KR102641616B1 - 남성 수정능력 상태의 판정 방법 및 시험 키트 - Google Patents

남성 수정능력 상태의 판정 방법 및 시험 키트 Download PDF

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크리스티나 카르도나
멜리사 에이. 무디
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지. 찰스 오스터메리어
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안드로비아 라이프 사이언시스 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 정자의 수정능 획득을 유도한 다음 GM1 편재화 패턴을 측정하고, 각종 패턴의 퍼센트, 특히 [(AA+APM)/GM1 편재화 패턴의 총수]의 비율을 구하고, 유도된 수정능 획득에 반응하여 특정 GM1 편재화 패턴의 퍼센트가 변화되었는지를 결정하는 것을 포함한다. 단독으로 또는 다른 정액 특성과 병행된 특정 편재화 패턴의 퍼센트에 있어서의 변화에 기초하여, 남성 수정능력 상태가 판정될 수 있다.

Description

남성 수정능력 상태의 판정 방법 및 시험 키트
<관련 출원 상호참조>
본 출원은 2016년 2월 17일자 미국 가특허출원 제62/296,420호, 2016년 4월 14일자 미국 가특허출원 제62/322,252호, 2016년 4월 28일자 미국 가특허출원 제62/328,890호의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전문이 본원에 원용된다.
<기술분야>
본 발명은 일반적으로 남성 수정능력 분야, 보다 구체적으로는 정자의 수정능 획득을 유도한 후 GM1 강글리오사이드 분포 패턴에 기초하여 남성 수정능력 상태를 판정하는 것에 관한 것이다.
미국에서, 부부 중 10%가 불임과 관련된 진료 예약을 하고 있으며, 불임의 40%는 남성에 기인한 것이다. 전세계적으로, 이는 73백만이 넘는 불임 부부를 의미한다. 전형적인 남성 생식능력 검진은 정자의 수, 외관 및 운동성을 평가한다. 불행하게도, 불임 남성의 절반은 이들 항목별 기준에 대한 정상적 파라미터를 충족시키는 정자를 가지고 있으며, 자연 임신과 자궁내 인공수정 (IUI)과 같은 보조 생식 시술에서 반복적으로 실패한 후에야 단지 "특발성 불임"으로 진단된다. 사이클의 실패는 매회 부부에 육체적, 정신적 및 경제적으로 막대한 손실을 일으키며, 미국 건강관리 시스템은 이에 연간 5억만 달러 이상의 비용을 지출하므로, 정자 기능의 실용적인 시험 방법에 대한 필요가 지대하다. 정자 기능에 대한 데이터는 검진의로 하여금 그들의 환자에게 보조 생식 시술을 권유하도록 함으로써 최상의 임신 기회를 제공할 것이다.
여성 생식기 내로 진입시에, 정자가 즉시 난자를 수정시킬 능력을 갖는 것은 아니다. 정자는 "수정능 획득"으로 알려진 기능적 성숙 과정을 거쳐야 한다. 이러한 과정은 정자가 수정능 획득을 위한 자극에의 노출에 응답하여 세포막에서의 특정 변화, 즉, 강글리오사이드 GM1의 분포 패턴에 있어서의 변화를 가짐으로써 특정 자극에 반응할 수 있는 눙력에 의존한다.
각종 GM1 편재화 패턴이 밝혀져 있으며, 수정능-획득 또는 수정능-비획득과 관련이 있다. 특히, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴은 소 및 인간의 정자에서 수정능 획득과 관련이 있다. 정자의 수정능 획득은 캡-스코어 (Cap-Score)™ 값으로 정량적으로 표시될 수 있으며, 이는 캡-스코어™ 정자 기능 시험 ("캡-스코어™ 시험" 또는 "캡-스코어")을 통하여 생성되는 것으로서, ([첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴의 수 + 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴의 수]/GM1 표지된 편재화 패턴의 총수)로 정의되며, 여기서, 각 편재화 패턴의 수가 측정되어 궁극적으로 퍼센트 점수로 환산된다. APM GM1 편재화 패턴 및 AA GM1 편재화 패턴 이외에, 다른 표지된 편재화 패턴은 라인드-셀 (Lined-Cell) GM1 편재화 패턴, 중간대 (INTER) GM1 편재화 패턴, 첨체 후방 원형질막 (PAPM) GM1 편재화 패턴, 첨체 정상부/첨체 후방 (AA/PA) GM1 편재화 패턴, 적도대 (ES) GM1 편재화 패턴, 및 확산 (DIFF) GM1 편재화 패턴을 포함한다 (Travis et al., "Impacts of common semen handling methods on sperm function," The Journal of Urology, 195 (4), e909 (2016)).
<발명의 요약>
하나의 실시양태에서, 본 명세서에는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법 및 키트가 개시되어 있다. 하나의 실시양태에서, 이러한 개시 내용은 시험관내 수정능 획득 유도에 반응하여 특정 GM1 편재화 패턴의 수에 있어서의 변화에 기초하여 남성 수정능력 상태를 확인하는 방법을 기술한다. 하나의 실시양태에서, GM1 편재화 패턴은 라인드-셀 GM1 편재화 패턴이다.
본 명세서에 개시된 하나의 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다. 시험관내 수정능 획득처리된 정자 세포의 샘플을 형광 표지로 처리한다. 하나 이상의 수정능 획득처리-형광 이미지를 수득하며, 여기서, 이미지는 형광 표지된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 세포와 관련된 한 가지 이상의 GM1 편재화 패턴을 표시한다. 수정능 획득처리-형광 이미지에 표시된 각각의 패턴 중, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴과 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴은 각각 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴은 수정능-비획득 상태에 배정한다. 수정능 획득처리-형광 이미지에 표시되어 있는 형광 표지된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 세포에 대하여, AA GM1 편재화 패턴, APM GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 포함하는 GM1 편재화 패턴의 수를 측정하며, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 결정한다. 하나의 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 다음과 같이 관련된다: 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 다음과 같이 관련된다: 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
본 명세서에 개시된 또다른 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 남성 개체로부터의 정자 샘플의 제1 부분을 비-수정능 획득 조건에 노출시켜 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플을 수득하고; 정자 샘플의 제2 부분을 수정능 획득 조건에 노출시켜 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 수득하고; 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 고정제로 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 고정시키고; 고정된 시험관내 비-수정능 획득 처리된 정자 샘플 및 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 처리하고; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 두 가지 이상의 표지된 GM1 편재화 패턴을 감별하고; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 표지된 GM1 편재화 패턴을 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 표지된 GM1 편재화 패턴에 대해 비교하고; 비교에 기초하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 수정능-비획득 상태에 배정하고; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대해 감별된 GM1 표지된 편재화 패턴에 기초하여 남성 개체의 수정능력 상태를 특성화하는 것을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치를 측정하는 것을 포함하며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
하나의 실시양태에서, 노출 단계 전에 비-금속재로 제조된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하고, 정액 점도를 감소시키는데 사용되는 각종 반응제로부터 선택된 것으로서 정자막을 손상시키지 않는 반응제를 사용하여 정액 샘플을 처리함으로써 정액의 점도를 감소시킨다. 일부 그와 같은 실시양태에서, 막을 손상시키는 반응제는 (i) 프로테아제; (ii) 뉴클레아제; (iii) 점액용해제; (iv) 리파제; (v) 에스테라제, 및 (vi) 글리코사이드 하이드롤라제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 감별 단계는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수가 실질적으로 일정해질 때까지 반복된다. 그러한 하나의 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 5% 미만, 또는 3% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 그러한 또 다른 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 2% 내지 25%; 2% 내지 20%; 2% 내지 15%; 2% 내지 10%; 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다.
또 다른 그와 같은 실시양태에서, 특성화 단계는 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 각 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 각 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계; 및, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 개시된 하나의 실시양태에서, 그 방법은 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 상기 비율을 수정능력 상태가 알려진, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 비율에 비교하는 단계; 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 상기 비율을 수정능력 상태가 알려진, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 비율에 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 비-수정능 획득 조건에 노출되고, 고정제 중에서 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 고정되고, GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 처리된, 남성 개체로부터의 정자 샘플의 제1 부분을 수득하는 단계; 수정능 획득 조건에 노출되고, 고정제 중에서 고정되고, GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 표지화 분자로 처리된, 남성 개체로부터의 정자 샘플의 제2 부분을 수득하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 두 가지 이상의 표지된 GM1 편재화 패턴을 감별하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 표지된 GM1 편재화 패턴을 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 표지된 GM1 편재화 패턴에 비교하는 단계; 비교에 기초하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 수정능-비획득 상태에 배정하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대해 감별된 GM1 표지된 편재화 패턴에 기초하여 남성 개체의 수정능력 상태를 특성화하는 단계를 포함한다. 그와 같은 하나의 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치를 측정하는 단계로서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타내는 것인 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교하는 단계; 및 비교에 기초하여 수정능력 역치를 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
일부 실시양태에서, 감별 단계는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수가 실질적으로 일정해질 때까지 반복된다. 그러한 하나의 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 5% 미만, 또는 3% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 그러한 또 다른 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 2% 내지 25%; 2% 내지 20%; 2% 내지 15%; 2% 내지 10%; 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다.
그러한 방법의 하나의 실시양태에서, 그 방법은 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 각 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플 각각에 대하여 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 상기 비율을 수정능력 상태가 알려진 남성 개체로부터의 시험관내 수정능 획득처리된 정자의 GM1 편재화 패턴의 비율에 비교하는 단계; 및 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 상기 비율을 수정능력 상태가 알려진 남성 개체로부터의 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자의 GM1 편재화 패턴의 비율에 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 남성 개체로부터의 정자 샘플을 시험관 내에서 수정능 획득 조건에 노출시키는 단계; 수정능 획득처리된 정자 샘플을 고정제로 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 고정시키는 단계; 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 처리하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 두 가지 이상의 표지된 GM1 편재화 패턴을 감별하는 단계; 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 수정능-비획득 상태에 배정하는 단계; 남성 개체의 수정능력 상태를 특성화하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치를 측정하는 단계로서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타내는 것인 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교하는 단계; 및 수정능력 역치를 비교에 기초하여 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치가 비교에 기초하여 확인된다.
하나의 실시양태에서, 노출 단계 전에 비-금속재로 제조된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하고, 정액 점도를 감소시키는데 사용되는 각종 반응제로부터 선택된 것으로서 정자막을 손상시키지 않는 반응제를 사용하여 정액 샘플을 처리함으로써 정액의 점도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 막을 손상시키는 반응제는 (i) 프로테아제; (ii) 뉴클레아제; (iii) 점액용해제; (iv) 리파제; (v) 에스테라제, 및 (vi) 글리코사이드 하이드롤라제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 감별 단계는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수가 실질적으로 일정해질 때까지 반복된다. 그러한 하나의 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 5% 미만, 또는 3% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 그러한 또 다른 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 2% 내지 25%; 2% 내지 20%; 2% 내지 15%; 2% 내지 10%; 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다.
그러한 방법의 하나의 실시양태에서, 그 방법은 상기 GM1 편재화 패턴의 비율을 수정능력 상태가 알려진 남성 개체에 대한 GM1 편재화 패턴의 비율과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 그와 같은 하나의 실시양태에서, 비교 단계는 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 각 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 및 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 시험관내 수정능 획득 조건에 노출되고, 고정제 중에서 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 고정되고, GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 염색된, 남성 개체로부터의 정자 샘플의 제1 부분을 수득하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 두 가지 이상의 GM1 표지된 편재화 패턴을 감별하는 단계; 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 수정능-비획득 상태에 배정하는 단계; 및 남성 개체의 수정능력 상태를 특성화하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치를 측정하는 단계로서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타내는 것인 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교하는 단계; 및 수정능력 역치를 비교에 기초하여 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
일부 실시양태에서, 감별 단계는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수가 실질적으로 일정해질 때까지 반복된다. 그러한 하나의 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정죈 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 5% 미만, 또는 3% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 그러한 또 다른 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 2% 내지 25%; 2% 내지 20%; 2% 내지 15%; 2% 내지 10%; 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다.
그러한 방법의 하나의 실시양태에서, 그 방법은 상기 GM1 편재화 패턴의 비율을 수정능력 상태가 알려진 남성 개체에 대한 GM1 편재화 패턴의 비율과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 그러한 실시양태에서, 비교 단계는 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 각 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 및 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 적어도 일부가 시험관내 수정능 획득 조건에 노출되어 시험관내 수정능 획득처리된 정자로 되고, 고정제에 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 노출되고, GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 염색된 정자 샘플을 수득하는 단계; 정자 샘플의 한 가지 이상의 정액 파라미터 값을 수득하는 단계; 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 한 가지 이상의 표지된 GM1 편재화 패턴에 기초하여, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플의 캡-스코어를 측정하는 단계; 및 측정된 CAP 스코어 및 상기 수득된 한 가지 이상의 정액 파라미터에 기초하여 남성 수정능력 지수 (MFI) 값을 계산하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 정자 샘플의 한 가지 이상의 정액 파라미터는 원래 정자 샘플의 부피, 정자의 농도, 정자의 운동성, 및 정자의 형태로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 감별 단계는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수가 실질적으로 일정해질 때까지 반복된다.
