TWI748992B - 測試雄性生育力狀態之方法及檢驗套組 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供用於判定男性生育力狀態之方法。該方法包含在誘發精子獲能之後判定GM1局部化型態、鑑定各種型態之百分比,特別是[(AA+APM)/GM1局部化型態總數]之比、及判定對經誘發之獲能的反應之某些GM1局部化型態百分比是否改變。基於某些對經誘發之獲能的反應的型態之局部化型態百分比改變,其單獨或併以其他精子性質,可鑑定男性生育力狀態。
Description
本申請案主張於2016年2月17日申請之美國臨時申請案案號62/296,420、2016年4月14日申請之美國臨時申請案案號62/322,252,2016年4月28日申請之美國臨時申請案案號62/328,890中的利益,彼等各者均全部併入。
本發明大致上關於男性生育力之領域,且更特定言之係關於基於經誘發之精子獲能後的GM1神經節苷脂分布型態的測試男性生育力狀態。
在美國,10%的伴侶有不孕相關醫療就診,而有40%的不孕與男性相關。就全球而言,這意味著超過7300萬不育伴侶。典型的男性生殖健康檢查評估精子數量、外觀和活動力(motility)。遺憾的是,一半的不育男性
具有的精子符合這些描述性標準的正常參數,並且僅在自然受孕和人工協助生殖的技術(諸如子宮內授精(IUI))兩者均重複地失敗之後被確定為具有“特發性不孕症(idiopathic infertility)”。因為每個失敗的周期都會對伴侶造成巨大的生理、情緒和財務損失,且美國健保系統每年花費超過50億美元,因此對精子功能的實際測試非常需要。精子功能的數據將允許臨床醫生指導他們的患者進行給予他們最好受孕機會之人工協助生殖的技術。
進入女性生殖道時,精子不能立即能夠使卵子受精。相反地,它們必須經歷被稱為“獲能(capacitation)”的功能成熟過程。此過程依賴於它們藉由在其細胞膜中具有特定變化來反應特定刺激物的能力,即對暴露於獲能刺激反應的神經節苷脂GM1的分布型態改變。
各種GM1局部化型態業經鑑定並與獲能或非獲能建立相關性。特別地,頂端頂體(AA)GM1局部化型態和頂體質膜(APM)GM1局部化型態業經與牛和人精子中的獲能建立相關性。精子獲能可以Cap-ScoreTM值來定量表示(Cap-ScoreTM值係經由Cap-ScoreTM精子功能檢驗(“Cap-ScoreTM Test”或“Cap-Score(獲能分數)”)而產生),定義係([頂端頂體(AA)GM1局部化型態數量+頂體質膜(APM)GM1局部化型態數量]/經標記之GM1的局部化型態的總數量),其中每個局部化型態數係經測量且接著最終轉化成百分比得分。除了APM GM1局部化型態
和AA GM1局部化型態,其他經標記的局部化型態包括襯細胞(lined-cell)GM1局部化型態、中間(INTER)GM1局部化型態、頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、赤道節段(ES)GM1局部化型態、和擴散(DIFF)GM1局部化型態。(Travis等人,“Impacts of common semen handling methods on sperm function,”The Journal of Urology,195(4),e909(2016))。
在一個實施態樣中,在本文中所揭示者係用於判定男性生育力狀態之方法及套組。在一個實施態樣中,本揭露描述基於對經體外誘發獲能反應的某些GM1局部化型態數量變化來鑑定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,GM1局部化型態是襯細胞GM1局部化型態。
在本文中所揭示之實施態樣係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包含下列步驟。經體外獲能之精子細胞的樣品係以螢光標記來處理。獲得一或多個經獲能之螢光影像,其中該等圖像展示與經螢光標記的經體外獲能之精子細胞相關聯之一或多個GM1局部化型態。頂端頂體(AA)GM1局部化型態和頂體質膜(APM)GM1局部化型態係各經指派至經獲能態,且襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態係經指派至非經獲能態,其各展示在經獲能之螢光影像
中。測量GM1局部化型態數量,該等型態包含AA GM1局部化型態、APM GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記之GM1局部化型態,針對經螢光標記的經體外獲能之精子細胞,展示在經獲能之螢光影像以判定[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比。在一個實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參
考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示異常男性生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在本文中所揭示之另一實施態樣係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括將來自男性的精子樣本之第一部分暴露至非獲能條件以獲得體外非獲能精子樣本;將該精子樣本之第二部分暴露至獲能條件以獲得經體外獲能之精子樣本;將該體外非獲能精子樣本及該經體外獲能之精子樣本以固定劑固定至少下列之時段:一小時、二小時、四小時、八小時、十二小時、十八小時或二十四小時;將該經固定的體外非獲能精子樣本及該經固定的經體外獲能之精子樣本以針對GM1局部化型態之標記分子處理,其中該標記分子具有可偵測性標記;針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本,鑑定多於一種經標記之GM1局部化型態,該GM1經標記之局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記的GM1局部化型態;比較針對該經標記之經固定的體外非獲
能精子樣本的該經標記之GM1局部化型態與針對該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的該經標記之GM1局部化型態;基於該比較,將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態指派至非經獲能態;及基於針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的經鑑定之GM1經標記之局部化型態,表徵該男性之生育力狀態。在一個實施態樣中,表徵步驟包含下列步驟:針對經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關之生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);大於低於參考平均百分比的二個標準偏差表示不孕。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示異常男性生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在一個實施態樣中,在暴露步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用選自用於降低精液黏度的各種試劑之不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。在一些此等實施態樣中,該損害細胞膜用試劑可能可包括(i)蛋白酶;(ii)核酸酶;(iii)黏液分解劑;(iv)脂酶;(v)酯酶及(vi)醣苷水解酶。在一些實施態樣中,該鑑定步驟係經重複直至襯細胞GM1局部化型態數目係實質上恆定為止。在一個此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對經標記之經固定的經體外獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數小於5%、小於經標記之細胞的總數的3%;或範圍為經標記之細胞的總數的1%至5%、2至5%。在另一此實施態樣
