CN109330999A - 二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种医学领域，特别涉及二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用。本发明采用的技术方案是：二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用，其特征在于：包括以下步骤，（1）模型建立，使小鼠具有自身免疫性肝炎（2）治疗，把步骤一后的具有自身免疫性肝炎小鼠给药，给药方式为灌胃给予溶于生理盐水中的二甲双胍药液，所述二甲双胍在生理盐水中的终浓度为6‑10mg/ml，小鼠的给药剂量为每天每只小鼠给二甲双胍150‑250mg/kg.d。通过采用上述方案，本发明主要实现了二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中具有非常明确的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种医学领域，特别涉及二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用。
背景技术
自身免疫性肝炎：自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）是一种由自身免疫反应介导的针对肝细胞抗原的慢性肝炎，临床上以不同程度血清转氨酶升高、多种自身抗体阳性、高丙种球蛋白血症及界面性肝炎为特征。AIH 发病机制尚未完全明确，学者们提出了多种假说，如环境因素触发遗传易感个体肝脏自身抗原免疫应答、免疫调节受损、肠道菌群紊乱及肠道通透性增加等。近年研究发现肠道炎症、肠道菌群紊乱、Treg/Th17 细胞的平衡破坏可能是诱发和促进AIH 的主要机制之一。
二甲双胍：二甲双胍（Metformin,Met）是用于治疗2 型糖尿病的一线药物。近年来，动物实验和体外研究发现,二甲双胍对恶性肿瘤、类风湿性关节炎、炎症性肠病等自身免疫性疾病有治疗作用。二甲双胍不仅抑制Th17 细胞分化及其相关因子分泌,还能够上调Treg 及其分泌的细胞因子，通过调节体内Treg/Th17 细胞的平衡参与自身免疫性疾病的发生发展。最近研究表明二甲双胍在基因水平上有一定的抗炎、抗纤维化作用、抵抗细胞增殖、调节细胞凋亡等作用。此外，二甲双胍被证明可以调控肠道菌群。但二甲双胍是否能改善自身免疫性肝炎尚未得到研究。
发明内容
本发明主要是实现了二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中具有非常明确的疗效。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用，其特征在于：包括以下步骤，
（1）模型建立，使小鼠具有自身免疫性肝炎；
（2）治疗，把步骤一后的具有自身免疫性肝炎小鼠给药，给药方式为灌胃给予溶于生理盐水中的二甲双胍药液，所述二甲双胍在生理盐水中的终浓度为6—10mg/ml，小鼠的给药剂量为每天每只小鼠给二甲双胍150-250mg/kg.d。
本发明的进一步技术方案是：所述模型建立：造模的第1天和第7天，分别取小鼠给予10%水合氯醛腹腔注射，待小鼠完全麻醉后，用手术剪剪开小鼠腹部皮肤及腹膜，暴露门静脉，将细输液针插入门静脉，确认插入成功后固定输液针，用冰磷酸盐缓冲液灌注直至肝脏变白，取出肝脏，用组织匀浆器将肝脏碾碎成匀浆，匀浆液150g 离心10min 去掉胞核，取上清液100000g 离心一小时，去除沉淀后用已装好的90×1cm 琼脂糖凝胶CL-6B 柱 分离S-100，分离得到的第一峰蛋白经Amicon μltra-15 滤波器离心浓缩至0.5-2g/L 的终浓度，最后将分离得到的S-100 与等体积的弗氏完全佐剂混合后腹腔注射小鼠，每只腹腔注射该混合液1.0ml，至第21 天造模完成。
