CN108611297B - 一种提高骨钙磷含量的植物乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高骨钙含量的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR237菌株，该植物乳杆菌AR237菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14003。本发明的植物乳杆菌AR237能够有效地提高骨骼中钙元素和磷元素的沉积量，从而防止高骨转换型骨质疏松钙、磷的流失。

Description

一种提高骨钙磷含量的植物乳杆菌

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种提高骨钙磷含量的植物乳杆菌。

背景技术

钙是人体中最丰富的矿物元素之一，约占人体总量的1.5％-2.0％，人体内含钙达1200-1300g，其中约99％的钙以羟基磷灰石晶体和无定型磷酸氢钙的形式存在于人体骨骼和牙齿中，其余约1％的钙存在于软组织、细胞外液和血液中，统称为混溶钙池，与骨钙保持动态平衡，维持细胞生理功能。人体缺钙会引起诸多疾病，儿童缺钙对牙齿生长发育十分不利，并有一定患上佝偻病的风险，青少年缺钙会导致骨骼生长不良，老年人缺钙易出现骨质疏松，骨质增生等疾病。

人体缺钙已经成为一个全球关注的问题，在我国，钙是居民膳食中缺乏最为明显的营养素，全国平均每人每日钙摄入量为405mg，仅达到RDA的49％。因受饮食习惯影响，我国居民膳食结构以植物性食物为主，植酸盐、草酸盐等含量较高，即便膳食摄入了充足的钙元素，但机体的钙吸收率较低，尤其是绝经后妇女由于机体内雌激素水平降低，再加上钙缺乏将使得骨质疏松程度更加严重。因此，开发一种能够有效提高骨骼中钙元素和磷元素沉积量的植物乳杆菌，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种提高骨钙磷含量的植物乳杆菌。

本发明提供了一种提高骨钙磷含量的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR237菌株，具有这样的特征：植物乳杆菌AR237菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14003。

本发明还提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR237菌株在发酵制备用于提高骨钙含量的乳酸菌产品中的应用。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的提高骨钙磷含量的植物乳杆菌，能够有效地提高当雌激素缺乏时的骨骼中钙元素和磷元素的沉积量，从而防止高骨转换型骨质疏松引起的钙、磷的流失。

附图说明

图1是本发明的实施例中的小鼠尿钙含量的示意图；

图2是本发明的实施例中的小鼠血清钙含量的示意图；

图3是本发明的实施例中的小鼠骨灰粉钙含量的示意图；

图4是本发明的实施例中的小鼠尿磷含量的示意图；

图5是本发明的实施例中的小鼠血清磷含量的示意图；

图6是本发明的实施例中的小鼠骨灰粉磷含量的示意图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。

下述实施例中，所采用的试剂如无特殊说明均从一般商业途径获得，未注明的实验条件均参照常规实验条件或遵照供应商建议的条件。

实施例一：植物乳杆菌AR237的分离、培养及保藏

1、菌种分离与培养

步骤1，采集黄酒后酵液，以浓度梯度稀释法进行稀释，得到稀释后的黄酒后酵液Ⅰ。

步骤2，取100uL的黄酒后酵液Ⅰ涂布于MRS培养基平板上进行40-56h的37℃的厌氧培养后，根据菌落的形状、大小、颜色等，将不同性状的分别挑至新的MRS培养基平板，进行划线分离纯化，得到分离菌株。

其中，每升MRS培养基的制作方法为：取牛肉浸出粉10g、酪蛋白胨10g、酵母浸粉5g、葡萄糖20g、三水乙酸钠8.3g、磷酸氢二钾2g、七水合硫酸镁0.58g、一水合硫酸锰0.25g，吐温-801mL，使用去离子水定容至1L，然后在115℃的条件下进行20min的灭菌。

步骤3，将分离菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶触试验，然后根据乳酸菌革兰氏染色阳性和无过氧化氢酶的特点来选取革兰氏染色阳性和过氧化氢酶触阴性的菌株。

步骤4，提取菌株的DNA，使用乳酸菌16srDNA片段通用引物 27F/1492R，经PCR扩增后进行测序，然后与NCBI基因库中基因序列进行同源比较，得到植物乳杆菌AR237菌株。

其中，27F为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R为 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

2、菌种保藏与活化

将植物乳杆菌AR237菌株配置成植物乳杆菌AR237菌液，在菌液中加入终浓度20％的甘油，混匀后置于-80℃冰箱，可保存2-3年，在活化时将甘油冻存管取出，冰浴条件下融化，用无菌接种环将菌液接种到事先准备好的MRS培养皿中，置于厌氧培养箱中生长40h左右直至培养皿中长出完整菌落，即可进行传代。

