CN116355857A - 悬浮培养的牛肾细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了悬浮培养的牛肾细胞及其制备方法与应用，属于动物细胞培养领域。本发明所要解决的技术问题是如何高密度体外培养牛肾细胞和/或提高利用牛肾细胞培养病毒的病毒产量。为了解决该技术问题，本发明提供了一种牛肾细胞MDBK‑V，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.45244。本发明的MDBK细胞可在反应器中进行低血清高密度悬浮培养，细胞密度可达7.0×106个/ml以上，病毒培养至少比贴壁培养提高1~2个滴度。本发明的方法可以明显提升所获得的细胞密度和病毒滴度，降低病毒培养的生产成本，提高疫苗生产效率和安全性。

Description

悬浮培养的牛肾细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及动物细胞培养领域，具体涉及悬浮培养的牛肾细胞及其制备方法与应用。
背景技术
MDBK细胞是牛肾细胞，由S H Madin和N B Darby从一头健康的成年牛肾脏组织中分离培养建立的贴壁培养型传代细胞系，细胞生长力强，被广泛用于病毒感染、检测和培养领域。
MDBK细胞呈贴壁型生长，由于其贴壁生长特性的限制，多采用转瓶培养方式和微载体培养方式进行生产，但贴壁培养的生产周期长，下游工艺相对复杂，工业化大规模生产的难度较大。悬浮培养相比贴壁培养的优势在于，生产放大工艺简单，可连续测定细胞浓度，连续收集部分细胞进行继代培养，也无须消化分散，细胞收率高，批间差异较小，劳动强度小，占地空间少，生产效率提升明显。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何高密度体外培养牛肾细胞和/或提高利用牛肾细胞培养病毒的病毒产量。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种牛肾细胞，所述牛肾细胞名称为MDBK-V，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.45244。
进一步地，所述牛肾细胞MDBK-V可悬浮培养。
进一步地，所述牛肾细胞MDBK-V可通过低血清培养基培养，所述低血清培养基中的血清浓度不超过2%。
本发明还提供了所述牛肾细胞MDBK-V的制备方法，所述方法可包括如下步骤：
A1）将带有ST6GalNac V基因的重组质粒转染至MDBK细胞中，获得表达ST6GalNacV基因的重组细胞（MDBK克隆细胞株）；
A2）对所述重组细胞进行低血清悬浮驯化获得所述牛肾细胞MDBK-V；所述低血清悬浮驯化包括在含2%胎牛血清的培养基中进行培养。
A1）中所述MDBK细胞为贴壁型生长的MDBK细胞。
所述ST6GalNac V基因的核苷酸序列为GenBank Accession No. NM＿030965.2的第879-1438位。
所述带有ST6GalNac V基因的重组质粒为ST6GalNac V重组质粒，购自Genecopoeia公司（货号：EX-V1581-M03），该重组质粒骨架采用puc19质粒，插入的外源基因为ST6GalNac V。
上述方法中，所述低血清悬浮驯化可包括如下步骤：
B1）将所述重组细胞（MDBK克隆细胞株）用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行传代培养；
B2）用由DMEM培养基与DMEM悬浮培养基混合而成的混合培养液进行传代培养，所述混合培养液中含10%胎牛血清；
B3）用低血清培养基传代培养，获得MDBK悬浮细胞；
B4）用低血清培养基传代培养所述MDBK悬浮细胞，驯化后获得所述牛肾细胞MDBK-V；
所述低血清培养基可为含2%胎牛血清的培养基。
进一步地，所述低血清培养基可为低血清培养基1，所述低血清培养基1可为由胎牛血清和所述MDBK悬浮培养基制成的培养基。
本文所述低血清培养基1可为由上述DMEM悬浮培养基和胎牛血清制成的胎牛血清体积百分含量为2%的液体培养基。
所述混合培养液可由DMEM培养基与DMEM悬浮培养基按照1:1的体积比混合而成。
所述DMEM悬浮培养基可为商品化产品：购自健顺生物，货号：66001-005。
所述DMEM培养基可为Gibco公司产品，货号：12100-061。
B4）中所述驯化可为驯化10~20代，驯化后的细胞呈圆形、透亮、分散生长，细胞密度达到要求。
进一步地，所述细胞密度达到要求可为细胞密度达到1×106/mL以上。
本发明还提供了所述牛肾细胞的培养方法，所述方法可包括：将所述牛肾细胞在低血清培养基1中悬浮培养扩增，然后接种至生物反应器，继续用低血清培养基1在温度37℃、CO2浓度为5%、溶氧30%~40%和pH 7.0-7.2的条件下培养。
上述培养的转速可为60~70 r/min。
所述低血清培养基1可为含2%胎牛血清的培养基。所述低血清培养基1可为由胎牛血清和所述悬浮培养基制成的培养基。
上述方法中，所述方法还包括在接种至生物反应器后的培养过程中，补加所述低血清培养基1，然后在温度37℃、溶氧50%-60%和pH 7.0-7.2的条件下培养。
