CN106754692A - 一种红细胞膜及其制备方法和应用 - Google Patents

一种红细胞膜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种红细胞膜及其制备方法和应用。本发明通过反复冻融法，并进一步结合匀浆破碎法和滤膜过滤，可以制备得到一种粒径均匀分布并且具有良好的抗原性、特别是具有良好的稀有血型系统抗原性的红细胞膜，解决了现有技术中红细胞膜通常只具有ABO血型抗原而不具备稀有血型抗原性的问题，同时还解决了现有红细胞膜粒径分布不均匀的问题，提供了一种粒径分布均匀并且具有全血型系统抗原性的红细胞膜，可以用于意外抗体的筛查和鉴定，保证了输血安全。

Description

一种红细胞膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医学与生物学技术领域，涉及红细胞膜的制备，具体地涉及一种红细胞膜及其制备方法和应用。
背景技术
细胞膜的主要成分为蛋白质(约49％重量比)、脂类(约44％重量比，主要有磷脂、胆固醇、糖脂等)和糖类，具有重要的生物学功能，与物质代谢、能量转换、细胞识别、细胞免疫、肿瘤发生等均高度相关，在分子生物学、细胞生物学、免疫学以及临床医学检测等领域均有广泛的研究以及应用价值。对于人体而言，红细胞的数量大、取材容易，并且人体成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，在因细胞内外渗透压不平衡而导致细胞膨胀破裂、胞浆外漏(即医学上所称的溶血现象)时，遗留的红细胞膜中无细胞器膜等杂质干扰，因此红细胞膜是最适于作为研究细胞膜的材料。现已证明，红细胞膜具有血型抗原活性，可与相应血型抗体反应，从而在红细胞血型鉴定中发挥重要作用，这也是目前对于红细胞膜研究的最重要应用；Siegel在1981年提出“红细胞免疫系统”的概念之后，现已公认红细胞膜蛋白亦具有免疫调节功能，在体内可发挥红细胞免疫功能，结合循环免疫复合物，并可调节T淋巴细胞及B淋巴细胞的功能；CN 101327317 B发现同物种的红细胞膜蛋白在具有相应血型抗体的人体内具有很好的杀瘤效应，并公开了一种由人红细胞膜蛋白和缓冲液组成的治疗肿瘤的注射液，等等。不难看出，前述相关领域的研究，均须建立在获得具有抗原性的红细胞膜的基础上进行。
现有技术中红细胞膜的制备主要是通过低渗溶解红细胞，高速离心洗涤去除血红蛋白后用等渗的盐水或PBS重悬。CN101109755A公开一种红细胞膜处理的方法，包括加预冷的0.01mol/L Tric-HCl与红细胞混合，4℃放置2h，再离心20min至无肉眼可见的红细胞为止。肖毅等(两种提取红细胞膜蛋白方法的比较，细胞与分子免疫学杂志，1997(2)：44-45)比较了两种提取红细胞膜蛋白的方法，其中一种是沉淀物加入预冷蒸馏水，离心后，因沉淀物中仍有少量红细胞，加入0.01N冰醋酸，置4℃2h后离心，沉淀物加NS混匀后，再加0.1NNaOH，室温30min，离心弃上清后加NS，用0.1N HCl(约0.1ml)调pH至7.4。现有提取红细胞膜的方法通常采用有机溶剂，容易破坏细胞膜表面结构，极易丧失抗原性，特别是丧失稀有血型系统(ABO血型系统以外的其他血型系统)的抗原性，这将导致无法进行不规则抗体(意外抗体)的筛查，极大地增加了输血风险；同时现有方法提取的红细胞膜通常存在粒径分布不均匀的问题。
为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种粒径分布均匀并且具有良好抗原性(特别是稀有血型系统抗原性)的红细胞膜，以及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种红细胞膜，该红细胞膜表面具有稀有血型抗原性，解决了现有红细胞膜通常仅具有ABO血型抗原性而不具备稀有血型抗原性的问题。
本发明的另一个目的在于提供一种粒径分布均匀的红细胞膜。
本发明的同时提供所述红细胞膜的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述红细胞膜在血型抗体检测和鉴定技术领域的应用，其可以用于意外抗体的筛查和鉴定。
