CN1528792A - 一种红细胞膜表面提取物的提取方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种红细胞膜表面提取物的提取方法及应用，其对机体免疫具有双向调节作用，提高机体对抗原的免疫应答水平，使血液中的抗体水平迅速升高，并可抑制子宫局部的免疫排斥反应，有利于动物的妊娠维持。本发明作为佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗，以提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，还可应用于子宫局部，可促进子宫局部Th2型细胞因子及IFN－τ分泌，提高子宫局部的抗感染能力，降低早期胚胎死亡和流产，提高动物妊娠率。

Description

一种红细胞膜表面提取物的提取方法及应用

一、技术领域：

本发明涉及一种红细胞膜表面提取物的提取方法及应用，其可用于提高动物的免疫水平。

二、背景技术：

红细胞表面表达有多种免疫相关抗原，包括CD58，CD59和补体C3b受体。CD58是一种细胞表面的糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，是CD2的天然配体。存在于红细胞表面和可溶性的CD58(sCD58)可能通过下述途径在机体免疫调节中发挥作用：①非特异地直接与CD2+淋巴细胞结合，通过CD2-CD58旁路途径激活而使其进一步增殖；②与T细胞CD2结合后，引起T细胞膜表面受体表达的改变，而影响T细胞TCR/CD3途径的活化；③通过与可溶性CD2的结合，而使其失去与APC细胞膜表面CD58的结合力，抑制可溶性CD2对免疫的负调节作用。目前对红细胞表面免疫相关抗原的应用缺乏相应的研究。

三、发明内容：

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种红细胞膜表面提取物的提取方法及应用，其对机体免疫具有双向调节作用，能刺激外周血淋巴细胞增殖，提高机体对抗原的免疫应答水平，使血液中的抗体水平迅速升高，显著缩短免疫后抗体达到有效保护水平的时间，并可抑制子宫局部的免疫排斥反应，有利于动物的妊娠维持。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种红细胞膜表面提取物的提取方法，其特殊之处在于包括以下操作步骤：无菌采集山羊或绵羊颈静脉血，肝素抗凝，加入适量0.05M pH7.5的PBS液，1500r·min^-1，离心15min，吸弃上清及压积红细胞(RBC)表层的灰黄层，加入PBS，重新混悬底层RBC，如上重复洗涤3～5次，取压积RBC加入等体积0.25g·L^-1胰蛋白酶，混匀，37℃水浴搅拌1h，1000r·min^-1，离心15min，取上清，电磁搅拌下，逐滴加入1/8体积的50％三氯乙酸，3000r·min^-1离心30min，取上清，用75g·L^-1 NaHCO₃调至中性，装透析袋，4℃透析48h，每4～8h换水一次，继之用聚乙二醇(PEG)或蔗糖浓缩至原量1/10，过G50柱后分装青霉素瓶，真空冷冻干燥，-20℃保存待测。

一种红细胞膜表面提取物的应用，其特殊之处在于：所述红细胞膜表面提取物与动物疫苗配合应用于提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力及疫苗的免疫效力。

上述红细胞膜表面提取物作为动物疫苗佐剂应用于提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力及疫苗的免疫效力。

上述红细胞膜表面提取物作为动物疫苗免疫增强剂应用于提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力及疫苗的免疫效力。

一种红细胞膜表面提取物的应用，其特殊之处在于：所述红细胞膜表面提取物应用于动物子宫局部，用于促进子宫局部Th2型细胞因子及IFN-τ(胚胎干扰素)分泌，提高子宫局部的抗感染能力，

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、本发明对机体免疫具有双向调节作用，能刺激外周血淋巴细胞增殖，提高机体对抗原的免疫应答水平，使血液中的抗体水平迅速升高，显著缩短免疫后抗体达到有效保护水平的时间。

2、本发明能抑制子宫局部的免疫排斥反应，促进Th2型细胞因子分泌，有利于动物的妊娠维持。

3、本发明完整的RBC、RBC膜碎片、游离CD58，均可提高淋巴细胞的免疫应答水平，显著提高鸡群对新城疫IV系苗的反应性，在免疫接种的同时注射CD58组于免疫后第3d，其HI抗体效价即可达到正常免疫组HI效价的峰值，并于第5d达到最高峰，而正常组于第9d左右才达到峰值，说明CD58不仅使IV系苗免疫后的HI抗体上升，且使其达到峰值的时间显著提前，另外对鸡法氏囊炎疫苗免疫也有类似的效果。