上述补加所述低血清培养基1后培养的转速可为转速70-90 r/min。
上述方法中，所述补加低血清培养基1的方法可为：在接种至生物反应器后培养40~48小时补加所述低血清培养基1，在温度37℃、CO2浓度为5%、溶氧50%和pH7.0-7.2的条件下继续培养至72小时，然后在温度37℃、CO2浓度为5%、溶氧60%、pH 7.0-7.2的条件下继续培养至96小时。
上述培养的转速可为70~90 r/min。
所述牛肾细胞MDBK-V的培养方法可为高密度培养方法。所述高密度培养方法可为按照该方法培养，所述牛肾细胞MDBK-V的细胞密度可达到7.0×106个/mL以上。
在本发明的一个实施方案中，所述高密度培养方法为：
将液氮冻存的纯悬浮培养的MDBK-V细胞株复苏，用玻璃摇瓶悬浮培养扩增，以细胞浓度0.4×106~0.8×106个/mL接种至生物反应器，反应器中加入含2%胎牛血清的低血清培养基2 2 L，接通四种气体，四种气体设定为空气、氧气、氮气和CO2，转速60~70 r/min，温度37℃，CO2浓度设定为5%，溶氧设定为30~40%，pH值设定为7.0-7.2；培养48小时补加低血清培养基2至3 L，转速设定为70~90 r/min，温度37℃，CO2浓度设定为5%，溶氧设定为50%~60%、pH 7.0-7.2，继续培养至72~96小时收获。可选地，培养至72小时补加低血清培养基至4L。
在本发明的一个实施方案中，所述MDBK-V悬浮细胞高密度培养方法包括如下步骤：
1、复苏一支MDBK-V悬浮细胞，用50 mL低血清培养基2，置于70 r/min、37℃、5%CO2的条件下培养72~96 h，使其细胞密度达1×106个/mL，用低血清培养基2稀释成100 mL，用悬浮培养瓶扩大培养，稀释后细胞密度为0.4×106~0.6×106/mL，培养条件：60 r/min，37℃、5% CO2培养；培养48~72 h加低血清培养基2至1000 mL分两个悬浮培养瓶扩大培养，每瓶500 mL，细胞密度为0.4×106~0.6×106个/mL。培养条件：60 r/min、37℃、5% CO2培养；培养48 h细胞密度达2.0×106个/mL以上。
2、MDBK-V悬浮细胞按密度0.4×106~0.6×106个/mL接种至生物反应器培养，起始培养体积2 L。参数设定：转速60 r/min、温度37℃、溶氧30%、pH7.2。每24 h计数细胞密度和活力，48 h细胞密度达1.6×106个/mL，补加低血清培养基2至3 L，反应器参数：转速70 r/min、温度37℃、pH7.0-7.2，提高空气和氧气通气量保持溶氧50%左右。培养至72 h细胞密度达5.7×106个/mL，补加低血清培养基2至4 L；反应器参数：转速70 r/min、温度37℃、溶氧60%、pH7.0-7.2，培养至96 h密度达8.2×106个/mL。
本发明还提供了一种利用所述牛肾细胞培养病毒的方法，所述方法可包括：
C1）在所述牛肾细胞上接种病毒；
C2）培养接种病毒后的牛肾细胞，得到培养液；
C3）从所述培养液中分离得到所述病毒。
上述方法中，C2）中所述培养可为按照任一所述的牛肾细胞的培养方法进行培养。
进一步地，在步骤C1）前，将所述牛肾细胞MDBK-V培养至2×106~7×106个/mL以上。
进一步地，步骤C1）所述接种的量可为0.01~1 MOI。
进一步地，步骤C2）所述培养可为培养48~96小时。
所述病毒培养过程采用高密度培养，所述培养基采用低血清培养基1。
上述方法中，所述病毒可为牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒1型或牛病毒性腹泻病毒2型。
本文所述低血清培养基1可为含2%胎牛血清的悬浮培养基。
本文所述悬浮培养基可为商品化产品：购自健顺生物，货号：66001-005。
本文所述培养基（如混合的培养液、低血清培养基）中还可含有0.03% PF68，PF68为常规发酵、细胞培养常用消泡剂。
本发明还提供了所述牛肾细胞的下述任一种应用：
D1）在病毒培养中的应用；
D2）在制备病毒或疫苗中的应用；
D3）在牛传染性鼻气管炎病毒培养、牛副流感3型病毒培养、牛病毒性腹泻病毒1型病毒培养、牛病毒性腹泻病毒2型病毒培养或牛呼吸道合胞体病毒培养中的应用；
D4）在制备牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感3型病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛病毒性腹泻病毒2型或牛呼吸道合胞体病毒中的应用；
D5）在制备牛传染性鼻气管炎病毒疫苗、牛副流感3型病毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒1型疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型疫苗或牛呼吸道合胞体病毒疫苗中的应用。
在本发明的一个实施方案中，所述低血清悬浮驯化包括如下步骤：
1、MDBK克隆细胞株悬浮驯化