本发明的一方面提供了一种红细胞膜，其具有良好的稀有血型抗原性，且粒径分布均匀。
本发明所述的一种红细胞膜，由如下方法制备而成：(1)取压积红细胞，加入生理盐水于－20℃-－200℃冰冻，再于20℃-40℃融化；(2)离心，去上清，洗涤，得到的白色的沉淀物。
优选的，所述的步骤(1)中所述压积红细胞与生理盐水加入量按体积比优选为2:1-1:10，更优选为1:1-1:5，最优选为1:1。所述冰冻的温度越低越好，以达到快速冻实的目的，在具体实施例中优选为－20℃-－200℃，更优选为－40℃-－196℃，最优选为－80℃-－196℃。所述融化的温度优选为25℃-37℃，最优选为37℃；所述融化优选在水浴箱中进行。
优选的，所述的步骤(1)重复2-10次，更优选为3-8次，最优选为3次。
优选的，所述的步骤(2)之后还包括步骤(3)将沉淀物进行匀浆破碎，匀浆时间为5-80min。匀浆时间更优选为10-40min，最优选为20min。
优选的，所述的步骤(2)中离心的离心力优选为5000-20000g，更优选为10000-18000g，最优选为15000g；离心时间优选为10-30min，更优选为15-25min，最优选为20min。所述的洗涤次数优选为2-10次，更优选为3-8次，最优选为5次。
进一步优选的，所述的步骤(3)之后还包括步骤(4)采用均一孔径的滤膜进行过滤。所述滤膜的孔径优选为1-20μm，更优选为2.5-10μm，最优选为5μm。
本发明的另一方面提供了一种红细胞膜的制备方法，具体方法如前所述。
在本发明的优选实施方式中，提供一种红细胞膜的制备方法，包括：(1)取压积红细胞，加入等量的生理盐水后于－20℃-－200℃冰冻，冻实取出于20℃-40℃融化；如此反复2-10次后5000-20000g离心10-30min，去上清，加入纯水洗涤2-10次，得到白色沉淀物；(2)利用匀浆器对提取的红细胞膜进行匀浆破碎5-80min；(3)用滤膜进行过滤，得到粒径均匀分布的红细胞膜。
在本发明的具体实施方式中，对于制备得到的红细胞膜还进行蛋白浓度测定以及抗原性验证。
所述蛋白浓度测定的方法包括但不限于紫外分光光度法、Lowry(酚试剂)法，考马氏亮蓝染色法、BCA(Bicinchoninic acid)法，胶体金法等，优选为BCA法和胶体金法，最优选为BCA法。
所述抗原性验证的方法优选采用凝集抑制试验。用现有方法提取的红细胞膜通常仅能够保留ABO血型系统的抗原性，而本发明不仅能够验证ABO血型系统的抗原性，还可以验证稀有血型系统的抗原性。所述的稀有血型系统包括但不限于Rh血型系统、MNS血型系统、P血型系统、Kell血型系统、Kidd血型系统、Lewis血型系统、Duffy血型系统等。所述抗原性验证的方法包括：首先检测已知稀有血清的抗体效价，然后取等量校正浓度的抗体分别加入等体积的红细胞膜和生理盐水，室温放置后离心，取上清，加卡，观察凝集强度。
所述校正浓度的抗体的体积优选为10-100ul，更优选为20-80ul，最优选为50ul。所述红细胞膜和生理盐水的体积优选为10-100ul，更优选为20-80ul，最优选为50ul。所述室温放置的时间优选为3-30min，更优选为5-20min，最优选为10min。所述离心的离心力优选为500-3000g，更优选为800-2000g，最优选为1000g；离心时间优选为20-300s，更优选为30-120s，最优选为60s。
本发明的又一个方面提供了上述红细胞膜在血型抗体检测和鉴定技术领域的应用。优选的，所述的血型抗体选自Rh血型系统、MNS血型系统、P血型系统、Kell血型系统、Kidd血型系统、Lewis血型系统、Duffy血型系统。
优选的，所述红细胞膜可以用于意外抗体的筛查和鉴定。
本发明所述的红细胞膜是指红细胞处理后的红细胞膜样品或红细胞膜提取物，其保留了对于血型抗体的抗原性。
本发明通过反复冻融法，并进一步结合匀浆破碎法和滤膜过滤，可以制备得到一种粒径均匀分布并且具有良好的抗原性、特别是具有良好的稀有血型系统抗原性的红细胞膜，解决了现有技术中红细胞膜粒径分布不均匀以及通常只保留ABO血型抗原的问题，提供了一种粒径分布均匀并且具有全血型系统抗原性的红细胞膜，可以用于意外抗体(不规则抗体)的筛查和鉴定，保证了输血安全。
附图说明
