CN111733203B - 一种精子顶体反应检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种精子顶体反应检测试剂，其特征在于：包括精子获能处理液，顶体反应诱导液以及染色液；其中，所述精子获能处理液含有干酪乳杆菌LC‑N235发酵上清液。本发明还提供了用所述精子顶体反应试剂做成的试剂盒。本发明还提供了用所述精子顶体反应试剂做成的试剂盒进行顶体检测的方法。本发明的优点：(1)突破性缩短了精子获能所需要的时间，提高了效率。(2)保护精子，提高精子的活力从而使得样本保存不当引起的偏差减少。
Description
技术领域
本发明创造涉及精子检测领域，具体涉及一种适用于流式细胞仪高效检测的精子顶体反应检测方法。
背景技术
顶体是精子所特有的结构，精子只有具备完整的顶体才能发生顶体反应(AR),从而穿过透明带。研究表明活精子的顶体反应百分率与精子的卵透明带穿透率呈强正相关,透明带诱发精子顶体反应率已成为评价精子功能的一个可靠的指标。正常的有受精能力的精子顶体反应必然经历精子头部的质膜、顶体外膜融合和破裂,释放内含物,而顶体反应完成的标志是顶体外膜的完全融合根据这个特点,我们可以通过一些手段来判断精子发生顶体反应的情况,进而对该精子的受精能力作出评价。
人们已经建立了比较成熟的顶体检测方法,其中,荧光染色法,如金霉素(CTC)染色法,荧光强,容易分辨；考马斯亮蓝(CBB)染色法,简便经济,可以在一般实验室中推广；酸性磷酸酶(ACP)检测法,客观灵敏,可同时检测多份标本。
中国专利还有人公开过一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂，包括顶体反应诱导液和染色液，其特征在于还包括精子获能液。检测方法为：刚取出的精液放置30～60分钟，使之完全液化。检测管中由精子获能液稀释精液成约1mL精子悬液，将精子悬液在37℃，CO2培养箱内孵育3小时，诱导获能。向检测管中加入10μL浓度为1mmol/L的顶体反应诱导液，使终浓度为10μmol/L，对照管中加入10μL的DMSO，全部管置于37℃孵育15分钟。检测时管中加10μL PSA-FITC染色液，37℃，染色1小时以上(或4℃染色过夜)。检测管中再加入10μL PI染色液，染色10-15min。流式细胞仪检测，用488nm激发光，检测绿光信号和红光信号。通过所述精子获能液作用，精子活力和顶体反应能力提高。该发明的缺点在于获能液需要孵育3小时，对于快速检测有较大的限制。
本发明旨在提供一种新型的精子顶体反应检测方法，其突破性缩短了精子获能所需要的时间，提高了效率。此外，保护精子，提高精子的活力从而使得样本保存不当引起的偏差减少。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的精子顶体反应检测方法，其突破性缩短了精子获能所需要的时间，提高了效率。此外，保护精子，提高精子的活力从而使得样本保存不当引起的偏差减少。
中国专利申请人江南大学曾经公开过一种可提高离体动物精子活力的组合物，所述组合物的成分包含屎肠球菌(Enterococcus Faecium)。该方法首次利用了微生物进行了提高精子活力。然而，该方法需要使用活菌制剂，保存困难，使用限制很大，此外，也并没有发现其对精子获能有何影响，我们研究发现，不管是屎肠球菌的活菌液还是上清液，均对精子获能无明显影响。
但是本公司研发团队受此启发，进行了一些益生菌的筛选，我们发现某些菌的发酵上清液也有提高精子活力的作用，但是大多数提高效果并不显著，我们筛选到一株菌，其发酵上清液具有十分显著的提高精子活力的作用。进一步，我们还发现其可以大大缩短精子获能所需要的时间。
所述筛选得到的菌株是中国专利2012101725644(已失效)公开的一株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LC-N235，已于2012年5月10日，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC M 2012157。干酪乳杆菌是典型的益生菌，其使用无任何生物风险。并且，本公司研发团队发现，其他株的干酪乳杆菌提高精子活力，缩短精子获能时间的效果很有限，可能是这株菌的发酵上清液中含有特定的代谢物和次级代谢物。由于该菌株的已知功能是高产L-乳酸，我们曾经推测是否L-乳酸会对精子获能产生正面影响，但是在后面的研究发现，L-乳酸单独使用对精子获能并无太大影响。因此，推测主要的机理可能是其他代谢物，或者是其他代谢物和L-乳酸的共同作用。
本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。
一种精子顶体反应检测试剂，其特征在于：包括精子获能处理液，顶体反应诱导液以及染色液；其中，所述精子获能处理液含有干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液。
作为优选，所述干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液的制备方法为：
(1)取干酪乳杆菌LC-N235接种到MRS固体培养基中划线，37℃培养24h，挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，培养条件：32℃，220r/min，培养24h后即可作为干酪乳杆菌LC-N235种子液1.0*107(CFU/ml)；