中,在進行鑑定步驟之後,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數目小於:經標記之細胞的總數之25%、20%、15%或10%;或範圍在經標記之細胞的總數的2%至25%;2%至20%;2至15%;2至10%;2至5%。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。
在另一此實施態樣中,該表徵步驟進一步包括下列步驟:針對經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目;針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目;針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本,計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比;及針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比。
在一個實施態樣中,在本文中所揭示之方法進一步包括下列步驟:比較該經標記之經固定的體外非獲能精子的比與具有已知生育力狀態的經標記之經固定的體外非獲能精子的比;及比較該經標記之經固定的經體外獲
能精子的比與具有已知生育力狀態的經標記之經固定的經體外獲能精子的比。
在本文中所揭示之又另一實施態樣係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括下列步驟:獲得來自男性的精子樣本之第一部分,其業經暴露至體外非獲能條件,於固定劑中固定至少:一小時、二小時、四小時、八小時、十二小時、十八小時或二十四小時,且以針對GM1局部化型態之標記分子處理,其中該標記分子具有可偵測性標記;獲得該精子樣本之第二部分,其業經暴露至體外獲能條件,於固定劑中固定,及以針對GM1局部化型態之標記分子處理;針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本,鑑定多於一種GM1經標記之局部化型態,該GM1經標記之局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記的GM1局部化型態;比較針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的該經標記之GM1局部化型態與針對該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的該經標記之GM1局部化型態;基於該比較,將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態指派至非經獲能態;及基於針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本
的經鑑定之GM1經標記之局部化型態,表徵該男性之生育力狀態。在一個此實施態樣中,該表徵步驟包含下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比,以及基於該比較鑑定生育力閾值。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百
分比表示異常生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在一些實施態樣中,該鑑定步驟係經重複直至襯細胞GM1局部化型態數目係實質上恆定為止。在一個此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對經標記之經固定的經體外獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數小於5%、小於經標記之細胞的總數的3%;或範圍為經標記之細胞的總數的1%至5%、2至5%。在另一此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數目小於:經標記之細胞的總數之25%、20%、15%或10%;或範圍在經標記之細胞的總數的2%至25%;2%至20%;2至15%;2至10%;2至5%。
在此方法的一個實施態樣中,該方法進一步包括下列步驟:針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,及各針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1局部化型態的總數之總和的比。
在另一實施態樣中,該表徵步驟進一步包括下列步驟:比較該經標記之經固定的經體外獲能精子的比與具有已知生育力狀態之男性的經體外獲能精子之GM1局部化型態的比;及比較該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的比與具有已知生育力狀態之男性的GM1局部化型態體外非獲能精子的比。
在本文中所揭示之又再另一實施態樣係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括下列步驟:將來自男性的精子樣本體外暴露至獲能條件;將該經獲能之精子樣本以固定劑固定至少:一小時、二小時、四小時、八小時、十二小時、十八小時或二十四小時;將該經固定的經體外獲能之精子樣本以針對以針對GM1局部化型態之標記分子處理,其中該標記分子具有可偵測性標記;針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,鑑定多於一種GM1經標記之局部化型態,該GM1經標記之局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記的GM1局部化型態;將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態指派至非經獲能態;及表徵該男性之生育力狀態。在一個實施態樣中,該表徵步驟包含下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部
化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差表示不孕。比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比,以及基於該比較鑑定生育力閾值。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示異常男性生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考
百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在一個實施態樣中,在暴露步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用選自用於降低精液黏度的各種試劑之不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。在一些實施態樣中,該損害細胞膜用試劑可能可係選自由下列所組成之群組(i)蛋白酶;(ii)核酸酶;(iii)黏液分解劑;(iv)脂酶;(v)酯酶及(vi)醣苷水解酶。在一些實施態樣中,該鑑定步驟係經重複直至襯細胞GM1局部化型態數目係實質上恆定為止。在一個此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對經標記之經固定的經體外獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數小於5%、小於經標記之細胞的總數的3%;或範圍為經標記之細胞的總數的1%至5%、2至5%。在另一此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數目小於:經標記之細胞的總數之25%、20%、15%或10%;或範圍在經標記之細胞的總數的2%至25%;2%至20%;2至15%;2至10%;2至5%。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。
在此方法的一個實施態樣中,該方法進一步包括下列步驟:比較GM1局部化型態的比與具有已知生育
力狀態之男性的GM1局部化型態的比。在一個此實施態樣中,該比較步驟包括下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,及計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比。