图1实施例7中不同匀浆时间获得的红细胞膜在显微镜下观察到的形态比较
图2实施例7中不同匀浆时间获得的红细胞膜的粒径面积分布比较
图3实施例8不同匀浆时间获得的红细胞膜的抗原性验证
图4实施例8不同匀浆时间获得的红细胞膜的凝集强度评分
具体实施方式
实施例1制备红细胞膜
(1)取压积红细胞，加入等体积的生理盐水，在－196℃的液氮中快速冻实，再在37℃水浴融化；
(2)重复“冻实-融化”的操作8次；
(3)以15000g离心20min，去上清，得到的白色的沉淀物即为红细胞膜。
实施例2制备红细胞膜
(1)取压积红细胞，加入等体积的生理盐水，在－40℃的温度下冻实，再在37℃水浴融化；
(2)重复“冻实-融化”的操作3次；
(3)以15000g离心20min，去上清；
(4)纯水洗涤5次，得到的白色的沉淀物即为红细胞膜；
(5)匀浆破碎20min；
(6)显微镜下观察形态及粒径大小；
(7)用孔径为5μm的滤膜过滤；
(8)用BCA试剂盒测定步骤(7)过滤后的红细胞膜浓度。
实施例3制备红细胞膜
(1)取压积红细胞，加入其一半体积比的生理盐水，在－80℃的温度下冻实，再在室温20℃下融化；
(2)重复“冻实-融化”的操作5次。
(3)以5000g离心30min，去上清；
(4)纯水洗涤10次，得到的白色的沉淀物即为红细胞膜；
(5)匀浆破碎40min；
(6)显微镜下观察形态及粒径大小后用滤膜过滤；
(7)用BCA试剂盒测定浓度。
实施例4制备红细胞膜
(1)取压积红细胞，加入其5倍体积的生理盐水，在－60℃的温度下冻实，再水浴30℃融化；
(2)重复“冻实-融化”的操作2次；
(3)以20000g离心10min，去上清；
(4)纯水洗涤8次，得到的白色的沉淀物即为红细胞膜；
(5)匀浆破碎5min；
(6)显微镜下观察形态及粒径大小后用滤膜过滤。
实施例5制备红细胞膜
(1)取压积红细胞，加入其3倍体积的生理盐水，在－30℃的温度下冻实，再在35℃的温度下融化；
(2)重复“冻实-融化”的操作6次；
(3)以18000g离心15min，去上清；
(4)纯水洗涤2次，得到的白色的沉淀物即为红细胞膜；
(5)匀浆破碎10min；
(6)显微镜下观察形态及粒径大小后用滤膜过滤。
实施例6制备红细胞膜
(1)取压积红细胞，加入其4倍体积的生理盐水，在－20℃的温度下冻实，再在25℃的温度下融化；
(2)重复“冻实-融化”的操作10次；
(3)以10000g离心25min，去上清；
(4)纯水洗涤3次，得到的白色的沉淀物即为红细胞膜；
(5)匀浆破碎80min；
(6)显微镜下观察形态及粒径大小后用滤膜过滤。
实施例7不同匀浆时间下红细胞膜形态观察
按照与实施例2相同的操作步骤，只调整步骤(5)中匀浆破碎的时间，分别为0min、2.5min、5min、10min、20min、40min、80min，获得7个红细胞膜样品。
显微镜下观察不同样品的形态及粒径大小，结果如图1所示，可见匀浆20min时样品粒径分布最均匀。
测量不同样品中红细胞膜的粒径，并以粒径面积大小为横坐标，以相应面积对应的颗粒数量为纵坐标作图，结果如图2所示，可见匀浆20min时样品粒径分布最均匀。
实施例8红细胞膜样品抗原性验证
采用凝集抑制试验对实施例7获得的7个红细胞膜样品进行抗原性验证：
将D抗体(针对Rh血型系统的D抗原)分别稀释2倍、20倍、200倍作为不同校正浓度；取2管50ul校正浓度的已知稀有血清抗体，分别加入50ul红细胞膜和50ul生理盐水，室温放置10min，1000g离心60s；取上清25ul和相应标准试剂红细胞50ul加入到抗人球蛋白卡中，观察凝集强度。结果如图3所示，其中M代表红细胞膜样品，S代表生理盐水，可见7个样品的抗原性均为阳性，且在20倍校正浓度时可发现7个样品抗原性的差异。
进一步地，对7个样品的凝集抑制试验的凝集强度进行评分。结果如图4所示，可见7个样品的抗原性均为阳性；同时，当匀浆时间在20min以下时，获得的红细胞膜样品的凝集强度评分随匀浆时间的延长从3+过渡到2+，即抗原性逐渐增强；当匀浆时间在20min以上时，随匀浆时间的延长凝集强度评分不再发生变化，是相同的2+，可以进一步判断在本发明提供的方法中，匀浆20min是一个最佳的时间。
实施例9红细胞膜样品抗原性验证
采用凝集抑制试验对实施例7获得的7个红细胞膜样品进行抗原性验证：