(2)将步骤(1)获得的种子液，按照3％的接种量接种于发酵培养基，发酵温度30℃，发酵培养25h后，1000rpm离心20min，取上清液，200目再次过滤，紫外消毒既得；考虑到过多的乳酸会对精子获能产生不利影响，因此我们在发酵的过程中使用低温发酵，低温发酵可以降低乳酸的产量，可能还会增加某些代谢物的产量，从而达到最佳的精子获能和提高活力的效果。
所述发酵培养基为，按照重量百分比：葡萄糖10％，海藻糖2％，胰蛋白胨0.1％，酵母膏2％，七水合硫酸镁0.05％，碳酸钙8％，其余为蒸馏水，pH 6.5。
作为优选，所述精子获能处理液的具体配方为：10g/L的干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液，0.15mol/L的氯化钠、1.2mmol/L的磷酸二氢钾、5g/L的葡萄糖、0.04mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、3.2mmol/L的碳酸氢钠、0.3mmol/L的丙酮酸钠、5g/L的牛血清白蛋白，调节pH为7.0。
所述染色液分为FITC-PSA荧光染色液和碘化丙啶染色液。
所述顶体反应诱导液为在5mg Ca2+载体A23187溶于9.56mL DMSO中得到。
本发明还提供了用所述精子顶体反应试剂做成的试剂盒。
本发明还提供了用所述精子顶体反应试剂做成的试剂盒进行顶体检测的方法。
本发明的优点：
(1)突破性缩短了精子获能所需要的时间，提高了效率。
(2)保护精子，提高精子的活力从而使得样本保存不当引起的偏差减少。
附图说明
图1为本发明精子顶体反应检测方法得到的流失细胞图示范图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
实施例1
一种精子顶体反应检测试剂，其特征在于：包括精子获能处理液，顶体反应诱导液以及染色液；
所述精子获能处理液含有干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液的制备方法为：
(1)取干酪乳杆菌LC-N235接种到MRS固体培养基中划线，37℃培养24h，挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，培养条件：32℃，220r/min，培养24h后即可作为1.0*107(CFU/ml)干酪乳杆菌LC-N235种子液；
(2)将步骤(1)获得的种子液，按照3％的接种量接种于发酵培养基，发酵温度30℃，发酵培养25h后，1000rpm离心20min，取上清液，200目再次过滤，紫外消毒既得；考虑到过多的乳酸会对精子获能产生不利影响，因此我们在发酵的过程中使用低温发酵，低温发酵可以降低乳酸的产量，可能还会增加某些代谢物的产量，从而达到最佳的精子获能和提高活力的效果，在本实施例中测试得到最后的L-乳酸的产量为3.5g/L。
所述发酵培养基为，按照重量百分比：葡萄糖10％，海藻糖2％，胰蛋白胨0.1％，酵母膏2％，七水合硫酸镁0.05％，碳酸钙8％，其余为蒸馏水，pH 6.5。
所述精子获能处理液的具体配方为：10g/L的干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液，0.15mol/L的氯化钠、1.2mmol/L的磷酸二氢钾、5g/L的葡萄糖、0.04mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、3.2mmol/L的碳酸氢钠、0.3mmol/L的丙酮酸钠、5g/L的牛血清白蛋白，调节pH为7.0。
所述染色液分为FITC-PSA荧光染色液和碘化丙啶染色液。所述碘化丙啶染色液的pH值7.2，含有浓度为50mmol/L的氯化钠、浓度为3mmol/L的氯化钾、浓度为5mmol/L的磷酸氢二钠、浓度为1mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为500μg/mL的碘化丙啶(PI)。FITC-PSA荧光染色液的pH值也为7.2，含有浓度为100mmol/L的氯化钠、浓度为5mmol/L的氯化钾、浓度为5mmol/L的磷酸氢二钠、浓度为1mmol/L的磷酸二氢钾、浓度为0.5mg/mL的异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素(FITC-PSA)。
所述顶体反应诱导液为在5mg Ca2+载体A23187溶于9.56mL DMSO中得到。
实施例2
对比例1：方法同实施例1，但是精子获能处理液制备过程中不加入干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液。
对比例2：同实施例1，但是精子获能处理液制备过程中将干酪乳杆菌LC-N235替换成干酪乳杆菌GIM1.411，其他不变。
对比例3：同实施例1，但是精子获能处理液制备过程中将干酪乳杆菌LC-N235替换成嗜酸乳杆菌GIM 1.1807，其他不变。
实施例3
刚取出的精液置于37℃水浴0.5h，使之完全液化，进行密度梯度离心获得高活力精子团，去除如白细胞、生殖细胞和死精子等污染物。
设置1个生理盐水对照组、1个L-乳酸对照组(3.5g/L的L-乳酸的水溶液)、含有实施例1和实施例2的3个检测组，每组均设置为2管(做不同时间孵育用)。
对照组为生理盐水稀释的精液1ml，浓度1×106个活动精子/ml；检测组使用实施例1和实施例2得到的精子获能处理液将精子稀释成含1×106个活动精子/ml的悬液，每管均含有1ml。将对照组和检验组的精子悬液在37℃，CO2培养箱内分别孵育15分钟和3个小时，诱导获能。