在本文中所揭示之另一實施態樣係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括下列步驟:獲得來自男性的精子樣本之第一部分,其業經暴露至體外獲能條件,於固定劑中固定至少:一小時、二小時、四小時、八小時、十二小時、十八小時或二十四小時,且以針對GM1局部化型態之標記分子染色,其中該標記分子具有可偵測性標記;針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,鑑定多於一種GM1經標記之局部化型態,該GM1局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記的GM1局部化型態;將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態指派至非經獲能態;及表徵該男性之生育力狀態。在一些實施態樣中,表徵步驟包含下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾
值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比,以及基於該比較鑑定生育力閾值。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示異常男性生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在一些實施態樣中,該鑑定步驟係經重複直至襯細胞GM1局部化型態數目係實質上恆定為止。在一個此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對經標記之經固定的經體外獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數小於5%、小於經標記之細胞的總數的3%;或範圍為經標記之細胞的總數的1%至5%、2至5%。在另一此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數目小於:經標記之細胞的總數之25%、20%、15%或10%;或範圍在經標記之細胞的總數的2%至25%;2%至20%;2至15%;2至10%;2至5%。
在此方法的一個實施態樣中,該方法進一步包括下列步驟:比較GM1局部化型態的比與具有已知生育力狀態之男性的GM1局部化型態的比。在一個此實施態樣中,該比較步驟包括下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,及計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比。
在本文中所揭示之另一實施態樣係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括下列步驟:獲得精子樣本,其中該精子樣本之至少部分業經曝露至體外獲能條件以獲得經體外獲能精子、業經曝露至固定劑至少:一小時、二小時、四小時、八小時、十二
小時、十八小時或二十四小時、且業經針對GM1染色;獲得一或多個該精子樣本之精液參數值;基於一或多種GM1經標記之局部化型態來判定該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本之Cap-Score,該GM1經標記之局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體後質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記的GM1局部化型態;及基於所判定之CAP分數及該一或多個所獲得之精液參數來計算該男性之男性生育力指數(MFI)值。在一個實施態樣中,該精子樣本之該一或多個精液參數係選自由下列所組成之群組:原始精子樣本之體積、精子之濃度、精子活動力、及精子之形態。在一些實施態樣中,該鑑定步驟係經重複直至襯細胞GM1局部化型態數目係實質上恆定為止。
在一個此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對經標記之經固定的經體外獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數小於5%、小於經標記之細胞的總數的3%;或範圍為經標記之細胞的總數的1%至5%、2至5%。在另一此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數目小於:經標記之細胞的總數之25%、20%、15%或10%;或範圍在經標記之細胞的總數的2%至25%;2%至20%;2至15%;2至10%;2至5%。
在本文中所述之方法的各種實施態樣中,該
多於一種GM1經標記之局部化型態包含AA GM1局部化型態、APM GM1局部化型態、襯細胞(lined-cell)GM1局部化型態、中間(INTER)GM1局部化型態、頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、赤道節段(ES)GM1局部化型態、和擴散(DIFF)GM1局部化型態。
在一個實施態樣中,將該精子樣本之該第一部分暴露至非獲能條件及將該精子樣本之該第二部分暴露至獲能條件係同時發生。
在本文中所揭示之一個實施態樣中,係一種用於鑑定男性生育力狀態之套組,其包含:圖解,其描繪一或多種經獲能之精子之GM1局部化型態及一或多種非經獲能之精子之GM1局部化型態,其中該經獲能之精子之GM1局部化型態及非經獲能之精子之GM1局部化型態係反映已知生育力狀態;寬孔吸量管,其具有足夠直徑尺寸之孔口以預防精子細胞膜之剪切;一或多個下列者:獲能用培養基、非獲能用培養基、固定劑組成物、用於判定GM1局部化型態之標記用試劑;惟該固定劑組成物不損害精子細胞膜,其中該獲能培養基及非獲能培養基,當體外施加至精子細胞時,製造如圖解中所反映之指示為經獲能之精子之GM1局部化型態及指示為非經獲能之精子之型態。在一個實施態樣中,該套組含有用於處理精子之使用說明以避免損害精子細胞膜。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或
規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。
在本文中所述之某些實施態樣中,該體外獲能條件包括暴露至重碳酸鹽離子、鈣離子、及固醇流出(sterol efflux)之調介物的一或多者。在一些實施態樣中,該固醇流出之調介物係2-羥基丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂質囊胞(phospholipid vesicle)、胎兒臍帶血清超濾液、脂肪酸結合蛋白、或脂質體。在一個實施態樣中,該固醇流出之調介物係2-羥基丙基-β-環糊精。
在一個實施態樣中,該非獲能條件包括缺少暴露至重碳酸鹽離子、鈣離子、及固醇流出之調介物的一或多者。
在本文中所述之某些實施態樣中,該固定劑係醛固定劑。在一個實施態樣中,該固定劑包括聚甲醛、戊二醛或彼等之組合。在某些實施態樣中,該用於GM1之親和力分子係經螢光標記之霍亂菌毒素b次單元。
前述之發明內容及下列用於判定男性生育力狀態之方法及套組的實施態樣詳述,當與所附圖式閱讀時,將更能了解。然而,應了解的是,本發明並不限於所示之該等精確排列及工具。
圖式中:
圖1顯示正常人精子及來自不孕男性精子在非獲能條件下或獲能條件下的GM1的INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES、及DIFF局部化型態;圖2A顯示正常人精子在非獲能條件下的GM1的INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES、及DIFF局部化型態之相對分布;圖2B顯示正常人精子在獲能條件下的GM1的INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES、及DIFF局部化型態之相對分布;圖2C顯示來自不孕男性精子在獲能條件下的GM1的INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES、及DIFF局部化型態之相對分布;圖3顯示結合APM及AA局部化型態相對數目與正常男性組人類精子及不孕男性組人類精子在獲能條件及非獲能條件下培育時間之函數關係,以及各組的男性之臨床結果;圖4顯示在以促進獲能的刺激物來培養來自已知可孕供給者之精子的AA及APM局部化型態百分比;圖5顯示來自疑為次可孕/不孕供給者精子中AA及APM局部化型態百分比與可孕男性統計閾值之比較;以及圖6A、6B、6C、及6D顯示來自不孕男性之精子在獲能條件下的襯細胞GM1局部化型態。