4、本发明可显著促进山羊和猪外周血淋巴细胞的活化以及IL-2的分泌。

5、本发明能优势活化子宫局部γδT细胞及Th2型淋巴细胞、促进Th2型细胞因子(IL-4)分泌。

四、附图说明：

图1为本发明中CD58的提取工艺流程图。

图2为CD58在子宫局部免疫细胞调节中的作用模式图。

图3为提取物对猪PBMChh活化的影响示意图。

图4为提取物对Et花环形成细胞的影响示意图。

图5为CD58对山羊PBMC活化的作用示意图。

图6为GCD58对山羊PBL的活化作用示意图。

图7为GCD58对CD4⁺T细胞及CD4^-淋巴细胞活化作用比较图。

图8为GCD58对不同组分细胞活化作用的比较图。

五、具体实施方式：

参见图1，本发明的制备方法为：无菌采集山羊或绵羊颈静脉血，肝素抗凝，加入适量0.05M pH7.5的PBS液，1500r·min^-1，离心15min，吸弃上清及压积红细胞(RBC)表层的灰黄层，加入PBS，重新混悬底层RBC，如上重复洗涤3～5次，取压积RBC加入等体积0.25g·L^-1胰蛋白酶，混匀，37℃水浴搅拌1h，1000r·min^-1，离心15min，取上清，电磁搅拌下，逐滴加入1/8体积的50％三氯乙酸，3000r·min^-1离心30min，取上清，用75g·L^-1NaHCO₃调至中性，装透析袋，4℃透析48h，每4～8h换水一次，继之用聚乙二醇(PEG)或蔗糖浓缩至原量1/10，过G50柱后分装青霉素瓶，真空冷冻干燥，-20℃保存待测。

红细胞膜表面提取物的应用

1.作为佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗，以提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力。

2.子宫局部应用，可促进子宫局部Th2型细胞因子及IFN-τ(胚胎干扰素)分泌，提高子宫局部的抗感染能力，降低早期胚胎死亡和流产，提高动物妊娠率。

本发明建立了CD58的提取和生物活性测定方法，证明其在机体接受免疫原的早期对机体具有明显的免疫促进作用，确定了其在鸡新城疫免疫中的作用及其应用方法和剂量。同时证明，来源于猪和绵羊的CD58具有相同的免疫活性，均能明显提高鸡新城疫发病鸡群的治愈率。

在理论上：

1.首次将红细胞免疫与妊娠期子宫局部的免疫调节相联系，提出了RBC及CD58在妊娠期子宫局部免疫调节中作用(图2)。

2.首次证明CD58对山羊外周血淋巴细胞具有活化作用，其优势活化的细胞是CD4^-淋巴细胞包括CD8⁺T细胞及γδT细胞。同时发现PHA-P与CD58两者对CD4⁺T细胞及混合淋巴细胞的刺激具有相互协同作用，而对CD4^-淋巴细胞则表现为PHA-P对CD58作用的抑制。

3.首次证明CD58对妊娠早期山羊子宫局部细胞因子具有调节作用。CD58极显著抑制IL-2产生，明显促进IL-4产生；对TGF-β₂产生具有一定促进作用，而对TGF-β₁无影响。

4.首次证明CD58与EPF具有抗原交叉性，为应用CD58进行动物超早期妊娠诊断奠定了基础。

一、CD58的制备与免疫活性检测

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂

0.05M pH7.5的PBS；无Ca⁺⁺、Mg⁺⁺平衡盐缓冲液(CMF)；RPMI 1640培养液；完全RPMI 1640培养液(CM)，MTT、SDS-DMF溶解缓冲液；瑞特氏染色液，台盼兰染色液；以上试剂的配制见附录。

0.25g·L^-1胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶(Difco，1∶250)0.50g，溶于100mL CMF中，30～37℃电磁搅拌10～15min，使全溶，过滤除菌，分装，低温保存，临用时依次作2倍和10倍稀释，即分别为2.5g·L^-1和0.25g·L^-1应用液。50％三氯乙酸：称取三氯乙酸(分析纯，上海化学试剂采供站)50g，去离子水溶解，定容于100mL容量瓶，分装，室温保存。

0.8％戊二醛：用吸管准确量取戊二醛溶液(武汉有机合成化工厂)，按其百分含量，用生理盐水稀释至0.8％，分装，室温保存。

肝素钠：称取肝素钠(上海生化试剂分装站)50mg，溶于100mL生理盐水，10磅10min灭菌，4℃保存。

淋巴细胞分离液(上海华精)：密度1.077±0.001g·L^-1。

PHA-P：Difco产品，华美公司分装，用CMF配成5g·L^-1浓度，-20℃保存。临用前用RPMI 1640培养液稀释成20mg·L^-1，0.22μm微孔滤膜过滤。

1.1.2器材

酶标仪：DG5030型，南京，华东电子集团

恒温水浴摇床：3540-1，LAB-Ling instruments Inc.

真空冷冻干燥机：Alpha-5，ehvisf.