그러한 하나의 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 5% 미만, 또는 3% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 그러한 또 다른 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 2% 내지 25%; 2% 내지 20%; 2% 내지 15%; 2% 내지 10%; 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다.
본 명세서에 개시된 방법의 각종 실시양태에서, 두 가지 이상의 GM1 표지된 편재화 패턴은 AA GM1 편재화 패턴, APM GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴, 중간대 (INTER) GM1 편재화 패턴, 첨체 후방 원형질막 (PAPM) GM1 편재화 패턴, 첨체 정상부/첨체 후방 (AA/PA) GM1 편재화 패턴, 적도대 (ES) GM1 편재화 패턴, 및 확산 (DIFF) GM1 편재화 패턴을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 정자 샘플 제1 부분을 비-수정능 획득 조건에 노출시키는 것과 정자 샘플 제2 부분을 수정능 획득 조건에 노출시키는 것은 동시에 일어난다.
하나의 실시양태로서, 남성 개체의 수정능력 상태를 판정하는 키트가 본 명세서에 개시되어 있으며, 그러한 키트는 수정능 획득처리된 정자의 한 가지 이상의 GM1 편재화 패턴 및 비-수정능 획득처리된 정자의 한 가지 이상의 GM1 편재화 패턴을 나타낸 것으로서, 상기 수정능 획득처리된 정자의 GM1 편재화 패턴 및 비-수정능 획득처리된 정자의 GM1 편재화 패턴은 알려진 수정능력 상태를 반영하는 것인 다이아그램; 정자막에 전단력을 가하지 않도록 충분히 큰 직경의 오리피스를 갖는 오리피스가 넓은 피펫; 및, 수정능 획득처리용 매질, 비-수정능 획득처리용 매질, 고정제 조성물 및 GM1 편재화 패턴을 얻기 위한 표지화 시약 중 1종 이상을 포함하며, 단, 고정제 조성물은 정자막을 손상시키지 않고, 수정능 획득처리용 매질 및 비-수정능 획득처리용 매질은 시험관내에서 정자 세포에 사용될 때 다이아그램에 제시된 바와 같이 수정능 획득처리된 정자를 나타내는 GM1 편재화 패턴 및 비-수정능 획득처리된 정자를 나타내는 패턴을 생성하게 한다. 하나의 실시양태에서, 키트는 정자막의 손상을 방지하도록 정자를 취급하는 지시서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다.
본 명세서에 기재된 일부 실시양태에서, 시험관내 수정능 획득 조건은 중탄산 이온, 칼슘 이온 및 스테롤 배출 매개체 중 1종 이상에 노출되는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스테롤 배출 매개체는 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린, 혈청 알부민, 고밀도 지단백질, 인지질 소포, 제대 혈청 한외여과물, 지방산 결합 단백질 또는 리포좀이다. 하나의 실시양태에서, 스테롤 배출 매개체는 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린이다.
하나의 실시양태에서, 비-수정능 획득 조건은 중탄산 이온, 칼슘 이온 및 스테롤 배출 매개체 중 1종 이상에 노출되는 것의 결여를 포함한다.
본 명세서에 기재된 일부 실시양태에서, 고정제는 알데하이드 고정제이다. 하나의 실시양태에서, 고정제는 파라포름알데하이드, 글루타르알데하이드 또는 그들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, GM1을 얻기 위한 친화성 분자는 형광 표지된 콜레라 독소 b 서브유닛이다.
상술한 발명의 요약 뿐만아니라 후술하는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법 및 키트의 실시양태에 관한 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조하여 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 본 발명이 도시된 구체적인 방법 및 수단으로 한정되는 것은 아니다.
도면에서:
도 1은 비-수정능 획득 조건 또는 수정능 획득 조건하에, 정상 남성의 정자 및 불임 남성으로부터의 정자 중 GM1의 INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES 및 DIFF 편재화 패턴을 나타낸 것이고;
도 2A는 비-수정능 획득 조건하에 (NC), 정상 남성의 정자 중 GM1의 INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES 및 DIFF 편재화 패턴의 상대적 분포를 도시한 것이며;
도 2B는 수정능 획득 조건하에 (CAP), 정상 남성의 정자 중 GM1의 INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES 및 DIFF 편재화 패턴의 상대적 분포를 도시한 것이고;
도 2C는 수정능 획득 조건하에, 불임 남성으로부터의 정자 중 GM1의 INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES 및 DIFF 편재화 패턴의 상대적 분포를 도시한 것이며;
도 3은 수정능 획득 조건 또는 비-수정능 획득 조건하에, 정상 남성군으로부터의 정자 및 불임 남성군으로부터의 정자에서 인큐베이션 시간의 함수로서의 APM과 AA 편재화 패턴을 합한 상대적 수치, 및 각 남성군에 대한 임상적 결과를 나타낸 것이며;
도 4는 알려진 수정가능 공여자로부터의 정자를 수정능 획득을 촉진하는 자극하에 인큐베이션시킨 것에서 AA와 APM 편재화 패턴의 퍼센트를 도시한 것이고;
도 5는 수정능력-저하/수정불능으로 의심되는 공여자로부터의 정자에서의 AA와 APM 편재화 패턴의 퍼센트를 수정가능 남성의 통계적 역치와 비교한 것을 도시한 것이며;
도 6A, 6B, 6C 및 6D는 수정능 획득 조건하에, 수정불능 남성으로부터의 정자 중 라인드-셀 GM1 편재화 패턴을 보여준다.
첨부된 도면을 참조하여, 본 발명의 여러 실시양태가 이하 보다 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 모든 실시양태가 아닌 일부 실시양태가 기재되어 있다. 본 발명의 각종 실시양태는 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있는 것이므로, 구체적으로 기재된 실시양태에 한정되는 것으로 간주되어서는 안된다. 본 발명의 특징 및 기재의 적어도 일부가 본 발명을 명확히 이해하는데 필요한 구성요소에 촛점을 맞추도록 단순화된 한편, 보다 명확히 기재하기 위하여, 해당분야 통상의 기술자에 의해 본 발명의 일부를 구성할 수 있는 것으로 인식되는 다른 구성요소는 생략하였음이 이해되어야 한다. 그러나, 그러한 구성요소가 해당 기술분야에 잘 알려져 있고, 반드시 본 발명의 보다 명확한 이해를 돕는 것은 아니므로, 그러한 구성요소의 기재는 본 명세서에 주어지지 않았다.
본 명세서에 인용된 개개의 모든 참고문헌은 그 전문이 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에 구체적으로 언급이 되지 않은 한, 수사로 수식되지 않은 단수 명사는 하나의 구성요소로 한정되는 것이 아니라, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
"약"은 주어진 값의 + 및 - 10%의 범위를 의미하는 것으로 이해된다. 그러나, "약"을 사용함으로써 주어진 값을 단독으로 의미하는 것을 배제하는 것은 아니다. 예를 들어, "약 1시간"은 "54분," "1시간," 및 "66분"을 완벽히 지지하는 것으로 이해된다.
본 발명은 특정 GM1 편재화 패턴이 남성 수정능력 상태에 관련된 정보를 제공할 수 있다는 관찰에 기초한 것이다. GM1 편재화 패턴의 측정은 미국 특허 제7,160,676호, 제7,670,763호 및 제8,367,313호에 기재되어 있으며, 이들 문헌의 개시 내용은 본 명세서에 원용된다. 본 발명은 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법 및 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 그러한 방법은 시험관내 수정능 획득 자극에 노출시 특정 GM1 편재화 패턴의 퍼센트에 있어서의 변화에 기초한다. 다른 실시양태에서, 그러한 방법은 구체적으로는 시험관내 수정능 획득 자극에 노출시 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 퍼센트에 있어서의 변화에 기초한다.
하나의 실시양태로서, 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이 개시되어 있다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 개체로부터의 정자 샘플을 시험관내 수정능 획득 및 시험관내 비-수정능 획득 조건으로 처리하고, 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시 특정 GM1 편재화 패턴의 퍼센트에 있어서의 변화를 측정하고, 변화의 정도에 기초하여 수정능력 상태를 판정하는 것을 포함한다.
"시험관내 수정능 획득처리된" 정자란 수정능 획득 과정을 촉진하는 조건하에 인큐베이션된 정자를 이른다. 하나의 실시양태에서, 수정능 획득 조건은 중탄산 이온, 칼슘 이온, 및 혈청 알부민 또는 시클로덱스트린과 같은 스테롤 수용체 중 1종 이상을 함유하는 매질 중에 존재하는 것을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 시험관내 수정능 획득 조건은 매질 중 중탄산 이온 및 칼슘 이온의 존재, 및 스테롤 수용체의 존재를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 스테롤 수용체는 스테롤 배출의 매개체이다. 수정능을 획득한 정자는 첨체 세포외유출을 거칠 능력을 획득하고, 과활성화된 패턴의 운동성을 획득한 것이다. "시험관내 비-수정능 획득처리된" 정자란 수정능 획득을 위한 상기 자극제 중 1종 이상과 함께 인큐베이션되지 않은 정자를 이른다. 하나의 실시양태에서, 비-수정능 획득 조건은 수정능 획득 조건의 결여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 비-수정능 획득 조건은 수정능 획득에 필요한 자극제 1종 이상의 결여를 포함한다. 수정능을 획득하지 않은 정자는, 예를 들어, 투명대, 투명대로부터의 용해된 단백질, 또는 프로게스테론과 같은 생리학적 리간드에 의해 유도되는 첨체 세포외유출을 겪지 않는다. 또한, 비-수정능 획득 조건하에 인큐베이션된 정자는 과활성화된 운동성을 나타내지 않을 것이다.
하나의 실시양태에서, 수정능 획득은 시험관내에서 외부적 자극, 예를 들어, 중탄산 이온 및 칼슘 이온, 및 스테롤 배출 매개체, 예컨대, 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린, 혈청 알부민, 고밀도 지단백질, 인지질 소포, 리포좀 등에 노출시켜 유도될 수 있다. 일부 실시양태에서, GM1 편재화 패턴에 있어서의 판별가능한 변화는 정자가 시험관내에서 1종 이상의 이러한 자극에 노출될 때 관찰된다.
하나의 실시양태에서, 정액 샘플은 채취 후 전형적으로는 액상화, 세척 및/또는 농축 중 한 가지 이상을 포함하는 방법으로 처리된다. 일부 실시양태에서, 액상화는 샘플이 다양한 시간 동안 (전형적으로는 15 내지 20분, 가능하게는 10 내지 60분) 실온 또는 37℃ (또는 그 사이의 임의의 온도)에서 액화되도록 하는 것을 포함한다. 액상화는 정장이 젤 상태에서 보다 유체/액체인 상태로 전환되는 과정이다. 정장은 전형적으로는 어떠한 조작없이도 액상화되지만, 샘플의 점성이 크거나, 과정을 신속화하거나 취급되는 모든 샘플에 대하여 일관된 액상화 프로토콜을 적용하고자 하는 경우, 샘플을 조작하여 액상화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 비금속 재료로 된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하여 정액 샘플을 조작함으로써 정액 점도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다. 일부 실시양태에서, 정자막을 손상시키지 않는 각종 반응제를 가하여 액상화시킬 수 있다. 사용하지 말아야 할 반응제는 정자막을 손상시키는 종류이다. 정자는 원심분리 및 재현탁에 의해 세척되어 정액 분석 과정을 거치고/거나, 다음을 포함하는 하나 이상의 선택 과정을 거칠 수 있다: 층으로 쌓고 밀도 구배에 의해 원심분리하거나; 층으로 쌓고 밀도 구배에 의해 원심분리하여 정자-농축 분획을 취한 후 재현탁 및 세척하거나; 층으로 쌓고 밀도 구배에 의해 원심분리하여 정자-농축 분획을 취한 후, 그 위에 밀도가 보다 낮은 매질을 덮어서 정자가 그 매질 내로 떠오르도록 하거나; 샘플의 위에 밀도가 보다 낮은 매질을 덮어서 정자가 그 매질 내로 떠오르도록 한다.
초기 처리 과정 후에, 정자의 수를 셀 수 있으며, 주어진 수의 정자를 시험관내 비-수정능 획득처리용 또는 시험관내 수정능 획득처리용 매질을 함유하는 용기 (예를 들어, 튜브)에 넣어서 원하는 최종 농도를 얻을 수 있다. 하나의 실시양태에서, 전형적인 정자 최종 농도는 1,000,000/ml이다 (최종 농도는 250,000/ml 내지 250,000,000/ml일 수 있다).
