CN110684685A

CN110684685A - 发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4及其应用

Info

Publication number: CN110684685A
Application number: CN201910974562.9A
Authority: CN
Inventors: 王成华; 卢良华; 刘田甜; 张冉; 朱春燕
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-10-14
Also published as: CN110684685B

Abstract

本发明公开了一株发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9‑4及其应用，该菌株于2019年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M 2019619。所述发酵乳杆菌是从广西壮族地区传统食物生榨米粉中筛选出的具有降嘌呤能力的乳酸菌菌株，该菌株在MRS琼脂培养基上生长良好，耐酸性强，在pH为1.5条件下，3h后存活率为34％；在3％浓度胆盐下可以缓慢生长，存活率为65％。该菌株具有良好的耐酸，耐胆盐，降嘌呤能力，适用于低嘌呤食品及降嘌呤功能发酵食品的生产。

Description

发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及功能性乳酸菌开发及其制品生产开发领域。具体是一种发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4及其应用。

背景技术

痛风是一种尿酸盐沉积所致的关节病，与嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关。痛风患者常在夜间出现关节剧烈疼痛，疼痛持续几天或几周不等，易导致关节红肿、发炎。关节水肿后组织变软，使活动受限，最终影响日常生活。痛风常伴发肾脏病变、高脂血症、高血压病、糖尿病、动脉硬化及冠心病等，因此，痛风是一种严重危害人类健康的代谢性疾病。流行病学调查显示，我国痛风的发病率高于世界平均水平，高尿酸血症人群数量庞大。近年随着生活水平提高、生活节奏加快等因素，痛风及高尿酸血症患者数量呈显著上升趋势。

尿酸是人类嘌呤代谢的终产物，人体内尿酸主要来源于机体自身合成和摄入食物中的核苷酸分解。目前痛风治疗方法主要为药品治疗和食物预防。长期药物治疗易带来副作用，如肝肾损害、胃肠道症状、肌肉与神经病变等。食物预防指尽可能减少外源性嘌呤类物质的摄入，降低体内的嘌呤含量，是抑制尿酸形成的主要方法之一。但由于各种食物中嘌呤类物质含量难以精确定论，通过严格饮食控制嘌呤摄入较为困难。同时严格控制饮食意味着食物风味与饮食习惯的改变，易造成营养不均衡，不利于健康。因此发展降嘌呤技术，解决高营养与低嘌呤的矛盾，是制造低嘌呤食品、预防和治疗痛风及高尿酸血症的关键。

乳酸菌是一种安全的食品级微生物，在预防与治疗代谢调控类疾病中发挥着重要作用。近年来，关于乳酸菌降嘌呤、降尿酸的文献报道主要有：中南大学蒋云生等人通过基因工程手段，构建了一株产尿酸氧化酶的乳酸乳球菌，该菌株于2009年申请专利并获得授权 (CN101451146)。日本株式会社明治于2015年分别申请了抑制嘌呤吸收的乳酸菌及其用途(CN106460029A)和具有嘌呤摄取能力的乳酸菌及其用途的发明专利(CN107208029A)，并于2017年获得授权。崔伟东等人从发酵食品中分离鉴定了一株植物乳杆菌，并通过动物实验证明其具有降血尿酸水平，提高尿素氮、肌酐水平，抑制血清总黄嘌呤氧化酶活性功能(CN108048368A)。此外，朱珺等人从新疆传统酸奶中分离并鉴定了一株发酵乳杆菌，并证实其具有体外降鸟苷能力，鸟苷浓度为1mM时，鸟苷降解率为63.06％，动物实验表明其具有降血尿酸功能(CN110079476A)。然而有必要进一步开发新型耐酸、耐胆盐能力更好的将嘌呤乳酸菌。

生榨米粉是广西壮族特色的一种传统发酵食物，其中蕴含着丰富的乳酸菌资源。选择生榨米粉作为分离培养乳酸菌的原料来源，从中筛选出新型具有降嘌呤能力的乳酸菌，将其应用于功能性食品领域，对预防与治疗痛风和高尿酸血症等代谢调控类疾病具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4及其应用，该菌株具有降低嘌呤的能力。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum 9-4 菌株，CCTCC NO：M 2019619，其具有降低嘌呤的能力。

