JP2021517242A - Ｍａｇｅａ４を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明はサンプル中のMAGEA4を検出する方法を提供する。本方法は、抗MAGEA4抗体をサンプルに２〜20μg/mlの範囲内の濃度で添加し、抗体及びサンプルをインキュベートし、サンプルに結合した抗体を検出することを含んでなり得る。本発明の方法は、被験体がガンを有するかどうか、及び、該被験体がMAGEA4標的ガン療法での処置に適格かどうかを判定するために用いることができる。【選択図】なし
Description
本発明は、メラノーマ関連抗原A4(Melanoma-Associated Antigen A4；MAGEA4)を検出する方法に関する。本発明の方法は、被験体がガンを有するかどうか及び該被験体がMAGEA4標的ガン療法での処置に適格であるかどうかを診断するために用いることができる。
MAGEA4(NCBI Reference Sequence：NP_001011550.1)は、生殖細胞系にコードされたガン抗原MAGEファミリーに属する腫瘍関連抗原(TAA)であり(De Plaenら(1994)，Immunogenetics 40(5): 360-369)、治療的介入の理想的な標的である。MAGEA4の高レベル発現は、メラノーマ、食道ガン、頭頸部ガン、肺ガン、乳ガン及び膀胱ガンを含む幾つかのタイプの腫瘍において報告されている(Bergeron(2009)，Int J Cancer 125(6): 1365-1371；Cabezonら(2013)，Mol Cell Proteomics 12(2): 381-394；Cuffelら(2011)，Int J Cancer 128(11): 2625-2634；Forghanifardら(2011)，Cancer Biol Ther 12(3): 191-197；Karimiら(2012)，Clin Lung Cancer 13(3): 214-219；Svobodovaら(2011)，Eur J Cancer 47(3): 460-469)。正常組織におけるMAGEA4発現は、成人の精巣及び(胎盤を含む)他の免疫特権を有する部位に制限されている。よって、他の組織におけるMAGEA4の検出は、ガンを暗示し、標的ガン療法の提案に用いることができる。
標的ガン療法は、ガンの成長、進行又は拡散に関与する分子と特異的に相互作用するために設計される。近年、承認されるか又は臨床試験中である処置の数は大幅に増えている。この増加に伴い、特定の療法の利益を享受する可能性が最も高い患者を特定することができる適切なコンパニオン診断法のための要件も増えている。
腫瘍関連抗原(TAA)(例えばMAGEA4)を特異的に認識するように設計されている療法のために、患者腫瘍サンプルにおける所与のTAAの発現の検出は、患者を有望なレスポンダーに分類し、したがって対応する療法での処置に適格であるとする簡便な診断アプローチを提供する。TAAの検出に適用し得る既知の技法が幾らか存在するものの、正確で再現可能なコンパニオン診断アッセイを得ることは簡単ではなく、注意深い最適化が求められる。偽陰性の結果は、患者が有益であり得る処置を受けられないことを意味する一方、偽陽性の結果は、患者に対して不必要で、有害であり得る副作用を導き得る。したがって、TAAを検出し、ガンを診断し、処置前に適格患者を特定する診断法の必要性が引き続き存在している。
腫瘍関連抗原(TAA)(例えばMAGEA4)を特異的に認識するように設計されている療法のために、患者腫瘍サンプルにおける所与のTAAの発現の検出は、患者を有望なレスポンダーに分類し、したがって対応する療法での処置に適格であるとする簡便な診断アプローチを提供する。TAAの検出に適用し得る既知の技法が幾らか存在するものの、正確で再現可能なコンパニオン診断アッセイを得ることは簡単ではなく、注意深い最適化が求められる。偽陰性の結果は、患者が有益であり得る処置を受けられないことを意味する一方、偽陽性の結果は、患者に対して不必要で、有害であり得る副作用を導き得る。したがって、TAAを検出し、ガンを診断し、処置前に適格患者を特定する診断法の必要性が引き続き存在している。
免疫組織化学(IHC)は周知の診断法である。IHCは自動染色システムを用いて行われ得る。このようなシステムにより標準化が可能となり再現性が増大する。自動染色システムは、Ventana/Roche、Dako/Agilent、Leica ThemoFisherを含む幾つかのベンダーからの市販品として入手可能である。他の方法(例えばPCR)とは異なり、IHCは細胞局在及び発現レベルの情報をもたらすことができる。このことは、抗原発現が不均一であり得る腫瘍サンプルに関してとくに重要である。FDAに認可されたHerceptest(Agilent-Dako)は、標的療法についてのプロトタイプのIHCベースコンパニオン診断アッセイである。この場合、陽性の試験結果は、患者を、乳ガンに対するHer2標的化抗体トラツズマブ(Herceptin)への「レスポンダー」として分類する。より最近の例は、非小細胞肺ガンにおけるPD-L1抗体ペムブロリズマブのためのIHC診断アッセイである(Roachら(2016), Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 24(6): 392-397)。IHCは診断法として広く受け容れられているにもかかわらず、再現性、標準化の欠如及び試薬の過多、検出システム及びアッセイ条件などに問題が残されたままであり(Taylorら(2014), Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 22(8): 555-561)、これらの全てが、診断アッセイの開発をルーチンからほど遠いものとしている。
第１の観点において、本発明は、サンプル中のMAGEA4を検出する方法であって、
抗MAGEA4抗体を前記サンプルに２〜20μg/mlの範囲内の濃度で添加すること；
該抗体及び該サンプルをインキュベートすること；
該サンプルに結合した抗体を検出すること
を含んでなり、該抗体がOTI1F9である、方法を提供する。
抗MAGEA4抗体を前記サンプルに２〜20μg/mlの範囲内の濃度で添加すること；
該抗体及び該サンプルをインキュベートすること；
該サンプルに結合した抗体を検出すること
を含んでなり、該抗体がOTI1F9である、方法を提供する。
本発明者らは、特定の濃度の抗体が正確で再現可能なMAGEA4検出を可能にし、そのことにより、偽陽性及び偽陰性の結果が最小となることを見出した。
抗MAGEA4(又は「一次」抗体)はモノクローナル抗体であり得る。抗MAGEA4はヒト若しくはマウス抗体であり得、及び/又はIgA、IgD、IgE、IgG若しくはIgMサブタイプであり得る。当業者に公知であるように、MAGEA4は、MAGEファミリーの他のタンパク質に対して高レベルの配列相同を有する。したがって、偽陽性を最小とするために、一次抗体は、MAGEA4を特異的に認識することができ、腫瘍サンプルにおいて評価されたとき、他のMAGEファミリーメンバーとの交差反応性が限定的であるか又は無いことを証明されていることが好ましい。
抗MAGEA4(又は「一次」抗体)はモノクローナル抗体であり得る。抗MAGEA4はヒト若しくはマウス抗体であり得、及び/又はIgA、IgD、IgE、IgG若しくはIgMサブタイプであり得る。当業者に公知であるように、MAGEA4は、MAGEファミリーの他のタンパク質に対して高レベルの配列相同を有する。したがって、偽陽性を最小とするために、一次抗体は、MAGEA4を特異的に認識することができ、腫瘍サンプルにおいて評価されたとき、他のMAGEファミリーメンバーとの交差反応性が限定的であるか又は無いことを証明されていることが好ましい。