（1）将MDBK克隆细胞株用胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶溶液）消化，然后用DMEM培养基在37℃、5% CO2传代培养48~72小时，轻摇细胞瓶收集细胞转入摇瓶，37℃、70 r/min、5% CO2培养48~72小时。上述DMEM培养基含10%胎牛血清和0.03% PF68。
（2）将（1）中收获的细胞用DMEM培养基（Gibco公司，货号：12100-061）和DMEM悬浮培养基（健顺生物，货号：66001-005）按体积比1：1比例混合的培养液调整至0.4×106~0.8×106个/mL，37℃、70 r/min、5% CO2培养48~72小时。上述混合的培养液含10%胎牛血清和0.03% PF68。
（3）将步骤（2）获得的细胞按照步骤（2）的相同培养方法培养三代。
（4）将（3）中收获的细胞用低血清培养基2调整至0.4×106~0.8×106个/mL，37℃、70 r/min、5% CO2培养48~72小时。
（5）将步骤（4）获得的细胞再按照上述步骤（4）中相同的培养方法培养三代，细胞呈圆形、透亮、分散生长，细胞密度在1×106个/mL以上，即得MDBK悬浮细胞株。
所述低血清培养基2为由DMEM悬浮培养基、胎牛血清和PF68制成的胎牛血清体积百分含量为2%且PF68的体积百分含量为0.03%的液体培养基。
细胞培养液离心收集细胞，冻存悬浮细胞种子，冻存液配方：60% DMEM+30% 胎牛血清+10% DMSO，细胞活力为90%以上，1.5mL/管，每管至少含1.0×107个细胞。
2、MDBK悬浮细胞低血清悬浮驯化
（1）用低血清培养基2将步骤1获得的细胞密度调整至0.4×106~0.8×106个/mL，用摇瓶在80 r/min、37 ℃、5% CO2培养48~72小时。
（2）上述步骤（1）中得到的细胞培养液吸入至摇瓶，加等体积低血清培养基2，37℃、70~90 r/min、5% CO2培养72~96小时；细胞密度达到1×106个/mL以上时，按照细胞密度为0.4×106~0.8×106个/mL传代。细胞种子密度为1.4×107个/mL，细胞活力为94.8%，每支1.5 mL。
与贴壁细胞相比，纯悬浮细胞尽量减少或避免了血清的添加，同时也减少了血清对后续生物制品的影响，使其具有更好的传代稳定性和安全性。而且纯悬浮细胞培养使细胞实现了工业化和规模化生产，缩短了生产周期，节约了生产成本。
本发明首先对贴壁型MDBK细胞进行基因改造，在MDBK细胞中转入ST6GalNac V基因得到MDBK克隆细胞株，进一步对所述MDBK克隆细胞株进行低血清悬浮驯化，获得MDBK-V悬浮细胞系，该细胞在生物反应器中可进行高密度悬浮培养。本发明进一步开发了MDBK-V细胞的高密度培养方法以及利用本发明MDBK-V细胞培养病毒的方法。
本发明获得的MDBK悬浮细胞（MDBK-V）可在反应器中进行低血清高密度悬浮培养，降低血清使用，降低生产成本，细胞密度可达7.0×106个/ml以上，活力90%以上，在5 L的反应器（实际最高培养体积4 L）中细胞密度至少可达3.0×1010个，相当于600个3 L滚瓶收获的细胞数量；病毒培养至少比贴壁培养提高1~2个滴度。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明中将贴壁细胞驯化为单个悬浮细胞，实现细胞的纯悬浮培养，并提高细胞活率。且使用该细胞进行纯悬浮培养，可以明显提升所获得的细胞密度和病毒滴度，降低病毒培养的生产成本，提高疫苗生产效率和安全性。
保藏说明
细胞株名称：牛肾细胞
拉丁名：Madin Darby Bovine Kidney
分类命名：牛肾细胞
细胞株编号：MDBK-V
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年8月10日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.45244。
附图说明
图1为驯化前MDBK细胞和MDBK-V悬浮细胞的形态对比图；其中，A为MDBK贴壁细胞（40×），B为MDBK-V悬浮细胞（40×）。
图2为细胞株的RT-PCR鉴定；其中，M：DL2000Marker，1：MDBK克隆细胞株-1；2：MDBK克隆细胞株-2；3：MDBK克隆细胞株-3；4：MDBK克隆细胞株-4；5：MDBK克隆细胞株-5；6：MDBK母本细胞；7：阴性对照。
图3为驯化前MDBK细胞和MDBK-V细胞核型分析对比图；其中，A为驯化前MDBK细胞，B为MDBK-V细胞。
图4为实施例2中培养方式1下MDBK-V悬浮细胞生物反应器培养生长曲线。
图5为实施例2中培养方式2下MDBK-V悬浮细胞生物反应器培养生长曲线。
图6为MDBK悬浮细胞低血清培养驯化结果。
图7为MDBK-V悬浮细胞的无菌和支原体检验结果。
图8为细胞观察及红细胞吸附试验记录结果。
图9为牛病毒性腹泻病毒荧光抗体试验记录结果。
图10为MDBK-V悬浮细胞生物反应器培养细胞计数及观察结果。
图11为MDBK-V悬浮细胞生物反应器高密度培养细胞计数及观察结果。
图12为MDBK-V悬浮细胞生物反应器高密度培养结果。
图13为不同细胞对牛传染性鼻气管炎病毒增殖能力的对比。
图14为不同细胞对牛副流感3型病毒增殖能力的对比。
图15为不同细胞对牛病毒性腹泻病毒1型增殖能力的对比。
