CN110079476A - 一株可降低血尿酸的发酵乳杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，公开了一株可降低血尿酸的发酵乳杆菌，菌株命名为：2644菌株，于2018年11月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.16754；保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，微生物分类命名为Lactobacillus fermentum。本发明菌株能够有效降低血尿酸的含量。除可减少外源性嘌呤类物质的摄入外，也可促进体内尿酸从肠道排出，更为有效地控制机体的血尿酸水平。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株可降低血尿酸的发酵乳杆菌。
背景技术
临床上，当男性血尿酸水平大于7.0mg/dL，女性血尿酸水平大于6.0mg/dL即可确诊为高尿酸血症。据统计，我国普通人群高尿酸血症的患病率大约为10％，与糖尿病患率相当；而沿海和经济发达地区达高尿酸血症的患病率在20％以上。2017年中国痛风现状调查显示我国高尿酸血症患者人数已达1.7亿。痛风已经成为我国仅次于糖尿病的第二大代谢类疾病。
循环血液中尿酸含量的多少主要由人体尿酸的合成及排泄这两者代谢速度之间的动态关系决定的。人体内的尿酸来源包括内源性与外源性，其中67％是体内核蛋白、核酸等物质分解代谢产生，剩余33％来源于食物中的嘌呤类物质。体内尿酸的生成由嘌呤类代谢相关酶控制。尿酸的排泄途径则包括肾脏与肠道两种途径，一般情况下70％由肾脏排出，30％由肠道排出。现有的调节尿酸水平的手段以药物治疗为主，主要分为三类，抑制黄嘌呤氧化酶活力、减少尿酸重吸收或将尿酸转化为尿囊素。但大部分药物都有着不同程度的副反应，如严重的过敏反应、胃肠道反应、骨髓抑制、肝功能损害等。
明治乳业报道的加氏乳杆菌OLL2959具有将鸟苷、肌苷降解成为鸟嘌呤、次黄嘌呤的能力。大连医科大学获得的一株短乳杆菌DM9218对肌苷和鸟苷的分解率分别为99.31％，其分解后的产物为游离的嘌呤碱基，则吸收进入人体后仍有转化为尿酸、提高人体血尿酸的风险。上述益生菌在肠道中具有摄取或降解嘌呤类物质的功能，通过减少外源性的摄入来调节血尿酸水平，对内源性来源的尿酸升高则无作用。
发明内容
本发明提供了一株可降低血尿酸的发酵乳杆菌，本发明菌株能够有效降低血尿酸的含量。除可减少外源性嘌呤类物质的摄入外，也可促进体内尿酸从肠道排出，更为有效地控制机体的血尿酸水平。
本发明的具体技术方案为：一株可降低血尿酸的发酵乳杆菌，该菌株是发明人在前期工作中从中国新疆维吾尔自治区阿拉山口附近采集的传统酸奶中筛选得到。经鉴定属于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，命名为2644菌株，于2018年11月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCCNO.16754。该菌株的生物学性质如下：
形态学特征：在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色菌落，不透明、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、中央凸起。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈短杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动(图1所示)。
培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。
生物学鉴定：针对16s rRNA基因序列测序，所得结果于NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。基因序列如SEQ ID NO.1所示：
本发明的发酵乳杆菌可在制备具有降血尿酸功能的食品、药物中应用。
作为优选，所述发酵乳杆菌的服用剂量为4×109-1×1011CFU/d。
作为优选，所述发酵乳杆菌的服用剂量如下表所示，服用剂量是依据实施例中的动物试验换算而得，具体换算方法为：
正常人体体重按60kg计算，正常大鼠体重按300g计算。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1、本发明所提供的发酵乳杆菌2644菌株经大鼠体内试验表明可有效降低血清中尿酸水平。服用剂量在1×108-2.5×109CFU/d范围内都具有显著效果，回复至与正常大鼠相似的的血尿酸水平，血尿酸降低水平达25％-32％。
2、本发明所提供的发酵乳杆菌2644菌株可促进体内尿酸从肠道的排出，控制机体的血尿酸水平。在高尿酸血症大鼠模型试验中，服用剂量在1×108-2.5×109CFU/d范围内都具有显著效果。尿酸排出量较模型组提高46.4-111.6％。
3、本发明所提供的发酵乳杆菌2644菌株对鸟苷具有很强的利用能力，可将鸟苷100％进行降解。该菌株对鸟苷降解后的产物鸟嘌呤也具有进一步的降解和利用能力，去除率达57.46％。该菌株可通过利用和降解嘌呤类物质，抑制外源性嘌呤类物质的摄入，降低血尿酸水平(如背景技术中所述，现有技术中的菌株将鸟苷分解后，其分解后的产物游离嘌呤碱基仍会被人体吸收后转化为尿酸，只能减少外源性尿酸的摄入，而对内源性尿酸的升高无作用)，与现有技术相比，取得了显著的进步。