本明細書で用いる場合、用語「抗体」とは、別の分子に特異的に結合することにより、当該分子の特定の空間的又は極性的な構成と相補的であると規定されるイムノグロブリンをいう。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得、当該分野において周知の技法により、例えば、宿主の免疫化及び血清の収集により(ポリクローナル)、又はハイブリッド連続継代細胞株を作製し、分泌タンパク質を収集することにより(モノクローナル)、又は天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列若しくはその種々の変異バージョンをクローニングして発現させることにより、作製することができる。抗体は、完全なイムノグロブリン又はそのフラグメントを含み得る。イムノグロブリンは、種々のクラス及びアイソタイプ、例えばIgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3、IgMなどを含む。イムノグロブリンのフラグメントは、Fab、Fv及びF(ab')2、Fab'などを含み得る。加えて、適切であれば、特定の標的に対する結合親和性が維持される限り、イムノグロブリン又はそのフラグメントの凝集体、重合体及び接合体を使用することができる。用語「モノクローナル抗体」、「mAb」及び「MAB」は、抗原上の単一エピトープのみを認識するリンパ球の単一クローンにより産生されるイムノグロブリンである抗体をいう。例えば、本明細書に開示の方法に有用なモノクローナル抗体は、MAGEA4の１つの特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。用語「ポリクローナル抗体」は、本明細書中で用いる場合、同じ又は異なる抗原上の幾つかの異なる特異的抗原決定基に結合又は反応することができる異なる抗体分子の組成物をいう。ポリクローナル抗体の抗原特異性の多様性は、当該ポリクローナル抗体を構成する個々の抗体の可変領域、特に相補性決定領域(CDR)に位置する。
好適な抗MAGEA4抗体はOTI1F9であり、これは、Origeneから市販されているマウスIgG2aモノクローナル抗体(Cat# TA505362)である。CPTC-MAGEa4-1(Developmental Studies Hybridoma Bank - DSHB Cat# CPTC-MAGEA4-1，RRID:AB#2138142)を含む他の一次抗体も使用し得る。
抗体の濃度は、４〜15、４〜10、５〜13、６〜12、７〜11又は６、７、８、９、10、11又は12μg/mlの範囲内であり得る。好適な範囲は４〜10であり、好適な濃度は10μg/mlである。OTI1F9抗体を用いる本発明の実施形態において、用いる濃度は６〜12、７〜11又は９、10又は11μg/mlであり得、10μg/mlが好ましい。
インキュベーションの条件及び期間は、用いる特定の抗体に依存する。サンプル及び抗体は、30〜60、25〜50、25〜39、27〜35、28〜34、30〜33、31、32又は33分間36℃にてインキュベートされ得る。サンプル及び抗体は、上記期間のいずれかの間33〜39、34〜38、35〜37、35、36又は37℃にてインキュベートされ得る。本発明者らは、32分間36℃が最適な結果(特にOTI1F9について)をもたらすことを見出した。しかし、時間及び温度は変化し得る。例えば、より低い温度を用いる場合、インキュベーション時間はより長く、例えば４℃一晩であり得る。同じく、より高い温度を用いる場合、インキュベーション時間はより短くあり得る。
抗体の濃度は、４〜15、４〜10、５〜13、６〜12、７〜11又は６、７、８、９、10、11又は12μg/mlの範囲内であり得る。好適な範囲は４〜10であり、好適な濃度は10μg/mlである。OTI1F9抗体を用いる本発明の実施形態において、用いる濃度は６〜12、７〜11又は９、10又は11μg/mlであり得、10μg/mlが好ましい。
インキュベーションの条件及び期間は、用いる特定の抗体に依存する。サンプル及び抗体は、30〜60、25〜50、25〜39、27〜35、28〜34、30〜33、31、32又は33分間36℃にてインキュベートされ得る。サンプル及び抗体は、上記期間のいずれかの間33〜39、34〜38、35〜37、35、36又は37℃にてインキュベートされ得る。本発明者らは、32分間36℃が最適な結果(特にOTI1F9について)をもたらすことを見出した。しかし、時間及び温度は変化し得る。例えば、より低い温度を用いる場合、インキュベーション時間はより長く、例えば４℃一晩であり得る。同じく、より高い温度を用いる場合、インキュベーション時間はより短くあり得る。
サンプルに結合した抗MAGEA4抗体は、幾つかの技法により検出され得る。検出は直接的に又は間接的に行われてもよい。直接検出では、MAGEA4への抗体の結合は、標識試薬、例えば(更なる抗体相互作用なしで視覚化できる)蛍光タグ、酵素又は発色性若しくは蛍光性基質で標識された一次抗体を用いて、直接決定される。抗体は、発色反応を触媒することができる酵素、例えばペルオキシダーゼに接合されていてもよい。或いは、抗体は、蛍光体に付加されることもでき、よって免疫蛍光の原理を用いることができる。間接検出では、接合されていない一次抗体がMAGEA4に結合し、次いで標識二次抗体が一次抗体に結合する。適切な二次抗体は、一次抗体を惹起させた動物種の抗体アイソタイプに対して惹起され得る。例えば、二次抗体は、マウス抗体に結合することができる抗マウス抗体であり得る。二次抗体を用いる方法は、一次抗体に結合する複数の二次抗体からのシグナル増幅に起因して、直接検出法より高感度であり得る。二次抗体は、酵素標識、発色性基質又は蛍光性基質に接合されて抗原の視覚化をもたらし得る。適切な標識としては、酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びルシフェラーゼ、並びに量子ドット、蛍光体及び発色団を含む比色用試薬が挙げられる。視覚化試薬は、Dako/Agilent及びVentana/Rocheからの市販品のようなキットの一部として提供されてもよい。本発明の方法は好ましくは間接アッセイである。
二次抗体は、任意の適切な蛍光体に接着されていてもよい。特定の場合では、蛍光体は、クマリン、シアニン、ベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンザゾール、ボラポリアザインダセン及び/又はキサンテン(フルオレセイン、ローダミン及びロドールを含む)であり得る。
興味深い特異的蛍光染料としては、キサンテン染料、例えばフルオレセイン及びローダミン染料、例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6-カルボキシフルオレセイン(略号FAM及びFで一般に知られる)、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン(JOE又はJ)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA又はT)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX又はR)、5-カルボキシローダミン-6G、6-カルボキシローダミン-6G及びローダミン110；シアニン染料、例えば、Cy3、Cy5及びCy7染料；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド染料、例えばHoechst 33258；フェナントリジン染料、例えば、Texas Red；エチジウム染料；アクリジン染料；カルバゾール染料；フェノキサジン染料；ポルフィリン染料；ポリメチン染料、例えばシアニン染料、例えばCy3、Cy5など；BODIPY染料及びキノリン染料が挙げられる。対象の適用に広く用いられている興味深い特異的蛍光体としては、ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、FAM、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、R110、エオシン、JOE、R6G、テトラメチルローダミン、TAMRA、Lissamine、ナフトフルオレセイン、Texas Red、Cy3及びCy5などが挙げられる。