所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株于2019年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019619。保藏地址：中国武汉武汉大学。

所述保藏编号为CCTCC NO：M 2019619的菌株9-4的16S rDNA序列如序列表中SEQIN NO:1所示。

所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株其菌落特征为：菌落表面光滑，呈白色或乳白色的单个菌落，显微镜下呈圆形或椭圆形，无芽孢，革兰氏染色呈阳性。

所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株是从壮族传统食物生榨米粉中筛选出的具有高降嘌呤能力的乳酸菌菌株。

所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株的筛选方法，包括如下步骤为：

(1)使用MRS培养基对广西南宁壮族传统美食生榨米粉中的微生物进行培养，挑选特征菌落并分离、纯化，获得纯化候选菌株；

(2)以嘌呤代谢途径中2个关键酶，尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶的催化活力为检测指标，筛选出具有尿酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶酶活的菌株；

(3)进行16S rDNA测序，通过NCBI与RDP数据库Blast比对，鉴定并保存乳酸菌菌株；

(4)以静息细胞代谢核苷能力为检测指标，利用高效液相色谱法对乳酸菌的降嘌呤能力进行复筛，筛选出核苷代谢能力较高的菌株；

通过步骤(1)-(4)得到具有高核苷代谢能力的发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum 9-4 菌株，其对肌苷降解率为50.24％，对鸟苷降解率为61.16％。

所述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株，通过耐酸、耐胆盐试验表明其对酸和胆盐有一定的耐受能力。在pH为1.5时，3h后存活率为34％；在3％浓度胆盐下可以缓慢生长，存活率为65％。

所述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株，在MRS培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘齐整，不透明。对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色，杆状。

所述发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株，采用细菌通用引物16SrDNA的 27F/1492R对其基因组DNA为进行PCR扩增并测序，获得1480bp的基因序列，如SEQUENCE LISTING所示。将该基因序列输入NCBI进行比对，其与发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum strain M6相似率达99.86％，可初步鉴定该菌株为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum。

所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株在制备发酵食品中的应用。

所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株在制备低嘌呤食品中的应用。

所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株在制备发酵乳制品中的应用。

一种降解嘌呤的方法是将所述发酵乳杆菌9-4细胞加入到含有嘌呤的体系中。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

首次从广西壮族传统生榨米粉中筛选出具有降嘌呤功能的发酵乳杆菌，作为传统食品来源的益生菌，更加适合用于发酵食品、功能食品制备。

本发明提供的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株同时具有包括黄嘌呤氧化酶和尿酸氧化酶在内的嘌呤代谢酶，能够高效地将核苷降解为次黄嘌呤及黄嘌呤，并将嘌呤最终代谢为尿囊素，有效减少机体内尿酸的生成与积累。因此，该菌株应用于功能性食品领域，用于生产降嘌呤益生菌和低嘌呤食品，对预防、改善和治疗痛风以及高尿酸血症疾病具有重要意义。

与已发现的降嘌呤发酵乳杆菌相比，本发明提供的发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum 9-4菌株在pH 1.5的情况下发酵乳杆菌存活率为34％，胆盐浓度为0.3％的情况下存活率为 65％，对酸和胆盐都具有更好的耐受性，更加有利于发酵制品制备，更有利于人体利用。

附图说明

图1为发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株的菌落形态图。

图2为初步筛选中35株菌的黄嘌呤氧化酶酶活测定结果。

图3为初步筛选中35株菌的尿酸氧化酶酶活测定结果。

图4为8株菌中黄嘌呤氧化酶酶活测定分析图。

图5为8株菌中尿酸氧化酶酶活测定分析图。

图6为菌株基因组DNA提取结果。

图7为菌株16S rDNA PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

相关培养基配方及缓冲液、溶液配方

(1)MRS培养基：牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL， pH 6.6-6.8，配置固体培养基时，加入琼脂20g，121℃高压灭菌15min，使用时加入终浓度为2％的葡萄糖溶液，固体培养基则再加入终浓度为1％的碳酸钙。

