CN101116640B - 一种提高牛、羊胚胎移植妊娠率的缓释微胶囊 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于提高牛、羊胚胎移植妊娠率的移植液，利用该移植液通过提高母体子宫内IFN-tau的水平来提高移植胚胎妊娠率。本发明还提供了几种可行的提高IFN-tau水平的方法，包括在胚胎移植时在移植液中添加IFN-tau或孤雌发育胚胎。通过本发明的方法能够显著提高牛羊胚胎移植妊娠率，与对照组相比能提高妊娠率15％-20％。本发明方法操作简便，应用成本低廉，效果显著，对动物不产生任何有害影响。其可以在牛、羊胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。

Description

一种提高牛、羊胚胎移植妊娠率的缓释微胶囊

技术领域

本发明涉及胚胎移植技术，具体地说涉及一种提高牛、羊胚胎移植妊娠率的胚胎移植液。

背景技术

胚胎移植技术能充分利用优良种畜的遗传资源，迅速扩大畜群的良种比例。同时，此技术也是治疗哺乳动物不孕症的有效手段。然而，家畜胚胎移植技术的效率依然未达到理想的水平，如奶牛新鲜胚胎受胎率仅为55％-60％，冷冻后解冻胚胎受胎率仅为45％-50％，体外受精胚胎受胎率在30％左右，而体细胞核移植克隆胚胎的受胎率仅为10％-20％。绵羊和山羊胚胎移植效率基本与此相同。但是，自然交配或人工授精技术的妊娠率能达到80％-90％。通过以上数字比较发现，移入胚胎有近一半发生早期死亡，一些新型技术的死亡率更高，达80％-90％。由于移植胚胎的遗传品质、生产成本较高，早期胚胎死亡带来巨大经济损失，这直接限制了胚胎移植技术在生产中的应用。因此，提高移入胚胎的受胎率是畜牧生产和科学研究所必需。

母畜妊娠是胚胎与母体子宫互作的结果，母畜排出的卵子在输卵管完成受精以后，转移到子宫，同时不停向前发育。牛、羊胚胎发育到囊胚阶段分泌一类酸性糖蛋白分子IFN-tau，IFN-tau作用于子宫内膜细胞，这些细胞产生反应，抑制了溶解黄体物质PGF_2α的合成与释放，母体卵巢上的周期黄体发育为妊娠黄体，分泌大量的孕激素。子宫组织在孕激素作用下，腺体发育并分泌多种营养物质，形成子宫乳，促进早期胚胎的发育和附植。目前的研究认为IFN-tau是胚胎发出的最初妊娠信号。如果胚胎分泌量不足，母体不能发生妊娠反应，卵巢上的黄体将被溶解，继而孕激素分泌量下降，子宫腺体发育不全，子宫 中营养物质缺乏，胚胎不能正常发育，最终妊娠失败。因此，从理论上说，母体在合适的时间接受足量的IFN-tau是妊娠建立的基础，通过提高子宫内IFN-tau的水平将有望提高牛、羊胚胎的妊娠率。然而，目前还没有相关的研究和报道。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种提高牛、羊胚胎移植妊娠率的胚胎移植液。该胚胎移植液通过提高子宫内IFN-tau的水平来提高牛、羊胚胎妊娠率。

胚胎移植时，由于胚胎质量差或胚胎与母体同期化程度不一致，是导致妊娠识别失败的主要原因。提高子宫内IFN-tau的水平，母体会及时发生妊娠反应，分泌子宫乳，促进胚胎发育，一些级别稍差或发育滞后的胚胎会发育正常，最终顺利完成妊娠建立。

本发明提出三种优选方案来提高妊娠识别期母体子宫内IFN-tau的水平，从而增强母体对胚胎的识别。

第一种方法是在移植液中添加IFN-tau。IFN-tau可以通过基因工程手段大量生产，首先克隆牛、羊IFN-tau基因，并与表达载体连接后在大肠杆菌中表达，然后分离纯化此蛋白，再将此蛋白添加到胚胎移植液中，与胚胎同时注入母体子宫内，以提高母体妊娠率。IFN-tau的添加量根据蛋白活性确定，通常约为1--2μg/次移植。