정자를 시험관내 비-수정능 획득 및 시험관내 수정능 획득 조건하에 인큐베이션하기 위한 기본 매질은 생리학적 완충 용액, 예를 들어, 인간 난관액 (HTF); 개량 인간 난관액 (mHTF); 휘텐 (Whitten's) 배지; 개량 휘텐 배지; KSOM; 인산염-완충 생리식염수; HEPES-완충 생리식염수; Tris-완충 생리식염수; 햄 (Ham's) F-10; 타이로드 (Tyrode's) 배지; 개량 타이로드 배지; TES-Tris (TEST)-난황 완충제; 또는 비거 (Biggers), 휘텐 (Whitten) 및 휘팅엄 (Whittingham) (BWW) 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기본 매질에 1종 이상의 규정 또는 복합 단백질 공급원 및 다른 인자, 예를 들어, 제대 혈청 한외여과물, 플라스마네이트, 난황, 탈지유, 알부민, 지단백질, 또는 지방산 결합 단백질 등을 첨가함으로써 활력을 촉진시키거나 수정능 획득 유도를 돕기에 충분한 농도로 할 수 있다. 수정능 획득을 위한 전형적인 자극은 다음 중 1종 이상을 포함한다: 중탄산 이온 (전형적으로 20-25 mM, 가능하게는 5-50 mM), 칼슘 이온 (전형적으로 1-2 mM, 가능하게는 0.1-10 mM), 및/또는 시클로덱스트린 (전형적으로 1-3 mM, 가능하게는 0.1-20 mM). 시클로덱스트린은 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린 및/또는 메틸-β-시클로덱스트린을 포함할 수 있다. 인큐베이션 온도는 전형적으로 37℃ (가능하게는 30℃-38℃)이고, 인큐베이션 시간은 전형적으로 1-4 시간 (가능하게는 30분 내지 18시간)이며, 기준시 샘플은 인큐베이션 시간의 개시점 ("제로 시간")에서 취해질 수 있다.
하나의 실시양태에서, GM1 패턴을 생성하기 위하여, 정자를 표준 기본 매질 (예를 들어, 인산염-완충된 생리식염수, 개량 휘텐 배지 또는 기타 유사 매질)로 세척하고, GM1에 대한 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자와 함께 인큐베이션한다. GM1은 에피토프로 작용할 수 있는 세포외 당 잔기를 가지므로, 세포를 고정시키고 투과성으로 만들지 않고도 가시화될 수 있다. 그러나, 세포를 고정시키면 패턴 형성에도 기여하는 한편, 표본을 보다 잘 보존하고, (유영하는 정자 중의 패턴을 식별하는 것과 비교하여) 가시화를 더 쉽게 하며, 볼 수 있는 시간도 더 길게한다. 정자의 조직학 연구에 알려진 여러 가지 고정제가 해당 기술분야 숙련가의 지식 범위 내에 있다. 적절한 고정제는 파라포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 부앵 (Bouin's) 고정제, 및 나트륨 카코딜레이트, 염화칼슘, 피크르산, 탄닌산 등을 포함하는 고정제를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 파라포름알데하이드, 글루타르알데하이드 또는 그들의 조합이 사용된다.
고정화 조건은 약 0.004% (중량/부피) 파라포름알데하이드 내지 약 4% (중량/부피) 파라포름알데하이드의 범위일 수 있으마, 약 0.01% 내지 약 1% (중량/부피) 파라포름알데하이드가 전형적으로 사용된다. 하나의 실시양태에서, 약 0.005% (중량/부피) 파라포름알데하이드 내지 약 1% (중량/부피) 파라포름알데하이드가 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 인산염 완충 생리식염수 중 약 4% 파라포름알데하이드 (중량/부피), 약 0.1% 글루타르알데하이드 (중량/부피) 및 약 5 mM CaCl2가 사용될 수 있다.
정자 샘플이 고정제 중에서 고정되는 시간은 다양할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 정자 샘플은 고정제 중에서 약 5시간 이하로 고정된다. 하나의 실시양태에서, 정자 샘플은 고정제 중에서 약 5시간을 넘게 고정된다. 또 다른 실시양태에서, 정자 샘플은 고정제 중에서 약 0.5시간, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간, 약 3.5시간, 약 4시간, 약 4.5시간, 약 5시간, 약 5.5시간, 약 6시간, 약 6.5시간, 약 7시간, 약 7.5시간, 약 8시간, 약 8.5시간, 약 9시간, 약 9.5시간, 약 10시간, 약 10.5시간, 약 11시간, 약 11.5시간, 약 12시간, 약 12.5시간, 약 13시간, 약 13.5시간, 약 14시간, 약 14.5시간, 약 15시간, 약 15.5시간, 약 16시간, 약 16.5시간, 약 17시간, 약 17.5시간, 약 18시간, 약 18.5시간, 약 19시간, 약 19.5시간, 약 20시간, 약 20.5시간, 약 21시간, 약 21.5시간, 약 22시간, 약 22.5시간, 약 23시간, 약 23.5시간, 약 24시간, 약 24.5시간, 약 25시간, 약 25.5시간, 약 26시간, 약 26.5시간, 약 27시간, 약 27.5시간, 약 28시간, 약 28.5시간, 약 29시간, 약 29.5시간, 약 30시간 동안, 또는 상기 시간내에서 결정될 수 있는 임의의 범위의 시간 동안 (예를 들어, 약 26시간 내지 약 28시간, 또는 약 3시간 내지 약 5시간) 고정된다.
활동 또는 고정된 정자 내의 GM1 편재화 패턴은 표지 결합 기술을 사용하여 수득될 수 있다. GM1 강글리오사이드에 대한 특이적 친화도를 갖는 분자가 사용될 수 있다. 표지화 분자는 검출가능한 표지 (예를 들어, 형광단)에 직접 결합될 수 있거나, 검출가능한 표지를 갖는 제2의 표지화 분자에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 콜레라 독소의 b 서브유닛은 GM1에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 표지된 (예를 들어, 형광 표지된) 콜레라 독소 b 서브유닛이 GM1의 분포 패턴을 수득하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 형광단에 결합된 콜레라 독소 b 서브유닛의 최종 농도는 약 10 ㎍/ml 내지 약 15 ㎍/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 형광단에 결합된 콜레라 독소 b 서브유닛의 최종 농도는 약0.1 ㎍/ml 내지 약 50 ㎍/ml이다. 다른 방법으로는, GM1에 대한 표지된 항체가 사용될 수 있다. 또 다른 방법으로, 콜레라 독소 b 서브유닛에 대한 표지된 항체를 사용하여 GM1 염색 패턴을 가시화할 수 있다. 또 다른 방법으로, GM1에 직접 결합하는 1차 항체 또는 콜레라 독소 b 서브유닛에 결합하는 1차 항체에 결합하는 표지된 2차 항체가 사용될 수 있다. 본 명세서에서, "GM1 염색" 또는 "GM1의 염색" 또는 "표지화" 또는 관련 용어는 GM1에 표지된 친화성 분자가 결합한 결과 세포상에 또는 세포내에 보여지는 염색을 의미한다. 예를 들어, 형광 태깅/표지된 콜레라 독소 b 서브유닛이 GM1의 위치를 확인하는데 사용되며, 시그널 또는 염색은 콜레라 독소 b 서브유닛으로부터 나오는 것이지만 GM1이 존재하는 위치를 나타낸다. 용어 "시그널," "염색" 및 "표지화"는 상호교환적으로 사용된다. 검출가능한 표지는 검출가능한 시그널을 발생시킬 수 있는 것을 의미한다. 그러한 표지는 방사성 핵종, 효소, 형광제 또는 발색단을 포함한다. 표지화 (또는 염색) 및 정자 중 GM1 분포의 가시화는 표준 기술에 의해 수행된다. 콜레라 독소 b 서브유닛 이외의 표지화 분자가 또한 사용될 수 있다. 이는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함한다. GM1 강글리오사이드에 대한 특이적 항체는 통상의 면역 프로토콜에 의해 생성될 수 있거나, 시중에서 (예를 들어, Matreya, Inc., State College, PA) 구입할 수 있다. 항체는 GM1에 대하여 생성시키거나, GM1 분자의 관련 에피토프의 펩타이드 미믹을 사용하여 생성시킬 수 있다. 펩타이드 미믹의 확인 및 생성은 해당 기술분야 숙련가에게 잘 알려져 있다. 또한, 콜레라 독소 b 서브유닛의 결합은 소분자에 의해 흉내내어질 수 있다. 주어진 물질에 대하여 유사한 결합 특성을 갖는 소분자를 찾아내는 것은 해당 기술분야 숙련가에게 잘 알려져 있다.
인간 정자에 있어서, 시험관내 수정능 획득 조건하에 두었을 때 여덟가지 상이한 편재화 패턴이 관찰되었다 (실시예 1의 상세 설명 참조). 이들 패턴은 INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES, DIFF 및 라인드-셀로 지칭된다. INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES 및 DIFF 패턴은 도 1에 나타나 있고, 라인드-셀 패턴은 도 6A, 6B, 6C 및 6D에 도시되어 있으며, 이들 각각이 이하 상세히 기재된다:
＊ INTER: 대부분의 형광이 적도대 주위의 밴드에 존재하며, 일부 시그널은 첨체를 덮고 있는 원형질막에 존재한다. 대체로 시그널의 구배가 있으며, 적도대에서 가장 크고, 첨체 정상으로 갈수록 점차적으로 줄어든다. 적도대를 가로지르는 밴드 중 정자 두부의 가장자리에서 종종 시그널 강도의 증가가 있다.
＊ APM (첨체 원형질막): INTER와 비교하여, 이 패턴에서는 적도대 시그널과 첨체 정상을 향하여 이동하는 시그널 사이에 차이가 덜하다. 즉, 첨체를 덮고 있는 원형질막 내의 시그널은 보다 균일하게 분포되어 있다. APM 시그널은 정상을 향하여 이동하는 밝은 적도대 INTER 밴드에서부터 보여지거나, 정상을 향하는 훨씬 윗쪽에서 시작하여 AA와 연속되어 있는 것 같이 보다 작은 영역에서 발견될 수 있다.
＊ AA (첨체 정상부): 이 패턴에서, 형광은 정상으로 갈수록 더욱 농축되며, 밝기가 증가하고, 시그널이 있는 면적은 감소한다.
＊ PAPM (첨체 후방 원형질막): 시그널은 첨체 후방 원형질막에만 존재한다.
＊ AA/PA (첨체 정상부/첨체 후방): 시그널은 첨체를 덮고 있는 원형질막 및 첨체 후방 원형질막 모두에 존재한다. 시그널은 적도대에서는 나타나지 않는다.
＊ ES (적도대): 밝은 시그널이 단지 적도대에서만 나타난다. 적도 영역을 가로지르는 정자 두부의 농축이 수반될 수 있다.
＊ DIFF (확산): 확산된 시그널이 정자의 두부 전체에 걸쳐 나타난다.
＊ 라인드-셀: 시그널은 첨체 후방 영역의 상부 및 첨체를 덮고 있는 원형질막 뿐만 아니라 적도대의 바닥에서 나타난다 (즉, 첨체/적도대 후방 밴드). 시그널은 적도대 주변에서는 나타나지 않는다.
"GM1 편재화 패턴"이란 용어는 "패턴" 또는 "편재화 패턴"과 상호교환적으로 사용된다.
도 6A, 6B, 6C 및 6D는 수정능 획득 조건하에 수정불능 남성으로부터의 정자 중 GM1의 라인드-셀 GM1 편재화 패턴을 보여준다. 구체적으로, 도 6A는 첨체/적도대 후방 밴드 및 첨체를 덮고 있는 원형질막에 시그널이 균일하게 분포되어 있는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴을 보여준다. 도 6B는 첨체를 덮고 있는 원형질막에서의 시그널이 첨체/적도대 후방 밴드에서의 시그널보다 밝은 라인드-셀 GM1 편재화 패턴을 보여준다. 도 6C 및 6D는 첨체/적도대 후방 밴드에서의 시그널이 첨체를 덮고 있는 원형질막에서의 시그널보다 밝은 것을 보여준다.
INTER, AA, APM 패턴 및 그들의 조합이 정상적 정자막 구조 및 결과적으로 수정능력을 갖는 활동성 정자와 확실한 관련이 있는 한편, PAPM, AA/PA, ES, DIFF 및 라인드-셀 패턴은 활동성, 정상적 막구조 및 수정능력과 확실한 관련이 있지 않은 것으로 관찰되었다. 비-수정능 획득 조건하에 인큐베이션될 때, 정상적인 막구조를 갖는 활동성 정자의 대부분은 INTER 패턴을 나타낼 것이며, 이는 대부분의 표지가 적도대 부근에 있고, 나머지는 첨체를 덮고 있는 원형질막을 통해 확산되어 나가는 것으로 특징지워진다. 또한, 수정능 획득을 위한 자극에 노출시 APM 및 AA 패턴의 수가 증가한다. APM 패턴은 첨체를 덮고 있는 원형질막에서 보다 균등한 시그널을 보이는 반면, AA 패턴은 정자 두부의 끝부분인 첨체 정상부에서는 증가하는 강도의 시그널을, 적도대를 향하여 이동하면서 점차적으로 감소된 시그널을 보인다. 시험관내 비-수정능 획득 조건하에 인큐베이션된 수정불능 개체로부터의 정자는 비-수정능 획득 조건하에 인큐베이션된 정상 개체로부터의 정자의 GM1 편재화 패턴과 유사한 GM1 편재화 패턴을 갖는다.