另外，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR237菌株已经于 2017年04月07日在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，其保藏编号为CGMCC No.14003。

实施例二：植物乳杆菌AR237提高骨钙磷含量的功效评价

1、建立动物模型

SPF级雌性C57BL/6小鼠适应环境1周后，取体重18g±1g小鼠 32只，禁食12小时(不禁水)，随机分组，每组8只，对每组的小鼠的腹腔注射70mg/kg麻醉剂戊巴比妥钠，并对其中8只在相应部位只作手术切口，不摘除卵巢作为假手术组，其余24只进行双侧卵巢摘除术，小鼠术后可正常活动，自行饮水摄食，术后伤口愈合正常，没有红肿、渗出、化脓等现象。

1.1双侧卵巢摘除术的方法

在对小鼠进行麻醉且麻醉成功后进行背位固定，在距最末肋骨下约1cm的位置剪毛，切开约1.5-2cm的皮肤，将距切口处左右两侧 2cm范围内的的背肌和皮肤分离，视野中可见背肌下面白色的脂肪团，卵巢即包埋其中；用弯头眼科镊轻夹脂肪团拉到切口外，即可见到粉红色蜂窝状卵巢；用4号手术缝合线扎紧连接卵巢的输卵管，以防出血，再将卵巢完整摘除，同法摘除另一侧卵巢最后将子宫顺势送回原位，依次缝合背肌和皮肤。

2、动物分组及给药

将假手术组小鼠记为SHAM组，术后恢复正常的小鼠随机分为3 组，分别记为OVX组，AR237组和E2组，SHAM组和OVX组给予0.9％生理盐水，AR237组给予植物乳杆菌AR237菌悬液，E2组给予0.02％17β-雌二醇溶液，然后灌胃给药，给药体积为100μL/10g 体重，每天给药，连续8周，并在给药过程中，每天称量一次体重，根据体重调整灌胃量。

其中，植物乳杆菌AR237菌悬液的配制方法为：在温度为4℃，速度为6000rpm的条件下离心传至第三代的菌液，每代接种量为2％，生长时间为16h，弃上清，0.9％生理盐水重悬，重复上述步骤3次，直至离心后的上清液无色透明，根据AR237OD₆₀₀的吸光值与 CFU/mL的关系，用紫外可见分光光度计调节菌浓度，使得菌悬液最终浓度为10^9CFU/mL。

3、样品采集

4组小鼠均在末次给药后禁食12小时(不禁水)，然后称量体重，收集尿液和粪便，存放于-80℃冰箱，接着腹腔注射70mg/kg麻醉剂戊巴比妥钠，小鼠心脏穿刺取血并处死小鼠，血浆在25℃的室温下静置40min后以3500rpm的速度离心10min，然后小心吸取上层血清，存放于-80℃冰箱。

4、尿肌酐(Cr)测定

采用肌酐测定试剂盒(苦味酸法)测定小鼠尿液中Cr浓度，在碱性条件下，尿液中的肌酐能够和苦味酸作用形成橘黄色的复合物，用酶标仪检测505nm波长处吸光度的变化，即可计算出尿液中肌酐浓度。

4.1实验操作

步骤1，尿液样品前处理：以4000rpm的速度离心5min，小心吸取上层清液，然后用0.9％生理盐水稀释20倍用于肌酐检测。

步骤2，加样：分别设置空白孔、标准孔以及待测样品孔且每个样品有3个复孔，在96孔板上涂布0.9％生理盐水(用于空白孔)、标准品和尿液样品均精确吸取20μL，然后用排枪快速加入200μL工作液，轻轻晃动混匀后使用酶标仪在505nm处检测吸光值，精确计时5min后再检测第二次吸光值。

其中，R1：主要成分为0.32mol/L氢氧化钠，R2：主要成分为 35mmol/L苦味酸，标准品：134mmol/L肌酐(水基质)，工作液：按 1：1的比例将R1和R2混合而成的混合液，且现配现用。

4.2计算

用两次读取吸光度的差值，以空白管校零，计算ΔA_空白及ΔA_样品。然后根据公式计算样品肌酐浓度c(Cr样品)：

5、尿钙含量的测定

邻甲酚酞络合酮(OCPC)是金属络合指示剂，在碱性条件下，样品中的钙与邻甲酚酞络合酮生成红色络合物，在600nm测量吸光度，吸光度增加与血清钙的浓度成正比。

5.1实验操作

步骤1，尿液样品前处理：以4000rpm的速度离心5min，小心吸取上层清液待测。

步骤2，加样：分别设置空白孔、标准孔以及待测样品孔且每个样品3个复孔，在96孔板上涂布0.9％生理盐水(用于空白孔)、标准品和尿液样品均精确吸取4μL，然后用排枪快速加入200μL工作液，轻轻晃动混匀后37℃保温5min，使用酶标仪在600nm波长处检测吸光值。