興味深い特異的蛍光染料としては、キサンテン染料、例えばフルオレセイン及びローダミン染料、例えばフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6-カルボキシフルオレセイン(略号FAM及びFで一般に知られる)、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン(JOE又はJ)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA又はT)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX又はR)、5-カルボキシローダミン-6G、6-カルボキシローダミン-6G及びローダミン110；シアニン染料、例えば、Cy3、Cy5及びCy7染料；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド染料、例えばHoechst 33258；フェナントリジン染料、例えば、Texas Red；エチジウム染料；アクリジン染料；カルバゾール染料；フェノキサジン染料；ポルフィリン染料；ポリメチン染料、例えばシアニン染料、例えばCy3、Cy5など；BODIPY染料及びキノリン染料が挙げられる。対象の適用に広く用いられている興味深い特異的蛍光体としては、ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、FAM、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、R110、エオシン、JOE、R6G、テトラメチルローダミン、TAMRA、Lissamine、ナフトフルオレセイン、Texas Red、Cy3及びCy5などが挙げられる。
本発明に有用である適切な識別可能な蛍光標識対としては、Cy-3及びCy-5(Amersham Inc.，Piscataway，N.J.)、Quasar 570及びQuasar 670(Biosearch Technology，Novato Calif.)、Alexafluor555及びAlexafluor647(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)、BODIPY V-1002及びBODIPY V1005(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)、POPO-3及びTOTO-3(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)、並びにPOPRO3及びTOPRO3(Molecular Probes，Eugene，Oreg.)が挙げられる。更に適切な識別可能な検出標識は、Krickaら(Ann Clin Biochem. 39:114-29，2002)、Riedら(Proc. Natl. Acad. Sci. 1992: 89: 1388-1392)及びTankeら(Eur. J. Hum. Genet. 1999 7:2-11)などに見出され得る。
抗体結合は、蛍光顕微鏡及び各蛍光体に適切なフィルターを用いて、又は複数の蛍光体を見るための二重若しくは三重バンドパスフィルターセット(例えば、米国特許第5776688号)により観察することができる
抗体結合は、蛍光顕微鏡及び各蛍光体に適切なフィルターを用いて、又は複数の蛍光体を見るための二重若しくは三重バンドパスフィルターセット(例えば、米国特許第5776688号)により観察することができる
種々の検出可能な酵素基質が、酵素標識抗体を用いる場合に利用可能である。これら酵素基質としては、発色性基質、例えばpNNP、BCIP/NBT(5-ブロモ-4-クロロ-3'-インドリルリン酸/ニトロ-ブルーテトラゾリウム)、TMB(テトラメチルベンジジン)、DAB(3,3'-ジアミノベンジジン)、OPD(オルト-フェニレンジアミンジヒドロクロリド)及びABTS(2,2'-アジノビス[-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸])並びに化学発光性基質、例えばECL(増強化学発光)標識又はアクリジニウムエステル(AE)が挙げられる。抗体結合は、光学顕微鏡を用いて観察することができる。OTI1F9は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)又は蛍光体、例えばAlexa Fluor(登録商標) Plus 488に接合されていてもよい二次抗マウス抗体を用いて検出され得る。このような二次抗体は当該分野において公知である。
二次抗体は、好ましくは、HRPに接合されていてもよく、HRP標識抗体のカクテル(ヤギ抗マウスIgG、ヤギ抗マウスIgM及びヤギ抗ウサギ)を含んでいてもよい。抗MAGEA4抗体/二次抗体複合体は、好ましくは、過酸化水素基質及び3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)を用いて視覚化され得る。過酸化水素基質は0.4％であり得、3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)色原体は0.2％であり得る。好ましくは、酢酸緩衝剤中の硫酸銅(５g/L)を用いて染色を増強させる。染色は光学顕微鏡観察により評価し得る。
二次抗体は、好ましくは、HRPに接合されていてもよく、HRP標識抗体のカクテル(ヤギ抗マウスIgG、ヤギ抗マウスIgM及びヤギ抗ウサギ)を含んでいてもよい。抗MAGEA4抗体/二次抗体複合体は、好ましくは、過酸化水素基質及び3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)を用いて視覚化され得る。過酸化水素基質は0.4％であり得、3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)色原体は0.2％であり得る。好ましくは、酢酸緩衝剤中の硫酸銅(５g/L)を用いて染色を増強させる。染色は光学顕微鏡観察により評価し得る。
Ventana/Rocheにより提供される検出キットを、指示通りのタイミングで用いてもよい。他の検出キットを用いることもできる。好ましくは、抗MAGEA4抗体(例えばOTI1F9)は、Ventana Medical Systems(product code 760-500)により供給されるultraView検出キットを用いて、スライドをHRP-マルチマー中で20分間36℃にてインキュベートして検出される。この場合、褐色の沈降物の出現がMAGEA4の存在を示し、当該被験体がMAGE-A4標的療法での処置に適格である可能性を示す。
染色は対照と比較されてもよい。対照は、染色の妥当性を支持するため及び実験アーチファクトを同定するために有用である。幾つかの場合、対照は参照サンプル又は参照データセットであり得る。参照は、既知の程度の適切性を有する被験体から以前に取得したサンプルであり得る。参照は、参照サンプルを分析して取得したデータセットであり得る。対照は、標的分子が存在するか又は高レベルで発現していることが既知である陽性対照であってもよいし、標的分子が存在しないか又は低レベルで発現していることが既知である陰性対照であってもよい。適切な陽性対照組織は精巣であり、適切な陰性対照組織は卵巣である。
染色は対照と比較されてもよい。対照は、染色の妥当性を支持するため及び実験アーチファクトを同定するために有用である。幾つかの場合、対照は参照サンプル又は参照データセットであり得る。参照は、既知の程度の適切性を有する被験体から以前に取得したサンプルであり得る。参照は、参照サンプルを分析して取得したデータセットであり得る。対照は、標的分子が存在するか又は高レベルで発現していることが既知である陽性対照であってもよいし、標的分子が存在しないか又は低レベルで発現していることが既知である陰性対照であってもよい。適切な陽性対照組織は精巣であり、適切な陰性対照組織は卵巣である。
対照は、処置の利益を享受することが既知である被験体に由来するサンプルであり得る。組織は、試験するサンプルと同じタイプのものであり得る。例えば、被験体由来の腫瘍組織のサンプルは、処置に適切であることが既知の被験体、例えば処置に以前に応答した被験体に由来する腫瘍組織の対照サンプルと比較され得る。幾つかの場合、対照は、試験サンプルと同じ被験体から取得したものであるが、健常であることが既知の組織に由来するサンプルであり得る。よって、被験体からのガン組織のサンプルは、非ガン組織サンプルと比較されてもよい。幾つかの場合、対照は細胞培養サンプルである。幾つかの場合、試験サンプルは、抗体とのインキュベーションの前に、当該サンプルに固有のバックグランド染色レベルを測定するために分析される。幾つか場合、アイソタイプ対照を用いる。アイソタイプ対照は、標的特異的抗体と同じクラスの抗体を用いるが、サンプルと免疫反応性ではない。このような対照は、標的特異的抗体の非特異的相互作用の識別に有用である。
試験結果を確実に正確に解釈するため、形態学及び免疫組織化学の解釈が病理学者により行われてもよい。その方法には、発現パターンが予測パターンと相関することの確証が含まれ得る。方法には、標的シグナル対ノイズ比が閾値レベルを超えることにより、特異的シグナルと非特異的バックグランドシグナルとの明確な識別が可能であることの検証を含み得る。
