CN112646880A - Usp4作为自身免疫性肝病生物标志物的应用 - Google Patents

Usp4作为自身免疫性肝病生物标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了USP4作为自身免疫性肝病生物标志物的应用，属于医学检测领域。本发明将USP4应用于制备自身免疫性肝病标志物；本发明还将USP4应用于制备用于诊断自身免疫性肝病或预测自身免疫性肝病的荧光定量检测试剂盒，其试剂盒用于检测外周血单核细胞中USP4的表达水平。本发明首次通过实验证明，自身免疫性肝病患者的外周血单核细胞中USP4表达水平相比健康受试者的USP4表达水平显著上调；通过使用本发明提出的外周血中的USP4表达量作为分子标志，可对自身免疫性肝病进行无创检测，并能进行无创动态监控，具有重要的临床应用价值。

Description

USP4作为自身免疫性肝病生物标志物的应用
技术领域
本发明涉及医学检测领域，特别是涉及USP4作为自身免疫性肝病生物标志物的应用。
背景技术
自身免疫性肝病(autoimmune liver disease，AILD)是一组由自身免疫性反应介导的慢性肝胆系统炎症性疾病，以肝脏损伤为主，其主要包括原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)和原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)等。临床对于自身免疫性肝病的诊断尚无明确标准，然而，疾病若不加以控制经过长期发展可以导致进展性肝纤维化和肝硬化。因此，早期诊断自身免疫性肝病是非常有必要的。
去泛素化是泛素化的可逆过程，其机制是通过去泛素化酶去除泛素蛋白基团。特异性泛素化酶体(USP4)是去泛素化酶(DUBS)中最大的家族。去泛素化酶(DUBS)被分为5大家族，USP4(泛素特异性蛋白酶4)是USP家族中的一员，被认为与组织纤维化进程和免疫疾病进展密切相关。USP4可以通过调节Rheb的去泛素化进而控制Rheb的降解。USP4的升高会导致Rheb降解减少，从而激活mTOR信号通路，加重肝纤维化，促进疾病发展。
但目前国际上尚无专利文献提及USP4与自身免疫性肝病诊断及治疗疗效的关系，因此将USP4做为生物标志物用于诊断自身免疫性肝病具有重要研究价值。
发明内容
为解决现有技术中对于诊断自身免疫性肝病的手段有限、结果不明确的问题，本发明提供USP4作为自身免疫性肝病生物标志物的应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种USP4在制备自身免疫性肝病标志物中的应用。
本发明还提供一种检测USP4基因及其表达产物表达水平的试剂在制备诊断自身免疫性肝病产品中的应用。
进一步地，所述产品包括实时定量PCR检测USP4基因及其表达产物的表达水平以诊断自身免疫性肝病的产品。
进一步地，所述用实时定量PCR诊断自身免疫性肝病的产品至少包括一对特异扩增USP4基因的引物。
进一步地，所述产品包括芯片和/或试剂盒；所述芯片包括基因芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒。
进一步地，所述基因检测试剂盒包括SYBR Green实时荧光定量聚合酶链式反应体系、用于扩增人外周血清单核细胞USP4基因的引物对；所述SYBR Green实时荧光定量聚合酶链式反应体系包括超纯水、SYBR Green荧光染料、cDNA、上游引物、下游引物。
进一步地，所述扩增人外周血清单核细胞USP4基因的引物对序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；所述内参基因为GAPDH，扩增GAPDH的引物对序列如SEQ ID NO.7～SEQID NO.8所示。
本发明公开了以下技术效果：
本发明和现有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明首次通过实验证明，自身免疫性肝病患者的外周血单核细胞中USP4表达水平相比健康受试者外周血单核细胞中的USP4表达水平显著上调(p<0.05)。
通过使用本发明提出的外周血单核细胞中的USP4表达量作为分子标志，可对自身免疫性肝病进行无创检测，并能进行无创动态监控，具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1为健康受试者与自身免疫肝病患者USP4基因的ΔCT值；
图2为USP4的实时荧光定量PCR检测结果；其中a是AIH患者与健康受试者的血液单核细胞中USP4的表达量；b是AIH小鼠模型与正常小鼠的肝脏USP4表达量；c是利用LPS构造的AML12肝细胞体外模型中USP4的表达量；
图3为USP4的AIH小鼠模型以及AML12肝细胞体外模型Westernblot检测表达结果；
图4为AIH小鼠模型USP4免疫组化结果；a为对照组小鼠，b为AIH小鼠。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明的实施例，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
样品准备
1、AIH小鼠模型的构建