其中，R1：主要成分为乙醇胺缓冲液，R2：主要成分为 0.175mmol/L邻甲酚酞络合酮(OCPC)和7.8mmol/L 8-羟基喹啉，校准品：2.5mmol/L氯化钙(水基质)，工作液：按1：1的比例将R1 和R2混合而成的混合液，且现配现用。

5.2计算

图1是本发明的实施例中的小鼠尿钙含量的示意图。

以空白管调零，读取标准品与样品吸光度A_校准品和A_样品。根据公式计算样品钙浓度c(Ca样品)：

最终尿液Ca含量用肌酐校正，结果如图1所示。

6、血钙含量的测定

血钙含量的变化常能反映出骨组织的代谢情况，因此钙含量的测定有助于疾病的诊断。

6.1实验操作

步骤1，尿液样品前处理：小心吸取上层清液待测。

步骤2，加样：分别设置空白孔、标准孔以及待测样品孔且每个样品3个复孔，在96孔板上涂布0.9％生理盐水(用于空白孔)、标准品和尿液样品均精确吸取4μL，然后用排枪快速加入200μL工作液，轻轻晃动混匀后37℃保温5min，使用酶标仪在600nm波长处检测吸光值。

其中，R1：主要成分为乙醇胺缓冲液，R2：主要成分为 0.175mmol/L邻甲酚酞络合酮(OCPC)和7.8mmol/L 8-羟基喹啉，校准品：2.5mmol/L氯化钙(水基质)，工作液：按1：1的比例将R1 和R2混合而成的混合液，且现配现用。

6.2计算

图2是本发明的实施例中的小鼠血清钙含量的示意图。

以空白管调零，读取标准品与样品吸光度A_校准品和A_样品。根据公式计算样品钙浓度c(Ca样品)：

结果如图2所示。

7、骨钙含量的测定

7.1实验操作

7.1.1股骨灰化

首先将完整左侧股骨置于60℃烘箱干燥72h至恒重，然后在干燥器中冷却至室温，称量质量记为股骨干重，其中，前后两次称量质量之差小于等于0.001g即为恒重；再以同样方法得到坩埚质量，接着将坩埚与股骨置于马弗炉，在800℃的温度下对股骨进行6h的灰化，待马弗炉温度下降至100℃以下，迅速取出置于干燥器中冷却至室温，称量质量，然后减去坩埚质量，记为股骨灰重m，简称为灰重。

7.1.2骨灰分钙含量测定

步骤1，股骨灰分样品前处理：用1mL 6mol/L盐酸充分溶解股骨灰分，然后用蒸馏水稀释60倍待测。

步骤2，加样：分别设置空白孔、标准孔以及待测样品孔且每个样品3个复孔，在96孔板上涂布0.9％生理盐水(用于空白孔)、标准品和尿液样品均精确吸取4μL，然后用排枪快速加入200μL工作液，轻轻晃动混匀后37℃保温5min，使用酶标仪在600nm波长处检测吸光值。

其中，R1：主要成分为乙醇胺缓冲液，R2：主要成分为 0.175mmol/L邻甲酚酞络合酮(OCPC)和7.8mmol/L 8-羟基喹啉，校准品：2.5mmol/L氯化钙(水基质)，工作液：按1：1的比例将R1 和R2混合而成的混合液，且现配现用。

7.2计算

图3是本发明的实施例中的小鼠骨灰粉钙含量的示意图。

以空白管调零，读取标准品与样品吸光度A_校准品和A_样品。根据公式计算样品骨灰分钙含量c(灰分Ca)：

结果如图3所示。

8、尿磷含量测定

机体内的磷主要以磷酸盐的形式参与许多对生命活动非常重要的物质代谢过程和能量代谢过程。在酸性条件下钼酸铵与血清里无机磷反应，形成非还原性磷钼酸化合物，在340nm测量吸光度，吸光度增加与无机磷浓度成正比。

8.1实验操作

①尿液样品前处理：以4000rpm的速度离心5min，小心吸取上层清液，并用0.9％生理盐水稀释20倍待测。

②加样：分别设置空白孔、标准孔以及待测样品孔且每个样品3 个复孔，在96孔板上涂布0.9％生理盐水(用于空白孔)、标准品和尿液样品均精确吸取4μL，然后用排枪快速加入180μL试剂R1，轻轻晃动混匀后37℃保温5min，再使用排枪加入80μL试剂R2，轻轻混匀置于37℃保温5min，使用酶标仪在340nm波长处检测吸光值。