通过采用上述方案，本发明的有益效果是：二甲双胍分子式：C4H11N5；分子量：165.63；二甲双胍是经典的治疗2 型糖尿病的一线药物，临床使用时间长、经验丰富；二甲双胍易溶于水溶剂，且性质稳定，不论干粉还是水性溶液均可以在常温保存；二甲双胍能在溶解后直接口服，方便且便于携带服用，且二甲双胍具有抗炎、抗凋亡和促进肝细胞再生的作用,可有效减轻肝损伤的炎症反应,改善肝细胞功能；通过调节Treg/Th17 细胞的平衡，减缓自身免疫性肝炎肝脏炎症和纤维化进展；还可以调节肠道微生态，改善肠道炎症从而减轻疾病的内毒素血症进而缓解肝脏的炎症反应。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
图1 为二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后肝脏病理HE 染色情况；
图2 为二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后肠道病理HE 染色情况；
图3 为二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后血清ALT、AST 水平；
图4 为高剂量（250mg/kg.d）二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后脾脏Treg 细胞占CD4+T 细胞比例变化；
图5 为高剂量（250mg/kg.d）二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后脾脏Th17 细胞占CD4+T 细胞比例变化；
图6 为高剂量（250mg/kg.d）二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后脾脏Treg/Th17细胞群比例变化。
具体实施方式
二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用，包括以下步骤，（1）模型建立，使小鼠具有自身免疫性肝炎；（2）治疗，把步骤一后的具有自身免疫性肝炎小鼠给药，给药方式为灌胃给予溶于生理盐水中的二甲双胍药液，所述二甲双胍在生理盐水中的终浓度为6—10mg/ml，小鼠的给药剂量为每天每只小鼠给二甲双胍150-250mg/kg.d。
在本发明实施例中，所述模型建立：造模的第1天和第7天，分别取小鼠给予10%水合氯醛腹腔注射，待小鼠完全麻醉后，用手术剪剪开小鼠腹部皮肤及腹膜，暴露门静脉，将细输液针插入门静脉，确认插入成功后固定输液针，用冰磷酸盐缓冲液灌注直至肝脏变白，取出肝脏，用组织匀浆器将肝脏碾碎成匀浆，匀浆液150g 离心10min 去掉胞核，取上清液100000g 离心一小时，去除沉淀后用已装好的90×1cm 琼脂糖凝胶CL-6B 柱 分离S-100，分离得到的第一峰蛋白经Amicon μltra-15 滤波器离心浓缩至0.5-2g/L 的终浓度，最后将分离得到的S-100 与等体积的弗氏完全佐剂混合后腹腔注射小鼠，每只腹腔注射该混合液1.0ml，至第21 天造模完成。
本发明更进一步实施例及其表述其疗效的对比试验如下：
（1）模型建立：
随机选取16只C57BL/6小鼠用于提取S-100 肝脏蛋白。于造模的第1天和第7天，分别取8只小鼠给予10%水合氯醛腹腔注射。待小鼠完全麻醉后，用手术剪剪开小鼠腹部皮肤及腹膜，暴露门静脉，将细输液针插入门静脉，确认插入成功后固定输液针，用冰磷酸盐缓冲液灌注直至肝脏变白。取出肝脏，用组织匀浆器将肝脏碾碎成匀浆。匀浆液150g离心10min 去掉胞核，取上清液100000g离心一小时，去除沉淀后用已装好的90×1cm 琼脂糖凝胶CL-6B柱（Pharmacia 公司）分离S-100。分离得到的第一峰蛋白经Amicon μltra-15 滤波器（Millipore公司）离心浓缩至0.5-2g/L 的终浓度。最后将分离得到的S-100 与等体积的弗氏完全佐剂（Sigma 公司）混合后腹腔注射40只小鼠，每只腹腔注射该混合液1.0ml，至第21天造模完成。
（2）治疗方法及分组：
将40只C57BL/6 小鼠，按随机数字表法随机分为5组，分别为：正常对照组（A）、自身免疫性肝炎模型组（B）、低剂量二甲双胍治疗组（C1）、中剂量二甲双胍治疗组（C2）和高剂量二甲双胍治疗组（C3）。