第二种方法是将正常胚胎与孤雌发育胚胎共移植。用体外成熟的牛、羊卵子，经化学试剂或电激活诱导孤雌发育，发育到囊胚后冷冻保存。在进行胚胎移植时，孤雌胚胎与正常胚胎按1∶1比例同时注入子宫内。孤雌胚胎分泌的IFN-tau会促进正常胚胎发育与附植。

第三种方法是正常胚胎与分泌IFN-tau的活组织碎片共移植。将体外受精胚胎或性别鉴定后不再使用的体内受精胚胎，将其内细胞团破坏，仅保留滋养层细胞块，或附植前胚胎组织片。胚胎移植时， 正常胚胎与滋养层细胞块或附植前胚胎组织片(60个细胞左右)，按照1∶1的比例共同移入受体母牛子宫内，滋养层细胞分泌的IFN-tau会促进正常胚胎发育和附植。

IFN-tau外源增加的量过多还未发现对胚胎产生不良影响，但其对胚胎或子宫腺体发育的促进作用会消失。

当然，本领域技术人员可以按照本发明的精神，通过其他途经来提高子宫内IFN-tau的水平来提高牛、羊胚胎妊娠率，例如：IFN-tau与缓释佐剂混合后注入子宫腔内或制备成缓释微胶囊投入子宫内等。

本发明通过提高牛、羊子宫内IFN-tau的水平，来提高牛、羊胚胎移植的妊娠率，本发明方法能使牛、羊胚胎移植妊娠率比现有技术提高15％-20％，冷冻解冻胚胎的妊娠率达到65％-75％。本发明方法操作简便，应用成本低廉，效果显著，对动物不产生任何有害影响，可以在牛、羊胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为一步法PCR产物电泳分析，图中M：DNA Ladder Marker DL2000；1-2：bIFN-tau PCR产物；

图2为重组质粒pGEM-bIFNS-tau酶切鉴定图谱，图中M：DNA Ladder Marker DL2000+15000；1：NcoI/SpeI；2：SphI/SpeI；3：PstI；4：BglII/SmaI；5：BglII；ck：plasmid control；

图3为实施例1获得的IFN-tau与(XM593584)的比对结果；

图4为pET-bIFNS(+)-tau酶切验证图谱，M：DNA Ladder Marker DL2000+15000；1：NdeI/XhoI；2：SphI/XhoI；3：BglII/NdeI；4：XhoI；5：BamHI；6：plasmid control；

图5为pET-bIFNS(-)-tau酶切验证图谱，M：DNA Ladder Marker DL2000+15000；1：NdeI/XhoI；2：SphI/XhoI；3：BglII/NdeI；4：XhoI；5： BglII；ck：plasmid control；

图6为pET-bIFNS(+)-tau和pET-bIFNS(-)-tau的原核表达产物SDS-PAGE电泳图谱，M：Prestained Protain Marker；1：pET-bIFNS(+)-tau诱导前；2：pET-bIFNS(-)-tau诱导前；3：25℃，pET-bIFNS(+)-tau表达产物；4：25℃，pET-bIFNS(-)-tau表达产物；5：37℃，pET-bIFNS(+)-tau表达产物；6：37℃，pET-bIFNS(-)-tau表达产物；7：pET-30a(+)阴性对照；

图7为pET-bIFNS(-)-tau的原核表达产物SDS-PAGE电泳图谱，M：Prestained Protain Marker；1：37℃，pET-bIFNS(-)-tau诱导前；2：25℃，pET-bIFNS(-)-tau表达产物；3：25℃，pET-bIFNS(-)-tau破碎后上清；4：25℃，pET-bIFNS(-)-tau破碎后沉淀；5：37℃，pET-bIFNS(-)-tau表达产物；6：37℃，pET-bIFNS(-)-tau破碎后上清；7：0.1mM IPTG，pET-bIFNS(-)-tau表达产物；8：37℃，pET-bIFNS(-)-tau破碎后沉淀；

图8纯化后的rbIFN-tau SDS-PAGE电泳图谱，M：Prestained Protain Marker；1-2：纯化后的rbIFN-tau；

图9培养液中添加rbIFN-tau后对牛子宫内膜上皮细胞形态变化的影响，a和c：牛子宫内膜上皮细胞对照组正常生长的贴壁细胞；b：添加1×PBS培养24h后贴壁生长的细胞；d：添加rbIFN-tau培养24h后贴壁生长的细胞；e：胰蛋白酶消化5min后的对照组细胞；F：胰蛋白酶消化5min后的rbIFN-tau处理组细胞。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一、在移植液中添加牛重组IFN-tau提高牛移植妊娠率的方案

