延伸72℃，30秒，循环数为34，重延伸72℃，5分钟，4℃保存。
2.2.2重组质粒构建
使用DNA凝胶回收试剂盒对扩增出的EPF基因回收，并将该目的产物和载体pET28-His10-Sumo分别用SacI内切酶和XhoI内切酶于37℃水浴酶切2h，用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收。酶切体系为：10X CutSmart Buffer 4ul，SacI和XhoI各1ul，目的产物/载体8ul，26ul的dd水。将回收后的目的产物，空载体，T4DNA连接酶体系用封口膜封口于16℃连接过夜。连接体系为： 10X T4 DNA ligase Buffer 1ul，T4 DNA ligase 1ul，目的片段6ul，载体2ul。连接产物转化至DH5α感受态细胞中：将4ul产物加入50ul感受态中冰浴30分钟， 42℃热激90秒，迅速放入碎冰冰浴2分钟，加入400ul LB于37℃摇床培养1 小时，取50ul涂在含卡那的LB固体培养基上，37℃过夜倒置培养。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(50)提质粒，并进行重组质粒菌液PCR鉴定和测序验证。
2.3EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定
将阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中。涂板培养后挑取单克隆于 37℃震荡培养13～16h收集于4℃冰箱保存备用。将保存的EPF重组菌液按1： 200接种于37℃震荡培养，2～3h后加入IPTG过夜诱导，次日收集菌液，用超声波细胞破碎仪进行破菌处理后取部分菌液进行SDS-PAGE电泳。剩余菌液离心，分别收集上清和包涵体进行Western Blot实验。
2.4EPF重组蛋白表达条件优化
2.4.1诱导剂浓度优化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h 后分别加入0nmol/L、100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L、500nmol/L、700nmol/L、 900nmol/L IPTG在37℃下过夜诱导，次日各取1ml菌液制备蛋白样品，进行 SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定最佳诱导剂浓度。
2.4.2诱导温度优化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h 后加入300nmol/L IPTG分别放在16℃、26℃、30℃、37℃过夜诱导，次日各取 1ml菌液制备蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定诱导表达的最佳温度。
2.4.3诱导时间优化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h 后加入300nmol/L IPTG在37℃下诱导，从0h开始，隔2h收集一次菌液，到诱导时间达8h时各取1ml菌液处理蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定最佳时间。
2.4.4EPF重组蛋白纯化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于锥形瓶大量摇菌1L，2～3h后加入浓度为300nmol/L的IPTG 1ml在37℃下诱导6h。离心收集上清，用超声波细胞破碎仪进行破菌处理：超声开5s，关10s，250W超声60min。离心收集上清用过滤器过滤后与Ni Sepharose6Fast Flow His标签蛋白纯化填料结合4h。用不同浓度(顺序为20、40、60、80、150、500mmol/L)洗脱液洗脱，收集洗脱液制备蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。
2.5多克隆抗体的制备及鉴定
用纯化后的EPF重组蛋白免疫小鼠。四免后采集小鼠血液，置于4度冰箱，次日离心收集血清。将小鼠多抗血清以1：2000用1％脱脂奶粉稀释，HRP标记的羊抗鼠二抗工作浓度按1：10000稀释。纯化后的EPF重组蛋白作为抗原进行 Western Blot检测。
3、结果与分析
3.1目的基因扩增及重组质粒鉴定
PCR扩增目的基因，在300bp左右得到比较单一的条带，与预期结果一致。 EPF重组质粒用通用引物进行菌落PCR，扩增产物长度约在300bp左右，与预期结果一致。送北京擎科新业生物技术有限公司测序，结果进一步证实了重组 EPF质粒构建成功。其中，牦牛EPF基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳见图2，重组质粒pET28-His10-Sumo-EPF扩增产物琼脂糖凝胶电泳见图3。
3.2EPF重组蛋白表达形式鉴定