我们前期实验摸索得出二甲双胍的小鼠灌胃剂量应小于300mg/kg.d，否则容易致死。实验常用二甲双胍小鼠灌胃量为200mg/kg.d。本次实验，二甲双胍治疗组内分为低剂量（150mg/kg.d）(C1)，中剂量（200mg/kg.d）(C2)，高剂量（250mg/kg.d）(C3)三个亚组，探究二甲双胍用于治疗自身免疫性肝炎肝炎小鼠的适宜剂量（二甲双胍治疗组中二甲双胍在生理盐水中的终浓度为6—10mg/ml）。
A(正常对照组):于造模前一天开始，每天在同一时间段灌胃生理盐水0.5ml,直至第28天，同时每天食用普通饲料。
B(自身免疫性肝炎模型组)：于造模前一天开始，每天在同一时间段灌胃生理盐水0.5ml,直至第28天，同时每天食用普通饲料。
C1(低剂量Met 治疗组):于造模前一天开始灌胃给予150mg/kg.d 溶于生理盐水中的二甲双胍药液。每天在相同时间段灌胃一次，每次的剂量为150mg/kg(二甲双胍重量/小鼠体重)。称量小鼠体重，如小鼠体重为20g，则每次灌胃需二甲双胍质量为3mg，药液体积为0.5ml，即将3mg二甲双胍溶于0.5ml 生理盐水(0.9％的NaCl 溶液)中，制成6mg/ml的药液,每天在相同时间段灌胃一次；食用普通饲料至28天。
C2（中剂量Met 治疗组）：于造模前一天开始灌胃给予200mg/kg.d 溶于生理盐水中的二甲双胍药液。每天在相同时间段灌胃一次，每次的剂量为200mg/kg(二甲双胍重量/小鼠体重)。称量小鼠体重，如小鼠体重为20g，则每次灌胃需二甲双胍质量为4mg，药液体积为0.5ml，即将4mg 二甲双胍溶于0.5ml 生理盐水(0.9％的NaCl 溶液)中，制成8mg/ml 的药液,每天在相同时间段灌胃一次；食用普通饲料至28天。
C3（高剂量Met 治疗组）：于造模前一天开始灌胃给予250mg/kg.d 溶于生理盐水中的二甲双胍药液。每天在相同时间段灌胃一次，每次的剂量为250mg/kg(二甲双胍重量/小鼠体重)。称量小鼠体重，如小鼠体重为20g，则每次灌胃需二甲双胍质量为5mg，药液体积为0.5ml，即将5mg 二甲双胍溶于0.5ml 生理盐水(0.9％的NaCl 溶液)中，制成10mg/ml 的药液,每天在相同时间段灌胃一次；食用普通饲料至28天。
（3）评价方法：
通过HE 染色观察各组小鼠肝脏、肠道的病理变化；采用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清ALT、AST 值反映肝损伤情况；推测出最优的二甲双胍小鼠灌胃浓度后，再利用流式细胞术检测该组小鼠与正常对照组和模型组三组的Treg细胞亚群CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞及CD4+IL-17+Th17 细胞亚群占CD4+T 细胞比例，再进行Treg/Th17的计算。
（4）标本处理：
1）用1ml 注射器抽取10％水合氯醛腹腔注射，30 只小鼠眼眶取血，将全血分别置于两管EP管中，室温放置30 min，以3000 rpm 离心15 min，上清液即为血清，小心吸取转移至-80℃保存。全自动生化分析仪检测检测肝损伤因子：ALT、AST。检测完毕再次收集剩余血清备用。
2）肝脏、肠道HE 染色：
A.取出组织：30 只小鼠禁食过夜，将小鼠按0.004ml/g 的剂量给予10%水合氯醛腹腔注射，随后固定在操作平台上。十字开腹后，暴露腹腔，取肝脏、小鼠回肠（长度大约为6cm），放于无菌培养皿中用PBS 小心冲洗干净，除去肠道内容物，注意不破坏肠道结构，并将肝脏切成小块，肝脏和肠道组织保存至装有4%多聚甲醛的15ml离心管中，完全浸润，可保存24小时。
B.包埋
①取出肝脏、肠道组织块放入包埋盒中，做好标记，用细线将多个包埋盒串好，再用流动的自来水缓慢冲洗20分钟，避免水冲力太大损伤组织。
②脱水：将组织块依次放入以下浓度酒精中：40min75%酒精→40min85%酒精→1h90%酒精→1h95%酒精→30 min100%酒精I→30min100%酒精II。