图16为不同细胞对牛病毒性腹泻病毒2型增殖能力的对比。
图17为不同细胞对牛呼吸道合胞体病毒增殖能力的对比。
图18为不同代次MDBK-V悬浮细胞对牛病毒性腹泻病毒1型增殖能力的对比。
图19为纯悬浮培养、微载体培养和贴壁培养的对比。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的牛肾细胞MDBK-V CGMCC No.45244已于2022年08月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC No.45244。牛肾细胞MDBK-V，简称为MDBK-V。
下述实施例中，涉及的生物材料、试剂、仪器设备为：
细胞株：MDBK是一种可传代的牛肾细胞系，MDBK贴壁细胞为美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）的菌株，保藏编号为ATCC CCL-22。
DMEM培养基为商品化产品：Gibco公司产品，货号：12100-061；可根据需要加入2%~10%胎牛血清。
DMEM悬浮培养基为商品化产品：购自健顺生物，货号：66001-005。
胎牛血清：内蒙古奥普赛生物科技有限公司产品，货号：BS-1101。
低血清培养基1：由上述DMEM悬浮培养基和胎牛血清制成的胎牛血清体积百分含量为2%的液体培养基。
胰蛋白酶：Gibco公司产品，货号：27250-018，使用时配制成0.25%胰蛋白酶溶液。
10% PLURONIC F-68（简称PF68）：Gibco公司产品，货号：24040-032。
低血清培养基2：由上述DMEM悬浮培养基、胎牛血清和PF68制成的胎牛血清体积百分含量为2%且PF68的体积百分含量为0.03%的液体培养基。
ST6GalNac V重组质粒：购自Genecopoeia公司（货号：EX-V1581-M03），该重组质粒骨架采用puc19质粒，插入的外源基因为ST6GalNac V。
ST6GalNac V基因的核苷酸序列为GenBank Accession No. NM_030965.2的第879-1438位。
大肠杆菌DH5α感受态细胞：批号AJ11854A；pMD18-T载体，货号D101A，均购自Takara公司。
G418（遗传霉素）：购自Invitrogen公司。
转染试剂Lipofectamine 2000 Regeant：购自Gibco公司，货号11668019。
EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix：购自北京全式金生物技术有限公司，货号：AE411-02。
TransZol Up Plus RNA Kit：购自北京全式金生物技术有限公司，货号：ER501-01。
下述实施例中的TG培养基组成为：胰酪蛋白胨、酵母浸出粉、无水葡萄糖、硫乙醇酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐、氯化钠、新配制的0.1%刃天青溶液、琼脂。
下述实施例中的GA培养基组成为：酪蛋白胨、酵母浸出粉、无水葡萄糖、L-半胱氨酸盐酸盐、氯化钠、琼脂。
下述实施例中的TBS培养基组成为：葡萄糖（含1个结晶水）、胰酪蛋白胨、大豆粉木瓜蛋白酶消化物（大豆胨）、磷酸氢二钾（含3个结晶水）、氯化钠。
生物反应器，sartorius stedim，型号：Biostat®B CC 5L，最大培养体积5L。
CO2培养箱，ESCO，型号：CCL-170B-8。
低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号：SC-3616。
倒置显微镜，舜宇光学科技集团，型号：XD系列。
T75细胞培养瓶，Corning，货号：430720。
悬浮培养瓶，Corning，规格：500 mL，1000 mL。
移液器，eppendorf，规格：20~200 μL，100~1000 μL。
数显恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号：HHS-21-24。
50 mL离心管，Corning，货号：430829。
洁净工作台，苏净安泰，型号：SW-CJ-2FD。
实施例1、MDBK-V悬浮细胞制备及驯化
1、MDBK克隆细胞株获得
MDBK细胞复苏：将MDBK细胞（ATCC CCL-22）进行复苏，细胞活力为94%，该细胞经无菌、支原体、外源病毒检验均合格，培养液为含10%胎牛血清的DMEM，37℃、5% CO2培养48 h形成了致密单层，细胞边缘清晰，呈上皮细胞样，按1:4比例分瓶传代，见图1中A。
转染：接种约0.5×106个MDBK细胞于T75细胞培养瓶中，待细胞长至80%～90%时可用于转染，ST6GalNac V重组质粒采用Lipofectamine 2000 Regeant转染试剂按照转染说明书转染进入MDBK细胞。
阳性克隆的筛选：转染后48 h，将细胞用胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶溶液）消化，均匀铺于24孔板中，用含G418的10%胎牛血清DMEM培养基继续培养，间隔72～96小时换一次液，持续培养，通过G418抗性筛选，有G418抗性的细胞生长，无G418抗性的细胞死亡。