将EPF重组菌液于37℃震荡培养，2～3h后加入IPTG过夜诱导，次日收集菌液，用超声波细胞破碎仪进行破菌处理，离心收集上清和包涵体分别进行 Western Blot检测，结果证明EPF重组蛋白成功表达，并且在上清和包涵体中都有表达。其中，上清中表达蛋白的Western Blot检测见图4，包涵体中表达蛋白的Western Blot检测见图5。
3.3EPF重组蛋白诱导表达条件优化
3.3.1最佳诱导剂浓度
将菌液于37℃培养2.5h后分别加入0nmol/L、100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L、500nmol/L、700nmol/L、900nmol/L IPTG过夜诱导。SDS-PAGE结果显示EPF重组蛋白在IPTG浓度为300nmol/L时蛋白表达量最大。其中，EPF 重组蛋白诱导剂IPTG浓度优化见图6。
3.3.2最佳诱导温度
将菌液于37℃培养2.5h后加入300nmol/L IPTG分别于16℃、26℃、30℃、 37℃过夜诱导。SDS-PAGE结果显示EPF重组蛋白在37℃时蛋白表达量最高，所以选择37℃为最佳诱导温度。其中，EPF重组蛋白诱导温度优化见图7。
3.3.3最佳诱导时间
将菌液于37℃培养2.5h后加入300nmol/L IPTG继续在37℃下诱导培养，每隔2h取一次菌液，放置于4度冰箱备用，诱导8h后处理蛋白样品。SDS-PAGE 结果显示EPF重组蛋白在第6h时蛋白表达量最高，所以选择最佳诱导时间为 6h。其中，EPF重组蛋白诱导时间优化见图8。
3.3.4EPF重组蛋白纯化
EPF重组蛋白经Ni柱纯化后用梯度浓度的洗脱液洗脱，当洗脱液浓度较小时洗脱掉大量的杂蛋白，目的蛋白大部分存在于500mmol/L的洗脱液中，蛋白纯化效果较好。透析后EPF重组蛋白经SDS-PAGE分析，获得的纯化蛋白无杂蛋白。其中，纯化的EPF重组蛋白SDS-PAGE分析见图9，EPF重组蛋白透析后SDS-PAGE分析结果见图10。
3.4多克隆抗体的制备及鉴定
以重组EPF蛋白作为抗原，小鼠抗血清以1：2000稀释作为一抗，二抗以 1：10000稀释。
4、早孕因子(early pregnancy factor，EPF)是存在于妊娠早期家畜血清中的一种无动物品种特异性免疫抑制因子。Morton等用RIA实验发现早孕小鼠血中存在一种EPF。也有研究证明人在受精后24～48h可在母体血清中测出EPF的含量。Takagi等通过活体移植马成活胚胎，监测供体及受体移植前后血清EPF 活性，发现体内EPF活性与胚胎状态密切相关，供体在胚胎离体后第2d即检测不到血清EPF活性，而受体则在胚胎植入后第2～3d即可检测到EPF活性，故检测体内EPF活性可监控活体胚胎的生存能力及早期胚胎死亡。Cruz等对怀孕 1～9d的袋鼠血清进行EPF活性检测，结果均阳性，认为EPF是其妊娠的早期指征。Shu-xin H等利用RIA实验检测母牛血清中EPF活性，试验证明EPF活性可预测家畜流产。Ohnuma等报道用RIT检测纯种马的EPF活性，发现经孕酮及孕马血清促性腺激素确诊妊娠的孕马，其早孕血清均具EPF活性。Lash等通过实验证明EPF能较好的提示早期妊娠且对于监控早期胚胎的丢失也有一定的潜力。鉴于EPF的上述作用及其特点，制备EPF抗体建立快速检测方法，达到高效的EPF检测，以便应用于母畜超早期妊娠诊断。
5、本发明成功构建了牦牛早孕因子重组质粒，通过原核表达系统表达了EPF 蛋白，用重组EPF蛋白免疫小鼠，得到了牦牛早孕因子多克隆抗体，该抗体具有免疫原性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
基因序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> 一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法
<160> 1
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgagctcatggcaggacaggcatttagaa
ccctcgagtcagtcgacatatttcccaagaatgtca

Claims (10)

1.一种多克隆抗体在制备用于检测畜类怀孕早期药物上的应用。
2.一种牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，引物设计与合成；
步骤二，重组质粒的构建；
步骤三，EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定；
步骤四，EPF重组蛋白表达条件优化；
步骤五，多克隆抗体的制备及鉴定。
3.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述引物设计与合成，包括：
利用软件Prime premier5设计引物，两端选择Sac1和Xho1酶切位点，引物大小为309bp；
所述引物序列如SEQ ID NO：1所示。
4.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述重组质粒的构建，包括：
(1)目的基因扩增
使用Trizol法从牦牛胎盘组织中提取RNA后按反转录试剂盒步骤反转录为cDAN，以cDAN为扩增模板扩增EPF目的基因；
(2)重组质粒构建