(2)Tris-HCL(pH＝8.5)：称取Tris-HCL固体15.76g，用适量超纯水溶解后，定容至1L。制得母液浓度为100mmol/L的Tris-HCL，并用HCL和氢氧化钠将pH调至8.5。

(3)EDTA(pH＝8.0)：称取EDTA固体29.2mg，用适量超纯水溶解后，调pH至8.0，定容至10mL。

(4)尿酸：称取33.6mg尿酸，用适量50mmol/L氢氧化钠溶解后，并用其定容至10mL。制得母液浓度为20mmol/L的尿酸溶液。

(5)NAD：称取0.663g NAD固体，用适量超纯水溶解后，将其定容至10mL，制得母液浓度为100mmol/L的NAD溶液。

(6)氧嗪酸钾：称取氧嗪酸钾20mg，用适量超纯水溶解后，定容至5mL。制得母液浓度为10mmol/L的氧嗪酸钾溶液。

(7)黄嘌呤：称取黄嘌呤固体30.4mg，用适量50mmol/L氢氧化钠溶解后，并用其定容至10mL。制得母液浓度为20mmol/L的黄嘌呤溶液。

(8)磷酸缓冲溶液(50mmol/L，pH＝7.5)：量取1mol/L的磷酸氢二钠84.5mL，再量取1mol/L的磷酸二氢钠溶液15.5mL，调pH为7.5，定容至1L。

(9)磷酸氢二钠(1mol/L)：称取14.2g磷酸氢二钠固体，用适量超纯水溶解后，定容至100mL。

(10)磷酸二氢钠(1mol/L)：称取15.6g磷酸二氢钠固体，用适量超纯水溶解后，定容至100mL。

(11)肌苷：称取53.6mg肌苷标准品，适量超纯水溶解后，定容至10mL，制得母液浓度为20mmol/L的肌苷标准溶液。

(12)鸟苷：称取56.6mg鸟苷标准品，用适量50mmol/L氢氧化钠溶解后，定容至10mL，制得母液浓度为20mmol/L的鸟苷标准溶液。

(13)次黄嘌呤：称取27.2mg次黄嘌呤标准品，用适量50mmol/L氢氧化钠溶解后，定容至10mL，制得母液浓度为20mmol/L的次黄嘌呤标准溶液。

(14)尿囊素：称取31.6mg尿囊素标准品，用适量50mmol/L氢氧化钠溶解后，定容至10mL，制得母液浓度为20mmol/L的尿囊素标准溶液。

实施例1

生榨米粉中乳酸菌菌株分离、纯化及初步筛选

一、乳酸菌的分离、纯化

分别称取各生榨米粉样品2.5g，用灭菌生理盐水按1：9稀释，此为10^-1稀释度，取上述稀释液用生理盐水进行10倍稀释，为10^-2稀疏度，以此类推，进行梯度稀释。取10^-1、10^-3、10^-5、10^-7稀释度，分别吸取100μL涂布于MRS培养基，每个稀释度做两个重复，置于37℃恒温箱中，培养48h，待菌落长出，挑取平板上具有溶钙圈的乳酸菌特征菌落，如图1。不同的平板挑取3-4个单菌落，并进一步平板划线纯化。

从南宁市的十个样品中共分离出菌株35株，将纯化好的菌株保存于15％甘油中，-20℃冻存备用。

二、降嘌呤乳酸菌初步筛选

以嘌呤代谢途径中2个关键酶--尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶的催化活力(比酶活)为检测指标，初步筛选出具有降嘌呤能力的菌株。

1、粗酶液制备：将各菌株分别以1％的接种量接种于MRS液体培养基中，30℃培养至对数期，取菌液3mL，4℃，10000r/min条件下，离心1min，弃上清液，保留菌体。向菌体中加入50mmol/L磷酸缓冲溶液100μL将菌体重悬，再加入0.12g石英砂，随后在-30℃下研磨破胞4min。破胞结束后，13000r/min、4℃离心2min，取上清液，为待测粗酶样液。