③透明：先浸泡于二甲苯I20min，再于二甲苯II中浸泡20min。
④浸蜡：将组织块放入65℃石蜡I 2h，再移至65℃石蜡II 1h。
⑤包埋：用包埋机包埋浸好蜡的组织块,等待蜡凝固，注意组织块的位置需便于切片。
C. 切片
①将包埋好组织块的包埋盒置于-20℃冰箱30min，再调整石蜡组织切片机参数，切片厚度为4μm，进行组织连续切片，选取完整的组织薄片用来贴片。
②贴片：将4μm 厚的组织薄片，在自来水上湿润轻轻贴在载玻片上，放置于35℃左右温水中慢慢展平,再转移置60℃的干燥箱内进行烘干。
D.H&E染色
①先将切片于60℃干燥箱内烘干30min。
②第一步进行脱蜡，依次放入二甲苯I →二甲苯II →二甲苯III，每次5min。
③再用不同浓度酒精进行脱二甲苯，依次将切片放入1 min 100%酒精I→30s100%酒精II→30s95%酒精→30s85%酒精→30s75%酒精，取出切片后用自来水缓慢冲洗15minL。染色时，先用苏木素染色7-8min，再用自来水缓慢冲洗10min，接着放入1%盐酸酒精中，立即拿起；再用自来水缓慢冲洗5-6min，用伊红染色1-2min，再用自来水缓慢冲洗5min。
④染完色后将切片进行脱水，选择不同浓度的酒精，分别加至75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精各5s，最后再在100%酒精中脱水1min。
⑤组织透明需要依次于二甲苯I 和二甲苯II 中各30s。
E.最后封片与观察：先用中性树脂封片，注意保持组织平坦，待组织切片凝固后于显微镜下观察组织病理情况，选取合适视野及倍数进行摄片分析。
3)流式细胞术检测小鼠脾脏Treg/Th17
A.制备脾脏淋巴细胞悬液
①打开小鼠腹腔，可见模型组小鼠脾脏肿大明显，小心剪取小鼠脾脏，于装有组织匀浆液的平皿中洗涤，再用10ml 注射器针芯轻轻充分研磨脾脏组织，用力不能过猛，以免损伤细胞，用100目不锈钢滤网过滤脾脏研磨液，滤去多余组织，再用组织匀浆液冲洗平皿及过滤网，收集细胞悬液。
②将细胞悬液置于离心机，配平，以1500rpm，离心3分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。
③用1ml细胞清洗液轻轻吹打重悬细胞沉淀，充分混匀，400g离心3分钟去除细胞碎片，重复清洗2次。
④用1ml细胞清洗液重悬沉淀，用200目不锈钢过滤网去除细胞团块。
⑤取干净盛有500μl 脾脏淋巴细胞分离液的1.5ml EP 管，垂直方向沿管壁缓慢加入等体积细胞悬液，使细胞悬液轻轻滴在淋巴细胞分离液上，再用水平密度梯度微型台式离心机离心，配平，400g 低速离心20min，轻轻取出EP 管，可见出现分层现象，可以观察到从上至下分为四层，依次为血浆层、淋巴细胞层、淋巴细胞分离液层及细胞沉淀层，取放时须小心缓慢，避免震荡破坏淋巴细胞层。
⑥小心吸取上层的血浆层，弃去，再轻轻吸取淋巴细胞层的细胞悬液于新EP管内，用1ml 细胞清洗液充分吹打重悬，以400g 离心10min，弃去上清液，收集细胞沉淀。
⑦取含10%灭火胎牛血清的RPMI1640 用来重悬脾脏淋巴细胞沉淀，充分吹打混匀后，用细胞计数板进行计数细胞，用RPMI1640 将细胞浓度调整为1X107/ml。
B.Treg 细胞的流式检测。
①吸取含1X106个细胞的100μl脾脏淋巴细胞悬液于流式上样管内，先将Anti-CD4-FITC抗体0.5μl、Ant-CD25-APC 抗体1.0μl 加入到淋巴细胞中，充分吹打混匀，用以标记淋巴细胞表面的CD4和CD25，放置于4℃冰箱避光孵育30min。
②用1ml PBS 洗涤标记好的淋巴细胞，轻轻吹打清洗，以400g离心5min，弃去上清液。
③按3：1比例配置（固定破膜稀释液:固定破膜浓缩液=3:1）固定破膜工作液，并取1ml轻轻吹打重悬淋巴细胞沉淀（固定破膜工作液需现配现用），充分混匀后，避光孵育30min。
④配置（破膜缓冲液:去离子水=1:9 ）破膜缓冲工作液，取2ml 破膜缓冲工作液，吹打混匀后于400g 离心5min，弃去上清。