小鼠注射新鲜制备的S100建立自身免疫性肝炎模型。用生理盐水灌流肝脏，匀浆后制备S100抗原。在100000g离心2小时后，取上清液S100，用AmiconΜLtra-15过滤器浓缩至0.5ml，然后用AKTAPURE通过90cm CL-6B Sepharose柱(Solarbio)。从柱子中收集到3个蛋白峰，其中作为肝抗原，峰1和峰3组分优于峰2。本发明中，取3号峰，浓度为0.5～2.0g/l，免疫时用等体积的完全弗氏佐剂(第0天)或不完全弗氏佐剂(第7天)乳化肝S100抗原。这种混合物在第0天和第7天再次注射到小鼠的腹腔内。因为有两只老鼠在实验中死亡。建立自身免疫性肝炎小鼠12只，对照组12只，随机分为两组，每组12只，第28天以6％乙醇胺麻醉小鼠，处死动物。
2、AML12肝细胞的体外模型构建
将AML12细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM/F-12中，在37℃、5％CO2培养箱中培养。传代培养至细胞占70～80％培养皿时，加入LPS脂多糖(5μg/ml)处理12h。
3、人外周血淋巴细胞的分离
3.1人外周血淋巴细胞的来源
(1)健康受试者入选标准：
来自我院体检中心无相关基础疾病的健康人:年龄18岁以上，性别不限；无肝病、自身免疫性疾病，肿瘤等病史，无服用肝毒性药物史，无自身免疫病及肝病家族史，无其他严重躯体疾病；无药物滥用史，非孕期及哺乳期。
(2)自身免疫性肝炎患者入选标准：
根据IAIHG2008年发布的自身免疫性肝炎简化诊断标准选择入组病人；年龄18岁以上，性别不限。
排除标准:听觉、视觉障碍；精神疾病史；长期服用镇静剂；嗜酒、吸毒史；既往12个月内有严重的出血史；合并甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎等其他病毒性肝炎；近期(1个月内)感染者；合并有人类免疫缺陷病毒感染；合并有非酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、遗传性肝病、药物性肝炎；既往或现患有肿瘤疾病者；并发肝性脑病、顽固性腹水、出血倾向、肝肾综合征等；患有其他自身免疫性疾病者。
(3)选择受试者的步骤：
门诊或者住院部发现自身免疫性肝病的患者，在符合入选标准并且不符合任一一项排除标准后，与患者充分沟通，取得患者同意后签署知情同意书。对照患者选择健康志愿者，取得同意后签署知情同意书。
(4)受试者分配：
自身免疫性肝病患者纳入自身免疫性肝病组，健康受试者纳入对照组。
3.2外周血单核细胞的制备
(1)取步骤3.1所述健康受试者或自身免疫性肝病患者新鲜抗凝血进行离心,3000rpm,10min，留上清。
(2)将上清液即血浆用胶头滴管吸去。
(3)将除去血浆的剩余外周血转移至15ml离心管中，加入PBS进行稀释，外周血与稀释液的比例为1：2。
(4)在50ml离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入步骤(3)稀释的外周血，Ficoll与稀释血的比例为1：1。
(5)20℃，1800rpm(500-1100g)，离心30min。
(6)离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
(7)用吸管小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，加入等量PBS，吹打混匀。
(8)1500rpm，10min。弃上清。
(9)加入5ml PBS，吹打混匀。
(10)重复步骤8，彻底弃去上清，得到外周血单核细胞。
实施例1用于检测USP4 mRNA的试剂盒
试剂盒用于临床检验用途的USP4基因相对表达量的检测，采用实时荧光定量PCR技术，肝病患者外周血单核细胞中USP4基因表达水平，同时对自身免疫性肝病的诊断具有一定的帮助作用。
试剂盒组分包括：
(1)样本总RNA提取试剂：TRIZOL，氯仿，乙醇，DEPC水；
(2)总RNA逆转录试剂：赛默飞公司的Revert First Strand cDNA SynthesisKit。
(3)实时荧光定量PCR反应试剂：USP4和GAPDH的上下游标准引物，SYBR Green(赛默飞)。引物序列如下表1所示，
表1
Figure BDA0002915767260000071
实施例2实时荧光定量PCR检测USP4的mRNA水平的方法
1、RNA提取
①取50mg小鼠肝组织、样品制备中制得的健康受试者或自身免疫性肝病患者人外周血单核细胞，加入1ml的Trizol，研磨/吹打充分后室温静置5分钟以彻底分离核蛋白复合体；在六孔板培养的AML12肝细胞则是弃去培养基后用PBS洗涤1至2次后，向孔中加入1ml的Trizol，吹打充分后室温静置5分钟以彻底分离核蛋白复合体；
②分别加入0.2ml氯仿，用手剧烈震荡15秒，室温等待2分钟后，4℃、13000rpm，离心15分钟，可见溶液分为三层，从上至下分别为透明的水相(含RNA)、中间层以及红色的酚-氯仿相；
③分别将含RNA的水相转移到干净的EP管中，加入相同体积的异丙醇，放置10分钟，13000rpm离心10分钟，倒掉上清；
④取1ml的75％乙醇用于洗涤沉淀，振荡器混匀，7500g离心5分钟，倒掉上清，晾干沉淀；用DEPC水重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打，静置10分钟后测RNA浓度；
2、RNA浓度测定：将提取的RNA用DEPC水稀释15倍，加入比色杯中，以超纯水作为对照，在紫外分光光度计中检测A260和A280处的吸光度；A260/A280比值在1.8～2.0之间则可用于后续PCR实验；RNA浓度＝A260处OD值×40ng/μl×稀释倍数；