參照所附圖式,更完整說明各種本發明之實施態樣如下。有些且並非所有本發明的實施態樣係予顯示。事實上,本發明之各種實施態樣可以許多不同形式實施且不應限制至明確描述之實施態樣來解讀。應了解的是,本發明至少一些圖式及說明業經簡化以著重在相關於明確了解本發明之元件,而為明確性去除熟悉本技術領域者理解之其他元件,亦可包含本發明之部分。然而,由於此等元件係本技術領域中已熟知,且由於它們不一定有助於更佳了解本發明,此等元素的說明不會在本文中提供。
各個及每個參考文獻在本文中係以引用方式全部併入。
除非在本文中另有指明,否則用語一(a及an)及該(the)不限於一個元件而相反地應解讀為至少一者(at least one)。
約(about)係理解為意指所指涉數值的+及-10%之範圍。然而,使用"約"來指涉數值並不排除單獨所指涉數值之可能性。例如,“約1小時”係理解以為可完全支持“54分鐘”、“1小時”、及“66分鐘”。
本發明係基於某些GM1局部化型態可提供有關男性生育力狀態資訊之觀察。GM1局部化型態的判定係描述於美國專利第7,160,676、7,670,763、及8,367,313號中,彼等之揭露係以引用方式併入本文中。本揭露提供用
於判定男性生育力狀態之方法及套組。在某些實施態樣中,該方法係基於在暴露於體外獲能刺激時某些GM1局部化型態百分比的改變。在某些實施態樣中,該方法係特定基於在暴露於體外獲能刺激時襯細胞GM1局部化型態百分比的改變。
在一個實施態樣中,在本文中所揭示係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括將來自個體之精子樣本予以體外獲能及體外非獲能條件;判定在暴露於體外獲能刺激時某些GM1局部化型態百分比的改變;以及基於該改變量,鑑定生育力狀態。
該用語“經體外獲能精子"係指業經培育在促進獲能過程的條件下之精子。在一個實施態樣中,獲能條件包括培養基中存在重碳酸鹽離子、鈣離子、及固醇受體(sterol acceptor)(例如血清白蛋白或環糊精)的一或多者。在一個實施態樣中,體外獲能條件包括培養基中存在重碳酸鹽離子及鈣離子,以及存在固醇受體。在一個實施態樣中,該固醇受體係固醇流出之調介物。經獲能之精子已獲得經歷頂體胞吐作用能力且已獲得超活化(hyperactivated)活動力型態。該用語“體外非獲能"精子係指未以上列獲能刺激的一或多者來培育之精子。在一個實施態樣中,非獲能條件包括缺少獲能條件。在另一實施態樣中,非獲能條件包括缺少獲能所需的刺激的一或多者。非經獲能之精子不會經歷由生理配體(諸如透明帶、來自透明帶之可溶性蛋白質、或助孕酮)所誘發之頂體胞吐作用。此外,在非
獲能條件下所培育之精子也亦不會展現超活化活動力。
在一個實施態樣中,獲能可藉由暴露至外部刺激(諸如重碳酸鹽離子及鈣離子)及固醇流出調介物(例如2-羥基丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂質囊胞(vesicle)、脂質體等)而體外誘發。在某些實施態樣中,當精子係經暴露至這些體外刺激的一或多者,觀察在GM1局部化型態中的可鑑定之改變。
在一個實施態樣中,在收集後,精液樣本係通常以一些方式處理,包括下列的一或多者:液化(liquefaction)、洗滌、和/或富集。在一些實施態樣中,液化涉及使該樣本在室溫下或在37℃下(或介於其間之任何溫度)液化歷時各種時段(通常15至20分鐘,但範圍在10至60分鐘)。液化係精漿自凝膠轉化成較流體/液體稠度之方法。精漿通常未有任何處理而液化,但特別黏稠樣本,或若有意加快該過程或進行所有樣本所應予處理的一致的液化操作規程,可操作該樣本以達到液化。在某些實施態樣中,該精液樣本係使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管來予以處理以降低精液黏度。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。在某些實施態樣中,亦可藉由加入不損害精子細胞膜的各種試劑來達成液化。應避免之試劑係會損害精子細胞膜者。精子可係藉由離心和再懸浮並予以精液分
析、和/或予以一或多個選擇程序,其包括:在頂部成層(layering on top of),並透過密度梯度離心;在頂部成層,並透過密度梯度離心,接著收集精子富集之級分,接著再再懸浮及洗滌;在頂部成層,並透過密度梯度離心,接著收集精子富集之級分,且其上覆蓋活動精子會向上游至其中的密度較低介質;或覆蓋密度較低介質在樣本頂部上且使活動精子向上游泳至其中。
在初始處理之後,可以計數精子,然後將給定數量的精子置於含有體外非獲能或體外獲能培養基的容器(例如管)中以達成所欲之最終濃度。在一個實施態樣中,精子的最終典型濃度係1,000,000/ml(最終濃度範圍可以在250,000/ml至250,000,000/ml之間變化)。
用於在體外非獲能和體外獲能條件下培育精子的基礎培養基可以是生理緩衝溶液,例如但不限於人類輸卵管液(HTF);經修飾之人輸卵管液(mHTF);Whitten氏培養基;經修飾之Whitten氏培養基;KSOM;磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline);HEPES緩衝鹽水(HEPES-buffered saline);Tris緩衝鹽水;Ham氏F-10;Tyrode氏培養基;經修飾之Tyrode氏培養基;TES-Tris(TEST)-卵黃緩衝液;或Biggers、Whitten及Whittingham(BWW)氏培養基。基礎培養基可以具有一或多種經界定或複雜的外加蛋白質和其他因子來源,包括胎兒臍帶血清超濾液、Plasmanate、蛋黃、脫脂乳、白蛋白、脂蛋白、或脂肪酸結合蛋白,以促進活力或在足夠濃
度下幫助誘發獲能。典型的獲能刺激包括下列者的一或多者:重碳酸鹽鹽(通常為20-25mM,範圍為5-50mM)、鈣(通常為1-2mM,範圍為0.1-10mM)、和/或環糊精(通常為1-3mM,範圍為0.1-20mM)。環糊精可包含2-羥基-丙基-β-環糊精和/或甲基-β-環糊精。培育溫度通常係37℃(範圍在30℃至38℃),且培育時間通常係1-4小時(範圍在30分鐘至18小時),儘管可以在培育時段開始取集基線樣品(“時間零”)。
在一個實施態樣中,為了產生GM1的型態,將精子用標準的基礎培養基(例如,磷酸鹽緩衝液、經修飾之Whitten氏培養基、或其他類似的培養基)洗滌,並與GM1的標記分子一起孵育,該標記分子上具有可檢測的標記。由於GM1具有可用作表位的胞外糖殘基,因此可以將其視覺化,而無需固定和透化(permeabilize)細胞。然而,細胞的固定導致樣品的較佳保存、更容易觀測(相較於游泳精子的肉眼辨別型態)並且允許更長的觀測時間,同時有助於型態形成。已知用於精子組織學研究的各種固定劑屬於熟習本技術領域者範圍。合適的固定劑包括聚甲醛、戊二醛、Bouin氏固定劑、和包含二甲胂酸鈉、氯化鈣、苦味酸、單寧酸及類似者的固定劑。在一個實施態樣中,使用聚甲醛、戊二醛或其組合。
固定條件可範圍在約0.004%(重量/體積)聚甲醛至約4%(重量/體積)聚甲醛,儘管通常使用約0.01%至約1%(重量/體積)的聚甲醛。在一個實施態樣
中,可以使用約0.005%(重量/體積)聚甲醛至約1%(重量/體積)的聚甲醛。在一個實施態樣中,可以使用約4%聚甲醛(重量/體積)、約0.1%戊二醛(重量/體積)和約5mM CaCl2(在磷酸鹽緩衝鹽水中)。
精子樣品固定在固定劑中的時間可以變化。在一個實施態樣中,將精子樣品固定在固定劑中約5小時或更少。在一個實施態樣中,將精子樣品固定在固定劑中大於約5小時。在另一實施態樣中,將精子樣品固定在固定劑中約0.5小時、約1小時、約1.5小時、約2小時、約2.5小時、約3小時、約3.5小時、約4小時、約4.5小時、約5小時、約5.5小時、約6小時、約6.5小時、約7小時、約7.5小時、約8小時、約8.5小時、約9小時、約9.5小時、約10小時、約10.5小時、約11小時、約11.5小時、約12小時、約12.5小時、約13小時、約13.5小時、約14小時、約14.5小時、約15小時、約15.5小時、約16小時、約16.5小時、約17小時、約17.5小時、約18小時、約18.5小時、約19小時、約19.5小時、約20小時、約20.5小時、約21小時、約21.5小時、約22小時、約22.5小時、約23小時、約23.5小時、約24小時、約24.5小時、約25小時、約25.5小時、約26小時、約26.5小時、約27小時、約27.5小時、約28小時、約28.5小時、約29小時、約29.5小時、約30小時,或從前述時間可確定的任何範圍(例如約26小時至約28小時,或約3小時至約5小