1.1.3动物

山羊：关中奶山羊，购自杨凌区周围养殖农户，均为当年青年母羊。

绵羊：本校实验动物房提供。

猪：购自当地市场的仔猪，临床检查健康，饲养于本校实验动物房。

1.2方法

1.2.1红细胞膜提取物(erythrocytic membrane extract，EME)的制备

主要过程是无菌采集山羊或绵羊颈静脉血，肝素抗凝，加入适量0.05M pH7.5的PBS液，1500r·min^-1，离心15min，吸弃上清及压积红细胞(RBC)表层的灰黄层，加入PBS，重新混悬底层RBC，如上重复洗涤3～5次，取压积RBC加入等体积0.25g·L^-1胰蛋白酶，混匀，37℃水浴搅拌1h，1000r·min^-1，离心15min，取上清，电磁搅拌下，逐滴加入1/8体积的50％三氯乙酸，3000r·min^-1离心30min，取上清，用75g·L^-1 NaHCO₃调至中性，装透析袋，4℃透析48h，每4～8h换水一次，继之用聚乙二醇(PEG)或蔗糖浓缩至原量1/10，过G50柱后分装青霉素瓶，真空冷冻干燥，-20℃保存待测。

1.2.2玫瑰花形成抑制实验

常规无菌分离猪外周血单个核细胞(peripheral blood monnuclearcells，PBMC)，以RPMI 1640培养液调浓度至1×10⁶个·mL^-1，加入12只小试管，每管0.1mL，再依次分别加入不同浓度的提取物0.1mL，每一浓度做三个重复，另设一组加入培养液作为正常对照，混匀后于室温(20～22℃)作用30min，加入5m LCMF混悬，1000r·min^-1离心10min，吸弃上清，如此反复2次，第3次用RPMI 1640培养液洗涤，洗后使每管恢复至约0.1mL，加入1％的SRBC悬液(CMF配制)0.1mL，37℃水浴5min，取出置4℃静置过夜，加0.8％戊二醛1滴(约0.025mL)，轻轻捻转试管，使管底细胞混悬，室温作用10min后，推片，瑞特氏染色法染色镜检，计数花环形成率，按下式计算花环抑制率：

1.2.3 PBL吸收实验和CD2封闭实验

常规制备猪PBMC，以CM调浓度至1×10⁶个·mL^-1，分装FCS包被的细胞培养扁方瓶(Nunc)，每瓶8mL，37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下孵育2～4h，取出，吸取悬浮细胞，即外周血淋巴细胞(PBL)，加入CMF混匀后，1000r·min^-1离心15min，重复洗涤2次，吸弃上清，CMF调浓度至1×10⁷个·mL^-1，分装小试管，1000r·min^-1离心，弃上清，加入提取物溶液，混匀，室温作用1h，离心取上清，进行花环抑制实验。

取制备的PBL，CMF调浓度至2×10⁷个·mL^-1，45℃水浴1h，3000r·min^-1离心30min，取上清(主要含CD2)^[301]，等量加入装有0.1mL浓度分别为8.0、4.0和2.0g·L^-1RBC膜提取物的小试管中，4℃作用20min，同时设1管加入CMF作为对照，取出，各管加入PBMC悬液0.1mL，室温作用30min，其间每10min混悬1次，结束后，加入CMF混悬，1000r·min^-1离心10min，反复洗涤3次，之后使各管恢复至0.1mL，加入1％SRBC悬液，以下，按花环形成实验操作，结束后，推片染色镜检，计算花环形成率。

1.2.4 PBMC转化实验

常规制备猪PBMC，以CM调浓度至2×10⁶个·mL^-1，按每孔100μL加于96孔细胞培养板，以单独加入PHA-P作为阳性对照，CM作为阴性对照，设PHA-P+提取物，PHA-P+PBL吸收后提取物、提取物、PBL吸收后提取物等为实验组，每组设3个复孔，另设3孔不含任何细胞的CM孔作为空白对照，含PHA-P各孔中PHA-P终含量为5mg·L^-1不含PHA-P各孔加入CM，使各孔总量为200μL，于37

℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养66h，取出各孔加入MTT应用液25μL，继续孵育至72h，取出，各孔加入SDS-DMF缓冲液100μL，37℃孵育过夜，于570nm下以空白对照孔调“0”值，按下式计算刺激指数(SI)；

2结果与分析

2.1 RBC膜提取物(EME)的花环抑制率，见表1。

           表1    RBC膜提取物的花环抑制率(％)

RBC来源       N    8g·L^-1      4g·L^-1       2g·L^-1

绵羊(SEME)    4    80.58±4.6    53.74±5.2    38.57±5.6

山羊(GEME)    6    68.60±3.7    36.43±2.8    32.46±6.2

从表1可见，两种来源的RBC膜提取物均具有显著的抑制Et花环形成的活性，绵羊来源较山羊来源的抑制活性高。这种抑制作用随剂量的增加而增强。显著性检验表明，绵羊与山羊来源的提取物间存在显著差异(P＜0.05)。