2、黄嘌呤氧化酶酶活测定：反应体系如表1所示，配置好反应液后，在酶标板孔中加入 10μL样液，并设置一个平行组。加完样液后，加入190μL反应液启动反应，利用infinite M200 PRO酶标仪测定波长为295nm时的吸光值，计算生成尿酸的含量。

表1黄嘌呤氧化酶200μL反应体系

3、尿酸氧化酶酶活测定：反应体系如表2所示，按表配置好反应液。同上述操作，配置好反应液后，在酶标板孔中加入10μL样液，并设置一个平行组。加完样液后，加入190μL反应液，5min之内利用infinite M200 PRO酶标仪测定波长为295nm时的吸光值，计算生成尿酸的含量。

表2尿酸氧化酶200μL反应体系

4、蛋白含量的测定：使用康为BCA蛋白定量试剂盒测定粗酶液蛋白含量，计算酶比活力。按照BCA蛋白定量试剂盒的操作说明，稀释标准品并配制BCA工作液。用磷酸缓冲溶液将样液稀释1倍，按步骤测定粗酶液蛋白总含量，同时做好记录。随后，绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。

三、初筛结果

1、具有酶活力的菌株

分析尿酸特征吸收波长295nm处吸光值的变化，分析各样液是否具有黄嘌呤氧化酶及尿酸氧化酶酶活。利用SLOPE函数进行筛选，所得数值为正时，说明有尿酸生成，即该菌破胞上清样液具有黄嘌呤氧化酶酶活；若SLOPE函数所得数值为负数，则尿酸被氧化降解为尿囊素，即样液具有尿酸氧化酶酶活。35株菌株黄嘌呤氧化酶和尿酸氧化酶酶活测定结果如图2 和图3所示。随后做出吸光值随时间变化的散点图，观察线性。黄嘌呤氧化酶有活力的菌共有4株，分别是菌株1-1，1-2，1-3，5-1。尿酸氧化酶有活力的菌也有4株，分别是菌株3-2， 4-3，6-3，9-4。其余菌株均未检测到酶活力，该八株菌所测定吸光度随时间变化的散点如图 4和图5所示。

2、酶比活力计算

黄嘌呤氧化酶比活力以每毫克蛋白每分钟生成尿酸的微摩尔量表示，尿酸氧化酶比活力以每毫克蛋白每分钟消耗尿酸的微摩尔量表示。根据蛋白标准曲线y＝1.1487x+0.0526；R²＝ 0.9956。将测得的样品吸光值代入标准曲线中，计算出样液中的蛋白含量，并进一步计算酶比活力。筛选出的各菌株的蛋白含量及酶比活力结果如表3和表4所示。

表3黄嘌呤氧化酶酶活、蛋白总含量及比酶活力结果

表4尿酸氧化酶酶活、蛋白总含量及比酶活力结果

实施例2

初筛乳酸菌分子生物学鉴定

一、基因组提取

将经过初筛的8株菌以1％接种量接种于MRS培养基，待培养至对数期时取菌液3mL，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明，对初筛所得的8株菌进行基因组DNA提取。提取后进行琼脂糖凝胶电泳验证，验证结果如图6所示。

二、PCR扩增

使用超微量全波长分光光度计对提取的基因DNA样液进行定量，并稀释至1ng/μL，以此作为PCR扩增的模板。引物27F和1492R具体序列分别为序列表SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3。按照表5构建PCR反应体系，使用PCR仪进行扩增，扩增程序为94℃预变性5min， 94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行30次循环，72℃终延伸2min。

表5 PCR反应体系

PCR扩增后，取扩增产物5μL，进行琼脂糖凝胶电泳验证，验证结果如图7所示，在1500 bp处出现了目的条带，PCR扩增成功。扩增成功后的PCR反应液待用于后续的DNA纯化和测序。

