CN115746146B - 一种GnRH重组蛋白抗原、哺乳动物去势重组蛋白疫苗及制备方法 - Google Patents
一种GnRH重组蛋白抗原、哺乳动物去势重组蛋白疫苗及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种GnRH重组蛋白抗原、哺乳动物去势重组蛋白疫苗及制备方法，描述了含有编码免疫去势蛋白促性腺激素释放激素六聚体与吻素蛋白的重组蛋白疫苗。本发明公开了GnRH6‑Kisspeptin重组蛋白疫苗的构建及转化表达和纯化，以及工程菌BL21(DE3)‑pET‑21a‑GnRH6‑Kisspeptin获取。该疫苗通过免疫动物后，产生特异性抗体，使睾丸萎缩，无精子产生，从而控制动物生育力的方法。所述方法中的GnRH6‑Kisspeptin重组蛋白，能有效控制动物生育能力。
Description
技术领域
本发明涉及分子疫苗学领域，具体涉及一种GnRH重组蛋白抗原、哺乳动物去势重组蛋白疫苗及制备方法。
背景技术
动物最常用的去势技术是手术阉割，其缺点是引起动物高度应激，外科伤口易感染，增加动物的发病率，甚至导致动物死亡。另外，由于手术阉割完全摘除了公畜的睾丸，破坏了机体完整性，使动物的日增重、饲料利用效率和肉质降低，而且在非麻醉情况下手术去势对动物非常残忍，在施术过程中对人的安全也构成威胁。而一种替代手术去势方法的选择就是采用去势疫苗接种，使动物体不能性成熟，与手术去势相比，安全方便，减少感染机会。
促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)也被称为GnRHl、促黄体生成激素释放激素、促性腺素释放素原-1和促性腺素释放素原-1前体，是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素，其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(Luteinizing hormone,LH)及促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)，即调控生殖轴。在雄性动物中，FSH和LH与发情、交配等生殖活动以及睾丸发育和精子生成等密切相关。因此通过免疫GnRH诱导GnRH的抗体产生，体内中和GnRH进而减少GnRH水平，导致LH和FSH合成减少，而伴随发情、睾丸发育和精子生成的破坏，最终达到绝育的目的。单体的GnRH疫苗在单次和多次注射下在降低睾丸质量、血清睾丸激素和正常小管的百分比等生殖参数方面均未出现显著效果。因此，需要去势效果更好的复合GnRH疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种哺乳动物去势重组蛋白疫苗及制备方法，该方法蛋白表达量高，达到菌体总蛋白的40－60％，其疫苗制剂简单，免疫原性强，操作方便，只需肌肉注射2－3次，即可产生特异性抗体，导致睾丸萎缩40％以上，睾酮水平下降，无精子产生，具有很强的免疫去势效果。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种GnRH重组蛋白抗原。根据本发明的实施例，所述GnRH重组蛋白抗原的氨基酸序列如序列表Seq_1所示。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种哺乳动物去势重组蛋白疫苗。根据本发明的实施例，所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗中含有权利要求1所述的GnRH重组蛋白抗原。
另外，根据本发明上述实施例的一种哺乳动物去势重组蛋白疫苗，还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗含有哺乳动物GnRH序列，包括犬、猫、宠物猪等。
在本发明的一些实施例中，所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗含有序列表Seq_2的犬GnRH序列。
在本发明的一些实施例中，所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗含有序列表Seq_3的山羊吻素多肽序列。
在本发明的一些实施例中，所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗含有序列表Seq_1的GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌表达的重组蛋白。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌。根据本发明的实施例，所述GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌于2022年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25035，分类命名为Escherichia coli，具体命名为BL21(DE3)-pET-21a-GnRH6-Kisspeptin，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。所述GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌表达含序列表Seq_1的氨基酸的重组蛋白。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌的构建方法。根据本发明的实施例，包括以下步骤:
(1)根据哺乳动物GnRH序列和山羊吻素序列，设计包含选定的GnRH六聚体融合吻素多肽；
(2)采用密码子优化系统设计合成带BamH I和Xho I酶切位点的DNA序列，经BamHI和Xho I双酶切后DNA产物与同样酶切的载体pET21a连接，获得连接液；