收集有G418抗性的细胞，采用有限稀释法，挑选生长状态较好的单克隆细胞，继续用有限稀释法筛选单个能稳定表达ST6GalNac V基因的细胞。有限稀释法广泛用于细胞克隆的筛选，通过将细胞稀释不同梯度，接种具有相应抗性的平板上，克隆成功的具有抗性的可以生长，未克隆的不具有抗性，不能生长，挑取生长出的单克隆细胞，按照上述方法继续进行操作，直至挑取的单克隆细胞阳性孔率为100%为止。
阳性克隆细胞的冻存：本研究共挑取阳性克隆株5株，分别命名为MDBK克隆细胞株-1、MDBK克隆细胞株-2、MDBK克隆细胞株-3、MDBK克隆细胞株-4、MDBK克隆细胞株-5。阳性克隆细胞用胰蛋白酶消化后扩大培养并采用常规方法冻存细胞。上述扩大培养液为DMEM培养基中含有0.8 mg/ml G418和10%胎牛血清。
MDBK克隆细胞株RT-PCR鉴定：MDBK克隆细胞株-1、MDBK克隆细胞株-2、MDBK克隆细胞株-3、MDBK克隆细胞株-4、MDBK克隆细胞株-5和MDBK母本细胞使用TransZol Up PlusRNA Kit取总RNA，以总RNA为模板，利用EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix进行检测，引物序列（引物P1、P2为ST6GalNac V基因的上下游引物）如下，由上海生工生物有限公司合成，扩增的目的片段大小560 bp。
P1（SEQ ID No.1）：5’-TTACTCGCCACAAGATGCTG-3’；
P2（SEQ ID No.2）：5’-TGCACTGCTTTGTCACCC-3’。
反应体系：2×ES One-Step Reaction Mix 10 µL；EasyScript One-Step EnzymeMix 0.4 µL；P1（10 µmol/L） 0.4 µL；P2（10mol/L） 0.4 µL；总RNA（233.7ng/µL） 2 µL；Rnase free water 6.8 µL，反应体系20 µL。
反应条件：45℃反转录30分钟；94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。
结果判定：阳性对照出现一条560 bp的条带，阴性对照无任何条带，试验成立。如果样品中出现和阳性对照大小一致条带，判为阳性；如果样品中没有出现560 bp的特异性条带，判为阴性。
扩增产物进行琼脂糖（10 g/L）凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电泳条件为120V、30 min，10 μL点样电泳，利用凝胶成像系统检测分析，结果见图2，说明MDBK克隆细胞株-1、MDBK克隆细胞株-2、MDBK克隆细胞株-3、MDBK克隆细胞株-4、MDBK克隆细胞株-5均成功插入了ST6GalNac V基因。
2、MDBK克隆细胞株悬浮驯化
2.1 将MDBK克隆细胞株用胰蛋白酶（0.25%胰蛋白酶溶液）消化，然后用DMEM培养基在37℃、5% CO2传代培养48~72小时，轻摇细胞瓶收集细胞转入摇瓶，37℃、70 r/min、5%CO2培养48~72小时。上述DMEM培养基含10%胎牛血清和0.03% PF68。
2.2 将2.1中收获的细胞用DMEM培养基（Gibco公司，货号：12100-061）和DMEM悬浮培养基（健顺生物，货号：66001-005）按体积比1：1比例混合的培养液调整至0.4×106~0.8×106个/mL，37℃、70 r/min、5% CO2培养48~72小时。上述混合的培养液含10%胎牛血清和0.03% PF68。
2.3 将步骤2.2获得的细胞按照步骤2.2的相同培养方法培养三代。
2.4 将2.3中收获的细胞用低血清培养基2调整至0.4×106~0.8×106个/mL，37℃、70 r/min、5% CO2培养48~72小时。
2.5 将步骤2.4获得的细胞再按照上述步骤2.4中相同的培养方法培养三代，细胞呈圆形、透亮、分散生长，细胞密度在1×106个/mL以上，即得MDBK悬浮细胞株，见图1中B。
细胞培养液离心收集细胞，冻存悬浮细胞种子，冻存液配方：60% DMEM+30% 胎牛血清+10% DMSO，细胞活力为90%以上，1.5mL/管，每管至少含1.0×107个细胞。
3、MDBK悬浮细胞低血清悬浮驯化
3.1 用低血清培养基2将步骤2获得的细胞密度调整至0.4×106~0.8×106个/mL，用摇瓶在80 r/min、37 ℃、5% CO2培养48~72小时。
3.2 上述步骤3.1中得到的细胞培养液吸入至摇瓶，加等体积低血清培养基2，37℃、70~90 r/min、5% CO2培养72~96小时；细胞密度达到1×106个/mL以上时，按照细胞密度为0.4×106~0.8×106个/mL传代。细胞种子密度为1.4×107个/mL，细胞活力为94.8%，每支1.5 mL。
按照步骤2、3的方法分别驯化MDBK克隆细胞株-1株~5株10~20代，驯化结果见图6。