본 명세서에 개시된 하나의 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 남성 개체로부터의 정자 샘플의 제1 부분을 비-수정능 획득 조건에 노출시켜 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플을 수득하고; 정자 샘플의 제2 부분을 수정능 획득 조건에 노출시켜 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 수득하고; 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 고정제로 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 고정시키고; 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 처리하고; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 두 가지 이상의 표지된 GM1 편재화 패턴을 감별하고; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 표지된 GM1 편재화 패턴을 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 표지된 GM1 편재화 패턴과 비교하고; 비교에 기초하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 수정능-비획득 상태에 배정하고; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 감별된 GM1 표지된 편재화 패턴에 기초하여 남성 개체의 수정능력 상태를 특성화하는 것을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치를 측정하는 것으로서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타내는 것인 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교하는 단계; 및 비교에 기초하여 수정능력 역치를 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
하나의 실시양태에서, 노출 단계 전에 비-금속재로 제조된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하고, 정액 점도를 감소시키는데 사용되는 각종 반응제로부터 선택된 것으로서 정자막을 손상시키지 않는 반응제를 사용하여 정액 샘플을 처리함으로써 정액의 점도를 감소시킨다. 일부 그와 같은 실시양태에서, 막을 손상시키는 반응제는 (i) 프로테아제; (ii) 뉴클레아제; (iii) 점액용해제; (iv) 리파제; (v) 에스테라제, 및 (vi) 글리코사이드 하이드롤라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 감별 단계는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수가 실질적으로 일정해질 때까지 반복된다. 그러한 하나의 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 5% 미만, 또는 3% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 그러한 또 다른 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 2% 내지 25%; 2% 내지 20%; 2% 내지 15%; 2% 내지 10%; 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다.
그와 같은 하나의 실시양태에서, 특성화 단계는 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 각각의 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 각각의 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계; 및, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
그러한 하나의 실시양태에서, 그 방법은 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 상기 비율을 수정능력 상태가 알려진, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 비율과 비교하는 단계; 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 상기 비율을 수정능력 상태가 알려진, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 비율과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 하나의 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 시험관내 비-수정능 획득 조건에 노출되고, 고정제 중에서 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 고정되고, GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 처리된, 남성 개체로부터의 정자 샘플의 제1 부분을 수득하는 단계; 시험관내 수정능 획득 조건에 노출되고, 고정제 중에서 고정되고, GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 표지화 분자로 처리된, 남성 개체로부터의 정자 샘플의 제2 부분을 수득하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 두 가지 이상의 표지된 GM1 편재화 패턴을 감별하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 표지된 GM1 편재화 패턴을 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 표지된 GM1 편재화 패턴과 비교하는 단계; 비교에 기초하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 수정능-비획득 상태에 배정하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 감별된 GM1 표지된 편재화 패턴에 기초하여 남성 개체의 수정능력 상태를 특성화하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치를 측정하는 단계로서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타내는 것인 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교하는 단계; 및 비교에 기초하여 수정능력 역치를 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
일부 실시양태에서, 감별 단계는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수가 실질적으로 일정해질 때까지 반복된다. 그러한 하나의 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 5% 미만, 또는 3% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 그러한 또 다른 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 2% 내지 25%; 2% 내지 20%; 2% 내지 15%; 2% 내지 10%; 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다.
그러한 방법의 하나의 실시양태에서, 그 방법은 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 각각의 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플 및 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플 각각에 대하여 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계를 포함한다.
그러한 하나의 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 상기 비율을 수정능력 상태가 알려진 남성 개체의 시험관내 수정능 획득처리된 정자의 GM1 편재화 패턴의 비율에 비교하는 단계; 및, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 상기 비율을 수정능력 상태가 알려진 남성 개체의 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자의 GM1 편재화 패턴의 비율에 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시양태로서, 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이 개시되어 있다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 남성 개체로부터의 정자 샘플을 시험관 내에서 수정능 획득 조건에 노출시키는 단계; 수정능 획득처리된 정자 샘플을 고정제로 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 고정시키는 단계; 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 처리하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 두 가지 이상의 표지된 GM1 편재화 패턴을 감별하는 단계; 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 수정능-비획득 상태에 배정하는 단계; 남성 개체의 수정능력 상태를 특성화하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치를 측정하는 단계로서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타내는 것인 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교하는 단계; 및 수정능력 역치를 비교에 기초하여 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
하나의 실시양태에서, 노출 단계 전에 비-금속재로 제조된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하고, 정액 점도를 감소시키는데 사용되는 각종 반응제로부터 선택된 것으로서 정자막을 손상시키지 않는 반응제를 사용하여 정액 샘플을 처리함으로써 정액의 점도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 막을 손상시키는 반응제는 (i) 프로테아제; (ii) 뉴클레아제; (iii) 점액용해제; (iv) 리파제; (v) 에스테라제, 및 (vi) 글리코사이드 하이드롤라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 감별 단계는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수가 실질적으로 일정해질 때까지 반복된다. 그러한 하나의 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 5% 미만, 또는 3% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 그러한 또 다른 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 2% 내지 25%; 2% 내지 20%; 2% 내지 15%; 2% 내지 10%; 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다.
그러한 하나의 실시양태에서, 그 방법은 상기 GM1 편재화 패턴의 비율을 수정능력 상태가 알려진 남성 개체의 GM1 편재화 패턴의 비율에 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 알려진 수정능력 상태는 수정가능 남성 개체에 대한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 알려진 수정능력 상태는 수정불능 남성 개체에 대한 것이다. 그러한 하나의 실시양태에서, 비교 단계는 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 각각의 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 하나의 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 시험관내 수정능 획득 조건에 노출되고, 고정제 중에서 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 고정되고, GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 염색된, 남성 개체로부터의 정자 샘플의 제1 부분을 수득하는 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 두 가지 이상의 GM1 표지된 편재화 패턴을 감별하는 단계; 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 수정능-비획득 상태에 배정하는 단계; 및 남성 개체의 수정능력 상태를 특성화하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 특성화 단계는 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치를 측정하는 단계로서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타내는 것인 단계; 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교하는 단계; 및 수정능력 역치를 비교에 기초하여 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정되며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치는 비교에 기초하여 확인된다.
일부 실시양태에서, 감별 단계는 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수가 실질적으로 일정해질 때까지 반복된다. 그러한 하나의 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 5% 미만, 또는 3% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 1% 내지 5%, 또는 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다. 그러한 또 다른 실시양태에서, 감별 단계가 수행된 후, 표지되고 고정된 시험관내 비-수정능 획득처리된 정자에 대한 라인드-셀 GM1 편재화 패턴의 수를, 그러한 수가 표지된 세포의 총수의 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만이 될 때까지; 또는 표지된 세포의 총수의 2% 내지 25%; 2% 내지 20%; 2% 내지 15%; 2% 내지 10%; 2% 내지 5%에 이를 때까지 측정한다.
그러한 하나의 실시양태에서, 그 방법은 상기 GM1 편재화 패턴의 비율을 수정능력 상태가 알려진 남성 개체의 GM1 편재화 패턴의 비율에 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 알려진 수정능력 상태는 수정가능 남성 개체에 대한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 알려진 수정능력 상태는 수정불능 남성 개체에 대한 것이다. 그러한 하나의 실시양태에서, 비교 단계는 미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 각각의 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 하나의 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 적어도 일부가 시험관내 수정능 획득 조건에 노출되어 수정능 획득처리된 정자로 되고, 고정제에 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 또는 24시간 이상 동안 노출되고, GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 염색된 정자 샘플을 수득하는 단계; 정자 샘플에 대해 한 가지 이상의 정액 파라미터 값을 수득하는 단계; 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴 중 한 가지 이상의 GM1 표지된 편재화 패턴에 기초하여, 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 캡-스코어를 측정하는 단계; 및, 측정된 캡-스코어 및 수득된 한 가지 이상의 정액 파라미터에 기초하여 남성 수정능력 지수 (MFI) 값을 계산하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 정자 샘플의 한 가지 이상의 정액 파라미터는 원래 정자 샘플의 부피, 정자의 농도, 정자의 운동성, 및 정자의 형태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 개시된 하나의 실시양태는 남성 수정능력 상태를 판정하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 그 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다. 시험관내 수정능 획득처리된 정자 세포의 샘플을 형광 표지로 처리한다. 하나 이상의 수정능 획득처리-형광 이미지가 얻어지며, 이러한 이미지는 형광 표지된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 세포와 관련된 한 가지 이상의 GM1 편재화 패턴을 표시한다. 수정능 획득처리-형광 이미지 중에 표시된, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 각각 수정능-획득 상태에 배정하고, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 수정능-비획득 상태에 배정한다. 수정능 획득처리-형광 이미지 중에 표시된 형광-표지된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 세포에 대하여, 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴 및 다른 모든 표지된 GM1 편재화 패턴을 포함하여 각 GM1 편재화 패턴의 수를 측정하여, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 결정한다. [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치를 측정하며, 여기서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정가능을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다는 작으나 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 수정능력 저하를 나타내며; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 2단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 수정불가를 나타낸다. [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치를 비교에 기초하여 확인한다.
또 다른 실시양태에서, [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트와 관련된 수정능력 역치가 측정하며, 여기서, 알려진 수정가능 집단의 분포 통계에 기초한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 관련하여, 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 큰 경우는 정상적 남성 수정능력을 나타내고; 표준 평균 퍼센트보다 표준편차 1단계 만큼 감소된 퍼센트보다 작은 경우는 비정상적 남성 수정능력을 나타낸다. 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대한 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 퍼센트를 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 표준 퍼센트와 비교한다. 수정능력 역치를 비교에 기초하여 확인한다.
하나의 그러한 실시양태에서, 판정 단계는 또한 환자 인구통계, 배우자의 생식능력 상태, 정자 농도, 전체 운동성, 전진 운동성, 정액 부피, 정액 pH, 정액 점도 및/또는 정자 형태 및 그들의 조합 중 한 가지 이상의 인자에 기초한다.
본 명세서에 개시된 방법의 여러 실시양태에서, 정자 세포는 시험관 내에서 수정능 획득 조건으로 1시간 이상; 3시간 이상; 12시간 이상; 18시간 이상; 24시간 이상의 수정능 획득처리 시간 동안; 또는 0.5시간 내지 3시간; 3시간 내지 12시간; 6시간 내지 12시간; 3시간 내지 24시간; 12시간 내지 24시간; 또는 18시간 내지 24시간의 수정능 획득처리 시간 동안 처리된다.
본 명세서에 개시된 방법의 여러 실시양태에서, 시험관내 수정능 획득처리된 정자 세포는 고정제로 0.5시간 이상; 3시간 이상; 12시간 이상; 18시간 이상; 24시간 이상; 30시간 이상; 36시간 이상; 또는 48시간 이상의 고정 시간 동안; 또는 0.5시간 내지 3시간; 3시간 내지 12시간; 6시간 내지 12시간; 3시간 내지 18시간; 6시간 내지 18시간; 6시간 내지 24간; 12시간 내지 24시간; 18시간 내지 24시간; 18시간 내지 30시간; 18시간 내지 36시간; 24시간 내지 30시간; 24시간 내지 26시간; 18시간 내지 48시간; 24시간 내지 48시간; 또는 36시간 내지 48시간의 고정 시간 동안 처리된다.
본 명세서에 개시된 방법의 여러 실시양태에서, 두 가지 이상의 GM1 표지된 편재화 패턴은 AA GM1 편재화 패턴, APM GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴, 중간대 (INTER) GM1 편재화 패턴, 첨체 후방 원형질막 (PAPM) GM1 편재화 패턴, 첨체 정상부/첨체 후방 (AA/PA) GM1 편재화 패턴, 적도대 (ES) GM1 편재화 패턴 및 확산 (DIFF) GM1 편재화 패턴을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 정자 샘플의 제1 부분을 비-수정능 획득 조건에 노출시키는 것과, 정자 샘플의 제2 부분을 수정능 획득 조건에 노출시키는 것이 동시에 일어난다.
남성 개체는 인간 또는 비-인간 동물일 수 있다. 비-인간 동물의 경우에, 수정능력 상태와 관련된 패턴의 감별은 본 명세서에 제공된 교시 내용에 기초하여 수행될 수 있다. 비-인간 동물은 말, 소, 개, 고양이, 돼지, 염소, 양, 사슴, 토끼, 닭, 칠면조, 각종 어류 및 각종 동물류를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 수정능 획득 조건 및 비-수정능 획득 조건하에 인큐베이션되고 임의로는 고정된, 남성 개체로부터의 정자 및 정상 대조로부터의 정자 중 GM1 편재화 패턴 (예를 들어, 라인드-셀, AA, APM, 및 다른 모든 GM1 편재화 패턴 중 한 가지 이상)을 얻고, GM1 편재화 패턴을 비교하는 것을 포함하는, 남성 개체를 수정불능 가능성으로 판단하는 방법을 제공한다. 정상 대조에서는, 특정 편재화 패턴을 나타내는 정자의 퍼센트에 있어서 통계적으로 유의한 변화가 관찰될 것이다. 시험 개체로부터의 정자에서 동일한 변화가 관찰되지 않으면, 그 개체는 비정상적 수정능력 상태를 갖는 것으로 간주된다. 하나의 실시양태에서, 정상 및 비정상 수정능력 상태의 정보를 제공하는 패턴은 라인드-셀, INTER, AA 및/또는 APM 편재화 패턴이다. 따라서, 정상 수정능력 상태를 갖는 것으로 알려진 개체로부터의 샘플 (대조로서 사용될 수 있음)에 있어서, 시험관내 비-수정능 획득 조건에 노출되었을 때와 비교하여 시험관내 수정능 획득 조건에 노출되었을 때, AA 및/또는 APM 편재화 패턴을 나타내는 정자의 퍼센트는 보다 높고, 라인드-셀 및/또는 INTER 편재화 패턴을 나타내는 정자의 퍼센트는 보다 낮다. 시험관내 비-수정능 획득 조건에 노출되었을 때와 비교하여 시험관내 수정능 획득 조건에 노출되었을 때, 이들 편재화 패턴 중 한 가지 이상의 퍼센트에 있어서 차이가 관찰되지 않거나 유의한 차이가 관찰되지 않는 경우, 그 개체는 수정능력에 문제가 있는 것으로 판단된다. 상기 실시양태의 변형으로, 대조는 수정불능이거나 수정능력이 저하된 것으로 알려진 개체로부터의 것일 수 있다. 이 실시양태에서, 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시 시험 개체로부터의 라인드-셀, INTER, AA 및/또는 APM 편재화 패턴에 있어서의 변화가 대조에 있어서의 변화와 동일할 때, 그 개체는 수정불능 또는 수정능력 저하로 간주될 수 있다.