3、逆转录：按逆转录试剂盒说明书配置反应体系，反应体系为20μL，每个样品取1μg总RNA，逆转录反应条件为：37℃反应15分钟，85℃反应5秒，cDNA产物用于后续PCR实验；
4、检测试剂盒：采用实施例1提供的试剂盒。
5、检测方法：
①配制10μLPCR反应体系，反应体系如下表2所示：
表2
Figure BDA0002915767260000081
Figure BDA0002915767260000091
②PCR反应程序
95℃预变性20～60秒；95℃变性1～15秒，60℃退火5～30秒，72℃延伸30～60秒，共40个循环；60℃时收集荧光，以SYBR Green作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过ΔΔCT法进行相对定量。
③结果分析和判定：
结果判断：用ΔCT＝CtUSP4-CtGAPDH分析计算USP4的表达量，如果ΔCT值小于6.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；阴性：检测不到样本Ct值或ΔCT值大于6.0。
如图1所示，结果表明，健康受试者的ΔCT为7.215±0.3034，自身免疫性肝病患者的ΔCT为4.071±0.6921，由此可知，自身免疫性肝病患者USP4的ΔCT值小于6.0。
USP4的实时荧光定量PCR检测结果如图2所示，患者的USP4表达量较健康受试者明显升高；AIH小鼠的USP4表达量较正常小鼠明显升高；LPS刺激AML12细胞的USP4表达量较正常AML12细胞明显升高，因此，本发明通过实验证明，自身免疫性肝病患者的外周血单核细胞中USP4表达水平相比健康受试者的USP4表达水平显著上调。
实施例3Westernblot检测USP4蛋白表达
1)蛋白变性：AML12肝细胞的培养皿弃去培养基，用PBS洗涤后加入200μL裂解液，刮板后进行离心，取上清液；小鼠肝组织取出50mg，加入1ml裂解液充分研磨后，取上清液；调整上清液浓度一致，加1/4体积的5×Loading Buffer，吹打混匀，100℃热水浴中变性10分钟；
2)加样：将预制胶装在电泳槽中，加入1×电泳液，将变性好的待测样品混匀后，取15μl缓慢加入预制上方的小孔中，边上的孔加入蛋白marker作为标准；
4)电泳：盖上电泳槽，150V恒压电泳，目的蛋白跑完预制胶的2/3高度，终止电泳；
5)切胶、转膜：根据实际情况预先剪好PVDF膜和滤纸，PVDF膜使用前在甲醇中活化1～2分钟，打开转膜夹，黑色面朝下，在黑色面放上海绵垫及3层滤纸，铺平并赶走气泡；取出电泳槽中的玻璃板并打开，按目的条带的大小(USP4为100KDa)切下胶条，小心置于滤纸上，盖上PVDF膜并驱赶气泡；在PVDF膜上方盖上3层滤纸、海绵垫，合上转膜夹，固定在转膜槽中，加入预冷的1×转膜液，转膜槽置于冰块中，300mA，根据分子量大小设置转膜时间(1KDa转膜1分钟)；
6)封闭：取出PVDF膜，蛋白面朝上，抗体孵育盒中，加入配好的BSA封闭液，室温摇床封闭至少1.5个小时；
7)敷一抗：倒掉封闭液，加入相应的稀释好的一抗(anti-USP4稀释浓度均为1：1000，用5％BSA稀释)，4℃冰箱孵育过夜；
8)洗膜：第二天回收封闭液，加入1×TBST洗膜液，置于摇床上洗膜，每次10分钟，重复3次；
9)敷二抗：倒掉洗膜液，加入稀释好的二抗(稀释比例为1：5000，用5％BSA稀释)，室温摇床孵育1小时；
10)洗膜：回收二抗，加入1×TBST洗膜液，置于摇床上洗膜，每次10分钟，重复3次；
11)曝光、分析数据：配制ECL发光液(1：1)，小心加于PVDF膜蛋白面之上，注意避免产生气泡，上机曝光；AIH小鼠模型中USP4的表达量以及利用LPS刺激AML12肝细胞构建的体外模型中USP4的表达量如图3所示，结果表明USP4基因在自身免疫性肝炎中具有标志物的作用。
实施例4免疫组化
取50mg小鼠肝组织，经过75％、80％、95％、95％、100％、100％、100％梯度酒精及二甲苯处理，经过60℃恒温烤箱过夜，经二甲苯、无水酒精处理，甲醇-双氧水清除内源性过氧化物酶处理后，用蒸馏水和PBS液清洗液清洗，然后进行抗原修复，滴加一抗和二抗，室温下孵育30min后滴加显色剂，苏木素复染，经70％、95％×2、100％×4梯度酒精脱水和二甲苯处理后，中性树胶封片即可读片，AIH小鼠模型USP4免疫组化结果如图4所示，结果表明USP4基因在自身免疫性肝炎中具有标志物的作用。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学附属第一医院
<120> USP4作为自身免疫性肝病生物标志物的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctggcttct ctgcttcgta 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagggttgtc tcggttgat 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcctggcc caatagacaa c 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtagggacc aatacatagt cca 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggaggcat tgctgatgat 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggctggg gctcattt 18