時)。
在活精子或經固定之精子中的GM1局部化型態可以藉由使用標記結合技術而獲得。可以使用對GM1神經節苷脂具有特異性親和力的分子。該標記分子可以直接連接到可檢測的標記(諸如螢光團),或者可以藉由在其上具有可檢測標記的第二標記分子來檢測。例如,已知霍亂毒素的b次單元特異性結合GM1。因此,可以使用標記(例如經螢光標記之)霍亂毒素b次單元以獲得GM1分布之型態。在一個實施態樣中,與螢光團連接的霍亂毒素b次單元的最終濃度為約10μg/ml至約15μg/ml。在另一實施態樣中,與螢光團連接的霍亂毒素b次單元的最終濃度為約0.1μg/ml至約50μg/ml。或者,可以使用針對GM1的經標記之抗體。在又另一替代者中,可以使用針對霍亂毒素b次單元的經標記之抗體以觀測GM1染色的型態。並且,在又另一替代者中,可以使用結合至直接結合至GM1的初級抗體或結合至霍亂毒素b次單元的初級抗體。如本文中所使用,用語“GM1染色(GM1 staining)”或“GM1之染色(staining of GM1)”或“標記(labeling)”或相關用語意指由於經標記之親和力分子與GM1的結合而在細胞上或細胞中觀察到的染色。例如,當經螢光標籤/標記的霍亂毒素b次單元用於GM1的局部化定位時,信號或染色係來自霍亂毒素b次單元,但是表示GM1的位置。用語“信號(signal)”和“染色(staining)”和“標記(labeling)”可互換使用。可檢測的標記使得其能夠產生可檢測的信號。這樣的
標記包括放射性核種、酵素、螢光劑或發色基。藉由標準技術進行精子GM1分布的標記(或染色)和觀測。也可以使用除了霍亂毒素的b次單元之外的標記分子。這些包括多株和單株抗體。GM1神經節苷脂的特異性抗體可以藉由常規免疫操作程序來產生,或者可以商業購買(例如Matreya,Inc.,State College,PA)。可以針對GM1產生抗體,或者可以藉由使用GM1分子的相關表位的胜肽模擬物產生抗體。胜肽模擬物的鑑定和產生是本領域技術人員熟知的。此外,霍亂菌毒素b次單元的結合可藉由小分子來模擬。鑑定與給定試劑具有類似結合性質小分子是本領域技術人員熟知的。
對於人精子,當精子處於體外獲能條件下時,觀察到八種不同的局部化型態(參見實施例1的細節)。這些型態係經指定為INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES、DIFF和襯細胞。圖1中示出了INTER、APM、AA、PAPM、AA/PA、ES、和DIFF圖案,並且圖6A、6B、6C、和6D中示出了襯細胞型態,其中每一者進一步描述如下:
‧INTER:絕大多數的螢光是在赤道節段周圍的一個色帶,一些信號在覆蓋頂體之胞膜上。通常有一個信號的梯度,在赤道節段最多,然後朝向尖端逐漸減小。跨赤道節段的色帶內精子頭部邊緣的信號強度通常會增加。
‧APM(頂體質膜):與INTER相比,赤道信號與朝向頂端的信號之間的差異較小。也就是說,覆蓋頂體的
胞膜中的信號更均勻分佈。從明亮的赤道INTER色帶朝向頂端移動可以觀察到APM信號,或者APM信號可在更朝向尖端開始發現,並且在較小的區域中發現,因為它是與AA的連續。
‧AA(頂端頂體):在這種型態中,螢光越來越集中在頂端,亮度增加,信號面積減小。
‧PAPM(頂體後質膜):訊號只在頂體後質膜中。
‧AA/PA(頂端頂體/頂體後):在覆蓋頂體的質膜和頂體後質膜中均有信號。來自赤道節段的信號則失去。
‧ES(赤道節段):明亮信號僅在赤道節段看到。可能伴隨著跨赤道區域精子頭部的增厚。
‧DIFF(擴散):在整個精子頭部上看到擴散信號。
‧襯細胞:信號可以在頂體後區域的頂部和覆蓋頂體的質膜以及赤道節段的底部(即頂體頂體/赤道色帶)上看到。赤道節段周圍的信號則失去。
用語“GM1局部化型態(GM1 localization pattern)”與“型態(pattern)”或“局部化型態(localization pattern)”可互換使用。
圖6A、6B、6C、及6D顯示來自不孕男性之精子在獲能條件下的襯細胞GM1局部化型態。特定言之,圖6A顯示襯細胞GM1局部化型態,其中信號均勻地分佈在頂體後/赤道色帶和在覆蓋頂體之質膜上。圖6B顯示襯細胞GM1局部化型態,其中覆蓋頂體的質膜的信號比在頂體後/赤道色帶的信號更亮。圖6C和6D顯示在頂體後/赤
道色帶的信號比覆蓋頂體的質膜的信號更亮。
經觀察,雖然INTER、AA、APM型態以及這些型態的組合與具有正常精子細胞膜結構的存活精子和因此生育力正相關,但是PAPM、AA/PA、ES、DIFF、和襯細胞型態不與存活性、正常的膜結構和生育力呈正相關。如果在非獲能條件下培養,大多數具有正常膜結構的存活精子將顯示出INTER型態,其特徵在於大多數標記靠近赤道節段,其餘的延伸至覆蓋頂體的質膜。此外,暴露於獲能刺激後,APM和AA型態的數量有所增加。APM型態在覆蓋頂體的質膜中顯示更均勻的信號,而AA型態顯示精子頭部的喙部(rostral part)、頂端頂體的信號強度增加,且向尾部朝向赤道節段移動則信號減少。針對不孕個體的在體外非獲能條件下培育之精子具有GM1局部化型態類似於在正常個體的體外非獲能條件下培育之精子的GM1局部化型態。
在一個實施態樣中,在本文中所揭示係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括將來自男性的精子樣本之第一部分暴露至非獲能條件以獲得體外非獲能精子樣本之步驟;將該精子樣本之第二部分暴露至獲能條件以獲得經體外獲能之精子樣本;將該體外非獲能精子樣本及該經體外獲能之精子樣本以固定劑固定至少下列之時段:一小時、二小時、四小時、八小時、十二小時、十八小時或二十四小時,將該經固定的體外非獲能精子樣本及該經固定的經體外獲能之精子樣本以
針對GM1局部化型態之標記分子處理,其中該標記分子具有可偵測性標記;針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本,鑑定多於一種經標記之GM1局部化型態,該GM1經標記之局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記的GM1局部化型態;比較針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的該經標記之GM1局部化型態與針對該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的該經標記之GM1局部化型態;基於該比較,將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態指派至非經獲能態;及基於針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的經鑑定之GM1經標記之局部化型態,表徵該男性之生育力狀態。在一個實施態樣中,該表徵步驟包含下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參
考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比,以及基於該比較鑑定生育力閾值。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示異常男性生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在一個實施態樣中,在暴露步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用選自用於降低精液黏度的各種試劑之不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。在一些實施態樣中,該損害細胞膜用試劑係選自由下列所組成之群組(i)蛋白酶;(ii)核酸
酶;(iii)黏液分解劑;(iv)脂酶;(v)酯酶及(vi)醣苷水解酶。在一些實施態樣中,該鑑定步驟係經重複直至襯細胞GM1局部化型態數目係實質上恆定為止。在一個此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對經標記之經固定的經體外獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數小於5%、小於經標記之細胞的總數的3%;或範圍為經標記之細胞的總數的1%至5%、2至5%。在另一此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數目小於:經標記之細胞的總數之25%、20%、15%或10%;或範圍在經標記之細胞的總數的2%至25%;2%至20%;2至15%;2至10%;2至5%。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。