상기 실시양태의 또 다른 변형으로, 시험 개체로부터의 샘플은 대조에 비교되지 않고 평가될 수 있다. 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시 라인드-셀, INTER, AA 및/또는 APM 패턴에 있어서, 변화 또는 유의한 변화가 관찰되지 않는 경우, 그 개체는 비정상으로 간주되거나, 추가의 시험을 요하는 것으로 간주될 수 있는 반면, 라인드-셀 및/또는 INTER가 감소되고, AA가 증가되고/거나 APM이 증가되는 변화가 관찰되는 경우, 그 개체는 정상 수정능력을 갖는 것으로 간주될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 그 방법은 시험관내 수정능 획득 조건에 노출된 정자의 GM1 편재화 패턴을 분석하여 AA 및 APM 패턴의 수를 확인하는 것을 포함한다. 패턴의 수는 패턴 총수에 대한 한 가지 이상의 GM1 분포 패턴의 수의 퍼센트로서 표현될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 수정능력은 AA 및/또는 APM 편재화 패턴의 수를 미리결정된 수정능력 역치, 예를 들어, 수정불가 및 수정능력 저하로 분류되는 개체들 사이의 역치 (즉, 컷-오프) 수준, 또는 수정능력 저하 및 수정가능으로 분류되는 개체들 사이의 역치 수준에 비교한 것을 기초로 하여 예측된다.
다른 실시양태에서, 수정능력 역치는 수정능력이 알려진 남성 집단으로부터의 정자에서 발견되는 패턴을 통계적으로 분석하여 결정될 수 있다. 이 방법을 적용함에 있어서, 자연 임신 또는 3회 이하의 자궁내 인공수정에 의하여 현재 임신한 배우자가 있거나 3년 이내에 태어난 아이가 있는 남성은 수정가능 또는 정상 수정능력을 갖는 것으로 간주된다. 이 방법을 적용함에 있어서, 6 내지 12개월 이내에 피임을 하지 않고서 임신에 실패했고, 임신을 위해 4회 이상의 자궁내 인공수정을 요했던 남성은 수정능력 저하로 간주된다. 이 방법을 적용함에 있어서, 1년 이내에 피임을 하지 않고서 임신에 실패했고, 반복되는 자궁내 인공수정에도 임신에 실패한 남성은 수정불가로 간주된다. 이 방법을 적용함에 있어서, 비정상적 남성 수정능력은 수정능력 저하 및 수정불능 남성을 포함한다.
도 4에 도시되어 있는 바와 같이, 수정가능한 것으로 알려진 24명의 남성으로부터 73개의 정액 샘플을 수득하였다. 그들의 정자를 수정능 획득을 위한 자극, 이 경우에 4 mM 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린과 함께 인큐베이션시키고, 0.01% 파라포름알데하이드 (최종 농도)로 고정시켰다. 수정능을 획득하였음을 나타내는 패턴 (예를 들어, AA + APM)을 갖는 세포의 퍼센트를 평가하였다. AA 및 APM 패턴을 갖는 정자의 평균 퍼센트는 41%였으며, 평균치로부터 표준편차 2단계 만큼 벗어난 값은 27% 및 55%로 계산되었다.
수정능력 상태에 대한 의학적 평가를 구하는 14명의 남성으로부터 채집된 14개의 샘플의 GM1 편재화 패턴을 분석하였다. AA + APM 편재화 패턴을 갖는 정자의 상대적 퍼센트를 수정가능으로 알려진 남성 집단으로부터 확인된 통계학적 역치와 비교하였다 (도 5). 기준시 (비-자극, 비-수정능 획득) 조건하에 인큐베이션된 샘플에서 차이는 관찰되지 않았다. 그러나, 14명의 남성 중 5명에서, 4 mM 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린과 함께 인큐베이션되었을 때 AA + APM 패턴을 갖는 정자의 퍼센트는 낮게 나타났다. 이들 5개의 샘플은 모두 평균치로부터 표준편차 2단계 만큼 낮아졌다. 임신에 어려움을 겪는 부부의 대략 30 내지 50%는 남성이 원인이라고 여겨진다. 이 데이터는 그와 같은 예측된 범위 내에 드는 것이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 남성 수정능력 상태를 판정하는 키트를 제공한다. 그러한 키트는 다음 중 한 가지 이상을 포함한다: 정자막에 전단력 부하를 방지하기에 충분히 큰 직경의 오리피스를 갖는 피펫, 시험관내 수정능 획득처리의 자극제로 작용할 수 있는 활성제, 수정능 획득처리용 매질, 비-수정능 획득처리용 매질, 고정제, GM1 편재화 패턴의 측정을 위한 표지화 시약, 수정능 획득처리된 정자의 한 가지 이상의 GM1 편재화 패턴 및 비-수정능 획득처리된 정자의 한 가지 이상의 GM1 편재화 패턴을 나타낸 다이아그램. 수정능 획득처리된 정자 및 비-수정능 획득처리된 정자의 그와 같은 GM1 편재화 패턴은 알려진 수정능력 상태를 반영하는 것이다. 그러한 키트 실시양태에서, 고정제 조성물은 정자막을 손상시키지 않아야 한다. 그러한 실시양태에서, 정자막을 손상시킬 수 있는 반응제는 정액 점도를 감소시키는데 사용되는 각종 반응제로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 막을 손상시키는 반응제는 프로테아제, 뉴클레아제, 점액용해제, 리파제, 에스테라제 및 글리코사이드 하이드롤라제 중 1종 이상을 포함한다. 또 다른 키트 실시양태에서, 수정능 획득처리용 매질 및 비-수정능 획득처리용 매질은 시험관내에서 정자 세포에 사용될 때, 다이아그램에 나타낸 바와 같은, 수정능 획득처리된 정자를 나타내는 GM1 편재화 패턴 및 비-수정능 획득처리된 정자를 나타내는 GM1 편재화 패턴을 생성한다.
하나의 실시양태에서, 키트는 수정능 획득을 자극하기 위하여 4% 시클로덱스트린을 함유하는 활성제를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 수정능 획득처리용 매질은 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린이 최종 농도 3 mM로 첨가된 개량 인간 난관액을 포함하고; 비-수정능 획득처리용 매질은 개량 인간 난관액을 포함하며; 고정제는 1% 파라포름알데하이드이고; GM1 패턴 측정을 위한 시약은 콜레라 독소 b 서브유닛 (15 ㎍/ml 최종 농도)이다. 다른 실시양태에서, 파라포름알데하이드의 최종 농도는 0.01%이다.
예시적인 키트는 HEPES로 완충된 젠타마이신 함유 개량 HTF 배지 (Irvine Scientific, 제품번호 90126)를 포함한다. 중탄산염-완충된 매질이나 HEPES-완충된 매질을 사용하였을 때, GM1 편재화 패턴, 활동력 또는 정자 회수, 및 수정능 획득에 있어서의 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, 중탄산염-완충된 매질이 또한 사용될 수 있다. 이러한 매질이 CO2 인큐베이터에만 사용될 수 있는 반면에, HEPES-완충액을 사용하는 경우에는 에어 인큐베이터 또는 수조를 사용하는 연구실에서 어세이를 수행할 수 있다. 마찬가지로, 시판용 (HTF-SSSTM, Irvine Scientific, 또는 플라스마네이트) 또는 분말화 알부민 등의 보충 단백질을 가하는 것이 회수율 또는 활동력을 변화시키지는 않았으며, 수정능 획득처리 상태를 개선 향상시켰다.
예시적인 키트는 또한 세포 단리용 매질 (예를 들어, 인핸스 S-플러스 세포 단리용 매질, 90%; Vitrolife 제조, 제품번호: 15232 ESP-100-90%)을 포함할 수 있다. 예시적인 활성제, 소모품 및 과정은 인간 정자의 GM1을 우수하게 표지화하는 것으로 입증되었다.
예시적인 키트는 또한 오리피스가 넓은 피펫 팁 (200 ㎕ 크기 오리피스 팁, USA scientific, 1011-8400)을 포함할 수 있다. 예시적인 키트는 또한 오리피스가 넓은 트랜스퍼 피펫 (다목적 트랜스퍼 피펫, 표준 벌브 제품 번호: 202-20S. VWR 카탈로그 번호 14670-147)을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 피펫은 비-금속재로 된 것이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다.
예시적인 키트는 또한 수정능 획득을 자극하기 위하여 시클로덱스트린을 분말화된 형태로 함유하는 것과, 매질 단독의 비-수정능 획득 조건을 위한 것을 포함하여, 1.5ml 튜브 (수정능 획득 조건, 비-수정능 획득 조건, CD) (USA Scientific 14159700)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시클로덱스트린을 별도의 튜브에 넣고, 여기에 매질을 가하여 스톡 용액을 만들고, 이것을 수정능 획득처리용 튜브에 가할 수도 있다.
정장으로부터 정자를 단리할 때, 남성의학 연구소에서는 정자를 밀도 구배에 의해 채집하는 것이 일반적이다. 예시적인 키트는 또한 밀도 구배 물질 및/또는 정장을 밀도 구배 물질로부터 회수한 다음 새로운 트랜스퍼 피펫을 사용하여 펠렛화된 정자를 수집하라는 지시를 포함할 수 있다.
예시적인 키트는 또한 고정제 (예를 들어, 0.1% PFA)를 포함할 수 있으며, 임의로는 정보 서식 (예를 들어, 환자 신청서), 라벨, 및 수송, 저장 또는 규제 목적에 유용한 용기/백/파우치 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 포일 파우치, 환자 샘플 우송을 위한 흡수재 함유 유해생물질 백, 흡수재 함유 재밀봉형 백, 및 발포체 튜브 플레이스 홀더 등을 포함할 수 있다.
예시적인 키트는 또한 본 명세서에 개시된 임의의 방법을 기술한 지시서를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 남성 개체의 수정능력을 측정하는 방법이 제공된다. GM1 편재화 패턴 분석은 정자가 수정능을 획득하여, 결과적으로 난자를 수정시킬 수 있는지를 보여줄 수 있다. 상술한 바와 같이, 분석법은 정자 두부 중 GM1 편재화의 특이적 패턴을 갖는 형태학적으로 정상인 정자의 퍼센트로서 점수가 매겨질 수 있다. APM 및 AA 패턴은 정자가 수정능 획득을 위한 자극에 반응함에 따라 증가한다. 컷-오프는 사정물의 상대적 수정능력을 차별화하는데 사용되어, 정액 샘플을 남성 수정능력에 기초하여 군으로 분류 (예를 들어, 수정가능한 남성을 수정능력 저하 또는 수정불가한 남성과 구분)할 수 있다. 그러나, 정자의 수, 운동성 및 형태가 또한 남성 수정능력에 영향을 미칠 수 있으므로, 본 발명은 캡-스코어 및 한 가지 이상의 관련 정액 파라미터 (예를 들어, 수, 운동성 및 형태 등)를 포함하는 남성 수정능력의 지수 ("남성 수정능력 지수" 또는 "MFI")를 생성하는 방법을 제공한다. 캡-스코어 (GM1 스코어라고도 지칭)는 한 가지 이상의 GM1 패턴의 수이다. 예를 들어, 캡-스코어는 라인드-셀, INTER, AA 및 APM 중 한 가지 이상의 수일 수 있다. 특정 정액 파라미터를 강조하는 여러가지 다른 지수가 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 지수는 다음을 포함한다:
· 캡-스코어 × 전진 운동성을 갖는 정자의 % × 절대적인 수;
· 캡-스코어 × 형태학적으로 정상인 정자의 % × 절대적인 수;
· 캡-스코어 × 전체 운동성을 갖는 정자의 % × 절대적인 수 × 형태학적으로 정상인 정자의 %; 및
· 캡-스코어 및 이들 파라미터, 또는 다른 특정 파라미터, 예컨대, CASA (컴퓨터 정자 분석)를 사용하여 수득된 것으로서, VSL (속도 직선), STR (직선성), LIN (선형성), VCL (곡선 속도), VAP (속도 평균 경로), % 운동성, 운동성 지속시간, LHA (수평 두부폭), WOB (워블), PROG (전진), 및 BCF (비트 교차수) 등의 변형 또는 조합. 예를 들어, 문헌 (World Health Organization, "WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Sperm," (Fifth Ed. 2010)) 참조.