試験結果を確実に正確に解釈するため、形態学及び免疫組織化学の解釈が病理学者により行われてもよい。その方法には、発現パターンが予測パターンと相関することの確証が含まれ得る。方法には、標的シグナル対ノイズ比が閾値レベルを超えることにより、特異的シグナルと非特異的バックグランドシグナルとの明確な識別が可能であることの検証を含み得る。
MAGEA4の検出は、随意に又は追加的に、サンプル中のMAGEA4発現レベルの測定を含んでいてもよい。MAGEA4レベルは定量的又は半定量的に測定され得る。MAGEA4レベルがサンプル中で上昇しているか又は過剰発現している場合、被験体は処置に適切であると決定されてもよいし、処置について選択されてもよい。幾つかの場合、MAGEA4レベルは対照との比較で決定される。
最終的に、患者の処置についての適格性の決定は、IHC手順に熟達した有資格の病理学者が行う。
本発明の方法に用いるサンプルは細胞株であってもよく、細胞株はヒト由来であり得る。或いは、そして好ましくは、サンプルは被験体(ヒトであり得る)からの組織サンプルである。サンプルはヒト腫瘍組織サンプルであり得る。
最終的に、患者の処置についての適格性の決定は、IHC手順に熟達した有資格の病理学者が行う。
本発明の方法に用いるサンプルは細胞株であってもよく、細胞株はヒト由来であり得る。或いは、そして好ましくは、サンプルは被験体(ヒトであり得る)からの組織サンプルである。サンプルはヒト腫瘍組織サンプルであり得る。
用語「サンプル」は、本明細書で用いる場合、被験体から取得される種々のサンプルタイプを包含し、診断又はモニタリングアッセイに用いることができる。サンプルは、健常組織、疾患組織、又は疾患組織であると疑われる組織のサンプルであり得る。サンプルは、生検、例えば手術手順の間に採取した生検であり得る。サンプルは、細いニードルによる吸引、掻き取り又は体腔の洗浄より細胞又は組織を収集し得る。サンプルは、腫瘍(例えば充実腫瘍及び造血性腫瘍)及び近接する健常組織のものであり得る。サンプルは、個々の細胞のスメア又は組織切片であり得る。この用語は、血液及び生物起源の他の液状サンプル、固体組織サンプル、例えば生検標本又は組織培養物若しくはそれに由来する細胞及びその子孫を包含する。この用語は、調達後に任意の方法で、例えば試薬での処理、可溶化又は特定成分の富化により、操作されたサンプルを包含する。この用語は、臨床サンプルを包含し、細胞培養物の細胞、細胞上清、細胞溶解物、細胞抽出物、細胞ホモジネート及び細胞成分(合成タンパク質、血清、血漿、体液その他の生物学的液体)及び組織サンプルも含む。生物学的サンプルは、天然状態で当該細胞又は組織と混合していない化合物、例えば保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養物、抗生物質などを含んでいてもよい。１つの実施形態では、サンプルは、凍結サンプル又はホルムアルデヒド若しくはパラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋(FFPE)組織標本として保存される。例えば、サンプルは、マトリクス、例えばFFPEブロック又は凍結サンプル中に包埋することができる。サンプルは、本発明の方法の実施のために直接調製してもよいし、或いは、保管されたサンプルを用いてもよい。
本発明の方法は、追加的に、サンプルへの抗MAGEA4抗体の添加前に、１又は２以上の前処理工程を含んでいてもよい。
前処理は、サンプルへの抗MAGEA4抗体の添加前の、エピトープ回復若しくは顕在化工程を含み得る。ホルマリンによる組織の固定は、アルデヒドと組織中に存在するアミノ基との間の共有結合の形成を生じる。この結合の形成は、タンパク質を変性させ、抗原性の喪失をもたらす。加えて、ホルムアルデヒドは、組織タンパク質を架橋するメチレンブリッジを形成し得、このため、大きな分子(例えば抗体)の組織透過性が減少し得る。pH及び温度を組み合わせてこれら結合を除去することにより、タンパク質分子の復元及び抗体接近性増大が可能になる。これら変化は、抗体結合の顕著な増大及びS/N比の向上を生じることが多い。一般に、エピトープ回復に適切な任意の緩衝剤−特に、Ventana/Rocheにより供給されるもの-がこの工程に適切である。エピトープ回復又は顕在化工程に用いられる緩衝剤は、EDTAベース(pH８〜９)又はクエン酸ベース(pH６)であり得る。本発明者らは、EDTAベースの緩衝剤がクエン酸緩衝剤と比較して良好な細胞外観をもたらすことを見出した。適切な緩衝剤は、10mM Tris塩基、１mM EDTA、0.05％ Tween 20, pH 8.0を含有し得る；このような緩衝剤は市販されており、例えば、Ventana Medical Systemsが供給する細胞コンディショニング液１(product code 950-124)であり得る。この工程を行う時間及び温度は、形態学的外見と組織破壊との間の適正なバランスが達成されるとの条件で、変化し得る。温度が高ければ、一般に、短いインキュベーションで済む一方、低い温度では、一般に、長いインキュベーションが必要となる。エピトープ回復工程の温度は、80〜110、90〜100、92〜108、94、95又は96℃であり得る。エピトープ回復工程の期間は、10〜30、12〜28、13〜27、14〜26、15〜25、16〜24、17〜23、18〜22、18、19、20、21又は22分間であり得る。好適なエピトープ回復工程は、95℃にて20分間行われ、好適な緩衝剤はVentana Medical Systemsにより供給される細胞コンディショニング液１である(product code 950-124)。
前処理は、サンプルへの抗MAGEA4抗体の添加前の、エピトープ回復若しくは顕在化工程を含み得る。ホルマリンによる組織の固定は、アルデヒドと組織中に存在するアミノ基との間の共有結合の形成を生じる。この結合の形成は、タンパク質を変性させ、抗原性の喪失をもたらす。加えて、ホルムアルデヒドは、組織タンパク質を架橋するメチレンブリッジを形成し得、このため、大きな分子(例えば抗体)の組織透過性が減少し得る。pH及び温度を組み合わせてこれら結合を除去することにより、タンパク質分子の復元及び抗体接近性増大が可能になる。これら変化は、抗体結合の顕著な増大及びS/N比の向上を生じることが多い。一般に、エピトープ回復に適切な任意の緩衝剤−特に、Ventana/Rocheにより供給されるもの-がこの工程に適切である。エピトープ回復又は顕在化工程に用いられる緩衝剤は、EDTAベース(pH８〜９)又はクエン酸ベース(pH６)であり得る。本発明者らは、EDTAベースの緩衝剤がクエン酸緩衝剤と比較して良好な細胞外観をもたらすことを見出した。適切な緩衝剤は、10mM Tris塩基、１mM EDTA、0.05％ Tween 20, pH 8.0を含有し得る；このような緩衝剤は市販されており、例えば、Ventana Medical Systemsが供給する細胞コンディショニング液１(product code 950-124)であり得る。この工程を行う時間及び温度は、形態学的外見と組織破壊との間の適正なバランスが達成されるとの条件で、変化し得る。温度が高ければ、一般に、短いインキュベーションで済む一方、低い温度では、一般に、長いインキュベーションが必要となる。エピトープ回復工程の温度は、80〜110、90〜100、92〜108、94、95又は96℃であり得る。エピトープ回復工程の期間は、10〜30、12〜28、13〜27、14〜26、15〜25、16〜24、17〜23、18〜22、18、19、20、21又は22分間であり得る。好適なエピトープ回復工程は、95℃にて20分間行われ、好適な緩衝剤はVentana Medical Systemsにより供給される細胞コンディショニング液１である(product code 950-124)。