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctctccctca cgccatc 17
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgcacgatt tccctctc 18

Claims (7)

1.USP4在制备自身免疫性肝病标志物中的应用。
2.检测USP4基因及其表达产物表达水平的试剂在制备诊断自身免疫性肝病产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括实时定量PCR检测USP4基因及其表达产物的表达水平以诊断自身免疫性肝病的产品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断自身免疫性肝病的产品至少包括一对特异扩增USP4基因的引物。
5.根据权利要求3-4任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片和/或试剂盒；所述芯片包括基因芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因检测试剂盒包括SYBR Green实时荧光定量聚合酶链式反应体系、用于扩增人外周血清单核细胞USP4基因的引物对；所述SYBR Green实时荧光定量聚合酶链式反应体系包括超纯水、SYBR Green荧光染料、cDNA、USP4和GAPDH的上下游引物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述扩增人外周血清单核细胞USP4基因的引物对序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；所述内参基因为GAPDH，扩增GAPDH的引物对序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103044548A (zh) * 2011-12-23 2013-04-17 北京大学人民医院 一种原发性胆汁性肝硬化的特异性自身抗体及应用
CN103492590A (zh) * 2011-02-22 2014-01-01 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 循环生物标志物
WO2016027253A1 (en) * 2014-08-21 2016-02-25 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterocyclic amides as rip1 kinase inhibitors as medicaments
CN109330999A (zh) * 2018-10-09 2019-02-15 温州医科大学附属第医院 二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103492590A (zh) * 2011-02-22 2014-01-01 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 循环生物标志物
CN103044548A (zh) * 2011-12-23 2013-04-17 北京大学人民医院 一种原发性胆汁性肝硬化的特异性自身抗体及应用
WO2016027253A1 (en) * 2014-08-21 2016-02-25 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Heterocyclic amides as rip1 kinase inhibitors as medicaments
CN106573006A (zh) * 2014-08-21 2017-04-19 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 作为药物的rip1激酶抑制剂杂环酰胺
CN109330999A (zh) * 2018-10-09 2019-02-15 温州医科大学附属第医院 二甲双胍在治疗小鼠自身免疫性肝炎中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIE XU等: "Ubiquitously specific protease 4 inhibitor-Vialinin A attenuates inflammation and fibrosis in S100-induced hepatitis mice through Rheb/mTOR signalling", 《J CELL MOL MED》 *
徐洁: "USP4特异性抑制剂VialininA通过调节Rheb/mTOR信号通路缓解S100诱导的自身免疫性肝炎小鼠纤维化", 《万方数据知识服务平台》 *

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