其中，R1：主要成分为0.36mol/L硫酸，R2：主要成分为3.5mmol/L 钼酸铵、0.36mol/L硫酸以及150mmol/L氯化钠，标准品：1.29mmol/L 磷酸氢二钾(水溶液基质)。

8.2计算

图4是本发明的实施例中的小鼠尿磷含量的示意图。

以空白管调零，读取标准品与样品吸光度A_校准品和A_样品。根据公式计算样品钙浓度c(P样品)：

最终尿液P含量用肌酐校正，结果如图4所示。

9、血磷含量的测定

9.1实验操作

加样：分别设置空白孔、标准孔以及待测样品孔且每个样品3个复孔，在96孔板上涂布0.9％生理盐水(用于空白孔)、标准品和尿液样品均精确吸取4μL，然后用排枪快速加入180μL试剂R1，轻轻晃动混匀后37℃保温5min，再使用排枪加入80μL试剂R2，轻轻混匀置于37℃保温5min，使用酶标仪在340nm波长处检测吸光值。

其中，R1：主要成分为0.36mol/L硫酸，R2：主要成分为3.5mmol/L 钼酸铵、0.36mol/L硫酸以及150mmol/L氯化钠，标准品：1.29mmol/L 磷酸氢二钾(水溶液基质)。

9.2计算

图5是本发明的实施例中的小鼠血清磷含量的示意图。

以空白管调零，读取标准品与样品吸光度A_校准品和A_样品。根据公式计算样品钙浓度c(P样品)：

结果如图5所示。

10、骨磷含量的测定

10.1实验操作

10.1.1股骨灰化

首先将完整左侧股骨置于60℃烘箱干燥72h至恒重，然后在干燥器中冷却至室温，称量质量记为股骨干重，其中，前后两次称量质量之差小于等于0.001g即为恒重；再以同样方法得到坩埚质量，接着将坩埚与股骨置于马弗炉，在800℃的温度下对股骨进行6h的灰化，待马弗炉温度下降至100℃以下，迅速取出置于干燥器中冷却至室温，称量质量，然后减去坩埚质量，记为股骨灰重m，简称为灰重。

10.1.2骨灰分含量测定

步骤1，股骨灰分样品前处理：用1mL 6mol/L盐酸充分溶解股骨灰分，然后用蒸馏水稀释60倍待测。

步骤2，加样：分别设置空白孔、标准孔以及待测样品孔且每个样品3个复孔，在96孔板上涂布0.9％生理盐水(用于空白孔)、标准品和尿液样品均精确吸取4μL，然后用排枪快速加入180μL试剂 R1，轻轻晃动混匀后37℃保温5min，再使用排枪加入80μL试剂R2，轻轻混匀置于37℃保温5min，使用酶标仪在340nm波长处检测吸光值。

其中，R1：主要成分为0.36mol/L硫酸，R2：主要成分为3.5mmol/L 钼酸铵、0.36mol/L硫酸以及150mmol/L氯化钠，标准品：1.29mmol/L 磷酸氢二钾(水溶液基质)。

10.2计算

图6是本发明的实施例中的小鼠骨灰粉磷含量的示意图。

以空白管调零，读取标准品与样品吸光度A_校准品和A_样品。根据公式计算样品骨灰分磷含量c(灰分P)：

结果如图6所示。

实施例的作用与效果

本发明的上述实施例中，采用小鼠骨质疏松模型，评价植物乳杆菌AR237干预后，对小鼠股骨灰分Ca、P含量，尿Ca、P含量以及血清Ca、P含量进行测定。

通过OVX组与SHAM组相比可知，尿Ca和尿P均显著升高 (P<0.05)，血Ca和血P无显著性差异，骨Ca和骨P均显著降低骨 (P<0.05)，说明骨骼中沉积的Ca、P含量减少；AR237干预后较OVX 组，尿Ca排泄量无显著性差异，尿P含量显著降低(P<0.05)，血钙和血磷无明显变化，股骨灰分Ca、股骨灰分P含量均显著增高 (P<0.05)，恢复到与假手术组同水平。由此可见，植物乳杆菌AR237 能够有效降低骨质疏松小鼠尿液中P流失，显著增高骨骼中Ca元素和P元素的沉积量，并且恢复效果可达到假手术组的水平。

因此，本发明实施例所筛选出的植物乳杆菌AR237能够有效地提高当雌激素缺乏时的骨骼中钙元素和磷元素的沉积量，从而防止高骨转换型骨质疏松引起的钙、磷的流失，所以该植物乳杆菌AR237 可以用来制备用于提高骨钙磷含量的乳酸菌产品，从而保证机体的健康。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种提高骨钙磷含量的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR237菌株，其特征在于：所述植物乳杆菌AR237菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14003。

2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR237菌株在发酵制备用于提高骨钙磷含量的乳酸菌产品中的应用。

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