4、本发明所提供的发酵乳杆菌2644菌株具备良好的耐酸耐胆盐特性。在pH＝2.5酸环境作用下4h后，活菌数降低0.41个数量级，在0.3％胆盐作用8h后，活菌数仅降低1.31个数量级；具有良好的黏附特性，在HT-29细胞模型试验中表现出良好的黏附能力，单细胞黏附菌数达1.01±0.07。该菌株能顺利到达肠道，与肠道上皮细胞发生黏附，发挥生理功效。
5、本发明使用的发酵乳杆菌2644菌株是被囊括于卫生部2010年颁布的《可用于食品的菌种名单》的食品级微生物。
附图说明
图1为本发明分离得到的一株发酵乳杆菌的菌株外观特性(菌落特征)；
图2为本发明分离得到的一株发酵乳杆菌的菌株外观特性(革兰氏染色显微镜观察特征)；
图3为本发明实施例中对照菌的黏附实验镜检结果图；
图4为本发明发酵乳杆菌的黏附实验镜检结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例一株可降低血尿酸的发酵乳杆菌，该菌株是发明人在前期工作中从中国新疆维吾尔自治区阿拉山口附近采集的传统酸奶中筛选得到。经鉴定属于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，命名为2644菌株，于2018年11月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.16754。该菌株的生物学性质如下：
形态学特征：在MRS琼脂培养基中生长形态为乳白色菌落，不透明、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、中央凸起。革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈短杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动(图1-2所示)。
培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于MRS培养基中。
生物学鉴定：针对16s rRNA基因序列测序，所得结果于NCBI的GenBank数据库中进行同源性比对分析，结果显示该菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。基因序列如SEQ ID NO.1所示：
一、鸟苷转化率与鸟苷去除率测试
(1)取本发明菌株的甘油保藏管，接种至10mLMRS液体培养基中，于37℃条件下进行过夜培养。连续活化培养2代后用于实验。测定菌液的OD值，按照终孵育浓度为OD600＝1.5/mL的比例确定菌液吸取量。取一定量菌液于15mL离心管中，在4℃条件下，5000g离心10min，并用0.85％的生理盐水洗涤两次，用于共孵育实验。
使用超纯水配制pH＝7.4的0.05M PBS溶液，加入0.5mM的鸟嘌呤核苷。充分溶解后，过滤除菌。将菌泥重悬于10mL鸟嘌呤核苷孵育液中，混匀，在37℃、100rpm条件下振荡孵育1h后，5000g离心10min，取离心上清液按照9∶1的比例与中止液(7％的高氯酸)混合，中止反应的进行。经过滤除杂后，采用安捷伦1200型HPLC进行鸟嘌呤及鸟嘌呤核苷变化的检测，检测条件为：柱型为ZORBAX SB-C18，进样量10mL，柱温35℃，流速1mL/min，检测波长为254nm。流动相采用10mM的甲酸铵水溶液，将10％的甲酸溶液pH调整至3.2，按照99∶1的比例加入甲醇，混匀过滤后使用。根据标准样品确定鸟嘌呤与鸟苷峰的出峰时间。根据峰面积计算鸟苷与鸟嘌呤含量，以此计算鸟苷转化率与鸟苷去除率。
鸟苷转换率＝(1-上清液中残留鸟苷/上清液中原始鸟苷)×100％，
鸟苷去除率＝[1-(上清液中残留鸟苷+鸟嘌呤)/上清液中原始鸟苷]×100％。
从下表结果可知，发酵乳杆菌2644对鸟苷具有很强的利用能力，可将鸟苷100％进行降解，且对鸟苷降解后的产物鸟嘌呤也具有进一步的降解和利用能力，去除率达57.46％。同样分离自新疆奶样中的对比菌株发酵乳杆菌2434，鸟苷转化率与鸟苷去除率均远低于本发明菌株。
| 菌株名称 | 鸟苷转化率(％) | 鸟苷去除率(％) |
| L.fermentum 2644 | 100.00±0.00 | 57.46±2.42 |
| L.fermentum 2434 | 14.08±1.70 | 0.11±0.02 |
(2)配制多浓度梯度的鸟嘌呤核苷孵育液，分别在pH＝7.4的0.05M PBS溶液中加入0.1、0.25、0.5、1.0mM鸟嘌呤核苷，充分溶解后，过滤除菌。菌株培养同上所述。将菌泥重悬于鸟嘌呤核苷孵育液中，混匀，在37℃、100rpm条件下振荡孵育1h后，5000g离心10min，取离心上清液按9∶1的比例与中止液(7％的高氯酸)混合，中止反应进行。采用HPL法C进行鸟嘌呤及鸟嘌呤核苷含量的检测，检测方法同上。
发酵乳杆菌2644在不同鸟苷浓度下，鸟苷转化率与鸟苷去除率结果如下所示。在鸟苷浓度≤0.5mM的范围内，发酵乳杆菌2644均可将鸟苷进行100％的利用与降解。但随着初始鸟苷浓度的升高，鸟苷去除率呈现下降趋势。
| 鸟苷浓度(mM) | 鸟苷转化率(％) | 鸟苷去除率(％) |
| 0.1 | 100.00±0.00 | 60.20±0.49 |
| 0.25 | 100.00±0.00 | 53.25±0.19 |
| 0.5 | 100.00±0.00 | 48.49±0.91 |
| 1.0 | 63.06±2.83 | 28.61±0.24 |
二、菌株耐受特性测试将本发明菌株与市售菌株均培养至对数生长末期后，获取菌悬液，将菌悬液分成2组，4000g，10min离心后获得菌泥，分别进行如下操作：①加入用盐酸调整至pH＝2.5的MRS溶液，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育1h、2h、4h后菌数的变化。②加入胆盐浓度为0.3％的MRS溶液，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育4h、8h后菌数的变化。