MDBK克隆细胞株-1、MDBK克隆细胞株-3、MDBK克隆细胞株-2、MDBK克隆细胞株-5细胞经传代成功驯化，细胞呈圆形、透亮、分散生长，细胞密度在1×106/mL以上，说明MDBK悬浮细胞已适应低血清培养，冻存该阶段细胞种子，将MDBK克隆细胞株-3命名为MDBK-V悬浮细胞株。如图6和图1中B所示，驯化成功的MDBK-V悬浮细胞株的细胞形态呈圆形、透亮、分散生长。驯化前MDBK细胞和MDBK-V细胞核型分析对比如图3所示。
MDBK克隆细胞株-4株驯化结果不理想，细胞驯化20代细胞呈聚集或成团生长，细胞生长缓慢，细胞数量较低。
4、细胞株保藏
MDBK-V悬浮细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.45244，保藏日期：2022年08月10日，分类命名为：牛肾细胞，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。
5、MDBK-V悬浮细胞株鉴定
5.1、纯净性检验：根据《中国兽药典》“生产用细胞标准”进行鉴定。
5.2、无菌检验：MDBK-V悬浮细胞培养的上清液接种到TG、GA和TBS培养基培养均为阴性，见图7。
5.3、支原体检验：MDBK-V悬浮细胞冻融一次上清液接种到支原体液体培养基和支原体固体培养基中培养均为阴性，见图7。图7中，“+”表示阳性，“-”表示阴性；支原体液体培养基和支原体固体培养基是指根据《中国兽药典》附录进行配制的培养基。
5.4、外源病毒检验：MDBK-V悬浮细胞经致细胞病变检查法、红细胞凝集和红细胞吸附性外源病毒检查法、荧光抗体检查法检验均为阴性。
致细胞病变检查法、红细胞凝集和红细胞吸附性外源病毒检查法、荧光抗体检查法均为《中国兽药典》附录中规定的非禽源细胞外源病毒检测的常规方法。
5.4.1、细胞检查法：将MDBK-V悬浮细胞接种贴壁型MDBK细胞单层，观察7日，MDBK细胞上未出现细胞病变，未接种的正常MDBK细胞，也未出现细胞病变；同时加入0.5%豚鼠红细胞和0.5%鸡红细胞悬液，显微镜下检查，接种的MDBK细胞上未出现红细胞吸附现象，未接种的正常MDBK细胞也未出现红细胞吸附现象，结果见图8。
5.4.2、牛病毒性腹泻病毒荧光抗体检查法：将MDBK-V悬浮细胞接种贴壁型MDBK细胞单层，培养4-7日后用于荧光抗体检查。阳性对照出现特异性荧光，未接种MDBK-V悬浮细胞的正常MDBK细胞无荧光，接种MDBK-V悬浮细胞的MDBK细胞未出现荧光，见图9。
实施例2、MDBK-V悬浮细胞高密度培养
本实施例所用低血清培养基2均为含有2%胎牛血清和0.03% PF68的DMEM悬浮培养基。
复苏一支MDBK-V悬浮细胞，用50 mL低血清培养基2，置于70 r/min、37℃、5% CO2的条件下培养72~96 h，使其细胞密度达1×106个/mL，用低血清培养基2稀释成100 mL，用悬浮培养瓶扩大培养，稀释后细胞密度为0.4×106~0.6×106/mL，培养条件：60 r/min，37℃、5% CO2培养；培养48~72 h加低血清培养基2至1000 mL分两个悬浮培养瓶扩大培养，每瓶500 mL，细胞密度为0.4×106~0.6×106个/mL。培养条件：60 r/min、37℃、5% CO2培养；培养48 h细胞密度达2.0×106个/mL以上，一部分转入生物反应器培养，剩余部分以0.4×106~0.6×106个/mL密度连续传代培养。进一步考察两种转入生物反应器培养方式。
转入生物反应器培养方式1：用低血清培养基2将上述悬浮培养MDBK-V细胞以密度0.4×106~0.6×106个/mL接种至生物反应器，体积为4 L。反应器参数：转速60 r/min、温度37℃、溶氧30~40%、pH7.0-7.2 。每24小时取样计数，考察结果见图10，生长曲线见图4。
转入生物反应器培养方式2：MDBK-V悬浮细胞按密度0.4×106~0.6×106个/mL接种至生物反应器培养，起始培养体积2 L。参数设定：转速60 r/min、温度37℃、溶氧30%、pH7.2。每24 h计数细胞密度和活力，48 h细胞密度达1.6×106个/mL，补加低血清培养基2至3 L，反应器参数：转速70 r/min、温度37℃、pH7.0-7.2，提高空气和氧气通气量保持溶氧50%左右。培养至72 h细胞密度达5.7×106个/mL，补加低血清培养基2至4 L；反应器参数：转速70 r/min、温度37℃、溶氧60%、pH7.0-7.2，培养至96 h密度达8.2×106个/mL，见图11，生长曲线见图5。
综上，常规培养时接种密度0.5×106个/mL，培养96 h细胞密度2.9×106个/mL，约生长6倍，细胞活力为91%。而流加培养接种密度0.5×106个/mL，起始培养体积2 L，培养96h细胞密度8.4×106个/mL，约生长17倍，细胞活力为95%。由此可见，流加培养可以提高细胞生长效率，更适合MDBK-V悬浮细胞生物反应器的高密度培养，按照此培养工艺连续培养3批，结果见图12。
为了体现尽量减少培养条件造成的误差，以下实施例的病毒培养方法中在细胞接种病毒后的培养方法尽量参照实施例2的培养方式2培养，由于微载体培养方式与悬浮细胞的培养方式较容易达到相近的条件，对于贴壁细胞的培养是尽量一致的基础上（例如培养体积、接种密度、pH、接毒比例等），但像溶氧控制因悬浮培养和贴壁培养的差异是难以控制一致的，但也尽量满足贴壁培养的溶氧需求，以比较悬浮培养、贴壁培养对病毒培养的影响。
