CN116087531B

CN116087531B - 一种卵泡膜细胞特异性标记物及其应用

Info

Publication number: CN116087531B
Application number: CN202310376649.2A
Authority: CN
Inventors: 严杰; 乔杰; 田梦圆; 霍莹
Original assignee: Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Current assignee: Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Priority date: 2023-04-11
Filing date: 2023-04-11
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2043-04-11
Also published as: CN116087531A

Abstract

本发明提供了一种利用SCARB1蛋白鉴定或筛选卵泡膜细胞的方法，所述方法包括对卵泡膜细胞中的SCARB1蛋白进行特异性染色从而实现对卵泡膜细胞层的准确鉴定和/或定位，或通过使用SCARB1抗体对原代卵泡细胞中的膜细胞进行流式细胞术鉴定。

Description

一种卵泡膜细胞特异性标记物及其应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种卵泡膜细胞特异性标记物SCARB1蛋白及其在鉴定或筛选卵泡膜细胞中的应用。

背景技术

卵泡存在于人体的两侧卵巢中，一个月经周期有一个卵泡发育成熟，一旦发育成熟就会排出卵子（即排卵），排出的卵子与精子结合就是受精卵，即怀孕。新生儿两侧卵巢有70万～200万个原始卵泡，青春期约有4万个，至40～50岁时仅剩几百个。在胎儿及儿童期可偶见少量卵泡生长，但都不能发育成熟。从青春期至绝经期30～40年生育时期，卵巢在垂体周期性分泌的促性腺激素的影响下，每隔28天左右有1个卵泡发育成熟并排出1个卵子，左右卵巢交替排卵。

根据卵母细胞和颗粒细胞的发育状况，卵泡大致可分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、小窦卵泡和窦卵泡。

卵泡膜细胞在次级卵泡阶段开始形成，位于卵泡的最外层，为卵泡提供支持保护以及分泌激素等维持卵泡发育所必须的因子的作用。卵泡膜细胞因难以分离及在体外长期培养，一直是卵泡研究中被忽视的一部分。既往通常采用机械分离或梯度离心等物理方法分离膜细胞，得到的膜细胞可能纯度不一，从而影响结果的准确性和一致性。一般卵子的生殖潜能可由在卵泡发育的所有阶段表达的标志物代表，然而传统的膜细胞标志物，包括CYP17A1，STAR和LHR等，这些因子尽管在膜细胞内高表达，但其特异度较差，常常在颗粒细胞及卵泡周围的间质细胞中也能检测到。

目前尚无方便有效的、对各级卵泡膜细胞均有监测定位作用的方法被报道。

发明内容

发明人在前期的实验中发现，在卵巢中SCARB1蛋白在卵泡膜细胞上有特异性表达，可通过免疫组化的方法对其进行染色，或将其作为流式标志物，通过流式细胞术对卵泡中的卵泡膜细胞进行鉴定或分选。

因此，本发明第一方面，提供一种鉴定卵泡膜细胞的方法，所述方法包括对卵泡中的SCARB1蛋白进行染色。

在一种实施方式中，所述染色为使用免疫组织化学染色方法，更为具体地，所述方法包括如下步骤：

（4）使用抗SCARB1一抗特异性结合卵巢组织上的SCARB1抗原表位；

（5）用辣根过氧化物酶标记的二抗与所述抗SCARB1一抗结合；

（6）用显色液显示抗SCARB1抗体特异结合的位置，所述SCARB1抗体特异结合的位置即为卵泡膜细胞的位置。

本发明第二方面，提供一种用于鉴定卵泡膜细胞的试剂盒，所述试剂盒含有对SCARB1蛋白染色的试剂。

在一种实施方式中，所述试剂包括SCARB1抗体、酶标二抗和显色液，优选的，所述酶为辣根过氧化物酶，所述显色液为DAB显色液和苏木精染色液。

在一种实施方式中，所述试剂进一步包括石蜡、二甲苯、无水乙醇、内源性过氧化物酶阻断剂、EDTA抗原修复液、枸橼酸钠抗原修复液、PBS缓冲液、盐酸酒精和中性树胶。优选的，所述EDTA抗原修复液pH = 9.0，枸橼酸钠抗原修复液pH = 6.0。

本发明第三方面，提供SCARB1蛋白作为流式标志物用于鉴定卵泡膜细胞的应用。

在一种实施方式中，将所述SCARB1蛋白用于对卵泡膜细胞的流式细胞术鉴定。优选的，所述鉴定包括如下步骤：

1）分离卵巢中的卵泡，吸取卵泡内的卵泡液离心，使用培养基重悬后培养于细胞培养皿内，获得原代颗粒细胞；将卵泡壁撕开后刮取卵泡内壁的卵泡膜细胞，使用细胞筛过滤，将分离的细胞离心，使用培养基重悬后培养于细胞培养皿内获得原代膜细胞；