2.2 PBL吸收对提取物Et花环抑制活性的影响(表2)

         表2  经提取物PBL吸收后的花环抑制率(％)

提取物来源    N    8g·L^-1       4g·L^-1      2g·L^-1

绵羊          4    11.4±2.6      2.1±0.7      1.8±1.1

山羊          6    4.71±2.4      1.3±0.9      1.1±0.9

由表2可看出，提取物经PBL吸收后，其对Et花环的影响显著减弱。分析表明4g·L^-1与2g·L^-1组与对照组的花环形成率无明显差异(P＞0.10)。8g·L^-1组存在抑制活性可能与吸收不完全有关。

2.3 CD2对提取物Et花环抑制活性的封闭作用(表3)

       表3  提取物经CD2封闭后的花环形成率(％)

提取物来源   n      8g·L^-1      4g·L^-1      2g·L^-1     对照

绵羊         8      38.16±               40.39±6.41   42.35±             42.31±

山羊         8      38.69±               40.87±4.29   41.83±             3.62

从表3可见，CD2提取液可中和RBC膜提取物对Et花环形成的抑制活性，8.0g·L^-1组仍存在抑制活性，可能与中和不完全有关。

2.4 提取物对猪PBMC活化的影响(图3)

实验所制备的提取物均对猪的PBMC具有刺激活化作用(P＜0.01)，同时表现出对PHA-P的协同刺激效应(P＜0.01或P＜0.05)，而提取物经PBL吸收后，上述促进作用和协同效应均消失。表明提取物中存在的活化成分能直接与PBL结合而被去除。

绵羊源和山羊源提取物的上述作用在程度上存在差异，提示二者在局部结构或与PBL亲和力等方面的差异，也可能与有效成分的含量相关。

3  讨论

SRBC在一定条件下可与多种动物的T淋巴细胞结合，形成玫瑰花环。两者结合形成花环的基础是存在于T细胞表面的红细胞受体SER(又称CD2)与存在于SRBC表面的配体LFA-3(又称CD58)之间的结合。自RBC表面提取的CD58或存在于体液中的天然游离CD58同样具有与T细胞表面CD2结合的活性。可依剂量依赖的方式抑制Et玫瑰花环的形成。由于不同动物RBC表面CD58的活性存在交叉性，该实验已被应用于CD58活性的鉴定。

猪RBC表面提取物浓度在10g·L^-1时对猪PBMC Et花环形成的抑制率为47.4±12.8。对其提取方法经过进一步改良后，制备的猪RBC提取物在相同浓度下，对Et花环抑制率达到70％以上^[278]。本实验自绵羊和山羊制备的提取物在8g·L^-1时，对Et花环的抑制率分别达到80.58％和68.6％。表明所制备的提取物具有较高的花环抑制活性。

CD2与CD58的特异结合是Et玫瑰花环形成的分子基础。游离CD58可与T细胞表面CD2结合，从而阻断SRBC与T细胞的结合而抑制花环形成。所制备的提取物中具有花环抑制活性成分能被PBL吸收，并被CD2提取液封闭，表明本实验所制备的提取物中具花环抑制活性的成分为CD58，且具有较高的生物活性。

研究表明，人、绵羊、猪RBC表面CD58及其游离CD58均可通过CD2途径激活淋巴细胞。本实验证明，山羊RBC源提取物也具有类似的活性，吸收实验进一步表明，其活性成分可与PBL直接结合并经此将其去除。有实验认为，RBC对淋巴细胞的促进作用可能涉及CD59等粘附分子，但CD59单独作用并不能引起淋巴细胞的活化，只是通过促进T细胞与靶细胞或抗原呈递细胞间的粘附而发挥协同刺激效应。从本实验结果分析，提取物中的活性成分为CD58。

4  小结

实验所制备的提取物具有较高的Et花环抑制活性和促淋巴细胞活化的活性，其活性成分为CD58。

二、CD58对鸡新免疫的促进作用

CD58，又称淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3)，是广泛分布于体内多种细胞及血小板表面的一种糖蛋白。体外试验证明，它可通过与淋巴细胞表面的CD2结合，引起淋巴细胞的增殖，并提高外周血中单核细胞(PBMC)在植物血凝素(PHA)诱导下白细胞介素-2(IL-2)的产量。同时，有人证明存在于绵羊红细胞(SRBC)上的CD58，可引起体外培养的B细胞对特异性抗原的免疫反应性增强。但是，外源性CD58注入机体后，能否提高机体对特异性抗原的免疫应答水平，进而增强机体抵御病原微生物的能力，至今未见报道。本研究以鸡为模型，研究CD58对接种新城疫IV系疫苗后鸡群免疫应答水平的影响，为进一步阐明CD58在免疫调控中的作用及其临床应用提供试验依据。