实施例3、牛传染性鼻气管炎病毒培养
牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）分别接种驯化细胞株（MDBK-V悬浮细胞）、驯化失败的克隆细胞株（MDBK克隆细胞株-4和母细胞（MDBK细胞），按照0.01 MOI的接种量接种（接种时的细胞密度见图13）MDBK-V悬浮细胞、MDBK克隆细胞株-4、MDBK细胞株，培养72小时，当细胞达到80%以上病变时收获，MDBK-V悬浮细胞病毒含量达到109.0TCID50/mL，MDBK细胞病毒含量达到108.0TCID50/mL，单位体积病毒产量可比驯化前提高9倍，是MDBK克隆细胞株-2的1000倍。结果见图13。
实施例4、牛副流感3型病毒培养
牛副流感3型病毒（BPI3）分别接种驯化细胞株（MDBK-V悬浮细胞）、驯化失败的克隆细胞株（MDBK克隆细胞株-4）和母细胞（MDBK细胞），按照0.01 MOI的接种量接种（接种时的细胞密度见图14）MDBK-V悬浮细胞、MDBK克隆细胞株-4、MDBK细胞株，培养72小时，当细胞达到80%以上病变时收获，MDBK-V悬浮细胞病毒含量达到109.0TCID50/mL，MDBK细胞细胞病毒含量达到108.33TCID50/mL，单位体积病毒产量可比驯化前提高约4.7倍，结果见图14。
实施例5、牛病毒性腹泻病毒1型病毒培养
牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）分别接种驯化细胞株（MDBK-V悬浮细胞）、驯化失败的克隆细胞株（MDBK克隆细胞株-4）和母细胞（MDBK细胞），按照0.5 MOI的接种量接种（接种时的细胞密度见图15）MDBK-V悬浮细胞、MDBK克隆细胞株-2、MDBK细胞，培养72小时，当细胞达到80%以上病变时收获，MDBK-V悬浮细胞病毒含量达到106.83TCID50/mL，MDBK细胞细胞病毒含量达到106.0TCID50/mL，单位体积病毒产量可比驯化前提高约6.7倍，结果见图15。
实施例6、牛病毒性腹泻病毒2型病毒培养
牛病毒性腹泻病毒2型（BVDV-2）分别接种驯化细胞株（MDBK-V悬浮细胞）、驯化失败的克隆细胞株（MDBK克隆细胞株-4）和母细胞（MDBK细胞株），按照0.5 MOI的接种量接种（接种时的细胞密度见图16）MDBK-V悬浮细胞、MDBK克隆细胞株-4、MDBK细胞株，培养72小时，当细胞达到80%以上病变时收获，MDBK-V悬浮细胞病毒含量可达到106.83TCID50/mL，MDBK细胞细胞病毒含量达到106.0TCID50/mL，单位体积病毒产量可比驯化前提高约6.7倍，见图16。
实施例7、牛呼吸道合胞体病毒培养
牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）分别接种驯化细胞株（MDBK-V悬浮细胞）、驯化失败的克隆细胞株（MDBK克隆细胞株-2）和母细胞（MDBK细胞株），按照0.5 MOI的接种量接种（接种时的细胞密度见图17）MDBK-V悬浮细胞、MDBK克隆细胞株-2、MDBK细胞株，培养72小时，当细胞达到80%以上病变时收获，MDBK-V悬浮细胞病毒含量可达到107.5TCID50/mL，MDBK细胞细胞病毒含量达到106.0TCID50/mL，单位体积病毒产量可比驯化前提高约31倍，见图17。
从图13、14、15、16、17可知，将同样经过ST6GalNac V基因改造的MDBK-V悬浮细胞和MDBK克隆细胞株-2相比，其获得病毒滴度差异较大，说明并不是经过ST6GalNac V基因改造后就能获得悬浮效果好的悬浮细胞，同时也说明本发明的MDBK-V悬浮细胞不仅悬浮效果好，而且病毒培养的滴度也高，培养病毒的产量高。
实施例8、不同代次细胞对牛病毒性腹泻1型病毒增殖的影响研究
采用不同代次的纯悬浮MDBK-V细胞株对牛病毒性腹泻病毒1型进行培养，结果表明MDBK-V细胞株生物特性稳定，不同代次的细胞均可适应病毒生长。具体结果见图18。
实施例9、不同MDBK细胞培养不同病毒对病毒毒价的影响比较研究
在培养条件尽量一致的情况下，分别进行贴壁培养、微载体培养和纯悬浮培养，对比培养数据如图19。
如图19所示，本实施例的悬浮细胞MDBK-V细胞株不仅能进行纯悬浮培养，对牛传染性鼻气管炎病毒培养的病毒滴度达109.5TCID50/ml，与微载体培养体系的相近；而对牛病毒性腹泻病毒1型、牛病毒性腹泻病毒2型培养的病毒滴度分别为106.83TCID50/ml、106.83TCID50/ml，高于微载体培养和贴壁培养的病毒滴度。由于本实施例9中的微载体培养采用目前较成熟的微载体培养体系，通过借助颗粒载体，使细胞生长在颗粒载体上进而悬浮在培养基中，但此法规模放大难度较大，操作相对复杂，培养成本较高，而本发明的MDBK-V细胞株不仅方便放大培养，而且操作方便，能方便培养病毒，降低成本。