随意に、エピトープ回復工程において、酵素(例えばプロテアーゼ)を添加してもよい。用いるプロテアーゼは、任意の適切なプロテアーゼであり得、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼを含み得る。用いるプロテアーゼは、トリプシン(例えばウシ由来)、キモトリプシン(例えばウシ由来)、エンドプロテイナーゼAsp-N(例えばPseudomonas fragi由来)、エンドプロテイナーゼArg-C(例えばマウス顎下腺由来及びClostridium histolyticum由来)、エンドプロテイナーゼGlu-C(例えばStaphylococcus aureus由来)、エンドプロテイナーゼLys-C(例えばLysobacter enzymogenes由来)、ペプシン(例えばブタ由来)、サーモリシン(例えば、Bacillus thermoproteolyticus由来)、エラスターゼ、パパイン(例えば、Carica papaya由来)、プロテイナーゼＫ(例えばTritirachium album由来)、サブチリシン(例えばBacillus subtilis由来)、プロテイナーゼＫ、フリン及びフィシンからなる群より選択され得る。
本発明の方法は、随意に、特にサンプルが組織サンプルである場合、以下の前処理工程の１又は２以上(好ましくは全て)を含む。
本発明の方法は、随意に、特にサンプルが組織サンプルである場合、以下の前処理工程の１又は２以上(好ましくは全て)を含む。
サンプルは、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害する試薬で処理してもよく、内因性ペルオキシダーゼは、過酸化水素と反応して3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)基質又は(組織の非特異的染色を生じる)他のペルオキシダーゼ基質を還元する。内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害する最も一般的な方法は、過酸化水素溶液中でのサンプルのインキュベーションである。過酸化水素の適切な濃度は３％ v/vであり得、或いは、例えばより高い濃度では組織損傷が明らかな場合、0.3％溶液を用い得る。メタノール、PBS、蒸留水又は生理食塩水を用いて過酸化水素を希釈することができる。この工程は、サンプルが腫瘍サンプルであり、発色検出にHRP標識抗体が含まれる場合に、特に好適である。内因性ペルオキシダーゼの阻害は、エピトープ回復の前若しくは後又は一次抗体インキュベーション工程の前及び後に行うことができる。１つの好適な実施形態において、内因性ペルオキシダーゼは、(存在する場合)エピトープ回復工程の後に阻害される。１つの更なる好適な実施形態において、インヒビターは３％過酸化水素を含んでなり、業者から入手される。インヒビターは、Ventana Medical Systemsにより供給されるultraView Universal DABインヒビター(product code 253-4291)であり得る。サンプルは、十分な阻害を確実にするため、DABインヒビターに少なくとも５、６、７、８、９、10又は11分間、室温にて暴露され得る。室温にて少なくとも８分間が好適である。この前処理工程は60分間まで又は15分間までであり得る；８〜15分間が好適である。
本発明の方法は、ブロッキング試薬中でのインキュベーション工程を更に含んでなり得る。この工程は、バックグランドシグナルを低減することができ、サンプルが細胞株である場合には、随意選択の工程であり得る。原理上、標的抗原にも本発明の方法に用いる抗体にも特異的に結合せず、アッセイ中の他の検出試薬にも結合しない任意のタンパク質をブロッキングに用いることができる。しかし、実際には、特定のタンパク質が他のものより良好にブロッキングを行う。なぜならば、それらタンパク質は、非特異部位(反応性部位とも呼ぶ)に中性pHで容易に結合するか、又は他のアッセイ成分の機能を安定化するからである。ブロッキング剤の例として、正常血清、例えばヤギ血清及び/又はタンパク質、例えばアルブミン、ゼラチン、カゼイン又は粉乳が挙げられる。広範な市販のブロッキング緩衝剤が利用可能である。１つの好適な実施形態において、ブロッキング緩衝剤はヤギグロブリン及びカゼインを含有する。例えば、20％ヤギグロブリン及びカゼインを含有する100mMリン酸緩衝剤。好適な市販ブロッキング試薬は、Ventana Medical Systemsにより供給されるカゼイン含有Antibody Diluent(product code 760-219)である。IHC用のブロッキング工程は、好ましくは、他の全てのサンプル前処理工程の完了後、サンプルと一次抗体とのインキュベーションの直前に行われる。ブロッキング試薬とのインキュベーションは、36℃にて７〜20、８〜16、９〜15、10〜14、11〜13、11、12又は13分間であり得る。ブロッキング試薬とのインキュベーションは、33〜39、34〜38、35〜37、35、36又は37℃での上記いずれかの期間であり得る。本発明者らは、36℃にて12分間が最適な結果をもたらすことを見出した。しかし、期間及び温度は変化し得る。例えば、より低い温度を用いる場合、インキュベーション時間はより長くなり得る。例えば、ブロッキング試薬とのインキュベーションは、４℃にて一晩行われ得る。同様に、より高い温度を用いる場合、インキュベーションはより短くなり得る。
上記のとおり、サンプルは、ホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒド固定パラフィン-包埋(FFPE)組織標本として保存され得る。この場合、本発明の方法は、脱パラフィン化サンプルについて行われるか、又は初期に脱パラフィン化工程を含む。脱パラフィン化の適切な条件は当業者に公知である。
パラフィンワックスは溶媒交換により、例えば、サンプルをパラフィン溶媒(例えば、キシレン、トルエン又はリモネン)に暴露し、次いで溶媒をアルコールにより除去することにより除去され得る。ここで、アルコールは、最終的に組織が水又は水溶液により浸潤さら易くなるまで、アルコール濃度が漸減する系列アルコール/水混合物により除去される。サンプルに水が浸潤することにより、水溶性化学及び免疫化学染料による細胞抗生物質の染色が可能となる。
パラフィンワックスは溶媒交換により、例えば、サンプルをパラフィン溶媒(例えば、キシレン、トルエン又はリモネン)に暴露し、次いで溶媒をアルコールにより除去することにより除去され得る。ここで、アルコールは、最終的に組織が水又は水溶液により浸潤さら易くなるまで、アルコール濃度が漸減する系列アルコール/水混合物により除去される。サンプルに水が浸潤することにより、水溶性化学及び免疫化学染料による細胞抗生物質の染色が可能となる。
毒性パラフィン溶媒(例えば、キシレン及びトルエン)は、より毒性の低い非極性有機溶媒、例えばテルペンオイル(例えばAmeriClearTM，Baxter Healthcare Diagnostics，McGaw Park，IL)、イソパラフィン系炭化水素、例えばMicron Diagnostics(Fairfax，VA)のMicroClearTM及びヒストレン(96％ d-リモネンである脱ろう剤)(Fronine Pty Ltd，Riverstone，New South Wales，Australia)で置換し得る。自動化方法を用い得る。例えば、Ventana Medical Systemsの米国特許第6544798号は、界面活性剤を含む温水のみを用いて組織切片からパラフィンワックスを除去する自動化方法を記載する。このプロセスは、液化パラフィンと温水との非混和性を利用することによる組織からの液化パラフィンの物理的分配に依拠する。このプロセスは、BENCHMARK(登録商標)シリーズの自動組織染色装置に広範に用いられる。水及び乳化界面活性剤に基づく関連方法は、米国特許第6649368号に見出される。米国特許第6632598号(Zhangら)は、パラフィン包埋組織の脱パラフィン化のための方法及び組成物を記載する。この方法は、組織化学的分析の前に、パラフィンワックス包埋標本を脱ろう組成物と接触させて、標本に含浸したワックスを可溶化させることを含む。脱ろう組成物は、具体的には、芳香族炭化水素、テルペン及びイソパラフィン系炭化水素からなる群より選択されるパラフィン可溶化有機溶媒と、極性有機溶媒と、標本に結合したワックスを可溶化させる界面活性剤とを含む。本組成物は水を更に含んでなり得る。
好適な脱パラフィン化工程は、サンプルを60℃に30分間加温してワックスを溶融させた後、サンプルを適切な洗剤水溶液中69℃にて８分間の３回インキュベートすることを含んでなる。適切な市販緩衝剤はVentana Medical Systemsにより供給されるEZ-Prep(product code 950-102)である。初期加温の代表的な温度範囲は50〜70℃であり、反応緩衝剤とのインキュベーションの代表的な温度範囲は68〜71度である。この温度範囲未満でのサンプル処理は、サンプル中のワックス残存及びエピトープのアクセス効率の低下を生じ得る一方、この範囲を超える温度は組織破壊を生じ得る。更に、サイクル数は増加(例えば４、５又は６回に)又は減少(例えば１又は２回に)させることができる。サイクルの増加は、サイクル長の減少(例えば３、４、５、６又は７分間に)を含み得る。サイクルの減少は、サイクル長の増加(例えば９、10、11、12又は13分間に)を含み得る。