남성 수정능력 지수는 남성 개체의 수정능력 상태를 측정하는 방법으로서 구현될 수 있다. 측정하려는 개체로부터 정자 샘플을 얻어서, 상술한 바와 같이, 적어도 일부를 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시키고, 고정제에 노출시킨 다음, GM1에 대하여 염색한다. 정자 샘플에 대하여, 예를 들어, 개체로부터의 원래 샘플의 부피, 및/또는 농도, 운동성 및/또는 샘플의 정자의 형태와 같은 한 가지 이상의 정액 파라미터를 얻는다. 한 가지 이상의 GM1 패턴의 수 (예를 들어, "캡-스코어") 및 수득된 한 가지 이상의 정액 파라미터 값으로부터 MFI를 결정한다. 본 명세서에서 사용된 실시예에서, 캡-스코어는 수정능 획득 조건하에 3시간 처리시 얻어진 한 가지 이상의 GM1 패턴의 퍼센트이나, 다른 변형된 캡-스코어 (예를 들어, 다른 처리 시간에서의 수, 수정능 획득 조건하와 비-수정능 획득 조건하에서의 GM1 패턴의 수에 있어서의 변화의 차이 등)가 본 발명에 비추어 자명할 것이다.
하나의 실시양태에서, 다음 방정식에 따라서 남성의 정액 샘플에 대하여 남성 수정능력 지수 스코어가 계산될 수 있다: 남성 수정능력 지수/수정능력 군 = a + b1*x1　+ b2*x2　+ ... + bm*xm (식에서, a는 상수이고, b1　내지　bm은 회귀 계수이며, x1 내지 xm은 남성 수정능력 변수, 예를 들어, 캡-스코어, 운동성, 형태, 부피 및 농도임). 판별 함수 분석을 사용하여 어떠한 수정능력 변수가 둘 이상의 자연 발생군을 판별하는지 결정할 수 있다. 예를 들어, 개체가 수정가능, 수정능력 저하 또는 수정불가 중 어느 군에 속하는지를 결정하기 위하여, 정자 기능 및 정액 품질을 결정하는 여러 가지 수정능력 변수에 대하여 데이터를 수집한다. 그 다음 판별 분석을 사용하여 어떤 변수(들)이 수정능력 군을 가장 잘 예측하는지, 또한 각 수정능력 변수에 상대적으로 어느 정도의 가중치를 두어야 하는지 결정할 수 있다.
남성 수정능력 지수는 GM1 편재화 패턴 어세이를 판독하는 연구실에 의해 생성될 수 있다. 연구실은 하나 이상의 기관 (예를 들어, 불임 클리닉, 정자 은행 등)으로부터 정자 샘플 및 그에 대한 정액 분석을 얻을 수 있다. 정액 분석 정보는 GM1 편재화 어세이 키트에 포함된 카드 상에 포함되거나, 전자통신 방식으로 연구실에 송부되고/거나 다른 방식으로 제공될 수 있다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 연구실은 정자 샘플의 캡-스코어를 수득하며, 또한 그 정자 샘플에 대한 정액 분석 정보를 수득한다. 하나의 실시양태에서, 연구실은 수득된 캡-스코어 및 수득된 정액 분석 데이터에 기초하여 남성 수정능력 지수를 계산한다.
남성 개체의 수정능력 상태를 판정하는 예시적인 방법은 개체로부터의 정자 샘플을 시험관내 비-수정능 획득 및 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시키는 것을 포함한다. 정자를 고정시키고, 고정된 정자 중 선택된 GM1 패턴의 퍼센트를 결정한다. 시험관내 비-수정능 획득 조건 및 시험관내 수정능 획득 조건에 노출된 정자 중 상이한 GM1 패턴에 대한 퍼센트를 비교한다. 시험관내 비-수정능 획득 조건에 노출된 정자와 비교하여 시험관내 수정능 획득 조건에 노출된 정자 중 선택된 한 가지 이상의 GM1 패턴의 퍼센트에 있어서의 변화는 개체의 수정능력 상태를 나타낸다. 선택된 GM1 패턴은 라인드-셀, INTER, AA 및/또는 APM일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 개체의 수정능력 상태는 수정능 획득처리된 정자에 대하여 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수를 기준으로 한 AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하여 결정한다.
남성 개체의 수정능력 상태를 판정하는 예시적인 방법은 개체로부터의 정자 샘플을 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시키는 것을 포함한다. 정자를 고정시키고, 고정된 정자 중 선택된 GM1 패턴의 퍼센트를 결정한다. 상이한 GM1 패턴에 대한 퍼센트를 대조의 퍼센트와 비교하며, 이때 대조 정자 샘플은 동일한 시험관내 수정능 획득 조건 및 동일한 고정제에 노출시킨 것이다. 대조에 있어서의 변화에 비교한, 한 가지 이상의 선택된 GM1 패턴의 퍼센트에 있어서의 변화는 대조의 수정능력 상태와 상이한 개체의 수정능력 상태를 나타낸다. GM1 패턴은 라인드-셀, INTER, AA 및/또는 APM일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 개체의 수정능력 상태는 수정능 획득처리된 정자에 대한 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한 AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하여 결정한다. 하나의 실시양태에서, 노출 단계 전에, 비-금속재로 제조된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하고, 정액 점도를 감소시키는데 사용되는 각종 반응제로부터 선택된 것으로서 정자막을 손상시키지 않는 반응제를 사용하여 처리함으로써 정액의 점도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 막을 손상시키는 활성제는 (i) 프로테아제; (ii) 뉴클레아제; (iii) 점액용해제; (iv) 리파제; (v) 에스테라제, 및 (vi) 글리코사이드 하이드롤라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다.
예시적 방법에서, 대조는 정상 수정능력 상태를 갖는 것으로 알려진 개체나 비정상 수정능력 상태를 갖는 것으로 알려진 개체로부터의 정자 샘플일 수 있다. 대조는 다수의 개체를 포함하는 데이터 세트, 예를 들어, 50개체 이상을 포함하는 데이터 세트로부터 얻어진 값일 수 있다.
남성 개체의 수정능력 상태를 수정가능, 수정능력 저하 또는 수정불능으로 판정하는 하나의 예시적인 방법은 개체로부터의 정자 샘플을 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시키는 것을 포함한다. 샘플 중의 GM1 패턴을 측정한다. 한 가지 이상의 GM1 패턴의 퍼센트를, 그것보다 낮은 퍼센트는 수정능력에 문제가 있음을 나타내는 것인 수정능력 역치와 비교한다. 예를 들어, 수정능력 역치보다 낮은 퍼센트는 수정불능 또는 수정능력 저하의 수정능력 상태를 나타낼 수 있다. GM1 패턴은 라인드-셀, INTER, AA 및/또는 APM일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 개체의 수정능력 상태는 수정능 획득처리된 정자에 대한 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한 AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하여 결정한다. 하나의 실시양태에서, 노출 단계 전에, 정액 샘플을 비-금속재로 제조된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하고, 정액 점도를 감소시키는데 사용되는 각종 반응제로부터 선택된 것으로서 정자막을 손상시키지 않는 반응제를 사용하여 처리함으로써 정액의 점도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 막을 손상시키는 반응제는 (i) 프로테아제; (ii) 뉴클레아제; (iii) 점액용해제; (iv) 리파제; (v) 에스테라제, 및 (vi) 글리코사이드 하이드롤라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다.
예시적인 방법에서, 시험관내 수정능 획득 조건은 i) 중탄산 이온 및 칼슘 이온, 및 ii) 스테롤 배출 매개체, 예컨대, 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린, 혈청 알부민, 고밀도 지단백질, 인지질 소포, 제대 혈청 한외여과물, 지방산 결합 단백질, 또는 리포좀 등에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 그러한 예시적 방법에서, 대조를 수정능 획득 조건 또는 비-수정능 획득 조건에 노출시키는 것은 시험 샘플과 병행할 수 있다.
남성 개체의 수정능력 상태를 수정가능, 수정능력 저하 또는 수정불능으로 판정하는 하나의 예시적인 방법은 개체로부터의 정자 샘플을 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시키는 것을 포함한다. 샘플 중 각 GM1 패턴의 퍼센트를 측정한다. 한 가지 이상의 GM1 패턴의 퍼센트를, 그것보다 낮은 퍼센트는 수정능력에 문제가 있음을 나타내는 것인 수정불능 역치와 비교한다. 예시적인 방법에서, 시험관내 수정능 획득 조건은 i) 중탄산 이온 및 칼슘 이온, 및 ii) 스테롤 배출 매개체, 예컨대, 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린, 혈청 알부민, 고밀도 지단백질, 인지질 소포, 제대 혈청 한외여과물, 지방산 결합 단백질, 또는 리포좀 등에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 한 가지 이상의 GM1 패턴은 라인드-셀, INTER, AA 및/또는 APM일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 개체의 수정능력 상태는 수정능 획득처리된 정자에 대한 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수에 대한 AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하여 결정한다. 하나의 실시양태에서, 노출 단계 전에, 정액 샘플을 비-금속재로 제조된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하고, 정액 점도를 감소시키는데 사용되는 각종 반응제로부터 선택된 것으로서 정자막을 손상시키지 않는 반응제를 사용하여 처리함으로써 정액의 점도를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 막을 손상시키는 반응제는 (i) 프로테아제; (ii) 뉴클레아제; (iii) 점액용해제; (iv) 리파제; (v) 에스테라제, 및 (vi) 글리코사이드 하이드롤라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 게이지 크기는 18 게이지, 16 게이지 또는 14 게이지 이상이다. 일부 실시양태에서, 오리피스가 넓은 피펫의 오리피스 크기는 1 mm, 1.2 mm 또는 1.4 mm 이상이다.
예시적 방법에서 수정능력 역치는 집단의 수정능력이 실질적으로 증가하는 것이 멈춰지는 AA + APM 패턴 퍼센트일 수 있다. 예를 들어, 수정능력 역치는 집단의 50%를 초과하는 구성원이 수정가능한 것인 AA + APM의 수준이거나; 집단의 60% 초과 내지 85%가 수정가능한 것인 AA + APM의 수준이거나; (총 GM1 패턴에 대한 상대적 퍼센트가) 35% 내지 40% (포함) 범위인 AA + APM의 수준일 수 있다. 수정능력 역치는 (총 GM1 패턴에 대한 상대적 퍼센트가) 38%, 38.5%, 39% 또는 39.5% AA + APM일 수 있다.
하나의 예시적인 방법은 한 가지 이상의 GM1 패턴의 퍼센트를, 그것보다 낮은 퍼센트는 수정불능을 나타내는 것인 수정불능 역치와 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 수정불능 역치는 집단의 수정능력이 실질적으로 증가하기 시작하는 AA + APM 패턴 퍼센트로서, 예를 들어, 수정불능 역치는 집단의 50% 미만이 수정가능한 것인 AA + APM의 수준이거나; 집단의 60% 초과 내지 85%가 수정가능한 것인 AA + APM의 수준이거나; (총 GM1 패턴에 대한 상대적 퍼센트가) 14% 내지 18% (포함) 범위인 AA + APM의 수준일 수 있다. 수정불능 역치는 (총 GM1 패턴에 대한 상대적 퍼센트가) 14%, 14.5%, 15%, 또는 15.5% AA + APM일 수 있다.
남성 개체의 수정능력 상태를 판정하는 하나의 예시적인 방법은 정자 샘플을 수득하는 것을 포함하며, 개체로부터의 정자 샘플을 시험관내 비-수정능 획득 조건 또는 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시키고, 고정시키고, GM1 패턴을 얻기 위하여 염색한다. 정자 중 선택된 GM1 패턴의 수를 측정한다. 시험관내 비-수정능 획득 조건 및 시험관내 수정능 획득 조건에 노출된 정자 중 상이한 GM1 패턴에 대한 퍼센트를 비교한다. 시험관내 비-수정능 획득 조건에 노출된 정자에 비교한 시험관내 수정능 획득 조건에 노출된 정자 중 선택된 한 가지 이상의 GM1 패턴의 퍼센트에 있어서의 변화는 개체의 수정능력 상태를 나타낸다. GM1 패턴은 AA, APM, INTER, 라인드-셀 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 개체의 수정능력 상태는 수정능 획득처리된 정자에 대하여 GM1 표지된 편재화 패턴의 총수를 기준으로 한 AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하여 결정한다.
남성 개체의 수정능력 상태를 판정하는 하나의 예시적인 방법은 정자 샘플을 수득하는 것을 포함하며, 개체로부터의 정자 샘플을 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시키고, 고정시키고, GM1의 존재 확인을 위해 염색한다. 정자 중 선택된 GM1 패턴의 수를 측정한다. 한 가지 이상의 상이한 GM1 패턴에 대한 퍼센트를 대조로부터의 패턴의 퍼센트 또는 미리결정된 기준과 비교한다. 대조 정자 샘플은 동일한 시험관내 수정능 획득 조건 및 동일한 고정제에 노출된 것이다. 대조에 있어서의 변화에 비교한, 한 가지 이상의 선택된 GM1 패턴의 퍼센트에 있어서의 변화는 대조의 수정능력 상태와 상이한 개체의 수정능력 상태를 나타낸다.