1 材料与方法

试验雏鸡

购自陕西省农业学校孵化室的罗曼雏鸡，出壳后即移入消毒房舍内，隔离饲养至22日龄时随机抽样，测定抗鸡新城疫母源抗体效价，HI抗体效价＜2¹

疫苗和抗原

新城疫(ND)IV疫苗  陕西维康生物发展有限公司出品，批号9811；法氏囊病(IBD)中等毒力疫苗，南京药械厂出品，批号98-2；ND抗原、IBD抗原，西北农林科技大学畜牧微生物实验室提供，ND、IBD阳性血清由农业部家畜生殖内分泌与胚胎工程开放性重点实验室提供。

CD58的提取及活性鉴定

无菌采集绵羊(西北农业大学实验动物房提供)静脉血，肝素抗凝，1000r/min离心5min，弃去上层液，以Hank’s液洗涤3次，加入等体积0.25％的胰酶应用液，置37℃缓慢搅拌1h，1000r/min离心10min；取上清，边振荡边加入适量三氯乙酸，再离心，上清以7.5％的NaHCO₃调pH至7.0～7.2，装透析袋，4℃透析48h，浓缩后以Et花环抑制试验鉴定活性，分装，低温保存，应用中以抑制率50％作为一个活性单位。

CD58对鸡HI抗体效价的影响

将试验鸡随机分成7组，每组10只，分别标记为A_1～5，B和E组。对A_1～5和B组胸肌接种鸡新城疫IV疫苗(1羽份/只)，A_1～5组在接种的同时，分别胸肌注射CD58 2.0，1.5，1.0，0.5和0.25个活性单位；B组注射等量生理盐水，E组只注射生理盐水，不作IV系苗免疫作为空白对照。注射后分别于第1，3，5，9和14d采血，以B微量法测定其HI抗体效价，对结果进行统计分析。

CD58对IBD免疫的影响

另取22日龄鸡60只随机平均地分为C组、D组及对照组，按疫苗说明书中的用量，三组鸡均以滴口方式进行IBD疫苗免疫，同时C组鸡每只肌注绵羊源CD58 1.0单位。D组鸡CD58用量减半，以灭菌盐水补足肌注量0.25mL。对照组每只鸡肌注0.5mL灭菌盐水。

CD58对Et花环形成细胞的影响

在测定HI抗体效价的同时，以常规方法测定Et花环形成率。

2.结果与分析

2.1 CD58对鸡HI抗体效价的影响

每组在测定后，取其平均值，结果见表4：

      表4  不同剂量CD58对鸡HI抗体效价的影响

            不同时间的HI抗体效价(log2)

组别                                        Ti       Xi

        1d     3d     5d     9d     14d

A1      0      5.2    7.2    6.1    5.9    313.1

A2      0.8    6.3    8.5    7.2    7.0    717.6    143.5

A3      0      5.2    7.3    6.3    6.2    345.2    69.0

A4      1      4.2    6.3    5.4    5.2    178.2    35.6

A5      1      3.4    6      5      5      140.6    28.1

 B      0.8    1      2.4    5.4    5.4    93.5     18.7

从表4可见，A_1～5各组与B组相比，均可使HI抗体效价升高，经t检验分析，A₂组与B组差异极显著(P＜0.01)，说明CD58能显著提高鸡群对新城疫IV系苗的反应性，即CD58能显著增强机体对特异抗原的免疫反应性，这与Gabriel等(1988)的体外试验结果一致。

比较A_1～5各组可看出，HI抗体效价的变化与CD58呈现一定的剂量依赖性，剂量过高可消减其免疫增强作用。

将A₂组与B组的HI效价变化进行比较可见，在免疫接种的同时注射CD58，于前5d内可使其HI抗体效价迅速上升，而正常免疫组(B组)在这一阶段HI抗体上升较缓慢；另外，CD58注射组于免疫后第3d，其HI抗体效价即可达到正常免疫组HI效价的峰值，并于第5d达到最高峰，而正常组于第9d左右才达到峰值，说明CD58不仅使IV系苗免疫后的HI抗体上升，且使其达到峰值的时间显著提前。

2.2绵羊源CD58协同IBD中等毒力疫苗免疫鸡后的抗体变化

免疫前鸡IBD-AGP抗体测定表明，除极个别鸡原血清抗体阳性外，绝大部分均表现为阴性。免疫后，试验组鸡抗体出现早，且效价明显高于对照组(P＜0.01，或P＜0.05＝。结果见表5。

             表5 CD58对鸡群IBD免疫的影响(X±s)

组别                    AGP抗体效价

        4d             7d             10d         15d

C    2.5±0.55^**   3.6±1.2^*     5.0±1^**    5.1±1.3^*

D    2.1±0.85^**   3.4±0.78^**   4.6±1.1^*   4.9±1.1^*

E    0.85±0.42     2.1±1.69      3.6±0.54    4.0±1.25

*与对照组相比差异显著(P＜0.05)，**与对照组相比差异极显著(P＜0.01).