结果如下表所示，本发明菌株具有较好的耐受特性。在pH＝2.0环境下孵育4h，菌数降低0.66个数量级，优于对照商业菌株；在pH＝2.5环境下孵育4h，菌数降低0.41个数量级；在0.3％胆盐浓度下孵育8h，菌数降低1.31个数量级；略低于具有优秀耐酸与耐胆盐特性的商业菌株。本发明菌株在低酸性环境下具有较优秀的耐受性。
三、菌株黏附特性测试建立HT-29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的DMEM培养基中(含青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml)。待细胞传至第三代后，采用0.25％的胰酶(含EDTA)消化后进行重悬，以1×106细胞/孔的密度接种于已放置细胞爬片的6孔细胞培养板中，于37℃，含5％CO2浓度的培养箱中进行培养，构建出模拟体内乳杆菌黏附肠上皮细胞的黏附模型。将本发明菌株与市售菌株均培养至对数生长末期后，进行黏附实验，结果如下表及图3-4所示。发酵乳杆菌2644的黏附特性略低于市售的商业菌株。
| 菌株 | 黏附性(菌数/细胞数) |
| L.fermentum 2644 | 1.01±0.07 |
| 商业菌 | 1.49±0.10 |
四、动物试验
将健康的SPF级雄性SD大鼠(6-8周龄，200-220g)，经7天适应后，随机分为5组，每组10只。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为30-70％，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。分组如下：
对照组1：正常对照组，基础饲料喂养；
对照组2：模型对照组，高嘌呤饲料喂养+灌胃300mg/kg/d氧嗪酸钾造模；
对照组3：阳性药物组，灌胃20mg/kg/d别嘌呤醇；
实验组1：灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为2.5×109CFU/d；
实验组2：灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为5×108CFU/d；
实验组3：灌胃本发明菌株悬液，灌胃剂量为1×108CFU/d。
各实验组大鼠于受试样品给喂14天后，断食不断水，采用心脏穿刺取血获取大鼠血液样本。将血液样本静置30min后，于4℃条件下4000rpm离心15min，取上层血清样本。采用酶标比色法进行尿酸含量的测定，于510nm波长下测定吸光度值，采用尿酸标准品制作标准曲线，计算血清中尿酸含量。
结果如下所示，模型组血清尿酸水平显著高于对照组，说明造模成功。在高、中、低三个剂量下，灌胃发酵乳杆菌2644均可显著降低模型组大鼠的血清尿酸水平，回复至与正常对照组(对照组1)相似水平(p＜0.01)。
(平均值±标准差，标注**表示与对照组2相比具有显著性差异，P＜0.01)
各实验组大鼠于受试样品给喂14天后，收集粪便样品。粪便样品称重后，采用4倍体积生理盐水溶液进行涡旋混匀，超声处理20min后，4000rpm离心10min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，采用HPLC法测定样品中的尿酸含量。采用反相C18柱(4.6mm×250mm，5μm，Agilent)；流动相：0.2％醋酸水溶液∶甲醇＝94∶6；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：288nm。根据尿酸标准品确定出峰时间，制作标准曲线，进行粪便样品中尿酸浓度的计算。
结果如下所示，实验组2与实验组3相比对照组2(模型组)大鼠粪便中的尿酸含量均有显著增加，表明本发明菌株除可通过利用或降解核苷酸类物质降低尿酸的摄入外，也可促进体内尿酸从肠道的排出。
| 粪便尿酸浓度(μg/ml) | |
| 对照组1 | 0.68±0.34 |
| 对照组2 | 1.12±0.34 |
| 对照组3 | 1.50±0.61 |
| 实验组1 | 1.64±0.19 |
| 实验组2 | 2.35±0.95** |
| 实验组3 | 2.37±0.73** |
(平均值±标准差，标注**表示与对照组2相比具有显著性差异，P＜0.01)
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 杭州娃哈哈科技有限公司 杭州娃哈哈集团有限公司
<120> 一株可降低血尿酸的发酵乳杆菌
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1456
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)
<400> 1
atacatgcag tcgaacgcgt tggcccaatt gattgatggt gcttgcacct gattgatttt 60
ggtcgccaac gagtggcgga cgggtgagta acacgtaggt aacctgccca gaagcggggg 120
acaacatttg gaaacagatg ctaataccgc ataacaacgt tgttcgcatg aacaacgctt 180
aaaagatggc ttctcgctat cacttctgga tggacctgcg gtgcattagc ttgttggtgg 240