使用DNA凝胶回收试剂盒对扩增出的EPF基因回收，并将该目的产物和载体pET28-His10-Sumo分别用SacI内切酶和XhoI内切酶于37℃水浴酶切2h，用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收；将回收后的目的产物，空载体，T4DNA连接酶体系用封口膜封口于16℃连接过夜；连接产物转化至DH5α感受态细胞中：将4ul产物加入50ul感受态中冰浴30min，42℃热激90s，迅速放入碎冰冰浴2min，加入400ul LB于37℃摇床培养1h，取50ul涂在含卡那的LB固体培养基上，37℃过夜倒置培养；使用QIAprep Spin Miniprep Kit 50提质粒，并进行重组质粒菌液PCR鉴定和测序验证。
5.如权利要求4所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，总体系为25ul：上下游引物各1ul，模板1ul，1-5TM2X High-Fidelity Master Mix12.5ul，用高压后的去离子水补至25ul；
PCR反应程序为：预变性98℃，2min，变性98℃，10s，退火55℃，15s，延伸72℃，30s，循环数为34，重延伸72℃，5min，4℃保存。
6.如权利要求4所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，酶切体系为：10X CutSmart Buffer 4ul，SacI和XhoI各1ul，目的产物/载体8ul，26ul的dd水；
连接体系为：10X T4 DNA ligase Buffer 1ul，T4 DNA ligase 1ul，目的片段6ul，载体2ul。
7.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述EPF重组蛋白的表达及表达形式鉴定，包括：
将阳性质粒转化至BL21即DE3感受态细胞中；涂板培养后挑取单克隆于37℃震荡培养13～16h收集于4℃冰箱保存备用；将保存的EPF重组菌液按1：200接种于37℃震荡培养，2～3h后加入IPTG过夜诱导，次日收集菌液，用超声波细胞破碎仪进行破菌处理后取部分菌液进行SDS-PAGE电泳；剩余菌液离心，分别收集上清和包涵体进行Western Blot实验。
8.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述EPF重组蛋白表达条件优化，包括：
(1)诱导剂浓度优化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h后分别加入0nmol/L、100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L、500nmol/L、700nmol/L、900nmol/L IPTG在37℃下过夜诱导，次日各取1ml菌液制备蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定最佳诱导剂浓度；
(2)诱导温度优化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h后加入300nmol/L IPTG分别放在16℃、26℃、30℃、37℃过夜诱导，次日各取1ml菌液制备蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定诱导表达的最佳温度；
(3)诱导时间优化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于50ml离心管37℃震荡培养，2～3h后加入300nmol/L IPTG在37℃下诱导，从0h开始，隔2h收集一次菌液，到诱导时间达8h时各取1ml菌液处理蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色来确定最佳时间；
(4)EPF重组蛋白纯化
将保存的EPF重组菌液按1：200接种于锥形瓶大量摇菌1L，2～3h后加入浓度为300nmol/L的IPTG 1ml在37℃下诱导6h；离心收集上清，用超声波细胞破碎仪进行破菌处理：超声开5s，关10s，250W超声60min；离心收集上清用过滤器过滤后与Ni Sepharose6Fast Flow His标签蛋白纯化填料结合4h；用不同浓度洗脱液洗脱，收集洗脱液制备蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。
9.如权利要求8所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述洗脱液的浓度为：20、40、60、80、150、500mmol/L。
10.如权利要求2所述牦牛早期妊娠诊断试剂的制备方法，其特征在于，步骤五中，所述多克隆抗体的制备及鉴定，包括：
利用纯化后的EPF重组蛋白免疫小鼠；四免后采集小鼠血液，置于4℃冰箱，次日离心收集血清；将小鼠多抗血清以1：2000用1％脱脂奶粉稀释，HRP标记的羊抗鼠二抗工作浓度按1：10000稀释；纯化后的EPF重组蛋白作为抗原进行Western Blot检测。
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