⑤再用100μl 破膜缓冲工作液轻轻吹打混匀淋巴细胞沉淀,加入1.25μlAntiFoxp3-PE 抗体（同型对照管需要加IgG2ɑ-PE 抗体）进行标记，放置4℃避光孵育至少30min。
⑥用破膜缓冲工作液2ml 轻轻吹打洗涤细胞，400g 离心5min，弃上清液，收集标记了CD4-FITC、CD25-APC和Foxp3-PE 的淋巴细胞沉淀。
⑦最后用0.1%的多聚甲醛200μl加至流式上样管固定淋巴细胞，避光4℃保存，24小时内上机进行流式细胞检测。
C.Th17 细胞流式检测
①取1X106 的100μl 脾脏淋巴细胞悬液于流式上样管内,在细胞悬液中加入刺激剂及阻断剂（2μl PMA/Ionomycin 和2μl monensin/BFA 2μl），轻轻吹打充分混匀；
②将细胞悬液放置37℃、5％ 二氧化碳培养箱中培养4-5 h，每隔1-2 小时摇匀一次；
③刺激结束后将细胞悬液放离心机，以400g离心5 min，弃上清，收集沉淀及部分残留溶液，加入0.25μl Anti-CD4- FITC抗体，轻轻吹打混匀，于4℃避光孵育30 min；
④向细胞悬液中加固定破膜剂A液50μl，置室温孵育15min；
⑤再加染色缓冲液0.5ml，以400g 离心5min，弃去上清，收集细胞沉淀；
⑥加入固定破膜剂B 液100μl，漩涡震荡混匀后再加入1μl Anti-IL-17-PE 抗体，可见轻微红色悬液，充分混匀，放置于4℃，避光孵育30 min；
⑦加入0.5 ml染色缓冲液，轻轻吹打混匀清洗，400g离心5 min，弃上清，收集标记了CD4-FITC及IL-17-PE 的淋巴细胞；
⑧加200μl 0.1％多聚甲醛重悬细胞，4℃避光保存，24h 内上机流式检测。
（5）实验结果
1）二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后肝脏病理的改变情况
结果如图1 所示：在光学显微镜下观察：正常对照组小鼠（A）肝小叶结构完整，形态正常，肝索呈放射状整齐排列，无变性坏死，汇管区无炎性细胞浸润；自身免疫性肝炎组小鼠（B）肝小叶正常结构破坏，肝索排列紊乱无规则，可见肝细胞点状坏死，汇管区大量炎性细胞浸润；与自身免疫性肝炎组相比，二甲双胍治疗组（C）小鼠肝小叶结构较清晰完整，肝索排列较整齐，汇管区炎性细胞明显减轻,且随着剂量增大，肝脏炎症改善愈发明显。
2）二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后肠道病理的改变情况：
结果如图2 所示：正常对照组小鼠（A）肠道绒毛排列整齐规则，而自身免疫性肝炎组小鼠(B)肠道绒毛排列紊乱、稀疏，且明显比正常组短，二甲双胍治疗组（C）能明显改善自身免疫性肝炎小鼠的肠道绒毛破坏，且随着剂量增大，肠道炎症改善愈发明显。
3）二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后肝脏损伤因子的改变情况：
结果如图3 所示：自身免疫性肝炎组小鼠血清ALT、AST 检测值比正常对照组小鼠升高，二甲双胍治疗组血清ALT 与AST 水平较自身免疫性肝炎组明显降低有统计学差异（P<0.05）。（注：ALT 为丙氨酸转氨酶； AST 为天冬氨酸转氨酶；*表示与正常对照组比较p<0.05，#表示与模型组比较p<0.05，▲表示治疗组之间比较p<0.05）
4）高剂量（250mg/kg.d）二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后脾脏Treg 细胞占CD4+T细胞比例变化情况：
结果如图4 所示：与模型组相比较，二甲双胍治疗后脾脏Treg 细胞（CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞及）占CD4+T 细胞的比例显著升高，差异有统计学意义（P<0.05，*）。
5）高剂量（250mg/kg.d）二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后脾脏Th17 细胞占CD4+T 细胞比例变化情况：