贴壁型MDBK细胞正常生长需要由血清中吸取大量的必要物质，一般来说满足细胞正常生长的血清添加比例为10%，而要实现细胞培养中血清由10%降至5%，最终降至2%，难度非常大，需要对细胞改造并反复驯化培养，才能获得适应低血清培养的细胞株。同时血清属于外源蛋白，当疫苗中含有外源蛋白越高，产品的安全性就越差，甚至当注射动物时，会产生较高过敏率。然而本发明通过对贴壁型MDBK细胞进行基因改造和低血清悬浮驯化，筛选得到了一株能适应低血清悬浮培养的细胞株，不仅能实现低血清高密度纯悬浮培养，而且能大大提高病毒滴度，降低病毒培养成本，提高疫苗的生产效率，而在降低血清使用的同时，也提高疫苗产品的安全性。
本发明获得的MDBK悬浮细胞可在反应器中进行低血清高密度悬浮培养，降低血清使用，降低生产成本，细胞密度可达7.0×106个/ml以上，活力90%以上，在5L的反应器（实际最高培养体积4L）至少细胞密度可达3.0×1010个，相当于600个3L滚瓶收获的细胞数量；病毒培养至少比贴壁培养提高1~2个滴度。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.牛肾细胞，其特征在于，所述牛肾细胞名称为MDBK-V，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.45244。
2.权利要求1所述牛肾细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A1）将带有ST6GalNac V基因的重组质粒转染至MDBK细胞中，获得表达ST6GalNac V基因的重组细胞；
A2）对所述重组细胞进行低血清悬浮驯化获得所述牛肾细胞MDBK-V；所述低血清悬浮驯化包括在含2%胎牛血清的培养基中进行培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述低血清悬浮驯化包括如下步骤：
B1）将所述重组细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行传代培养；
B2）用由DMEM培养基与DMEM悬浮培养基混合而成的混合培养液进行传代培养，所述混合培养液中含10%胎牛血清；
B3）用低血清培养基传代培养，获得MDBK悬浮细胞株；
B4）用低血清培养基传代培养所述MDBK悬浮细胞株，驯化后获得所述牛肾细胞MDBK-V；
所述低血清培养基为含2%胎牛血清的培养基。
4.权利要求1所述牛肾细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括：将所述牛肾细胞在低血清培养基中悬浮培养扩增，然后接种至生物反应器，继续用低血清培养基在温度37℃、CO2浓度为5%、溶氧30%~40%和pH 7.0-7.2的条件下培养，所述低血清培养基为含2%胎牛血清的培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在接种至生物反应器后的培养过程中，补加所述低血清培养基，然后在温度37℃、溶氧50%-60%和pH 7.0-7.2的条件下培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述补加低血清培养基的方法为：在接种至生物反应器后培养40~48小时补加所述低血清培养基，在温度37℃、CO2浓度为5%、溶氧50%和pH 7.0-7.2的条件下继续培养至72小时，然后在温度37℃、CO2浓度为5%、溶氧60%和pH 7.0-7.2的条件下继续培养至96小时。
7.一种利用权利要求1所述牛肾细胞培养病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
C1）在所述牛肾细胞上接种病毒；
C2）培养接种病毒后的牛肾细胞，得到培养液；
C3）从所述培养液中分离得到所述病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，C2）中所述培养为按照权利要求4-6中任一所述的方法进行培养。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述病毒为牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒1型或牛病毒性腹泻病毒2型。
10.权利要求1所述的牛肾细胞的下述任一种应用：
D1）在病毒培养中的应用；
D2）在制备病毒或疫苗中的应用；
D3）在牛传染性鼻气管炎病毒培养、牛副流感3型病毒培养、牛病毒性腹泻病毒1型病毒培养、牛病毒性腹泻病毒2型病毒培养或牛呼吸道合胞体病毒培养中的应用；
D4）在制备牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感3型病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛病毒性腹泻病毒2型或牛呼吸道合胞体病毒中的应用；
D5）在制备牛传染性鼻气管炎病毒疫苗、牛副流感3型病毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒1型疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型疫苗或牛呼吸道合胞体病毒疫苗中的应用。
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