本例应用基因工程的手段，通过克隆牛IFN-tau基因，构建表达载体，进一步转化宿主细胞来生产IFN-tau蛋白，从中分离、纯化得 到IFN-tau，并添加到移植液中从而提高胚胎移植妊娠率。

(一)牛IFN-tau基因克隆与原核表达

1.胚胎裂解

(1)将含有牛雄性胚胎的细管从液氮中取出后，迅速放入32℃水浴中停留10s解冻，取出细管；

(2)剪掉细管封口端，用金属推杆推动棉栓，使管中内容物连同胚胎流入含有1×PBS(或Holding液)溶液的表面皿中；

(3)在实体显微镜下迅速回收胚胎，并用PBS洗三遍，10枚为一组；

(4)将收集的胚胎放入37℃预热的酸性Tyrode’s溶液中，在实体显微镜下观察，待透明带溶解后，迅速用大量PBS溶液中和、洗涤；

(5)将胚胎放入盛有5μl冰浴裂解液(0.8％Igepal+5mmol/LDTT+1U/μl RNAsin)的薄壁PCR管中，迅速投入液氮冷冻后30秒后取出，在-80℃冰箱保存或直接进行后续实验。

2.bIFN-tau基因的克隆

根据GenBank中已知的bIFN-tau基因序列GenBank(AF238611)，设计三组引物(表1)。由于bIFN-tau基因没有内含子，可以直接从基因组中扩增得到bIFN-tau基因(采用第一组引物)，反应程序：94℃，5min；94℃，45s，58.4℃，1min，72℃，1min，共35个循环；最后72℃延伸8min。扩增产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，然后与pGEM-T Vector连接，并转化大肠杆菌DH_5α感受态细胞，经过蓝白筛选，挑取白色菌落，SDS-碱裂解法提取质粒、酶切鉴定，初步鉴定正确的重组质粒进行DNA测序，并将重组质粒命名为pGEM-bIFNS-tau。

表1 用于基因扩增的引物序列

注：下划线部分分别为NdeI和XhoI的酶切位点

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测证实得到585bp的特异性bIFN-tau基因条带(图1)。

将bIFN-tau扩增产物与pGEM-T Vector连接后，得到重组质粒pGEM-bIFNS-tau，采用不同的内切酶进行酶切验证，结果如图2，酶切片断与预期大小一致。DNA测序结果表明，其核苷酸及氨基酸序列如SEQ ID No.1&2所示，得到的bIFN-tau序列与已知序列XM_593584(Gene ID：515549)相比，核苷酸和氨基酸的同源性分别达99％和97％，其核苷酸序列和氨基酸比对结果如图3(Upper line：重组质粒pGEM-bIFN-tau测序后的序列，from 1 to 585；Lower line：Genbank中的已知序列(XM593584)，from 1 to 585)。

3.bIFN-tau基因原核表达载体的构建

第二组和第三组(表1)引物均引入了NdeI和XhoI酶切位点，分别用于从pGEM-bIFNS-tau重组质粒上扩增含信号肽和不含信号肽的bIFN-tau基因，反应程序：94℃，3min；94℃，40s，60℃，1min，72℃，1min，共30个循环；最后72℃延伸8min。扩增产物经NdeI和XhoI双酶切、回收，与经过同样双酶切的pET-30a(+)Vector连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，提取质粒并验证，重组表达载体分别命名为pET-bIFNS(+)-tau(含信号肽)和pET-bIFNS(-)-tau(不含信号肽)。

从鉴定正确的重组质粒pGEM-bIFNS-tau上扩增含信号肽和不含信号肽的bIFN-tau基因，与pET-30a(+)连接后，酶切鉴定结果如图4和图5，产生的片断大小均与预期结果一致，表明已成功构建了bIFN-tau的两种原核表达载体。