结果如图5 所示：与模型组相比较，二甲双胍治疗后脾脏Th17 细胞（CD4+IL-17+Th17细胞）占CD4+T 细胞的比例显著下降，差异有统计学意义（P<0.05，*）。
6）高剂量（250mg/kg.d）二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠后脾脏Treg/Th17 细胞群比例变化情况：
结果如图6 所示：与正常对照组比较，模型组脾脏Treg/Th17 比例较正常组明显下降（P<0.05，*），而二甲双胍治疗后脾脏Treg/Th17 比例显著升高，与模型组相比具有统计学意义（P<0.05，*）。正常组与二甲双胍治疗组之间未见明显差异(P>0.05，#)。
上述利用本发明所述的二甲双胍治疗自身免疫性肝炎小鼠的实验证明，二甲双胍拥有调节Treg/Th17比例，抑制 Th17细胞，增强Treg细胞的免疫抑制功能，改善肠道炎症从而减轻肝脏损伤的作用。
Claims (2)
1.二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用，其特征在于：包括以下步骤，
（1）模型建立，使小鼠具有自身免疫性肝炎；
（2）治疗，把步骤一后的具有自身免疫性肝炎小鼠给药，给药方式为灌胃给予溶于生理盐水中的二甲双胍药液，所述二甲双胍在生理盐水中的终浓度为6—10mg/ml，小鼠的给药剂量为每天每只小鼠给二甲双胍150-250mg/kg.d。
2.根据权利要求1所述的二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用，其特征在于：所述模型建立：造模的第1天和第7天，分别取小鼠给予10%水合氯醛腹腔注射，待小鼠完全麻醉后，用手术剪剪开小鼠腹部皮肤及腹膜，暴露门静脉，将细输液针插入门静脉，确认插入成功后固定输液针，用冰磷酸盐缓冲液灌注直至肝脏变白，取出肝脏，用组织匀浆器将肝脏碾碎成匀浆，匀浆液150g 离心10min 去掉胞核，取上清液100000g 离心一小时，去除沉淀后用已装好的90×1cm 琼脂糖凝胶CL-6B 柱 分离S-100，分离得到的第一峰蛋白经Amicon μltra-15 滤波器离心浓缩至0.5-2g/L 的终浓度，最后将分离得到的S-100 与等体积的弗氏完全佐剂混合后腹腔注射小鼠，每只腹腔注射该混合液1.0ml，至第21 天造模完成。
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| CN201811173021.8A Active CN109330999B (zh) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | 二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109330999B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112646880A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-04-13 | 温州医科大学附属第一医院 | Usp4作为自身免疫性肝病生物标志物的应用 |
-
2018
- 2018-10-09 CN CN201811173021.8A patent/CN109330999B/zh active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112646880A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-04-13 | 温州医科大学附属第一医院 | Usp4作为自身免疫性肝病生物标志物的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109330999B (zh) | 2021-08-10 |
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