在一個此實施態樣中,該表徵步驟可包括下列步驟:針對經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目;針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目;針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本,計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比;及針對該經標記之經固定的經
體外獲能精子樣本,計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比。
在一個此實施態樣中,該方法可進一步包括下列步驟:比較該經標記之經固定的體外非獲能精子的比與具有已知生育力狀態的經標記之經固定的體外非獲能精子的比;及比較該經標記之經固定的經體外獲能精子的比與具有已知生育力狀態的經標記之經固定的經體外獲能精子的比。
在一個實施態樣中,在本文中所揭示係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括下列步驟:獲得來自男性的精子樣本之第一部分,其業經暴露至體外非獲能條件,於固定劑中固定至少:一小時、二小時、四小時、八小時、十二小時、十八小時或二十四小時,且以針對GM1局部化型態之標記分子處理,其中該標記分子具有可偵測性標記;獲得該精子樣本之第二部分,其業經暴露至體外獲能條件,於固定劑中固定,及以針對GM1局部化型態之標記分子處理;針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本,鑑定多於一種GM1經標記之局部化型態,該GM1經標記之局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記的GM1局部化型態;比較針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的該經標
記之GM1局部化型態與針對該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的該經標記之GM1局部化型態;基於該比較,將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態指派至非經獲能態;及基於針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的經鑑定之GM1經標記之局部化型態,表徵該男性之生育力狀態。在一個實施態樣中,該表徵步驟包含下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比,以及基於該比較鑑定生育力閾值。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示異常男性生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在一些實施態樣中,該鑑定步驟係經重複直至襯細胞GM1局部化型態數目係實質上恆定為止。在一個此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對經標記之經固定的經體外獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數小於5%、小於經標記之細胞的總數的3%;或範圍為經標記之細胞的總數的1%至5%、2至5%。在另一此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數目小於:經標記之細胞的總數之25%、20%、15%或10%;或範圍在經標記之細胞的總數的2%至25%;2%至20%;2至15%;2至10%;2至5%。
在此方法的一個實施態樣中,該方法進一步
包括下列步驟:針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,及針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本之各者,計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1局部化型態的總數之總和的比。
在一個此實施態樣中,該表徵步驟可進一步包括下列步驟:比較該經標記之經固定的經體外獲能精子的比與具有已知生育力狀態之男性的經體外獲能精子之GM1局部化型態的比;及比較該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的比與具有已知生育力狀態之男性的GM1局部化型態體外非獲能精子的比。
在一個實施態樣中,在本文中所揭示係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括下列步驟:將來自男性的精子樣本體外暴露至獲能條件;將該經獲能之精子樣本以固定劑固定至少:一小時、二小時、四小時、八小時、十二小時、十八小時或二十四小時,將該經固定的經體外獲能之精子樣本以針對以針對GM1局部化型態之標記分子處理,其中該標記分子具有可偵測性標記;針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,鑑定多於一種GM1經標記之局部化型態,該GM1經標記之局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及
所有其他經標記的GM1局部化型態;將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態指派至非經獲能態;及表徵該男性之生育力狀態。在一個實施態樣中,該表徵步驟包含下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比,以及基於該比較鑑定生育力閾值。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百
分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差表示異常男性生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在一個實施態樣中,在暴露步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用選自用於降低精液黏度的各種試劑之不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。在一些實施態樣中,該損害細胞膜用試劑係選自由下列所組成之群組(i)蛋白酶;(ii)核酸酶;(iii)黏液分解劑;(iv)脂酶;(v)酯酶及(vi)醣苷水解酶。在一些實施態樣中,該鑑定步驟係經重複直至襯細胞GM1局部化型態數目係實質上恆定為止。在一個此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對經標記之經固定的經體外獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數小於5%、小於經標記之細胞的總數的3%;或範圍為經標記之細胞的總數的1%至5%、2至5%。在另一此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數目小於:經標記之細胞的總數之25%、20%、15%或10%;或範圍在經標記之細胞的總數的2%至
25%;2%至20%;2至15%;2至10%;2至5%。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。
在此方法的一個實施態樣中,該方法可進一步包括下列步驟:比較GM1局部化型態的比與具有已知生育力狀態之男性的GM1局部化型態的比。在一個實施態樣中,該已知生育力狀態對應可孕男性。在另一實施態樣中,該已知生育力狀態對應不孕男性。在一個此實施態樣中,該比較步驟包括下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,及計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比。