１つの好適な本発明の方法は下記の工程：
サンプルを、例えばサンプルを60℃に30分間加温した後、該サンプルを反応緩衝剤(例えば、EZ-Prep溶液)中69℃にて８分間の３回インキュベートすることにより、脱パラフィン化する工程；
エピトープを、例えばサンプルを細胞コンディショニング液１中95℃にて20分間インキュベートすることにより、回復させる工程；
内因性ペルオキシダーゼ活性を、例えばサンプルをDABインヒビター中室温にて８分間インキュベートすることにより、阻害する工程；
サンプルをブロッキング試薬中、随意に36℃にて12分間、インキュベートする工程；
抗体OFI1F9をサンプルに10μg/mlの濃度で添加する工程；
抗体及びサンプルを36℃にて32分間インキュベートする工程；及び
サンプルに結合した抗体を検出する工程
を含んでなる。
サンプルを、例えばサンプルを60℃に30分間加温した後、該サンプルを反応緩衝剤(例えば、EZ-Prep溶液)中69℃にて８分間の３回インキュベートすることにより、脱パラフィン化する工程；
エピトープを、例えばサンプルを細胞コンディショニング液１中95℃にて20分間インキュベートすることにより、回復させる工程；
内因性ペルオキシダーゼ活性を、例えばサンプルをDABインヒビター中室温にて８分間インキュベートすることにより、阻害する工程；
サンプルをブロッキング試薬中、随意に36℃にて12分間、インキュベートする工程；
抗体OFI1F9をサンプルに10μg/mlの濃度で添加する工程；
抗体及びサンプルを36℃にて32分間インキュベートする工程；及び
サンプルに結合した抗体を検出する工程
を含んでなる。
抗体の検出は、ultraView検出キットを製造業者の指示通りに用いて行い得る。
本発明に従うIHCは自動染色システムを用いて行い得る。好ましくは、自動染色システムはVentana BenchMark ULTRAである。代替のスライド染色システムとして、Ventana BenchMark GX、Ventana BenchMark GT、Dako Autostainer Link 48、Dako Omnis、Leica BOND-III及びLeica BOND-MAXが挙げられる。
本発明の方法は単独で用いてもよく、他のアッセイ(他の形態学的染色、インサイチュハイブリダイゼーション、qRT-PCT、ELISA、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、FACSを含むがこれらに限定されない)との組合せで用いてもよい。
本発明の方法は、腫瘍サンプル中のMAGEA4タンパク質の存在を決定する診断キットの一部として提供されてもよい。好ましくは、キットは、MAGEA4標的療法に対する患者の適格性を決定するために用いられる。キットは、抗MAGEA4抗体を含んでなってもよく、随意に本発明の方法の実施に必要な試薬との組合せで含んでいてもよい。
本発明に従うIHCは自動染色システムを用いて行い得る。好ましくは、自動染色システムはVentana BenchMark ULTRAである。代替のスライド染色システムとして、Ventana BenchMark GX、Ventana BenchMark GT、Dako Autostainer Link 48、Dako Omnis、Leica BOND-III及びLeica BOND-MAXが挙げられる。
本発明の方法は単独で用いてもよく、他のアッセイ(他の形態学的染色、インサイチュハイブリダイゼーション、qRT-PCT、ELISA、ウェスタンブロッティング、プロテオミクス、FACSを含むがこれらに限定されない)との組合せで用いてもよい。
本発明の方法は、腫瘍サンプル中のMAGEA4タンパク質の存在を決定する診断キットの一部として提供されてもよい。好ましくは、キットは、MAGEA4標的療法に対する患者の適格性を決定するために用いられる。キットは、抗MAGEA4抗体を含んでなってもよく、随意に本発明の方法の実施に必要な試薬との組合せで含んでいてもよい。
キットは、ポイント・オブ・ケアのインビトロ診断検査に適切であり得る。キットは、検査室ベースの検査用であり得る。キットは、使用説明書(例えば小冊子又はリーフレットの形態)を含み得る。説明書は、本発明の方法を実施するためのプロトコルを含み得る。説明書は、IHCアッセイを行うためのプロトコルを含んでいてもよい。説明書は、異なるタイプのサンプルについて当該検査を適用するための方法及び示唆を含んでいてもよい。説明書は、当該検査から取得した結果を最適化するため、例えばS/N比を最小化するための方法及び示唆を提供してもよい。
本発明の方法は、MAGEA4標的療法に適格な患者を特定するためのコンパニオン診断としての使用に特に適切である。したがって、別の１つの観点で、本発明は、必要とするヒト又は哺乳動物被験体を処置する方法(有利には、個人に合わせた又は個別化された処置(MAGEA4標的療法を含む)を含んでなる)を提供し、当該方法は、
該被験体からのサンプルに抗MAGEA4抗体を２〜20μg/mlの範囲内の濃度で添加することにより、該サンプル中のMAGEA4を検出すること；抗体及びサンプルをインキュベートすること；及びdetectingサンプルに結合した抗体を検出すること
を含んでなり、サンプル中にMAGEA4が検出されれば、MAGEA4標的療法を該被験体に施術する。
本発明の方法は、MAGEA4標的療法に適格な患者を特定するためのコンパニオン診断としての使用に特に適切である。したがって、別の１つの観点で、本発明は、必要とするヒト又は哺乳動物被験体を処置する方法(有利には、個人に合わせた又は個別化された処置(MAGEA4標的療法を含む)を含んでなる)を提供し、当該方法は、
該被験体からのサンプルに抗MAGEA4抗体を２〜20μg/mlの範囲内の濃度で添加することにより、該サンプル中のMAGEA4を検出すること；抗体及びサンプルをインキュベートすること；及びdetectingサンプルに結合した抗体を検出すること
を含んでなり、サンプル中にMAGEA4が検出されれば、MAGEA4標的療法を該被験体に施術する。
このような療法として、可溶性生物製剤、細胞療法及びワクチンが挙げられる。適切な療法は、Ｔ細胞に再指向化された抗CD3抗体フラグメントに融合された、MAGEA4のHLA制限エピトープに対して高親和性を有する可溶性の操作されたＴ細胞レセプターを含んでなる二重特異性分子である。このような二重特異性分子の好適な例はWO2017175006に記載される。他のMAGEA4標的療法として、Adaptimmune(WO2017174824、臨床試験番号：NCT03132922)、Immatics(WO2017158103)、Adicet Bio(WO2016199141)及びタカラバイオ(臨床試験番号：NCT02096614)により開発中のものが挙げられるが、これらに限定されない。
方法は、MAGEA4を発現することが知られている任意の腫瘍タイプ(好ましくは、肺ガン(NSCLCを含む)、食道ガン、頭頸部ガン又は尿路上皮/膀胱ガン並びにメラノーマ)を有する患者を処置するために用い得る。
本発明の各観点の好適な特徴は、必要な変更を加えて本発明の他の観点の各々にも該当する。本明細書中で言及する先行技術文献は、参照により、法が許容する最大限で本明細書に組み込まれる。
ここから、本発明を下記の非限定的な実施例において更に説明する。添付図面についても言及する。
方法は、MAGEA4を発現することが知られている任意の腫瘍タイプ(好ましくは、肺ガン(NSCLCを含む)、食道ガン、頭頸部ガン又は尿路上皮/膀胱ガン並びにメラノーマ)を有する患者を処置するために用い得る。
本発明の各観点の好適な特徴は、必要な変更を加えて本発明の他の観点の各々にも該当する。本明細書中で言及する先行技術文献は、参照により、法が許容する最大限で本明細書に組み込まれる。
ここから、本発明を下記の非限定的な実施例において更に説明する。添付図面についても言及する。
実施例
実施例１-腫瘍サンプル中のMAGEA4の検出のためのIHC診断アッセイ
1.1 ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織サンプルの調製