三、16S rDNA序列分析

将PCR产物按照DNA产物纯化试剂盒操作方法进行纯化后，委托六合华大基因科技有限公司广州测序部进行正反向测序。借助NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)和RDP数据库(http://rdp.cme.msu.edu/)对各菌株16S rDNA序列进行比对分析，鉴定菌株信息，结果如表6。

表6序列对比结果

由于菌株5-1是条件致病菌的一种，故将其筛除，该步骤筛得菌株共7株。

实施例3

降核苷菌株筛选

食物中的核苷是生成嘌呤的前体物质，是体内嘌呤的主要来源。为了筛选出具有降核苷功能的菌株，以静息细胞对肌苷、鸟苷的代谢能力为指标，通过Waters e2695高效液相色谱仪对肌苷、鸟苷、嘌呤等进行检测，了解各菌株对核苷的代谢能力。

按照下表7配制2mL高效液相肌苷标样、鸟苷标样以及肌苷-鸟苷反应液体系。

表7高效液相2mL溶液体系

将经过筛选和鉴定的7个菌株以1％接种量接种于MRS培养基。经过16h后，取10mL菌液4℃，12000r/min离心3min，收集菌体。以1mL生理盐水洗涤菌体，该操作重复2次。

向洗净的菌体中加入2mL肌苷-鸟苷反应液，混匀后置于37℃培养箱中，160r/min振荡培养60min。随后4℃，12000r/min离心3min，取上清液2mL，90℃水浴灭酶20min，使用0.22μm滤膜过滤后，用于HPLC分析，HPLC色谱条件如表8所示。测定肌苷标样与鸟苷标样进样量为5，10，15，20μL时的峰面积。为方便后期分析嘌呤代谢情况，对黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸、尿囊素标样进样量为20μL时的峰面积及保留时间进行测定。

表8 HPLC色谱条件

分析各标准品及样品的高效液相色谱图，标准品及样品保留时间及峰面积见表9。以标准品物质的量X为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线。肌苷标准曲线为A_肌苷＝464884 X_肌苷+33998；R²＝0.9998，鸟苷标准曲线为A_鸟苷＝349543X_鸟苷+51254；R²＝0.9997。

表9标准品保留时间及峰面积

将测出的样品峰面积代入标准曲线，分别计算出各菌株反应液中肌苷和鸟苷的剩余含量 X，用公式1与公式2计算各菌株分解核苷速率和分解率。并计算每个菌株核苷分解速率和核苷分解率。计算的数据结果如表10和表11所示。

其中，n为反应前反应液肌苷或鸟苷的含量，X为反应后上清液中残余肌苷与鸟苷含量。

表10肌苷分解水平结果

表11鸟苷分解水平结果

由表10及表11可看出，7株候选菌株均具有一定的核苷分解能力，但不同菌株之间在核苷分解能力上有明显差异。分析样品图谱可知，反应残液中有次黄嘌呤和黄嘌呤生成，无尿酸与尿囊素生成，表明菌体消耗了反应液中的肌苷与鸟苷，生成了次黄嘌呤和黄嘌呤，同时在菌株黄嘌呤氧化酶及尿酸氧化酶的作用下，在菌体内生成尿酸和尿囊素。其中菌株4-3 及9-4对肌苷及鸟苷分解率较大，因此选择菌株4-3及9-4进行下一阶段实验。

实施例4

候选菌株耐酸、耐胆盐实验

1、耐酸受性实验

用浓度为1mol/L HCl及1mol/L NaOH将MRS液体培养基pH值分别调为pH＝1、pH＝2、 pH＝3，121℃灭菌20min。将菌株4-3及9-4接种于MRS液体培养基，37℃培养24h后，进行活菌计数，同时取菌液10mL于4℃，4000g离心10min，弃上清培养基，分别无菌操作加入pH＝1、pH＝2、pH＝3的MRS培养基10mL，充分重悬后，于37℃恒温培养。3h后取样进行活菌计数，计算存活率，结果见表12，在pH 1.5的情况下存活率为34.46％，证明菌株 9-4对酸有较强的耐受性。而菌株4-3在pH3.5的MRS培养基中培养3h后，存活率仅为11.41％，该菌株酸耐受性较弱。