对Et花环形成细胞的影响

整个试验期间，E组的花环形成率保持平稳，其平均值为18.87％±0.61％，应用CD58组(A₂组)的Et花环形成率高于B组，且变化趋势一致，经分析表明A₂组与B组差异不显著P＞0.05)。如图4。

讨论

体外试验证明，无论存在于完整的红细胞(RBC)膜表面或RBC膜碎片中的CD58，还是游离的CD58，均可通过与淋巴细胞膜上的CD3分子结合而提高淋巴细胞的免疫应答水平。肖俊杰等(1992)认为，体内的CD58与T细胞膜的CD2结合，可协助抗原刺激下的T细胞的活化作用，上述结论仅局限于体外试验或针对体外试验的假说。本试验以鸡为模型，证实了CD58在体内对特异免疫的增强作用，为上述假说提供了有力的佐证。

本试验中应用的CD58来自SRBC，证明CD58分子Et花环形成串变化曲线的作用位点不具有种间差异性，这与作者所做的体外试验结果一致，因而CD58作为一种免疫佐剂，具有广谱和来源广泛的优点，为其应用研究提供了试验依据。

一般认为，新城疫HI抗体效价≥2⁴时鸡群即具有可靠的保护作用，应用CD58与IV系苗同期免疫注射，第3d鸡群HI抗体效价即超过此值，比正常免疫鸡群达到此值的时间(第5d)显著提前，且能使该苗的HI效价显著提高。目前在新城疫的紫急预防中多采用I系苗，由于I系苗属弱强毒苗，常引起鸡群死亡或生产能力下降。本试验证明CD58配合应用IV系弱毒苗，可起到同样的免疫效果。因而CD58在鸡群首免及紧急预防接种中作为佐剂具有实际意义。

三、CD58对山羊PBL的活化作用

CD58对外周血淋巴细胞(PBL)的促增殖作用，在人^[1]猪^[2]等已得到证明，在羊则未见报道。与人、猪不同，山羊外周血中的T淋巴细胞中约60％为γσTCR⁺T细胞^[3]，对其进行研究不但对于揭示山羊RBC及体液中游离CD58在机体免疫反应及免疫调节中的作用，且对于研究γσT细胞的活化机制均具有重要意义。

1  材料方法

1.1 材料

动物：关中奶山羊，购自杨凌区养殖农户，主要为当年青年母羊。临床检查健康，饲养于西北农林科技大学实验动物房。

主要试剂：CD58为绵羊和山羊RBC膜提取物的冻干品，-20℃保存。文中分别简称为SCD58和GCD58；Percoll：(瑞典Pharamacia密度1.13g·mL^-1)按下式计算^[4]，用Hank’s液稀释，配制浓度为1.04～1.05g·mL^-1的Percoll分离液，再用密度瓶精确调整后，过滤除菌，4℃保存。

密度(g·mL^-1)＝(％·Hank’s液×0.001151)+1.0096

1.2  细胞悬液的制备

1.2.1  山羊PBMC和PBL悬液  常规密度梯度离心法分离PBMC，台盼兰染色计数，调整活细胞浓度至1×10⁶个·mL^-1。制备的PBMC悬液经粘附法和Percoll等密度梯度离心去除单核细胞，所得即PBL，以CM调整活细胞浓度至1×10⁶个·mL^-1，留取部分用于细胞活化实验，其余用于下一步分离。

1.2.2  CD4⁺T细胞及CD4^-淋巴细胞悬液  参照文献^[4]及试剂说明，应用免疫磁珠法(MACs)，以CD20单抗包被的磁珠悬液，阴性选择去除PBL中的B细胞，再以CD4单抗包被的磁珠悬液进行淋巴细胞再次分离，获取CD4^-淋巴细胞和CD4⁺T淋巴细胞，分别洗涤后调整活细胞浓度至1×10⁶个·mL^-1，所得细胞活率均≥95％。

淋巴细胞活化实验

将制备的细胞悬液加于96孔细胞培养板，每孔100μL，分别设A1：PHA-P+SCD58，A2：SCD58，A3：PHA-P+GCD58，A4：GCD58 4组作为实验组，以PHA-P组作为对照，另设细胞对照和培养液对照组，实验组依CD58浓度(B)作4个稀释梯度各加50μL，每一梯度浓度作3个复孔，含PHA-P组加0.02g·L^-1PHA-P 50μL使终含量为0.05mg·L^-1。其余孔以完全培养液补足200μL。于37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养66h，取出，各孔加MTT应用液25μL，振荡混匀，继续孵育至72h，各孔加入SDS-DMF溶解缓冲液100μL，37℃过夜，于570nm以培养液对照孔调“O”，测定OD值，计算刺激指数(SI)。