組織サンプルを約５mmのスライスに切り出し、20×組織体積に等しい最少体積の10％ NBF中で24時間(範囲16〜36時間)固定した。組織標本は、ホルマリンの効率的な灌流が可能となるよう寸法の１つが５mmを超えないようにした(例えば10mm×10mm×５mm)。サンプルが大きければ(例えば10mm×10mm×10mm)、２片(又は３片以上)に切断して、各サンプルについて、寸法の１つが５mm以下となるようにした(例えば、各々10mm×10mm×５mmの２サンプルに切断した)。組織を24時間後にホルマリンから取り出し、70％エタノール中で１回洗浄し、標識組織カセット内に置いた。サンプルカセットを組織プロセッサー内に搭載して、遅延開始特徴を用いる３ワックスタンクプログラムにより加工処理した(プログラム：２×１時間 室温 75％エタノール；２×１時間 室温 90％エタノール；２×１時間 室温 100％エタノール、３×１時間 室温 キシレン；３×80分間 60℃ ワックス)。
プログラムが終了しとき、サンプルカセットを組織プロセッサーから取り出し、続いて適切な配向でパラフィンワックス中に包埋した(FFPEフォーマット)。十分に固化し冷却したとき、ワックスブロックを４℃で保存した。
染色アッセイをアーカイブ化されたFFPEサンプルを用いて行う場合、サンプルの品質検査(QC)を行い、サンプルが適切に固定されており、偽陰性が低減されることを確証することが好ましい。QC検査はPTENに対する抗体を用いて行い得る。
実施例１-腫瘍サンプル中のMAGEA4の検出のためのIHC診断アッセイ
1.1 ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織サンプルの調製
組織サンプルを約５mmのスライスに切り出し、20×組織体積に等しい最少体積の10％ NBF中で24時間(範囲16〜36時間)固定した。組織標本は、ホルマリンの効率的な灌流が可能となるよう寸法の１つが５mmを超えないようにした(例えば10mm×10mm×５mm)。サンプルが大きければ(例えば10mm×10mm×10mm)、２片(又は３片以上)に切断して、各サンプルについて、寸法の１つが５mm以下となるようにした(例えば、各々10mm×10mm×５mmの２サンプルに切断した)。組織を24時間後にホルマリンから取り出し、70％エタノール中で１回洗浄し、標識組織カセット内に置いた。サンプルカセットを組織プロセッサー内に搭載して、遅延開始特徴を用いる３ワックスタンクプログラムにより加工処理した(プログラム：２×１時間 室温 75％エタノール；２×１時間 室温 90％エタノール；２×１時間 室温 100％エタノール、３×１時間 室温 キシレン；３×80分間 60℃ ワックス)。
プログラムが終了しとき、サンプルカセットを組織プロセッサーから取り出し、続いて適切な配向でパラフィンワックス中に包埋した(FFPEフォーマット)。十分に固化し冷却したとき、ワックスブロックを４℃で保存した。
染色アッセイをアーカイブ化されたFFPEサンプルを用いて行う場合、サンプルの品質検査(QC)を行い、サンプルが適切に固定されており、偽陰性が低減されることを確証することが好ましい。QC検査はPTENに対する抗体を用いて行い得る。
1.2 染色アッセイ
アッセイは、下記のプロトコルに従って、Ventana BenchMark ULTRA自動化IHC/ISHスライド染色システム(Ventana Medical Systems Inc. USA)を用いて行った。
アッセイ試薬
- 一次抗体 - マウスモノクローナル抗MAGE A4抗体(Clone OTI1F9、Origene Cat# TA505362)、ブロッキング試薬中に濃度10μg/ml(範囲４〜10μg/ml)に希釈
- EZ-Prep溶液(Ventana, Cat# 950-102)[洗剤水溶液]
- 細胞コンディショニング液１(Ventana, Cat# 950-124)(Tris-EDTA緩衝剤、pH８〜９)
- ブロッキング試薬 - カゼイン(Ventana, Cat# 760-219)(＜20mMのタンパク質(カゼイン及びヤギグロブリン)、＜50mMの塩、＜15mMのEDTA、brij洗剤及び保存剤(0.05％ ProClin 300)を含有する100mMリン酸緩衝剤)で希釈
- ultraView universal DAB検出キット(Ventana, Cat#760-500)、HRPマルチマー - HRP標識抗体(ヤギ抗マウスIgG及びIgM＋ヤギ抗ウサギ)のカクテル(＜50ug/ml)；3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)色素原(0.2％)；リン酸緩衝剤中の過酸化水素(0.04％)；酢酸緩衝剤中の硫酸銅(５g/L))を含む。
アッセイは、下記のプロトコルに従って、Ventana BenchMark ULTRA自動化IHC/ISHスライド染色システム(Ventana Medical Systems Inc. USA)を用いて行った。
アッセイ試薬
- 一次抗体 - マウスモノクローナル抗MAGE A4抗体(Clone OTI1F9、Origene Cat# TA505362)、ブロッキング試薬中に濃度10μg/ml(範囲４〜10μg/ml)に希釈
- EZ-Prep溶液(Ventana, Cat# 950-102)[洗剤水溶液]
- 細胞コンディショニング液１(Ventana, Cat# 950-124)(Tris-EDTA緩衝剤、pH８〜９)
- ブロッキング試薬 - カゼイン(Ventana, Cat# 760-219)(＜20mMのタンパク質(カゼイン及びヤギグロブリン)、＜50mMの塩、＜15mMのEDTA、brij洗剤及び保存剤(0.05％ ProClin 300)を含有する100mMリン酸緩衝剤)で希釈
- ultraView universal DAB検出キット(Ventana, Cat#760-500)、HRPマルチマー - HRP標識抗体(ヤギ抗マウスIgG及びIgM＋ヤギ抗ウサギ)のカクテル(＜50ug/ml)；3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)色素原(0.2％)；リン酸緩衝剤中の過酸化水素(0.04％)；酢酸緩衝剤中の硫酸銅(５g/L))を含む。
プロトコル
スライドを30分間60℃にて乾燥させた。スライドを反応緩衝剤中69℃にて８分間の３回インキュベートすることにより脱パラフィン化した。次いで、細胞コンディショニング液１中で95℃にて20分間エピトープ回復を行った。続いて、スライドをDABインヒビター(ultraView検出キットの構成成分)中室温にて８分間インキュベートした後、ブロッキング試薬中36℃にて12分間インキュベートした。一次抗体をスライドあたり約100μlで自動分注し、スライドを36℃にて32分間インキュベートした。抗体検出はultraView検出キットを製造業者の指示通りに用いて行った。スライドをHRPマルチマー中36℃にて20分間インキュベートした。
スライドを30分間60℃にて乾燥させた。スライドを反応緩衝剤中69℃にて８分間の３回インキュベートすることにより脱パラフィン化した。次いで、細胞コンディショニング液１中で95℃にて20分間エピトープ回復を行った。続いて、スライドをDABインヒビター(ultraView検出キットの構成成分)中室温にて８分間インキュベートした後、ブロッキング試薬中36℃にて12分間インキュベートした。一次抗体をスライドあたり約100μlで自動分注し、スライドを36℃にて32分間インキュベートした。抗体検出はultraView検出キットを製造業者の指示通りに用いて行った。スライドをHRPマルチマー中36℃にて20分間インキュベートした。
1.3 スライド視覚化
染色手順の完了時に、スライドを洗浄緩衝剤中で簡潔に洗浄し、蒸留水で濯いで残存するオイルを除去した。続いて、スライドを脱水和し(１×３分間 70％エタノール；３×３分間 100％エタノール；２×５分間 100％キシレン)、マウントし、CTM6自動カバースリップ装置でDPXを用いて封入した。スライドをドラフト内で一晩風乾させた。
3DHistech Pannoramic250スキャナー(ホワイトバランスについて毎週校正)で、スライドを倍率40×でデジタルイメージ化した。
陽性染色はサンプル中のMAGEA4の存在を示した。