4.bIFN-tau基因的诱导表达及纯化

分别挑取含有重组质粒pET-bIFNS(+)-tau和pET-bIFNS(-)-tau的菌落接种于50ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃活化 后按1∶10的稀释比例转移至新的培养基中继续培养至细菌OD₆₀₀＝1.0，添加IPTG至终浓度0.1mM，25℃条件下慢速诱导20h，37℃条件下快速诱导4h，离心分别收集菌体，经过超声波破碎收集沉淀，采用0.1％TritonX-100洗涤和纯化包涵体，经过10M尿素溶解，最后得到含有rbIFN-tau的上清液。参照ProBond^TM Purification System(Invitrogen)试剂盒说明书，在活性条件下纯化rbIFN-tau，用SDS-PAGE电泳检测表达产物分子量及其纯度，考马斯亮兰R-250染色后观察结果，并用Bradford法测定rbIFN-tau浓度。在25℃和37℃，含pET-bIFNS(-)-tau的表达菌在两种温度条件下诱导后，在约20kD处均有一条较粗的条带产生，分子量与预期大小一致(图6)。破碎后的细菌沉淀采用0.1％TritonX-100洗涤后，得到rbIFN-tau的包涵体，经过10M尿素溶解，部分rbIFN-tau转移至上清液，采用Ni²⁺亲合层析纯化。纯化步骤如下：

(1)取3ml包涵体溶解液，用1×Native Purification Buffer(7.8g/L NaH₂PO₄·2H₂O；29.22g/L NaCl，pH 8.0)等体积稀释，稀释后上柱，4℃条件下，不断摇动柱子1h，始终保持树脂悬浮(若包涵体溶解液中目的蛋白较少，可增加上柱次数)。

(2)自然沉淀树脂，吸上清，保存上清于4℃，进行SDS-PAGE分析。

(3)用8ml预冷的1×Native Wash Buffer(20mM Imidazole：1.362g Imidazole→1000ml 1×Native Purification Buffer，pH 8.0)洗涤树脂，自然沉淀树脂，吸上清，保存上清于4℃，进行SDS-PAGE分析。

(4)重复第3步至少3次。

(5)用4ml含350mM Imidizole的1×Native Elution Buffer(23.85g Imidazole→1000ml 1×Native Purification Buffer，pH到8.0)洗脱靶蛋白，4℃条件下，不断摇动柱子30min，始终保持树脂悬浮。 (可分2步加入洗脱液，2ml/次)

(6)用适量大小的超滤管接收洗脱下的蛋白，4℃，7500×g离心15min，小分子量的蛋白被滤下，离心后再加入8ml 1×PBS，4℃，7500×g离心15min，以除去洗脱液中多余的咪唑，用1×PBS反复3次，最后收集超滤管中的蛋白，分装1ml/管，-80℃保存，同时取10μl收集液进行SDS-PAGE。

最终得到纯度在90％以上rbIFN-tau。(如图8)

5.rbIFN-tau的抗病毒活性检测

以常规方法在96孔板培养牛肾细胞，待细胞长成单层后去除培养液，加入细胞维持液，同时每孔加入成倍稀释的rbIFN-tau 200μl，每个稀释度接2孔，37℃孵育过夜，IFN处理组和病毒对照组加入100μl，100TCID50的VSV病毒进行攻毒，细胞对照组加入维持液(每块96孔板均设细胞对照组、病毒对照组和IFN处理组)，37℃培养1-2天，在倒置镜下观察结果，待病毒对照组细胞全部发生明显病变时，将抑制50％细胞病变的干扰素最高稀释度定为1个IFN单位。

Bradford法测定rbIFN-tau的浓度为5.8μg/ml，当rbIFN-tau稀释10倍时，rbIFN-tau处理组细胞与细胞对照组、病毒对照组相比，rbIFN-tau仍可抑制50％以上的细胞发生病变，稀释度高于10倍时，处理组细胞发生明显病变，而加入10倍以下干扰素稀释度的细胞生长良好。因此，rbIFN-tau的最高稀释度为1∶10。根据rbIFN-tau的浓度，计算出rbIFN-tau的抗病毒活性单位为1×10⁴U/mg。

(二)胚胎移植

冷冻胚胎解冻后，在体视显微镜下挑选质量合格胚胎，移入添加1μg/ml rIFN-tau胚胎移植液中，然后每枚胚胎连同0.2ml此移植液吸入规格为0.25ml的常用塑料细管中，装入胚胎移植枪直接进行子宫角移植。采用上述方法移植胚胎80枚，其中52枚移植受胎，， 妊娠率达到65％；对照组不添加rIFN-tau，移植胚胎60枚，其中30枚移植受胎，妊娠率为50％。与对照组相比，本方法受胎率提高了15％。