表12各菌株在酸存在下的存活率

2、胆盐耐受性实验

用牛胆盐将MRS液体培养基的胆汁盐质量分数分别调为0.3％，0.5％，1.0％，分于37℃恒温培养，将菌株4-3及9-4接种于MRS液体培养基，37℃培养24h后，进行活菌计数，同时取菌液10mL于4℃，4000g离心10min，弃上清培养基，分别无菌操作加入胆汁盐为0.3％，0.5％，1.0％，的MRS培养基10mL，充分重悬后，于37℃恒温培养。12h后取样进行活菌计数。结果见表13，菌株9-4在0.3％胆盐的情况下存活率为64.1％，大于菌株4-3的存活率59.12％，表明菌株9-4对胆盐有较强的耐受性。

表13各菌株在胆盐存在下的存活率

综合考虑核苷分解能力以及耐酸、耐胆盐能力，菌株9-4分解核苷能力较强，耐酸、耐胆盐能力也更强，因此将9-4菌株确定为最终目的菌株。

实施例5

降嘌呤发酵牛乳制备

一、发酵牛乳制备

将菌株9-4及超市购买的常规对照酸奶以1％接种量接种于MRS液体培养基，37℃培养 24h后，取菌液10mL以4000r/min、4℃条件冷冻离心10min，倒弃培养基，用超纯水洗涤菌体，离心弃上清，该操作重复2次，制得菌体备用。量取100mL纯牛乳于烧杯中，加入终浓度为2％的蔗糖。在超净台中用牛奶重悬上述离心洗涤后的菌体，将其接种于水牛奶中。置于酸奶发酵机中发酵12h，随后4℃冷藏12h。

二、发酵牛乳核苷分解能力对比

1、样品活菌数记录

称取酸奶2.5g，用灭菌生理盐水按1：9稀释，此为10^-1稀释度，取上述稀释液用生理盐水进行10倍稀释，为10^-2稀疏度，以此类推，进行梯度稀释。取10^-1、10^-3、10^-5、10^-7稀释度，分别吸取100μL涂布于MRS培养基，每个稀释度设置两个平行，置于37℃恒温箱中，培养48h，待菌落长出，记录菌落数，结果见表14。

2、样品前处理

吸取2mL酸奶成品与2mL的对照酸奶于离心管中，按表6所示加入肌苷-鸟苷反应液2 mL。在37℃、160r/min条件下，振荡恒温培养3h。待反应结束后，4℃、10000rpm冷冻离心10min，吸取上清液300μL，加入0.6mol/L的高氯酸600μL，冰上静置5min，然后10000 r/min离心1min，取上清液600μL加入1mol/L氢氧化钾溶液240μL，17000r/min于4℃离心10min，取上清液用0.22μm膜过滤，-20℃冰箱中备用。

3、HPLC检测

HPLC色谱条件如表7所示。将备用样液上机进行检测，每个样品上样量为20μL记录并处理数据。

4、结果与分析

采用菌株9-4与市售酸奶菌株发酵得到的酸奶样品，其核苷及嘌呤降解水平如表14，与已知具有降嘌呤能力的阳性菌株短乳杆菌相比，发酵乳杆菌9-4对核苷分解能力更强，嘌呤降解能力相对较弱。与市售普通酸奶相比，筛选出的发酵乳杆菌9-4具有良好的核苷分解能力。分析菌株9-4液相图谱，菌株9-4将核苷分解为黄嘌呤、次黄嘌呤，同时菌株9-4中含有的黄嘌呤氧化酶催化两种嘌呤氧化生成尿酸，之后在菌株9-4尿酸氧化酶的作用下，尿酸氧化生成尿囊素。最终达到降低食品中嘌呤含量的目的。