染色手順の完了時に、スライドを洗浄緩衝剤中で簡潔に洗浄し、蒸留水で濯いで残存するオイルを除去した。続いて、スライドを脱水和し(１×３分間 70％エタノール；３×３分間 100％エタノール；２×５分間 100％キシレン)、マウントし、CTM6自動カバースリップ装置でDPXを用いて封入した。スライドをドラフト内で一晩風乾させた。
3DHistech Pannoramic250スキャナー(ホワイトバランスについて毎週校正)で、スライドを倍率40×でデジタルイメージ化した。
陽性染色はサンプル中のMAGEA4の存在を示した。
1.4 結果
ヒト腫瘍組織切片を調製し、上記のように染色した。各FFPEサンプル中のMAGEA4発現をqRT-PCTにより標準法を用いて測定し、100ngのRNAあたりの転写物の数として算出した。
図１は、肺ガン、食道ガン、頭頸部ガン及び膀胱ガン(それぞれＡ〜Ｄ)から取得したサンプルの代表的な染色を示す。各場合において、染色は10ug/mlの抗体濃度を用いて行った。各腫瘍タイプについて、染色強度はRNAレベルと相関することが示される(RNA-高、-中又は-低/無し)。
本アッセイの対照として、健常ヒト組織サンプルを精巣(MAGEA4陽性)及び卵巣(MAGEA4陰性)から取得し、同じ手順を用いて染色した。サンプルは、各症例で３人のドナー個体から取得した。
図２は、精巣サンプルの強い染色及び卵巣サンプルの無染色を示す。
ヒト腫瘍組織切片を調製し、上記のように染色した。各FFPEサンプル中のMAGEA4発現をqRT-PCTにより標準法を用いて測定し、100ngのRNAあたりの転写物の数として算出した。
図１は、肺ガン、食道ガン、頭頸部ガン及び膀胱ガン(それぞれＡ〜Ｄ)から取得したサンプルの代表的な染色を示す。各場合において、染色は10ug/mlの抗体濃度を用いて行った。各腫瘍タイプについて、染色強度はRNAレベルと相関することが示される(RNA-高、-中又は-低/無し)。
本アッセイの対照として、健常ヒト組織サンプルを精巣(MAGEA4陽性)及び卵巣(MAGEA4陰性)から取得し、同じ手順を用いて染色した。サンプルは、各症例で３人のドナー個体から取得した。
図２は、精巣サンプルの強い染色及び卵巣サンプルの無染色を示す。
比較例１
実施例１で用いたヒト腫瘍サンプルを、一次抗体の濃度が最適範囲より低いこと以外は同じ手順を用いて染色した。
図３は、４つの異なる腫瘍(Ａ〜Ｄ)についての、最適化した抗体濃度と最適化していない抗体濃度との間(それぞれ10μg/ml及び1.25μg/ml)での染色の比較を示す。
本実施例は、一次抗体濃度の低下が最適でない染色を生じることを証明する。このことは、特にMAGEA4レベルが低いサンプルにおいて、偽陰性の結果に至り得る。
実施例１で用いたヒト腫瘍サンプルを、一次抗体の濃度が最適範囲より低いこと以外は同じ手順を用いて染色した。
図３は、４つの異なる腫瘍(Ａ〜Ｄ)についての、最適化した抗体濃度と最適化していない抗体濃度との間(それぞれ10μg/ml及び1.25μg/ml)での染色の比較を示す。
本実施例は、一次抗体濃度の低下が最適でない染色を生じることを証明する。このことは、特にMAGEA4レベルが低いサンプルにおいて、偽陰性の結果に至り得る。
Claims (20)
- サンプル中のMAGEA4を検出する方法であって、
抗MAGEA4抗体を該サンプルに２〜20μg/mlの範囲内の濃度で添加すること；
該抗体及び該サンプルをインキュベートすること；
該サンプルに結合した抗体を検出すること
を含んでなり、該抗体がOTI1F9である、方法。 - 前記抗体の濃度が４〜15、４〜10、５〜13、６〜12又は７〜11μg/mlである、請求項１に記載の方法。
- 前記抗MAGEA4抗体の濃度が10μg/mlである、請求項２に記載の方法。
- 前記サンプル及び前記抗MAGEA4抗体を30〜60、25〜50、25〜39、27〜35、28〜34、30〜33、31、32若しくは33分間及び/又は33〜39、34〜38、35〜37、35、36若しくは37℃にてインキュベートする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記サンプル及び前記抗MAGEA4抗体を32分間36℃にてイキュベートする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記サンプルに結合した抗MAGEA4抗体を、該抗MAGEA4抗体に結合する二次抗体により間接的に検出する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記二次抗体がホースラディッシュペルオキシダーゼに結合されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記サンプルへの前記抗MAGEA4抗体の添加前にエピトープ回復工程を更に含んでなる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記エピトープ回復工程の温度が80〜110、90〜100若しくは92〜108℃であり、及び/又は該エピトープ回復工程の期間が10〜30、12〜28、13〜27、14〜26、15〜25、16〜24、17〜23、18〜22分間である、請求項８に記載の方法。
- 前記エピトープ回復工程を95℃で20分間行う請求項８又は９に記載の方法。
- 前記サンプル中の内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害することを更に含み、前記阻害は該サンプルをDAB(3,3'-ジアミノベンジジン)インヒビターと接触させることにより行われてもよい、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記サンプルを前記DABインヒビターと少なくとも５、６、７、８、９、10又は11分間、好ましくは少なくとも８分間、室温にて接触させる請求項１１に記載の方法。
- 前記サンプルをブロッキング試薬と接触させる工程を更に含み、該工程は内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害後に行われてもよい、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記サンプルを前記ブロッキング試薬と８〜16、９〜15、10〜14若しくは11〜13分間及び/又は33〜39、34〜38、35〜37℃にて接触させる請求項１３に記載の方法。
- 前記サンプルを前記ブロッキング試薬と12分間36℃にて接触させる請求項１４に記載の方法。
- 前記サンプルをパラフィン中に包埋する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 脱パラフィン化工程を更に含んでなる請求項１６に記載の方法。
- 前記脱パラフィン化工程が前記サンプルを反応緩衝剤中で８分間69℃のインキュベーションを３サイクル行うことを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
- 前記サンプルを脱パラフィン化すること、ここで、該脱パラフィン化は、該サンプルをEZ-Prep溶液のような反応緩衝剤中でインキュベートすることによってもよく、該インキュベーションは８分間69℃で３サイクル行われてもよく；
エピトープを回復させること、ここで、該エピトープの回復は、該サンプルを細胞コンディショニング液１中で95℃にて20分間インキュベートすることにより行われてもよく；
内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害すること、ここで、該阻害は、該サンプルをDABインヒビター中で８分間室温にてインキュベートすることによって行われてもよく；
該サンプルブロッキング試薬中でインキュベートすること、ここで、該インキュベーションは12分間36℃にて行われてもよく；
抗体OFI1F9を該サンプルに10μg/mlの濃度で添加すること；
該抗体及び該サンプルを32分間36℃にてインキュベートすること；及び
該サンプルに結合した抗体を検出すること
を含んでなる請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。 - 抗MAGEA4抗体を、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法の実施に必要な試薬と組み合わせて含んでなる、サンプル中のMAGEA4を検出するキット。
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