将S抗体(针对MNS血型系统的S抗原)分别稀释2倍、20倍、200倍作为不同校正浓度；取2管50ul校正浓度的已知稀有血清抗体，分别加入50ul红细胞膜和50ul生理盐水，室温放置10min，1000g离心60s；取上清25ul和相应标准试剂红细胞50ul加入到抗人球蛋白卡中，观察凝集强度。结果显示7个样品的抗原性均为阳性，且在20倍校正浓度时可发现7个样品抗原性的差异。
进一步地，对7个样品的凝集抑制试验的凝集强度进行评分。结果显示7个样品的抗原性均为阳性；当匀浆时间在20min以下时，获得的红细胞膜样品的凝集强度评分随匀浆时间的延长从3+过渡到2+，即抗原性逐渐增强；当匀浆时间在20min以上时，随匀浆时间的延长凝集强度评分不再发生变化，是相同的2+，可以进一步判断在本发明提供的方法中，匀浆20min是一个最佳的时间。
实施例10对比试验：
一、首先按照如下步骤提取红细胞膜：
(1)取压积红细胞，加入其10倍体积的浓度为5％的十二烷基磺酸钠溶液作为细胞裂解液，放置后以3000rpm的转速离心5min，去上清；
(2)向离心后的沉淀物中加纯水并震荡混匀，再次以3000rpm的转速离心5min，去上清；
(3)重复前一步骤5次，得到红细胞膜；
(4)用手持匀浆器匀浆破碎20min；
(5)显微镜下观察形态及粒径大小后用滤膜过滤，得到红细胞膜样品。
二、按照与实施例8相同的方法，用凝集抑制试验验证红细胞膜样品的抗原性，结果表明，用本实施例方法提取得到的红细胞膜不具有Rh血型系统稀有血型系统抗原性。
三、按照与实施例9相同的方法，用凝集抑制试验验证红细胞膜样品的抗原性，结果表明，用本实施例方法提取得到的红细胞膜不具有MNS血型系统稀有血型系统抗原性。
本说明书上文中结合具体实施例对本发明进行了阐释，但应理解，这些描述和阐释只是为了更好地理解本发明，而不构成对本发明的任何限定。本领域技术人员在阅读了本申请说明书之后可对本发明的具体实施方式进行必要的改动而不脱离本发明的精神和范围。本发明的保护范围由所附的权利要求书限定，并且涵盖了权利要求的等同变换。

Claims (10)

1.一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取压积红细胞，加入生理盐水于－20℃-－200℃冰冻，再于20℃-40℃融化；
(2)离心，去上清，洗涤，得到沉淀物。
2.权利要求1所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述压积红细胞与生理盐水加入量按体积比优选为2:1-1:10。
3.权利要求1所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述冰冻的温度为－40℃-－196℃；所述融化的温度为25℃-37℃。
4.权利要求1所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中－20℃-－200℃冰冻，再于20℃-40℃融化的过程重复2-10次。
5.权利要求1所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中所述离心力为5000-20000g；离心时间为10-30min。
6.权利要求1所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)之后还包括步骤(3)将沉淀物进行匀浆破碎，所述的匀浆破碎的时间为5-80min。
7.权利要求6所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述的匀浆破碎的时间为10-40min。
8.权利要求7所述的一种红细胞膜的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)之后还包括步骤(4)采用滤膜进行过滤，所述滤膜的孔径为1-20μm。
9.权利要求1-8任一项所述的一种红细胞膜的制备方法制备得到的红细胞膜。
10.权利要求9所述的红细胞膜用于意外抗体的筛查和鉴定。
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