2、结果与分析

2.1 CD58对山羊PBMC活化的作用

丝裂原PHA-P可显著刺激山羊PBMC活化，其SI值极显著地高于PBMC+CM组(P＜0.01)。该体系中加入SCD58或GCD58均可引起SI值的提高，且其作用与相应提取物的剂量有关，在一定范围内，随剂量的增加活化率增高，而在高剂量，则SI值下降(图5)。单独加入SCD58或GCD58也可引起PBMC的活化，且其作用规律与PHA-P+CD58一致。

分析表明，刺激因素A(PHA-P+CD58)及CD58的剂量(B)均对PBMC的活化有极显著的影响(P＜0.01)，刺激因素与CD58的剂量间交互效应极显著(P＜0.01)(表6)。CD58对PHA-P刺激的PBMC活化具有显著(P＜0.01或P＜0.05)的协同效应，SCD58的协同作用显著高于GCD58(P＜0.05)，单独加入GCD58或SCD58两者之间无显著差异(P＞0.05)。刺激剂量以1.25g·L^-1的作用最强，其引起的PBMC活化的SI极显著地高于其它剂量组(P＜0.01)。各水平组合平均数间的多重比较表明，PHA-P与1.25g·L^-1提取物共同作用刺激效应最强。

         表6  CD58对PBMC刺激的方差分析

变异原因    平方和     自由度      均方         F

A           2.0795       3        0.6932     51.105^**

B           2.2241       3        0.7414     54.66^**

A×B        2.0811       9        0.2312     17.048^**

误差        1.0851       80       0.0136

总和        7.4698       95

2.2 GCD58对山羊PBL的活化作用

GCD58对山羊PBL的刺激效应与对PBMC的刺激作用类似(图6)。但刺激因素(A)与剂量(B)间的交互作用不显著(P＞0.05)(表7)，含PHA-P组显著高于单独CD58作用组(P＜0.01)，提取物的剂量以1.25g·L^-1的作用最强(P＜0.01或P＜0.05)，其余3个剂量间差异不显著(P＞0.05)。

           表7  GCD58对PBL刺激的方差分析

变异原因     平方和      自由度     均方           F

A            0.13251       1        0.133       16.07^**

B            0.19493       3        0.065       7.878^**

A×B         0.01086       3        0.004       0.439

误差         0.3299        40       0.008

总和         0.6682        47

2.3 GCD58对CD4⁺T细胞及CD4^-淋巴细胞活化作用比较GCD58的刺激作用，在CD4⁺T细胞及CD4^-淋巴细胞两种表型细胞间存在极显著的差异(P＜0.01)。GCD58单独作用或与PHA-P共同作用对CD4^-淋巴细胞的活化效率均显著高于其对CD4⁺T淋巴细胞的活化(P＜0.01)，对于CD4^-淋巴细胞，GCD58的刺激作用极显著地高于PHA-P+GCD58的刺激(P＜0.01)，而对于CD4⁺T细胞，PHA-P+GCD58的刺激作用则高于GCD58(P＜0.05)(图7)。但单独PHA-P则对两类细胞均只表现微弱的刺激活性(分别为1.04±0.03和1.06±0.05)。上述结果表明，CD58活化的细胞主要是CD4^-淋巴细胞。

2.4 1.25g·L^-1提取物对不同组分细胞活化作用的比较(图8)

提取物剂量在1.25g·L^-1时，无论单独应用或与PHA-P共同作用，对各组分淋巴细胞的活化作用均最强。该条件下，GCD58刺激的CD4^-淋巴细胞活化率最高，其次依次为PBMC和PBL，而CD4⁺淋巴细胞活化率最低。PHA-P对CD58刺激的PBMC活化具有显著的促进作用(P＜0.01)，对其刺激的PBL活化无显著影响(P＞0.05)，在CD4^-淋巴细胞则表现为抑制。同时，去除单核细胞后的各细胞组分对PHA-P的刺激反应显著降低(P＜0.01)。

3  讨论

3.1 CD58对外周血淋巴细胞的活化作用

完整、新鲜的RBC可刺激人、小鼠和猪PBMC的活化。应用蒸馏水崩解后的RBC膜碎片、自RBC膜表面提取的CD58及体液中游离CD58均具有类似作用^[5]。本实验证明，无论自绵羊或山羊RBC表面提取的CD58均可引起山羊PBMC的活化。这种作用在一定范围内与剂量具有依赖关系，剂量过高则作用减弱，同时证明，山羊源和绵羊源CD58单独应用时，其作用间无显著差异。