在一個實施態樣中,在本文中所揭示係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括下列步驟:獲得來自男性的精子樣本之第一部分,其業經暴露至體外獲能條件,於固定劑中固定至少:一小時、二小時、四小時、八小時、十二小時、十八小時或二十四小時,且以針對GM1局部化型態之標記分子染色,其中該標記分子具有可偵測性標記;針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,鑑定多於一種GM1經標記之局部化型態,該GM1局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化
型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記的GM1局部化型態;將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態指派至非經獲能態;及表徵該男性之生育力狀態。在一個實施態樣中,該表徵步驟包含下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比,以及基於該比較鑑定生育力閾值。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態
加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示異常男性生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在一些實施態樣中,該鑑定步驟係經重複直至襯細胞GM1局部化型態數目係實質上恆定為止。在一個此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對經標記之經固定的經體外獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數小於5%、小於經標記之細胞的總數的3%;或範圍為經標記之細胞的總數的1%至5%、2至5%。在另一此實施態樣中,在進行鑑定步驟之後,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子,判定襯細胞GM1局部化型態的數目,直到該數目小於:經標記之細胞的總數之25%、20%、15%或10%;或範圍在經標記之細胞的總數的2%至25%;2%至20%;2至15%;2至10%;2至5%。
在此方法的一個實施態樣中,該方法可進一步包括下列步驟:比較GM1局部化型態的比與具有已知生育力狀態之男性的GM1局部化型態的比。在一個實施態樣中,該已知生育力狀態對應可孕男性。在另一實施態樣
中,該已知生育力狀態對應不孕男性。在一個此實施態樣中,該比較步驟包括下列步驟:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,及計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比。
在一個實施態樣中,在本文中所揭示係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包括下列步驟:獲得精子樣本,其中該精子樣本之至少部分業經曝露至體外獲能條件以獲得經體外獲能精子、業經曝露至固定劑至少:一小時、二小時、四小時、八小時、十二小時、十八小時或二十四小時、且業經針對GM1染色;獲得一或多個該精子樣本之精液參數值;基於一或多種GM1經標記之局部化型態來判定該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本之Cap-Score,該GM1經標記之局部化型態係頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體後質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記的GM1局部化型態;及基於所判定之CAP分數及該一或多個所獲得之精液參數來計算該男性之男性生育力指數(MFI)值。在一個實施態樣中,該精子樣本之該一或多個精液參數係選自由下列所組成之群組:原始精子樣本之體積、精子之濃度、精子活動力、及精子之形態。
在本文中所揭示之實施態樣係用於判定男性生育力狀態之方法。在一個實施態樣中,該方法包含下列
步驟。經體外獲能之精子細胞的樣品係以螢光標記來處理。獲得一或多個經獲能之螢光影像,其中該等圖像展示與經螢光標記的經體外獲能之精子細胞相關聯之一或多個GM1局部化型態。頂端頂體(AA)GM1局部化型態和頂體質膜(APM)GM1局部化型態係各經指派至經獲能態,且襯細胞GM1局部化型態和所有其他經標記的GM1局部化型態係經指派至非經獲能態,其各展示在經獲能之螢光影像中。測量GM1局部化型態數量,該等型態包含AA GM1局部化型態、APM GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態及所有其他經標記之GM1局部化型態,針對經螢光標記的經體外獲能之精子細胞,展示在經獲能之螢光影像以判定[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比。與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕。將[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾
值係基於該比較來鑑定。
在另一實施態樣中,與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關的生育力閾值係經判定,其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示正常男性生育力;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示異常生育力。將經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比來比較。生育力閾值係基於該比較來鑑定。
在一個此實施態樣中,該鑑定步驟亦係基於下列之一或多者:病患人口統計變項、女性伴侶之生殖狀態、精子濃度、總活動力、前向活動力(progressive motility)、精液體積、精液pH、精液黏度和/或精子形態及彼等之組合。
在本文中所述之方法的各種實施態樣中,該精子細胞係以獲能條件來體外處理歷時下列之獲能時段:至少一小時;至少3小時;至少12小時;至少18小時;至少24小時;歷時獲能時段範圍在介於0.5小時至3小時;3小時至12小時;6小時至12小時;3小時至24小時;12小時至24小時;或18小時至24小時之間。
在本文中所述之方法的各種實施態樣中,該經體外獲能之精子細胞係以固定劑處理歷時下列之固定劑時段:至少0.5小時;至少3小時;至少12小時;至少18小時;至少24小時;至少30小時;至少36小時;或至少48小時;歷時固定時段範圍在介於0.5小時至3小時;3小時至12小時;6小時至12小時;3小時至18小時;6至18小時;6至24小時;12小時至24小時;18小時至24小時;18至30小時;18至36小時;24至30小時;24至26小時;18至48小時;24至48小時;或36至48小時之間。
在本文中所述之方法的各種實施態樣中,該多於一種GM1經標記之局部化型態包含AA GM1局部化型態、APM GM1局部化型態、襯細胞(lined-cell)GM1局部化型態、中間(INTER)GM1局部化型態、頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、赤道節段(ES)GM1局部化型態、和擴散(DIFF)GM1局部化型態。
在一個實施態樣中,將該精子樣本之該第一部分暴露至非獲能條件及將該精子樣本之該第二部分暴露至獲能條件係同時發生。
該男性個體可係人或非人動物。在非人動物的情況下,可以基於本文所提供的教示來進行與生育力狀態相關聯的型態鑑定。非人動物包括馬、牛、狗、貓、豬、山羊、綿羊、鹿、兔、雞、火雞、各種魚類和各種動
物物種。