（2）贴壁细胞消化后离心，将细胞沉淀固定于4%多聚甲醛内30分钟；（3）PBS清洗后置于0.1% TritonX-100中10分钟破膜；

（4）PBS清洗后置于2%山羊血清稀释的SCARB1抗体工作液中孵育1小时；

（5）PBS清洗后置于2%山羊血清稀释的荧光二抗工作液中孵育30分钟；

（6）PBS清洗3次后离心，PBS重悬后上机进行流式细胞分析。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1. STAR在卵泡1颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图2. SCARB1在卵泡1颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图3. STAR在卵泡2颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图4. SCARB1在卵泡2颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图5. STAR在卵泡3颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图6. SCARB1在卵泡3颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图7. STAR在卵泡4颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图8. SCARB1在卵泡4颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图9. STAR在卵泡5颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图10. SCARB1在卵泡5颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图11. STAR在卵泡6颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图12. SCARB1在卵泡6颗粒细胞和膜细胞上的定位表达；

图13. 为STAR和SCARB1在卵泡1-6的颗粒细胞、膜细胞及其周围间质细胞免疫组织化学染色平均灰度值比较（组间比较采用单样本t检验；*表示0.01 ≤p<0.05，***表示p<0.001）；

图14. 为STAR和SCARB1在卵泡1-6的颗粒细胞、膜细胞及其周围间质细胞免疫组织化学染色阳性区域占组织面积百分比比较（组间比较采用非参数检验；*表示0.01 ≤p<0.05，**表示0.001 ≤ p<0.01）；

图15. 为SCARB1抗体进行牛卵泡膜细胞和颗粒细胞流式细胞分析图（P4门圈选的为两种细胞类型中SCARB1阳性细胞占去黏连活细胞的比例）。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 通过对SCARB1染色进行膜细胞定位

本实施例中所用实验样品获自在北京大学第三医院生殖医学中心接受治疗的患者，经充分知情同意，自愿签署知情同意书，其数据被匿名用于临床科学研究；样品具体信息如下：

实验方法：

1.石蜡切片及烤片

将6份样品分别用石蜡包埋，将石蜡包埋块置于切片机上，切片厚度5μm，组织片切下后立即置于40℃温水中展平，将组织片捞至载玻片上铺正。将载玻片放入37℃电热干燥箱中烘干。切片染色前放于60℃电热干燥箱中烘烤2小时，之后晾至室温准备脱蜡。

2.组织脱蜡

将切片依次浸入两次二甲苯各10分钟，两次无水乙醇各5分钟，95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，纯水各3分钟。

3.内源性过氧化物酶灭活及抗原修复

切片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温静置20分钟，以灭活内源性过氧化物酶。纯水清洗3次。将每份样品分为两组，分别为SCARB1染色组和STAR染色组（对照组）。将SCARB1染色组切片置于pH = 9.0的EDTA抗原修复液中，STAR染色组切片置于pH = 6.0 枸橼酸钠抗原修复液中，98℃水浴加热20分钟。切片浸泡在抗原修复液内自然恢复至室温。

4.一抗孵育

两组切片组织上分别滴加抗SCARB1（浓度比：1/500）一抗(货号：ab217318，Abcam)工作液和抗STAR（浓度比：1/250）一抗(货号：ab133657，Abcam)工作液，液体边缘超过组织边缘。将切片放入湿盒内4℃孵育18小时。

5.二抗孵育

将切片放入PBS缓冲液中清洗3次，每次5分钟。在切片组织上滴加辣根过氧化物酶标记的二抗（货号：PV-6001，中杉金桥），液体边缘超过组织边缘。湿盒内室温孵育20分钟。

6.DAB显色

将切片放入PBS缓冲液中清洗3次，每次5分钟。在切片组织上滴加DAB显色工作液，液体边缘超过组织边缘。SCARB1染色组切片抗体显色时间1分钟， STAR染色组切片抗体显色时间1分钟。

7.苏木精染色

将切片放入纯水中清洗3次，再放入苏木精染色液中染色2分钟，流动自来水冲洗3分钟，纯水清洗切片3次后将切片放入盐酸酒精中脱色（时间约1秒），流动自来水冲洗切片10分钟。

8.组织脱水及封片

将切片放入纯水中清洗3次后依次浸入70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇各3分钟，两次无水乙醇各5分钟，两次二甲苯各10分钟。将中性树胶滴加在组织上，覆盖盖玻片封片。