单核细胞是可溶性抗原及PHA刺激的人类淋巴细胞体外反应及单向混合淋巴细胞反应(MLR)的重要因素之一^[303]。本实验表明，PHA刺激山羊外周血淋巴细胞活化具有单核细胞依赖性，而去除PBMC中的单核细胞后的PBL仍可被CD58刺激活化(P＜0.01)(图2)，表明在CD58刺激的山羊PBL活化中，单核细胞并非是必需因素。但单核细胞对CD58的刺激具有辅佐功能(图4)。

体内不同类型淋巴细胞的优势活化，决定着免疫反应的类型，因而对CD58刺激的淋巴细胞表型的分析，是进一步分析其作用机制的基础。有研究认为，CD58可优势刺激CD8⁺T淋巴细胞的增殖^[1]。本实验观察到CD58对山羊外周血中CD4^-淋巴细胞的刺激作用显著高于对CD4⁺T淋巴细胞的活化作用(P＜0.01)。表明CD58作为一种T细胞活化的刺激分子，主要刺激CD4^-淋巴细胞的活化，提示在山羊机体免疫调控中，CD58可优势刺激包括γδT细胞在内的CD4^-淋巴细胞增殖，从而发挥其免疫调节功能。

3.2 CD58对PHA-P刺激的辅佐作用

RBC在葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的淋巴细胞活化中，具有替代单核细胞的辅佐作用，但其辅佐机制与单核细胞不同，他们在同一实验中，同样观察到单独应用RBC及其膜碎片对去除单核细胞的淋巴细胞的激活作用。本实验中也得到了类似结果，证明CD58能显著提高PHA-P诱导的PBMC的增殖，提示CD58在淋巴细胞活化过程中，对PHA-P刺激具有辅佐功能。

本试验还观察到，对于CD4^-淋巴细胞，PHA-P与CD58共同作用效果极显著地低于单独应用CD58诱导的活化(P＜0.01)，即表现出PHA-P对CD58刺激的抑制作用。对CD2分子的研究证明，CD2分子的不同表位在引发细胞活化机制中有着不同的功能，在促细胞活化机制的触发中需有2个或多个位点参与^[1]。Lin.J^[6]等进一步证明，抗CD2单抗对人外周血T细胞表面CD2和CD3的表达有重要调节作用，同时伴有其它一系列受体的变化。推测PHA-P与CD58共同作用引起的活化抑制，可能在于两者活化淋巴细胞的机制不同，两种刺激因子作用于CD4^-T细胞后，分别引起其表面抗原分子表达或构象的改变，使相应的活化受体亲和力降低或隐藏，或使抑制受体表露或上述两者同时出现而造成细胞活化的抑制。但在CD4⁺T细胞及混合淋巴细胞(PBL及PBMC)其作用则相反，提示T淋巴细胞接受刺激后，表面受体的变化及活化可能同时受其它细胞作用的调节，这种调节作用在不同表型细胞间存在某种差异。

Claims (5)

1、一种红细胞膜表面提取物的提取方法，其特征在于包括以下操作步骤：无菌采集山羊或绵羊颈静脉血，肝素抗凝，加入适量0.05M pH7.5的PBS液，1500r·min^-1，离心15min，吸弃上清及压积红细胞(RBC)表层的灰黄层，加入PBS，重新混悬底层RBC，如上重复洗涤3～5次，取压积RBC加入等体积0.25g·L^-1胰蛋白酶，混匀，37℃水浴搅拌1h，1000r·min^-1，离心15min，取上清，电磁搅拌下，逐滴加入1/8体积的50％三氯乙酸，3000r·min^-1离心30min，取上清，  用75g·L^-1 NaHCO₃调至中性，装透析袋，4℃透析48h，每4～8h换水一次，继之用聚乙二醇(PEG)或蔗糖浓缩至原量1/10，过G50柱后分装青霉素瓶，真空冷冻干燥，-20℃保存待测。

2、一种红细胞膜表面提取物的应用，其特征在于：所述红细胞膜表面提取物与动物疫苗配合应用于提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力及疫苗的免疫效力。

3、根据权利要求2所述的一种红细胞膜表面提取物的应用，其特征在于：所述红细胞膜表面提取物作为动物疫苗佐剂应用于提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力及疫苗的免疫效力。

4、根据权利要求2所述的一种红细胞膜表面提取物的应用，其特征在于：所述红细胞膜表面提取物作为动物疫苗免疫增强剂应用于提高动物抗病能力和对特异抗原的免疫应答能力及疫苗的免疫效力。

5、一种红细胞膜表面提取物的应用，其特征在于：所述红细胞膜表面提取物应用于动物子宫局部，用于促进子宫局部Th2型细胞因子及IFN-τ(胚胎干扰素)分泌，提高子宫局部的抗感染能力。

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