ggtaacggcc taccaaggcg atgatgcata gccgaattga gagactgatc ggccacaatg 300
ggactgaaac acggcccata ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccacaatggg 360
cgcaagcctg atggagcaac accgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg taaagctctg 420
ttgttaaaga agaacacgta tgaaagtaac tgttcatacg ttgacggtat ttaaccagaa 480
agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg 540
atttattggg cgtaaagaga gtgcaggcgg ttttctaagt ctgatgtgaa agccttcggc 600
ttaaccggag aagtgcatcg gaaactggat aacttgagtg cagaagaggg tagtggaact 660
ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga aggcggctac 720
ctggtctgca actgacgctg agactcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct 780
ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta ggtgttggag ggtttccgcc cttcagtgcc 840
ggagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg 900
aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc tacgcgaaga 960
accttaccag gtcttgacat cttgcgccaa ccctagagat agggcgtttc cttcgggaac 1020
gcaatgacag gtggtgcatg gtcgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1080
cgcaacgagc gcaacccttg ttactagttg ccagcattaa gttgggcact ctagtgagac 1140
tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga cgacgtcaga tcatcatgcc ccttatgacc 1200
tgggctacac acgtgctaca atggacggta caacgagtcg cgaactcgcg agggcaagca 1260
aatctcttaa aaccgttctc agttcggact gcaggctgca actcgcctgc acgaagtcgg 1320
aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380
ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac cttttaggag 1440
ccagccgcct aaggtg 1456
Claims (8)
1.一株可降低血尿酸的发酵乳杆菌，其特征在于：所述发酵乳杆菌命名为：2644，于2018年11月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，微生物保藏编号为CGMCC NO.16754；保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，微生物分类命名为发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum。
2.如权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌具有如SEQ ID NO.1所示的16s rRNA基因序列。
3.如权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌由中国新疆维吾尔自治区阿拉山口附近采集的传统酸奶中筛选得到。
4.如权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌对鸟苷以及对鸟苷降解后的产物鸟嘌呤同时具有降解和利用能力，可同时抑制外源性尿酸的摄入和内源性尿酸的升高。
5.如权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于，所述发酵乳杆菌具备耐酸耐胆盐特性以及黏附特性。
6.如权利要求1-5之一所述发酵乳杆菌在制备具有降血尿酸功能的食品、药物中用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述发酵乳杆菌的服用剂量为4×109-1×1011CFU/d。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述发酵乳杆菌的服用剂量为6.66×107-1.67×109CFU/kg。
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2019
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