向对照组和检测组检测管中加入10μL浓度为1mmol/L的顶体反应诱导液，使终浓度为10μmol/L，再置于37℃孵育15分钟。检测时管中加10μL PSA-FITC染色液，37℃，染色1小时以上(或4℃染色过夜)。检测管中再加入10μL PI染色液，染色10-15min。流式细胞仪检测，用488nm激发光，检测绿光信号和红光信号。根据发光信号比较精子顶体反应率，每组实验重复3次，结果见表1所示。
表1不同组别精子顶体反应率
| 组别 | 精子顶体反应率(15分钟) | 精子顶体反应率(3小时) |
| 生理盐水对照组 | 4.3±1.2％ | 7.2±3.2％ |
| L-乳酸对照组 | 5.2±1.1％ | 9.5±2.6％ |
| 实施例1组 | 40.3±11.4％ | 43.3±13.1％ |
| 对比例1组 | 6.9±2.1％ | 19.3±2.2％ |
| 对比例2组 | 9.7±1.9％ | 25.6±3.4％ |
| 对比例3组 | 8.2±2.7％ | 22.6±3.6％ |
对照组使用生理盐水作为处理液，精子顶体反应率最低；检测组中，实施例1精子顶体反应率最高，当变成其他不同种的乳杆菌(嗜酸乳杆菌)，顶体获能的能力明显下降；而其他株的干酪乳杆菌，单纯L-乳酸提高精子活力，缩短精子获能时间的效果也很有限。说明该株干酪乳杆菌制备的精子获能液对精子顶体获能能够起到特殊的催化加速作用，精子活力和顶体反应能力大大提高。精子获能处理液常规处理一般是3小时，随着处理时间的延长，能够提高精子的顶体获能数量。但是如实施例1所示，使用干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液作为获能处理液只需要15min，最终的精子顶体反应率就达到了40％，后续加强处理时间能再提高3％作用，说明15分钟已经基本完成获能的过程，相对于其他检验组更好，而单纯的生理盐水组和乳酸组获能少可能和能量物质本身消耗。
实施例4弱活力精子活力提高检测
(1)将实施例1或实施例2得到的精子获能液于温度37℃的条件下平衡2h；
(2)将收集有弱活力精液的取精杯置于37℃水浴0.5h，得到液化后的精液；
(3)使用预热后的实施例1或实施例2得到的精子获能液清洗、稀释液化后的精液，300g离心10分钟，得到分离后的弱活力精子；
(4)将分离后的弱活力精子按照1×107CFU/mL的添加量分别添加预热后的实施例1或实施例2得到的精子获能液中，于37℃的条件下进行孵育120min，得到孵育后的精子。
(5)同时设置2个对照组(温度37℃的生理盐水组和浓度为3.5g/L的L-乳酸的水溶液组)，分别进行清洗、稀释和孵育弱活力精子，分别检测孵育后的精子的活力。使用3个不同的临床弱精样本进行临床测试，检测结果如表2。
表2精子的前向运动精子比例
由表2可知，该株干酪乳杆菌制备的精子获能液可明显改善弱活力精子的前向运动精子比例。但是变成其他株的干酪乳杆菌并不能提高弱活力精子的前向运动精子比例。对比例3中嗜酸乳杆菌也能产生乳酸，但是前向运动的精子比例并没有明显增加，而且我们发现乳酸单独使用对精子获能并无太大影响。我们推测主要的机理可能是其他代谢物，或者是其他代谢物和L-乳酸的共同作用。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种精子顶体反应检测试剂，其特征在于：包括精子获能处理液，顶体反应诱导液以及染色液；其中，所述精子获能处理液含有干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液。
2.权利要求1所述的检测试剂，其中所述干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液的制备方法为：
(1)取干酪乳杆菌LC-N235接种到MRS固体培养基中划线，37℃培养24h，挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，培养条件：32℃，220r/min，培养24h后即可作为干酪乳杆菌LC-N235种子液1.0*107CFU/ml；
(2)将步骤(1)获得的种子液，按照3％的接种量接种于发酵培养基，发酵温度30℃，发酵培养25h后，1000rpm离心20min，取上清液，200目再次过滤，紫外消毒既得；
所述发酵培养基为，按照重量百分比：葡萄糖10％，海藻糖2％，胰蛋白胨0.1％，酵母膏2％，七水合硫酸镁0.05％，碳酸钙8％，其余为蒸馏水，pH6.5。
3.权利要求2所述的检测试剂，其中所述精子获能处理液的具体配方为：10g/L的干酪乳杆菌LC-N235发酵上清液，0.15mol/L的氯化钠、1.2mmol/L的磷酸二氢钾、5g/L的葡萄糖、0.04mol/L的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、3.2mmol/L的碳酸氢钠、0.3mmol/L的丙酮酸钠、5g/L的牛血清白蛋白，调节pH为7.0。
4.权利要求2或3所述的检测试剂，其中所述染色液为FITC-PSA荧光染色液和碘化丙啶染色液，所述顶体反应诱导液为5mg Ca2+载体A23187溶于9.56mL DMSO中得到。
5.包含权利要求1-4任一项所述检测试剂的精子顶体反应试剂盒。
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