남성 개체의 수정능력 상태를 판정하는 하나의 예시적인 방법은 정자 샘플을 수득하는 것을 포함하며, 개체로부터의 정자 샘플을 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시키고, 고정시키고, GM1 패턴을 얻기 위하여 염색한다. 정자 중 GM1 패턴을 측정한다. 한 가지 이상의 GM1 패턴의 퍼센트를, 그것보다 낮은 퍼센트는 수정능력에 문제가 있음을 나타내는 것인 수정불능 역치와 비교한다.
남성 개체의 수정능력 상태를 판정하는 하나의 예시적인 방법은 정자 샘플을 수득하는 것을 포함하며, 개체로부터의 정자 샘플을 시험관내 수정능 획득 조건에 노출시키고, 고정제에 노출시키고, GM1 패턴을 얻기 위하여 염색한다. 원래 샘플의 부피, 원래 샘플 중 정자의 농도, 운동성 및 형태 중 한 가지 이상에 대한 값을 수득한다. 정자 샘플의 캡-스코어를 샘플 중 한 가지 이상의 GM1 편재화 패턴의 퍼센트로서 측정한다. 개체의 남성 수정능력 지수 (MFI)의 값은 결정된 캡-스코어 및 수득된 부피, 농도, 운동성 및 형태 중 한 가지 이상에 기초하여 계산한다. 예를 들어, MFI 값은 캡-스코어, 부피, 농도, 운동성 값, 형태 값을 곱하여 계산할 수 있다. 운동성은 운동하는 정자의 퍼센트일 수 있다. 형태는 형태적으로 정상인 정자의 퍼센트일 수 있다.
남성 개체의 수정능력 상태를 측정하는 하나의 예시적인 방법은 샘플 중 한 가지 이상의 GM1 편재화 패턴의 퍼센트로서 개체로부터의 정자 샘플의 캡-스코어를 수득하는 것을 포함한다. 원래 샘플의 부피, 원래 샘플 중 정자의 농도, 운동성 및 형태 중 한 가지 이상에 대한 값을 수득한다. 개체의 남성 수정능력 지수 (MFI)의 값은 결정된 캡-스코어 및 수득된 부피, 농도, 운동성 및 형태 중 한 가지 이상에 기초하여 계산한다.
본 발명이 하기 예시적인 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
이 실시예는 인간 정자에서 수득된 GM1 편재화 패턴을 입증한다. 남성 공여자로부터 사정된 정자를 채집하고, 37℃에서 20분 동안 액상화한 다음, 부피, 초기 숫자, 운동성 및 형태 평가를 수행하였다. 15 ml의 원뿔형 튜브 중에서 1 ml의 밀도 구배 물질 (90% 인핸스-S, 비트로라이프 (Vitrolife), San Diego, California, USA 소재) 위에 1 ml의 정액 샘플의 층을 만들었다. 튜브를 300 x g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 바닥 1 ml 분획을 새로운 15 ml 튜브로 옮긴 다음, 4 ml의 mHTF에 재현탁시켰다. 이것을 600 x g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상등액을 제거한 다음, 정자 펠렛을 0.5 ml의 mHTF에 재현탁시켰다. 세척된 정자를 농도 및 운동성에 대하여 평가하였다. 동일한 부피의 정자를, 각 튜브의 최종 부피가 300 ㎕가 되고, 정자의 최종 농도가 1,000,000/ml가 되도록 두 개의 튜브에 넣었다. 첫번째 튜브는 mHTF (비-수정능 획득 조건)를 함유하였으며, 두번째 튜브는 mHTF와 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린을 최종 농도 3 mM (수정능 획득 조건)로 함유하였다. 정자를 상이한 시간 동안 인큐베이션하였으나, 전형적으로는 3시간 동안 하였다. 인큐베이션은 37℃에서 수행하였다.
인큐베이션 기간 말기에, 각 튜브의 내용물을 온화하게 혼합하고, 각 튜브로부터 18 ㎕를 취하여 별도의 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 2 ㎕의 1% (중량/부피) 파라포름알데하이드를 최종 농도 0.1%가 되도록 가하였다. 다른 실시양태에서는, 0.1% (중량/부피) 파라포름알데하이드를 최종 농도 0.01%가 되도록 가하였다. 이들 튜브를 온화하게 혼합한 다음, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 0.3 ㎕의 1 mg/ml 콜레라 독소 b 서브유닛을 가하였다. 두 튜브의 내용물을 다시 온화하게 혼합하고, 실온에서 추가로 5분 동안 인큐베이션하였다. 각 튜브로부터 5 ㎕를 회수하여, 형광전자현미경 평가를 위해 유리 슬라이드 위에 놓았다. 카운터-염색, 초점면의 빠른 결정 및 형광 시그널의 지속 시간 연장을 제공하기 위하여, 때때로 3 ㎕의 DAPI/안티훼이드를 가하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 정상 인간 정자 중 GM1의 편재화 패턴은 수정능 획득 조건에의 반응을 반영한다. 완전한 반응은 정상 수정능력을 가진 남성에게서만 보이며, 반응성 패턴은 이전에 자궁내 인공수정 (IUI) 또는 시험관내 인공수정 (IVF)에서 실패한, 불임의 원인을 알 수 없는 남성에서는 상당히 감소되거나 결여되어 있었다. 도 1은 인간 정자에서의 GM1 패턴을 보여준다. 그러나, 진단 분석의 목적에서, 분석을 용이하게 하기 위하여 PAPM, AA/PA, ES 및 DIFF과 같이 비정상성을 나타내는 패턴을 하나의 군으로 하였다. 도 2A 내지 2C는 비-수정능 획득 조건 (NC; 도 2A), 또는 수정능 획득 조건 (CAP; 도 2B)하에 인큐베이션된 정상 정액 중 상이한 패턴들의 상대적 분포를 도시한 것이다. CAP에 노출시 정상 정액에서 INTER 패턴에서의 감소가 나타난 반면 (도 2B), AA 패턴 및 APM 패턴에서는 상당한 증가가 보인다. 이들 정상적인 데이터와 비교하여, 원인 불명의 불임이 있는 것으로 알려진 남성군으로부터의 정자에 또한 GM1 어세이를 수행하였다. 이들 정자에서, 수정능 획득 조건하에 AA 패턴 또는 APM 패턴에 있어서의 증가는 거의 없었다 (도 2C).
실시예 2
이 실시예에서는, 34명 환자의 임상이력을 연구하여, 이제까지 수득된 임신의 임상적 증거 이력에 대비하여 그들의 GM1 어세이 스코어의 정밀한 분석을 수행하였다. 남성 환자는 3 사이클 이내에 환자 커플이 수정/임상적 임신의 어느 정도의 증거가 있을 때 (그것이 생화학적 증거 또는 초음파 심장박동이 없는 태낭에 한정되는 경우라도), "수정가능"으로 규정하였다.
이들 34명 환자의 데이터를 분석한 결과, 3시간 동안 수정능 획득처리한 샘플의 점수에 대해 40% (APM + AA) 컷-오프를 적용하는 경우, "통과한" (39.5% 또는 그 이상의 점수를 갖는) 8명 중 7명은 "수정가능"으로 판정된 것으로 밝혀졌다 (87.5%). "실패한 (통과하지 못한)" (39.4% 이하의 점수를 갖는) 26명 중에서, 단지 3명만이 임상적 임신의 증거를 가졌다 (11.5%). (하기 표 참조)
컷-오프를 감소시키는 경우, 임상적으로 수정능력 저하인 보다 많은 사람들이 통과 점수를 얻고, 어세이를 통과한 사람 중 3 사이클 이내에 수정가능한 퍼센트는 내려갈 것으로 예상되었다. 흥미롭게도, (3 사이클 이하라는 기준에 의해 규정되는) 수정능력에 있어서, 결과는 완만한 구배이거나 연속적인 곡선이 아니었다. 즉, 환자가 정의된 바와 같은 어세이를 40에서 통과실패하던 35에서 통과실패하던 임신 가능성에 있어서의 상당한 변화와 상관이 없었으며, 항상 낮았다 (11.5% 내지 14.3%). 역으로, 어세이를 40에서 통과하는 것에 비하여 35에서 통과하는 것은 임신 가능성에 있어서 매우 큰 차이에 해당하였다 (각각 87.5%에서 53.8%). 이러한 점을 강화하고 강조하자면, APM + AA 합한 퍼센트에 있어서 5%의 변화는 임신 이력에서 30%를 넘는 변화에 상당하였다.
이러한 결과는 남성 수정능력이 다분히 "단계 함수"라는 것, 즉, 남성 수정능력 어세이에 대한 점수의 작은 변화가 남성 수정능력 (임상적 임신의 가능성)에 있어서의 상응하게 작지만 연속적인 변화를 나타내는 것이 아니라, 점수의 범위가 "수정가능," "수정능력 저하," 또는 "수정불능"으로 카테고리화하는 것이라는 것을 암시한다. 이러한 데이터는 대략 38.5 내지 40의 점수가 "수정능력 저하" 또는 "수정가능" 사이의 컷-오프가 될 것이라는 것을 강력히 나타낸다. 데이터를 더욱 검사하면 14.5% 미만의 컷-오프가 "수정불능"으로 판정하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
평균 정액 파라미터에 있어서 모두가 유사한 이들 남성들에 대한 데이터를 요약하면, 다음과 같은 (절대 점수에 기초한) 범위로 된다: 수정불능: < 14.5, 수정능력 저하: 14.5-38.4, 수정가능: = 38.5.
다른 방식으로, 샘플의 수정능력은 APM 및/또는 AA 패턴의 상대적인 수에 있어서의 변화를 수정능 획득 조건하의 인큐베이션 시간에 대하여, 또는 비-수정능 획득 조건하에 관찰된 상대적인 수에 대하여 비교함으로써 평가할 수 있다. 예를 들어, 수정능 획득 조건하에 3시간 인큐베이션시킨 후의 APM + AA 상대적인 수를 인큐베이션 개시기의 그러한 패턴의 상대적인 수와 비교할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, APM 및/또는 AA 빈도에 있어서의 변화를 연속적인 시점 (예를 들어, 1, 2, 및 3시간)에서 얻어진 결과와 비교할 수 있다. 실제로, Y축 상에 상대적 빈도를, X축 상에 시점을 플롯팅하고, 비-수정능 획득 조건 및 수정능 획득 조건하에 INTER, APM 및/또는 AA 패턴 중 한 가지 이상의 수가 증가하는 변화의 기울기 또는 변화율을 평가할 수 있다. 이러한 분석 방법을 63명으로 된 환자군에 사용하였을 때, 정상 표준군에 속하는 점수를 갖는 31명의 남성에서, 각각 1, 2 및 3 시간 동안 인큐베이션시켰을 때 비-수정능 획득 조건하의 기준시 GM1 패턴은 17%-22%-28%, 수정능 획득 조건에서는 26%-31%-38%이었다 (도 3 참조). 표준값 미만인 32명의 남성에서는 비-수정능 획득 조건에서는 15%-20%-24%, 수정능 획득 조건에서는 20%-25%-29%이었다. 수, 운동성 및 정상 형태 퍼센트 (엄격한 WHO 기준 적용) 등의 정액 분석 파라미터는 두 군에서 유사하였다. 정상 범위 GM1 패턴을 갖는 집단은 자궁내 인공수정 (IUI) 임신율이 45.2% (14/31)였으며, 그 중 8명 (25.8%)은 적어도 한 번 태아 심장박동 소리가 들렸다. 이 그룹 중 추가의 세 커플이 자연적으로 임신하게 되었다. 표준값 미만의 GM1 패턴을 갖는 남성들에 있어서, IUI 임상 임신율은 단지 6.3% (2/32; P=0.03)였다. 이 집단에서, 13명이 ICSI (세포질내 정자주입)를 받았으며, 6명이 임신하였다 (46.2%).
실시예 3
정자 세포를 실시예 1에서와 같이 처리하였으나, 고정제 중에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 표지된 정자 세포를 형광현미경으로 검사하였다. 새로운 GM1 편재화 패턴인 라인드-셀이 도 6A, 6B, 6C 및 6D에 제시된 바와 같이 나타났다. 도 6A에 나타난 바와 같은 라인드-셀에서, GM1 시그널은 적도대의 바닥/첨체 후방 영역의 상부, 및 첨체를 덮고 있는 원형질막에서 나타난다. 이 시그널은 첨체 후방/적도 영역 및 첨체를 덮고 있는 원형질막에 균질하게 분포되어 있다. 적도대에는 또한 시그널이 없는 밴드가 있다. 도 6B에 나타난 바와 같이, 첨체를 덮고 있는 원형질막에서의 시그널은 첨체 후방/적도 밴드에서의 시그널보다 밝다. 도 6C 및 6D에 나타난 바와 같이, 첨체 후방/적도 밴드에서 발견되는 시그널은 첨체를 덮고 있는 원형질막에서의 시그널보다 밝다.