实施例2 胚胎共移植

本例将正常胚胎与发育缺陷胚胎共移植达到提高INF-tau水平的目的。所述的发育缺陷胚胎是指用体外成熟的牛卵子，经化学试剂诱导孤雌发育，发育到囊胚后冷冻保存。在进行胚胎移植时，孤雌胚胎与正常胚胎按1∶1比例同时注入子宫内。孤雌胚胎分泌的IFN-tau会促进正常胚胎发育与附植。

(一)牛卵母细胞采集及体外成熟培养

将从屠宰场取得的牛卵巢放入25℃的生理盐水中带回实验室。用带有19G针头的10mL注射器抽取2～6mm卵泡中的卵母细胞，在实体显微镜下选择带有完整致密的COCs(卵丘颗粒细胞和卵母细胞复合体)，用成熟培养液洗涤3遍后放入四孔板的成熟培养液中，置于二氧化碳培养箱中培养。培养条件为38.5℃，100％湿度，5％CO₂。培养23h后，把COCs吸入0.2％透明质酸酶中，消化吹打去除颗粒细胞，洗涤后挑选形态正常的卵母细胞备用。

(二)化学激活

将成熟后去除颗粒细胞的牛卵母细胞用无钙镁DPBS洗涤3次，放入9％乙醇激活液中处理5min，再放入2mmol/L的6-DMAP处理液中处理4h，洗涤3次后放入CR1aa培养液I中培养。

(三)胚胎培养与发育

激活后放入CR1aa培养液I中培养计为第0天，每隔48h以CR1aa Ⅱ更换一半培养液，培养至第6天收集囊胚，每天收集一次，收集到第8天。

CR1aa培养液成分表

(四)牛囊胚OPS法玻璃化冷冻保存及解冻

将室温调至25℃，冷冻操作在38～39℃恒温台上进行。首先用带有1mL塑料注射针筒的口吸管连接的OPS管将牛囊胚移入冷冻预处理液中平衡30s，再移入玻璃化冷冻液中平衡25s后，将囊胚吸入OPS管中直接投入液氮冷冻保存。每支管装入2～3枚囊胚。

OPS管从液氮中取出后，立即将装有囊胚部分浸入置于恒温台上(38～39℃)的含有0.25mol/L蔗糖解冻液的表面皿中，解冻后将囊胚从OPS管中吹出并摇动混匀，在此液中平衡1min，然后移入0.15mol/L蔗糖解冻液中平衡5min，再用DPBS液洗涤2次，移入胚胎移植液中，10-15min后，挑选形态完整、胚胎恢复原状，死亡细胞少于10％的胚胎用于与正常胚胎共移植。共移植时，每枚孤雌胚胎与1枚正常胚胎共移植。采用上述方法移植胚胎60枚，其中45枚移植受胎，妊娠率达到75％，而对照组的妊娠率为55％(28/51)比对照组高20％。(实施例2、3在同一牛场进行，实施例1在另外一个牛场进行，因此对照结果不相同)

实施例3 胚胎组织碎片共移植

本例的方法是正常胚胎与分泌IFN-tau的活组织碎片共移植。

本例使用性别鉴定后不再使用的体内受精囊胚，将其内细胞团破坏，仅保留滋养层细胞块。胚胎移植时，正常胚胎与滋养层细胞块(约含60个细胞)共同移入受体母牛子宫内，滋养层细胞分泌的 IFN-tau会促进正常胚胎发育和附植。采用上述方法移植胚胎40枚，其中28枚移植受胎，妊娠率达到70％，比对照组高15％。

社会效益与经济效益分

通过以上实例可以看出，本发明方法能显著提高牛、羊胚胎移植后的妊娠率，胚胎移植效率提高15％-20％，意味着良种胚胎的利用率提高15％-20％，胚胎移植成本也就降低15％-20％左右，良种价格可以至少降低15％-20％。这样胚胎移植技术就更能为广大农牧民所承受，良种扩繁速度将明显加快，良种覆盖率会大幅度提高，农牧民的经济收入会明显增加，从而带动整个农牧区经济发展。