结果分析：

使用ImageJ软件的IHC Profiler功能将免疫组化染色图片拆分成苏木精（蓝色）和DAB（黄色）染色图片，将DAB染色图转化为8 bit的黑白灰图像模式，调整图片阈值范围至可以选定所有阳性细胞且几乎无背景色，所有图片（STAR和SCARB1）分析使用相同的阈值范围。运用ImageJ的ROI功能在原图上圈选颗粒细胞、膜细胞和间质细胞区域，并将此ROI范围应用到DAB染色图片上，测量ROI区域平均灰度值、ROI面积及ROI内阳性区域面积，计算阳性区域面积占ROI面积的百分比。结果参数为ROI区域平均灰度值和阳性区域所占面积的百分比。

卵泡1-3的结果参数为通过对20倍下的整个卵泡的颗粒细胞、膜细胞和间质区域测量得到，卵泡4-6的结果参数为20倍下在卵泡壁上各随机选取5个位置，用5个位置结果参数的平均值来表示整个卵泡的结果参数。使用t检验分别比较颗粒细胞、膜细胞和间质细胞区域STAR和SCARB1染色的平均灰度值，使用非参数检验分别比较三个区域STAR和SCARB1染色的阳性区域面积百分比。绘制平均灰度值的柱状图（图13）和阳性区域面积百分比的箱图（图14）。统计及绘图使用SPSS 22.0。

如图1-12所示，卵泡1-3为3个小窦卵泡（直径300-800μm），4-6为窦卵泡（直径>3mm），其中，图1、3、5、7、9、11为用STAR（Abcam，ab96637）染色结果，图2、4、6、8、10、12为SCARB1（Abcam，ab52692）染色结果。卵泡结构为染色区域是膜细胞，膜细胞两侧分别为颗粒细胞和间质细胞。从图中可以看出，STAR和SCARB1均能对定位卵泡膜细胞，但STAR除了可使膜细胞着色，周围的颗粒细胞和间质细胞也可有不同程度的染色，而SCARB1染色时，周围的颗粒细胞和间质细胞几乎不着色，因此相较出传统的用于定位膜细胞的标记物STAR，SCARB1的特异性更强。

实施例2 应用SCARB1抗体通过流式细胞术鉴定卵泡膜细胞

流式细胞术实验流程：

（1）使用镊子分离牛卵巢中的卵泡，用注射器吸取卵泡内的卵泡液离心，使用培养基重悬后培养于细胞培养皿内，获得原代颗粒细胞；将卵泡壁撕开后用镊子刮取卵泡内壁的卵泡膜细胞，使用细胞筛过滤，将分离的细胞离心，使用培养基重悬后培养于细胞培养皿内获得原代膜细胞；

（2）贴壁细胞消化后离心，将细胞沉淀固定于4%多聚甲醛内30分钟；

（3）PBS清洗后置于0.1% TritonX-100中10分钟破膜；

（6）PBS清洗3次后离心，PBS重悬后上机进行流式细胞分析鉴定细胞类群。

2.数据分析：

使用FlowJo软件进行流式细胞分析。如图15所示，P4门圈选出的为去粘连后的细胞中荧光信号阳性的细胞，其中颗粒细胞中阳性比例为1.32%，膜细胞中阳性比例为76.35%，膜细胞中阳性细胞比例远远高于颗粒细胞。

综合免疫组织化学和流式细胞术实验结果，膜受体SCARB1特异表达于卵泡膜细胞，可将其作为特异性标记物用于卵泡膜细胞鉴定。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种鉴定卵泡膜细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使用免疫组织化学染色方法，对卵泡膜细胞中的SCARB1蛋白进行染色，并用显色液显示抗SCARB1抗体特异结合的位置，所述SCARB1抗体特异结合的位置即为卵泡膜细胞的位置。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）使用抗SCARB1一抗特异性结合卵巢组织上的SCARB1抗原表位；

（2）用辣根过氧化物酶标记的二抗与所述抗SCARB1一抗结合；

（3）用显色液显示抗SCARB1抗体特异结合的位置，所述SCARB1抗体特异结合的位置即为卵泡膜细胞的位置。

3.一种鉴定卵泡膜细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将SCARB1抗体作为流式分选特异性标记物，并通过流式细胞分析仪对细胞群中的卵泡膜细胞进行鉴定。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）分离卵巢中的卵泡，吸取卵泡内的卵泡液离心，使用培养基重悬后培养于细胞培养皿内，获得原代颗粒细胞；将卵泡壁撕开后刮取卵泡内壁的卵泡膜细胞，使用细胞筛过滤，将分离的细胞离心，使用培养基重悬后培养于细胞培养皿内获得原代膜细胞；

（3）PBS清洗后置于0.1% TritonX-100中10分钟破膜；

（6）PBS清洗3次后离心，PBS重悬后上机进行流式细胞分析。