(3)随后将连接液转入大肠杆菌DH5α，筛选得到质粒pET21a-GnRH6-Kisspeptin，通过将质粒pET21a-GnRH6-Kisspepti转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株得到工程菌BL21(DE3)-pET-21a-GnRH6-Kisspeptin，即为所述GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种哺乳动物去势重组蛋白疫苗的制备方法。根据本发明的实施例，将所述的GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌进行破菌纯化得到含序列表Seq_1的氨基酸的重组蛋白，即为所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种的哺乳动物去势重组蛋白疫苗的应用。根据本发明的实施例，所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗用于哺乳动物生育能力控制。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明采取GnRH六聚体和Kisspeptin蛋白融合的方式，提高了低分子量抗原免疫原性，提高了抗原的免疫效果；同时本发明使用的是重组GnRH6-Kisspeptin蛋白，减少了多肽合成和制剂成本，使用更加便利。
2)本发明采用GnRH六聚体和Kisspeptin重组蛋白表达方式，作为制备动物去势疫苗的一种方法，该方法蛋白表达量高，达到菌体总蛋白的40－60％，疫苗制剂简单，操作方便，只需肌肉注射2－3次。
3)本发明采用的GnRH六聚体和Kisspeptin重组蛋白的方式，能够有效的提高其免疫效果，导致睾丸至少萎缩40％，睾酮水平下降，表明具有很强的免疫原性。
附图说明
图1为本发明实施例1提供GnRH6-Kisspeptin的蛋白免疫印迹(Western blot)图，条带1表示Mark条带，条带2表示GnRH6-Kisspeptin与GnRH抗体反应条带；
图2为本发明实施例2对照组和GnRH6-Kisspeptin免疫组雄性大鼠抗体滴度检测图；
图3为本发明实施例2提供的实验动物免疫后睾丸切片图，其中，图A、C为对照组，图B、D为GnRH6-Kisspeptin免疫组，A和B为睾丸组织整体结构，ST指生精小管，短箭头指向精原细胞，长箭头指向初级精母细胞，椭圆形为精子细胞，长方形为精子；
图4为本发明实施例2提供的实验动物免疫后睾丸形态图，其中，图A为对照组，图B为GnRH6-Kisspeptin免疫组；
图5为本发明实施例2对照组和GnRH6-Kisspeptin免疫组雄性大鼠睾酮水平检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种哺乳动物去势重组蛋白疫苗，即GnRH6-Kisspeptin疫苗表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)质粒pET21a-GnRH6-Kisspeptin的构建：
①根据家犬GnRH序列(序列表Seq_2)和山羊的Kisspeptin序列(序列表Seq_3)，设计包含选定的GnRH六聚体融合Kisspeptin多肽。将从北京擎科生物科技有限公司合成的带BamH I和Xho I酶切位点的DNA序列(序列表Seq_4)冻干粉按照说明书用灭菌超纯水溶解，溶解的DNA和pET21a质粒同时分别用BamH I和Xho I进行双酶切，双酶切体系分别为GnRH6-Kisspeptin基因片段(100ng/μL)或pET21a(100ng/uL)40μL，其余体系均为10×CutSmartBuffer 10μL，BamH I和Xho I各1μL以及灭菌超纯水48μL。37℃酶切10h，核酸电泳分离目的片段，用手术刀将目的条带切下来，用凝胶回收试剂盒进行纯化。
②将GnRH6-Kisspeptin基因片段和pET21a载体片段按照摩尔比5:1使用T4连接酶4℃连接过夜，连接混合液转化大肠杆菌DH5α后在含有100μg/mL氨卞西林(Amp+)的LB固体培养基上培养过夜，挑取几个单克隆测序，选择序列正确的菌提取质粒，即为质粒pET21a-GnRH6-Kisspeptin。
其中，质粒提取及双酶切电泳回收均使用“北京艾德莱生命科技有限公司”的相应试剂盒。
(2)GnRH6-Kisspeptin疫苗蛋白的诱导表达和纯化：
①μ菌的制备：将上述的质粒pET21a-GnRH6-Kisspeptin用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有Amp+(100μg/mL)的LB固体培养基上培养12-15h，挑取一个转化子于含有Amp+(100μg/mL)的LB液体培养基中过夜培养；取1mL过夜后的培养菌液，加入100mL新鲜的含有Amp+(100μg/mL)的LB液体培养基中，于37℃下转速180rpm摇动培养至3h，使OD 600为0.8时，加入终浓度为1.0mM的IPTG，37℃继续以转速180rpm摇动培养6h，以10000g、4℃离心30min，收集菌沉淀，即为工程菌BL21(DE3)-pET-21a-GnRH6-Kisspeptin。
②破菌：100mL菌沉淀加入8mL(8％)变性裂解液(包涵体溶解液)进行重悬，变性裂解液为终浓度的50mM Tris>500mM NaCl和8M尿素，pH7.5。将重悬的菌体于-80℃反复冻融3次，每冻30min解冻一次，超声时可加入蛋白酶抑制剂PMSF(按1：100-1：1000稀释，工作浓度为17-174μg/mL)；超声功率为200W，超声4s，间歇4s，超声25min；超声结束后，在4℃、10000g离心30min。取上清，上清镍柱纯化后即得所述哺乳动物去势重组蛋白。
其中，质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用感受态细胞方法；所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京纽英伦生物技术有限公司”。
将纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳检测，即先在80V电压下电泳20-30min，随后在120V电压下电泳50-60min，测定其分子量大小，然后将纯化的蛋白经WB分析，结果如图1所示，证实哺乳动物去势重组蛋白疫苗为具有序列表Seq_1中的氨基酸序列的抗原蛋白GnRH6-Kisspeptin。
序列表Seq_1：
QHWSGGLRPGGGSEHWSYGLRPGGGSEHWSYGLRPGGGSEDWSYGLRPGGGSEHWSYGLRPGGGSEHWSYGLRPGGGGSNVLLSWQLMLFLCATAFRETLEKVAPMENPRTTGSQLGPATLRAPWEQSPRCAAGKPTAAGPRPRGAALCPSESSAGPRQPGPCAPRSRLIPAPRGAVLVQREKDVSAYNWNSFGLRYGRRQAALPGGRGAARG
序列表Seq_2
MEPIPKLVAGLLLLTFCVVSCSGQHWSYGLRPGGKRNAEHLIDSFQEMAKELDQPAEPQHLECTIHKPRPPLRDLRGALESLIEEETGQKRI
序列表Seq_3
MNVLLSWQLMLFLCATAFRETLEKVAPMENPRTTGSQLGPATLRAPWEQSPRCAAGKPTAAGPRPRGAALCPSESSAGPRQPGPCAPRSRLIPAPRGAVLVQREKDVSAYNWNSFGLRYGRRQAALPGGRGAARG
序列表Seq_4
ggatccCAGCATTGGAGCGGTGGTCTGCGTCCTGGTGGTGGTAGTGAACATTGGAGCTATGGTCTGCGTCCGGGTGGTGGTTCTGAACATTGGAGTTATGGTCTGCGCCCTGGTGGTGGCTCTGAAGATTGGAGTTATGGCCTGCGTCCGGGCGGTGGTAGTGAACATTGGTCATACGGTCTGCGTCCAGGTGGTGGTAGCGAACATTGGTCTTATGGTCTGCGTCCGGGTGGCGGTGGTAGCAACGTTCTGCTGAGTTGGCAGCTGATGCTGTTTCTGTGTGCAACGGCGTTTCGTGAAACCCTGGAAAAAGTGGCACCGATGGAAAATCCGCGTACGACCGGTAGTCAGCTGGGTCCTGCAACACTGCGTGCACCTTGGGAACAGAGCCCTCGTTGTGCAGCAGGTAAACCGACCGCAGCAGGTCCTCGTCCTCGTGGTGCAGCACTGTGTCCTTCAGAATCATCAGCAGGTCCGCGTCAGCCTGGTCCTTGTGCACCTCGTTCACGTCTGATTCCGGCACCTCGTGGTGCTGTTCTGGTTCAGCGTGAAAAAGATGTTAGCGCTTATAACTGGAATAGCTTTGGTCTGCGTTATGGTCGTCGTCAGGCCGCACTGCCTGGTGGTCGTGGTGCAGCCCGTGGTctcgag
实施例2
哺乳动物去势重组蛋白疫苗即GnRH6-Kisspeptin疫苗的应用：
选取雄性大鼠20只，对照组和免疫组各10只，重组蛋白和乳胶佐剂充分乳化，20日龄肌肉注射含200μg重组蛋白的疫苗，间隔2周加强免疫，共免疫3次，每次注射方法和剂量相同，104日龄时处死，采集不同阶段大鼠血液并使用ElISA法检测抗体效价和睾酮水平，比较各组睾丸大小。取睾丸样品制备切片，苏木精-伊红染色观察组织学结构。
GnRH6-Kisspeptin疫苗的免疫效果评估:
抗体水平在第二次免疫到最终处死阶段均显著高于对照组(图2)。免疫组大鼠的睾丸组织发生明显空泡变性。空泡变性的大鼠睾丸生精小管变化明显，精原细胞、精母细胞及精子细胞层次不分明，且无精子产生。对照组大鼠的睾丸生精小管结构正常，生精小管中有正常的精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子，并且层次分明，有大量精子产生(图3)。可见，GnRH6-Kisspeptin抑制大鼠睾丸的发育，最终萎缩40％以上(图4)，且睾酮水平显著下降(图5)。说明研制出的GnRH6-Kisspeptin疫苗具有很好的去势效果。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种GnRH重组蛋白抗原，其特征在于：所述GnRH重组蛋白抗原的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.一种哺乳动物去势重组蛋白疫苗，其特征在于：所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗中含有权利要求1所述的GnRH重组蛋白抗原。
3.一种GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌，其特征在于：所述GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌于2022年6月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25035，分类命名为Escherichia coli，具体命名为BL21（DE3）-pET-21a-GnRH6-Kisspeptin，所述GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌表达含序列表SEQ ID No.1的氨基酸的重组蛋白。
4.一种哺乳动物去势重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于：将权利要求3所述的GnRH6-Kisspeptin转化大肠杆菌进行破菌纯化得到含序列表SEQ ID No.1的氨基酸的重组蛋白，即为所述哺乳动物去势重组蛋白疫苗。
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