本发明方法能使牛、羊胚胎移植技术的效率提高15％-20％，按目前我国每年奶牛和肉牛胚胎移植数量在1.5万头左右，直接经济效益12.25亿元左右。我国每年绵羊、山羊胚胎移植数量目前在2.0万只左右，经济效益约0.1亿元左右。因此，在我国推广此技术和产品将获得直接经济效益10多亿左右元。如果在全世界推广，经济效益可达数十几亿美元。本发明方法每头(只)份的生产成本为2-3元，市场承受价约为30-50元。因此，该产品在国内推广后，直接获利1500-2000万元。如果在全世界推广，年收益达1-2亿美元。

序列表 

<110>中国农业大学 

<120>一种提高牛、羊胚胎移植妊娠率的方法 

<130> 

<160>2 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>585 

<212>DNA 

<213>牛(Bos taurus) 

<220> 

<221>CDS 

<222>(1)..(585) 

<400>1 

atg gcc ttc gtg ctc tct cta ctg atg gcc gtg gtg ctg atc agc tac     48 

Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Val Val Leu Ile Ser Tyr 

1               5                   10                  15 

agc ctg gga gga tcc ctg ggc tgt gac ctg tct ccg aac cat gtg ctg     96 

Ser Leu Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Pro Asn His Val Leu 

            20                  25                  30 

gtt ggc agg aag aac ctc agg ctc ctg ggc caa atg agg aga ctc tcc    144 

Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser 

        35                  40                  45 

cct cgc ttc tgt ctg cag gac aga aaa gac ttc act ttc ccc cag gag    192 

Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Thr Phe Pro Gln Glu 

    50                  55                  60 

atg gtg aag ggt ggc cag ctc cag gag gcc cag gcc atc tct gtg ctc    240 

Met Val Lys Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu 

65                  70                  75                  80 

cac gag ctg ctc cag cag acc ttc aac ctc ttc cac aca gag cat tcc    288 

His Glu Leu Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser 

                85                  90                  95 

tct gct gcc tgg gac acc acc ctc ctg gag cag ctc cac act gga ccc    336 

Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu His Thr Gly Pro 

            100                 105                 110 

cat cag cag ctg gac gac ctg gac gcc tgc ctg ggg cag gtg atg gga    384 

His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly 

        115                 120                 125 

gag gaa gac tct gcc ctg gga agg aca ggc ccc aca ctg gcc gtg aag    432 

Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Val Lys 

    130                 135                 140 

agg tac ttc cag ggc atc cat gtc tac ctg caa gag aag gaa tac agt    480 

Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Gln Glu Lys Glu Tyr Ser 

145                 150                 155                 160 

gac tgt gcc tgg gaa atc gtc aga ctg gaa atc atg aga tcc ttg tct    528 

Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser 

                165                 170                 175 

tca tca acc agc ttg caa gaa agg tta aga atg atg ggt gga gat ctg    576 

Ser Ser Thr Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Gly Gly Asp Leu 

            180                 185                 190 

aac tca ctt                                                        585 

Asn Ser Leu 

        195 

<210>2 

<211>195 

<212>PRT 

<213>牛(Bos taurus) 

<400>2 

Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Val Val Leu Ile Ser Tyr 

1               5                   10                  15 

Ser Leu Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Pro Asn His Val Leu 

            20                  25                  30 

Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser 

        35                  40                  45 

Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Thr Phe Pro Gln Glu 

    50                  55                  60 

Met Val Lys Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu 

65                  70                  75                  80 

His Glu Leu Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser 

                85                  90                  95 

Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu His Thr Gly Pro 

            100                 105                 110 

His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly 

        115                 120                 125 

Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Val Lys 

    130                 135                 140 

Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Gln Glu Lys Glu Tyr Ser 

145                 150                 155                 160 

Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser 

                165                 170                 175 

Ser Ser Thr Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Gly Gly Asp Leu 

            180                 185                 190 

Asn Ser Leu 

        195 

Claims (2)

1.IFN-tau在制备提高牛、羊胚胎移植妊娠率的缓释微胶囊的应用，其由IFN-tau与缓释佐剂混合后制备成缓释微胶囊。

2.一种用于提高牛、羊胚胎移植妊娠率的缓释微胶囊，其特征在于，其是由IFN-tau与缓释佐剂混合后制备而成。

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