한 명의 공여자로부터 얻은 정자 세포를 세척하고, 수정능 획득 (자극) 및 비-수정능 획득 (비-자극) 조건 각각에서 인큐베이션한 다음, 제0일 (고정제 중에 약 5시간 동안 유지) 및 제1일 (고정제 중에 약 27.5시간 동안 유지)에 점수를 매겼다. 자극 처리한 경우, 라인드-셀의 퍼센트는 제0일과 제1일 사이에 변화가 거의 없었다. 대조적으로, 비-자극 처리한 경우, 라인드-셀의 퍼센트는 제0일과 제1일 사이에 3%에서 22%로 증가하였다. 이러한 변화와 더불어, INTER는 76%에서 51%로 감소하였다. 이러한 데이터는 제0일에 INTER 패턴을 갖는 세포가 제1일의 라인드-셀 패턴으로 전환하였다는 것과 일치한다.
% AA % APM % INTER % 라인드-셀 % 기타
비-자극; 제0일 0 16 76 3 6
자극; 제0일 7 19 62 4 8
비-자극; 제1일 4 14 51 22 10
자극; 제1일 4 24 53 3 16
실시예 4
한 명의 공여자로부터 얻은 정자 세포를 세척하고, 수정능 획득 (자극) 및 비-수정능 획득 (비-자극) 조건 각각에서 인큐베이션한 다음, 제0일 (고정제 중에 약 4시간 동안 유지) 및 제1일 (고정제 중에 약 25시간 동안 유지)에 점수를 매겼다. 제0일에 라인드-셀은 거의 관찰되지 않았으므로, 캡-스코어를 결정함에 있어서 라인드-셀의 수를 포함시키거나 포함시키지 않거나에 관계없이 유사한 캡-스코어가 제0일에 얻어졌다. 그러나, 제1일에 라인드-셀이 나타남에 따라, 라인드-셀을 해석하는 방법에 따라서 상이한 캡-스코어™ 값이 얻어질 수 있었다. 예를 들어, 라인드-셀을 수정능-비획득으로 취급하였을 때, 자극 및 비-자극 처리에 대하여 유사한 캡-스코어™가 얻어졌다. 그러나, 라인드-셀을 수정능-획득으로 취급하거나, 분리하거나, 캡-스코어™ 계산에서 배제하였을 때, 비-자극 처리에 있어서 자극 처리의 경우보다 큰 캡-스코어가 얻어졌다. 비-자극 처리의 경우에 보다 큰 캡-스코어™ 값을 나타내는 것은 의미가 없으며, 이는 이들 정자 세포들이 기본적 조건하에 인큐베이션되었으므로, 수정능 획득처리로 인한 GM1 패턴을 나타내지는 않았을 것이기 때문이다. 이러한 관찰은 또한 라인드-셀이 수정능-비획득 상태를 나타내므로 캡-스코어™ 계산시에도 그와 같이 취급되어야 한다는 추가의 보충적 증거를 제공한다.
캡-스코어™ 계산 조건:
라인드-셀을
수정능-비획득으로 취급		 라인드-셀을
수정능-획득으로 취급		 라인드-셀을
분리하여 취급 		라인드-셀을
계산에서 제외
비-자극; 제0일 18 20 20 19
자극; 제0일 28 31 30 29
비-자극; 제1일 35 52 52 42
자극; 제1일 36 39 38 37
실시예 5
18명의 공여자로부터 얻은 40개의 상이한 정액 샘플을 세척하고, 정자를 수정능 획득 (자극) 및 비-수정능 획득 (비-자극) 조건 각각에서 인큐베이션한 다음, 제0일 및 제1일에 점수를 매겼다. 라인드-셀을 수정능-비획득으로 취급할 때, 제0일 및 제1일에 얻어진 자극 처리 캡-스코어™ 값 사이에 유의한 상관관계가 관찰되었다 (r=0.32; n=40; p<0.05). 대조적으로, 라인드-셀을 수정능-획득으로 취급하거나, GM1 편재화 패턴에 기초하여 수정능-획득 또는 수정능-비획득 그룹으로 분리하거나, 단순히 캡-스코어™로부터 배제할 때 제0일과 제1일 사이에 상관관계가 관찰되지 않았다. 이들 관찰사항은 정자가 밤새 유지될 때 라인드-셀 편재화 패턴이 형성되며, 제0일에는 이들 정자가 INTER/수정능-비획득 패턴을 나타낸다는 견해를 지지한다. 라인드-셀을 수정능-비획득으로 취급하는 것은 시간 경과에 따른 캡-스코어TM를 안정화시키며, 이러한 패턴이 수정불능인 세포를 반영한다는 것과 일치한다. 더우기, 이들 데이터는 그 집단에 대하여 라인드-셀을 수정능-비획득으로 해석 적용할 수 있다는 것을 입증한다. 그럼에도 불구하고, 제1일에 라인드-셀의 외형은 공여자에 따라 달랐다. 이는 이들 라인드-셀을 관찰함으로써 이들 공여자 및 그들의 정자의 수정능력 여부에 대한 추가의 정보를 제공할 수 있다는 가능성을 제기한다.
본 발명이 하나 이상의 특정 실시양태와 관련하여 기재되어 있으나, 본 발명의 요지 및 범주를 벗어나지 않고서 다른 실시양태가 구상될 수 있으며, 그와 같은 다른 실시양태도 본 발명의 범주 내에 드는 것이라는 것이 이해되어야 한다.

Claims (71)

  1. 남성 피험자의 생식력 상태를 특성화하기 위한 방법에 있어서,
    다음 단계를 포함하는, 방법:
    시험관내에서 남성(male) 피험자로부터의 정자 샘플을 수정능획득 조건에 노출시키는 단계;
    시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 고정제로 0.5 시간 이상 동안 고정시키는 단계;
    고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플을 GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 처리하는 단계;
    표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에서 한 가지 이상의 GM1 표지된 편재화 패턴을 감별하는 단계, 이때 GM1 표지된 편재화 패턴은 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴, 첨체 후방 원형질막 (PAPM) GM1 편재화 패턴, 첨체 정상부/첨체 후방 (AA/PA) GM1 편재화 패턴, 중간대 (INTER) GM1 편재화 패턴, 적도대 (ES) GM1 편재화 패턴 및 확산 (DIFF) GM1 편재화 패턴으로 이루어진 군에서 선택되고;
    첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하는 단계;
    (i) 수정능-획득 상태에 배정된 GM1 표지된 편재화 패턴의 수 및 (ii) GM1 표지된 편재화 패턴의 총 수의 비율에 해당하는 수정능력 역치를 측정하는 단계;
    수정능력 역치를 표준 수치와 비교하는 단계; 그리고
    상기 비교 단계의 결과에 기초하여 해당 남성 피험자의 생식력 상태를 결정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    표준 수치는 알려진 수정가능 집단의 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 평균 비율이고,
    이때 수정능력 역치가 (i) 표준 수치의 1 표준편차 작은 수치보다 크면 수정가능의 수정능력 상태를 나타내고; (ii) 표준 수치의 1 표준편차 작은 수치보다 작고 표준 수치의 2 표준편차 작은 수치보다 크면 수정능력 저하를 나타내며; 그리고 (iii) 표준 수치의 2 표준편차 작은 수치보다 작으면 수정불가를 나타내는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, GM1 편재화 패턴의 비율을 알려진 수정능력 상태를 가지는 남성에 대한 GM1 편재화 패턴의 비율과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 비교 단계는 다음 단계를 포함하는, 방법:
    미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에 대하여 각각의 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 그리고
    GM1 표지된 편재화 패턴의 총 수의 합에 대한, AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계.
  5. 제1항에 있어서, 수정능 획득 조건(capacitating condition)은 중탄산 이온, 칼슘 이온 및 스테롤 배출의 매개체 중 1종 또는 그 이상에 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 스테롤 배출의 매개체가 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린, 혈청 알부민, 고밀도 지단백질, 인지질 소포, 제대 혈청 한외여과물, 지방산 결합 단백질 또는 리포좀인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 스테롤 배출의 매개체는 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린인, 방법.
  8. 제3항에 있어서, 알려진 수정능력 상태는 수정가능 남성에 상응하는, 방법.
  9. 제3항에 있어서, 알려진 수정능력 상태는 수정불가 남성에 상응하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 고정제는 파라포름알데하이드, 글루타르알데하이드 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, GM1 편재화 패턴을 위한 표지화 분자는 형광 표지된 콜레라 독소 b 서브유닛인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 감별 단계는 노출 단계 후 2 내지 24시간에 수행되는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 노출 단계 전에 비-금속재로 제조된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하고, 정자막을 손상시키지 않는 반응제를 사용하여 정액 샘플을 처리함으로써 정액의 점도를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 남성 피험자의 생식력 상태를 특성화하기 위한 방법에 있어서,
    다음 단계를 포함하는, 방법:
    시험관내 수정능획득 조건에 노출되고, 고정제 중에서 0.5시간 이상 동안 고정되고, GM1 편재화 패턴을 얻기 위해 검출가능한 표지를 갖는 표지화 분자로 염색된, 남성 정자 샘플의 제1 부분을 수득하는 단계;
    표지되고 고정된 시험관내 수정능 획득처리된 정자 샘플에서, 한 가지 이상의 GM1 표지된 편재화 패턴을 감별하는 단계, 이때 상기 GM1 표지된 편재화 패턴은 첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴, 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴, 라인드-셀 GM1 편재화 패턴, 첨체 후방 원형질막 (PAPM) GM1 편재화 패턴, 첨체 정상부/첨체 후방 (AA/PA) GM1 편재화 패턴, 중간대 (INTER) GM1 편재화 패턴, 적도대 (ES) GM1 편재화 패턴 및 확산 (DIFF) GM1 편재화 패턴으로 이루어진 군에서 선택되고;
    첨체 정상부 (AA) GM1 편재화 패턴 및 첨체 원형질막 (APM) GM1 편재화 패턴을 수정능-획득 상태에 배정하는 단계;
    (ii) GM1 표지된 편재화 패턴의 총 수에 대한 (i) 수정능-획득 상태에 배정된 GM1 표지된 편재화 패턴의 수의 비율에 해당하는 수정능력 역치를 결정하는 단계;
    수정능력 역치를 표준 수치와 비교하는 단계; 그리고
    상기 비교 단계의 결과에 기초하여 해당 남성 피험자의 생식력 상태를 결정하는 단계.
  15. 제14항에 있어서,
    표준 수치는 알려진 수정가능 집단의 [(AA GM1 편재화 패턴 + APM GM1 편재화 패턴)/총 GM1 편재화 패턴]의 평균 비율이고,
    이때 수정능력 역치가 (i) 표준 수치의 1 표준편차 작은 수치보다 크면 수정가능의 수정능력 상태를 나타내고; (ii) 표준 수치의 1 표준편차 작은 수치보다 작고 표준 수치의 2 표준편차 작은 수치보다 크면 수정능력 저하를 나타내며; 그리고 (iii) 표준 수치의 2 표준편차 작은 수치보다 작으면 수정불가를 나타내는, 방법.
  16. 제14항에 있어서, GM1 편재화 패턴의 비율을 알려진 수정능력 상태를 가지는 남성에 대한 GM1 편재화 패턴의 비율과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 비교 단계는 다음 단계를 포함하는, 방법:
    미리결정된 수의 표지되고 고정된 시험관내 수정능획득 정자 샘플에 대하여 각각의 GM1 표지된 편재화 패턴의 수를 측정하는 단계; 그리고
    GM1 표지된 편재화 패턴의 총 수의 합에 대한 AA GM1 편재화 패턴의 수와 APM GM1 편재화 패턴의 수의 합의 비율을 계산하는 단계.
  18. 제14항에 있어서, 수정능획득 조건은 중탄산 이온, 칼슘 이온 및 스테롤 배출의 매개체 중 1종 이상에 노출시키는 것을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 스테롤 배출의 매개체가 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린, 혈청 알부민, 고밀도 지단백질, 인지질 소포, 제대 혈청 한외여과물, 지방산 결합 단백질 또는 리포좀인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 스테롤 배출의 매개체는 2-하이드록시-프로필-β-시클로덱스트린인, 방법.
  21. 제16항에 있어서, 알려진 수정능력 상태는 수정가능 남성에 상응하는, 방법.
  22. 제16항에 있어서, 알려진 수정능력 상태는 수정불가 남성에 상응하는, 방법.
  23. 제14항에 있어서, 고정제는 파라포름알데하이드, 글루타르알데하이드 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  24. 제14항에 있어서, GM1 편재화 패턴을 위한 표지화 분자는 형광 표지된 콜레라 독소 b 서브유닛인, 방법.
  25. 제14항에 있어서, 감별 단계는 수득 단계 후 2 내지 24시간에 수행되는, 방법.
  26. 제14항에 있어서, 수득 단계 전에 비-금속재로 제조된 오리피스가 넓은 피펫을 사용하고, 정자막을 손상시키지 않는 반응제를 사용하여 정액 샘플을 처리함으로써 정액의 점도를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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