表14发酵牛乳核苷降解水平

以上实例证明了该菌株在发酵牛乳中的应用，使用该菌株发酵的牛乳，具有分解核苷，降低食品中嘌呤含量的功能。

本发明不限于上述技术方案，本发明的任何改进，包括对该技术方案进行多种简单变形，均落在本发明的保护范围内。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中描述的各个具体技术特征，在不矛盾情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可任意进行组合，只要不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 广西大学

<120> 发酵乳杆菌 Lactobacillus fermentum 9-4及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1480

<212> DNA

<213> Lactobacillus fermentum 9-4

<400> 1

caactgtcac ttagcggctg gctcctaaaa ggttacccca ccgactttgg gtgttacaaa 60

ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct 120

gatccgcgat tactagcgat tccgacttcg tgcaggcgag ttgcagcctg cagtccgaac 180

tgagaacggt tttaagagat ttgcttgccc tcgcgagttc gcgactcgtt gtaccgtcca 240

ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atctgacgtc gtccccacct 300

tcctccggtt tgtcaccggc agtctcacta gagtgcccaa cttaatgctg gcaactagta 360

acaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacga 420

ccatgcacca cctgtcattg cgttcccgaa ggaaacgccc tatctctagg gttggcgcaa 480

gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt agcttcgaat taaaccacat gctccaccgc 540

ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg 600

agtgcttaat gcgttagctc cggcactgaa gggcggaaac cctccaacac ctagcactca 660

tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc gctacccatg ctttcgagtc 720

tcagcgtcag ttgcagacca ggtagccgcc ttcgccactg gtgttcttcc atatatctac 780

gcattccacc gctacacatg gagttccact accctcttct gcactcaagt tatccagttt 840

ccgatgcact tctccggtta agccgaaggc tttcacatca gacttagaaa accgcctgca 900

ctctctttac gcccaataaa tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct 960

ggcacgtagt tagccgtgac tttctggtta aataccgtca acgtatgaac agttactctc 1020

atacgtgttc ttctttaaca acagagcttt acgagccgaa acccttcttc actcacgcgg 1080

tgttgctcca tcaggcttgc gcccattgtg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga 1140

gtatgggccg tgtctcagtc ccattgtggc cgatcagtct ctcaactcgg ctatgcatca 1200

tcgccttggt aggccgttac cccaccaaca agctaatgca ccgcaggtcc atccagaagt 1260

gatagcgaga agccatcttt taagcgttgt tcatgcgaac aacgttgtta tgcggtatta 1320

gcatctgttt ccaaatgttg tcccccgctt ctgggcaggt tacctacgtg ttactcaccc 1380

gtccgccact cgttggcgac caaaatcaat caggtgcaag caccatcaat caattgggcc 1440

aacgcgttcg acttgcatgt atagcaaccg cccagtcccc 1480

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株，CCTCC NO：M 2019619，其具有降低嘌呤的能力。

2.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株，其特征在于，该菌株于2019年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019619。

3.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株，其特征在于，所述保藏编号为CCTCC NO：M 2019619的菌株9-4的16S rDNA序列如序列表中SEQ INNO:1所示。

4.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株，其特征在于，其菌落特征为：菌落表面光滑，呈白色或乳白色的单个菌落，显微镜下呈圆形或椭圆形，无芽孢，革兰氏染色呈阳性。

5.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株，是从壮族传统食物生榨米粉中筛选出的具有高降嘌呤能力的乳酸菌菌株。

6.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株的筛选方法，其特征在于，具体筛选步骤为：

(1)使用MRS培养基对广西南宁壮族传统食物生榨米粉中的微生物进行培养，挑选特征菌落并分离、纯化，获得纯化候选菌株；

(4)以静息细胞代谢核苷能力为检测指标，利用高效液相色谱法对乳酸菌的降嘌呤能力进行复筛，筛选出核苷代谢能力较高的菌株。

7.权利要求1所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株在制备发酵食品中的应用。

8.权利要求1所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株在制备低嘌呤食品中的应用。

9.权利要求6所述的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum 9-4菌株在制备发酵乳制品中的应用。

10.一种降解嘌呤的方法，其特征在于：所述方法是将所述发酵乳杆菌9-4细胞加入到含有嘌呤的体系中。