在一個實施態樣中,本揭露之方法提供一種用於指示雄性可能不孕之方法,其包含獲得來自該個體及來自正常對照之精子(其業經在獲能及非獲能條件下培育且隨意經固定)中的GM1局部化型態(例如襯細胞、AA、APM和所有其他GM1局部化型態的一或多種)個體和正常對照,及比較GM1局部化型態。在正常對照中,觀察到顯示某些局部化型態的精子百分比的統計學顯著變化。如果在測試個體的精子中沒有觀察到相同的變化,則個體係經指示為具有異常生育力狀態。在一個實施態樣中,代表正常和異常生育力狀態的型態是襯細胞、INTER、AA和/或APM局部化型態。因此,在已知具有正常生育力狀態(可用作對照)的個體的樣本中,當相較於經曝露在體外非獲能條件時,於暴露在體外獲能條件下,顯示AA和/或APM局部化型態的精子百分比較高,並且顯示襯細胞和/或INTER局部化型態的精子百分比較低。相較於當精子經曝露在體外非獲能條件時,若於曝露至體外獲能條件沒有觀察到這些局部化型態的一或多者差異或顯著差異,則個體被指示為具有生育力問題。在上述實施態樣的變型中,該對照可來自已知是不孕或次可孕的個體。在此實施態樣中,如果來自測試個體的GM1型態在體外獲能的襯細胞、INTER、AA和/或APM局部化型態中的變化與對照相同,那麼個體可以被認為是次可孕或不孕。
在又另一上述實施態樣之變異中,來自測試
個體之樣本可經評估而未與對照比較。如果在暴露於體外獲能條件,襯細胞、INTER、AA和/或APM型態的數量沒有觀察到改變或顯著變化,則個體可能被認為是異常的,並且可以指示進一步測試,而如果觀察到改變,襯細胞和/或INTER減少、AA增加、和/或APM增加,則可指示個體為具有正常的生育力。
在一個實施態樣中,該方法包括分析GM1局部化型態以鑑定暴露於體外獲能條件的精子中AA和APM型態的數量。該數量可以一或多種GM1分布型態相對於總數的百分比來表示。在一個實施態樣中,生育力係基於AA和/或APM局部化型態數相對經預定生育力閾值的比較來預測,例如介於經分類為不孕及次可孕的個體之間的閾值(截值)水平,或介於經分類為次可孕及經分類為可孕者的個體之間的閾值水平。
在其他實施態樣中,可以藉由統計分析來自具有已知生育力的男性族群的精子中發現的型態來判定生育力閾值。為了本案的目的,如果男性具有懷孕伴侶,或者使用自然受孕或三次或更少次子宮內授精,在三年內有小孩,男性被認為是可孕的或具有正常的男性生育力。為了本案的目的,如果男性未能在不使用避孕措施6至12個月達到懷孕,並且需要多於三次的子宮內授精來實現懷孕,那麼該男性就會被認為是次可孕。為了本案的目的,如果男性未能在不使用避孕措施一年內達到懷孕,並且使用多次的子宮內授精無法實現懷孕,那麼該男性就會被認
為是不孕。為了本案的目的,異常的男性生殖力包括次可孕和不孕男性。
如圖4所示,從24名已知可孕男性獲得了73份精液樣本。將其精子與用於獲能的刺激物一起培育,在這種情況下為4mM 2-羥基-丙基-β環糊精,用0.01%聚甲醛固定(最終濃度)。評估具有代表經獲能(例如AA+APM)的型態的細胞的百分比。具有AA和APM型態的精子的平均百分比為41%,平均值的二個標準偏差經計算為27%和55%。
分析了來自14名正在尋求其生育力狀態醫學評估的男性14份樣本的GM1局部化型態。具有AA+APM局部化型態的精子之相對百分比係相對於來自已知可孕男性的族群所鑑定之統計閾值來比較(圖5)。在基線(非刺激性、非獲能條件)下培育的樣本中沒有觀察到差異。然而,當與4mM 2-羥基-丙基-β-環糊精一起培養時,14名男性中有5名顯示了具有AA+APM型態的精子百分比較低的樣本。這5個樣本均低於平均值的二個標準偏差。咸信約有30-50%的懷孕困難的夫婦有男性因素。這些數據落於所預期之範圍內。
在一個態樣中,本揭露提供用於判定男性生育力狀態之套組。該套組包含下列一或多者:吸量管,其具有足夠直徑尺寸之孔口以預防精子細胞膜之剪切;可作為體外獲能刺激之劑、獲能培養基、非獲能培養基、固定劑、用於判定GM1局部化型態之標記試劑;圖解,其描繪
一或多種經獲能之精子之GM1局部化型態及一或多種非經獲能之精子之GM1局部化型態。該經獲能之精子之GM1局部化型態及非經獲能之精子之GM1局部化型態係反映已知生育力狀態。在此套組實施態樣中,該固定劑組成物應不損害精子細胞膜。在此等實施態樣中,可損害精子細胞膜之試劑係選自用於下降精液黏度之各種試劑。在一些實施態樣中,該損害細胞膜用試劑包括下列一或多者:蛋白酶、核酸酶、黏液分解劑、脂酶、酯酶及醣苷水解酶。在另一套組實施態樣中,該獲能培養基及非獲能培養基,當體外施加至精子細胞時,製造如圖解中所反映之指示為經獲能之精子之GM1局部化型態及指示為非經獲能之精子之型態。
在一個實施態樣中,該套組包含具有4%環糊精之劑以刺激獲能。
在一個實施態樣中,該獲能培養基包括:加入2-羥基-丙基-β-環糊精的經改良的人輸卵管液,以產生3mM最終濃度;非獲能培養基包括經改良的人輸卵管液;該固定劑為1%聚甲醛;且用於判定GM1型態的試劑是霍亂毒素b次單元(最終濃度為15μg/ml)。在其他實施態樣中,聚甲醛之最終濃度係0.01%。
例示性套組包含經修飾之HTF培養基加上建它黴素(gentamicin)並以HEPES緩衝(Irvine Scientific,reference 90126)。不論是否使用重碳酸鹽或HEPES緩衝培養基,GM1局部化型態、活力或精子回復、以及獲能均
未觀察到差異。因此,也可以使用重碳酸鹽鹽緩衝培養基。使用HEPES緩衝液可以在臨床診間使用空氣培養箱或水浴進行分析,而不會僅與CO2培養箱相容。類似地,添加補充蛋白質,無論是商業的(HTF-SSSTM,Irvine Scientific,或plasmanate)或粉末狀白蛋白都不會改變回復或活力,並且有利地增強獲能狀態。
例示性套組可以進一步包含細胞分離培養基(例如Enhance S-Plus Cell Isolation Media,90%來自Vitrolife,reference:15232 ESP-100-90%)。例示性試劑、消耗品和程序係經證實產生有利GM1標記於人精子上。
例示性套組可進一步包含寬孔吸量管吸管尖(200μl,大孔口吸管尖,USA scientific,1011-8400)。例示性套組可進一步包含寬孔移液吸管(General Purpose Transfer Pipettes,Standard Bulb reference number:202-20S.VWR catalog number 14670-147)。在一個實施態樣中,該吸量管係非金屬。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。
例示性套組可進一步包含1.5ml管(Treatment cap,noncap,CD)(USA Scientific 14159700)-一個含有粉末形式的環糊精以刺激獲能,且一個空管用於只有非獲能條件培養基。在一些實施態樣中,可在單獨的
管中發現環糊精,將添加培養基以製備儲備溶液,其本身將添加到獲能管中。
當將精子從精漿中分離出來時,人類雄性學實驗室通常使用密度梯度收集精子。例示性套組可以進一步包括密度梯度材料和/或使用說明以從密度梯度中除去精漿,然後使用新鮮的移液管收集沉澱的精子。
例示性套組可以進一步包含固定劑(例如0.1% PFA),並且任選地包括用於運輸、儲存或法規目的之信息表(例如患者申請表)、標籤和容器/袋/袋等。例如,該套組可以包含箔袋,具有用於寄送患者樣品的吸收劑的生物危害袋,具有吸收劑的可再密封袋和泡沫管容納座。
例示性套組可以進一步包括描述本文揭示的任何方法的說明書。
在另一態樣中,提供了一種用於測量雄性個體的生育力的方法。GM1局部化測定可以顯示精子是否可獲能,因此能夠勝任卵子的受精。如上所述,可以將測定法評分為在精子頭部中具有特定GM1局部化型態的形態正常精子的百分比。APM和AA型態隨著精子對獲能刺激的反應而增加。可以使用截值來區分射精的相對生育力,基於雄性生殖力將精液樣本分成數組(例如,區分可孕與次可孕與不孕男性)。然而,由於精子數量、活動力、和形態也可影響雄性生殖力,本發明提供了創建雄性生育指數(“雄性生育指數”或“MFI”)的方法,其中包括Cap-Score
和一或多個相關精液參數(例如數量、活動力、和形態等)。Cap-Score(也稱GM1分數)是一或多種GM1型態的數量。例如,Cap-Score可以是襯細胞、INTER、AA和APM中的一或多種的數量。可以產生強調特定精液參數的不同指標。例如,根據本發明的指數包括:‧Cap-Score×具前向活動力%×絕對數;‧Cap-Score×形態正常精子%×絕對數;‧Cap-Score×總活動力%×絕對數×形態正常精子%;及‧其他變數或Cap-Score和這些參數的組合,或其他特定參數,包括使用CASA(電腦輔助精子分析)獲得的參數,如:VSL(速度直線);STR(直度);LIN(線性);VCL(曲線速度);VAP(速度平均路徑);活動力%;活動力持續時間;LHA(橫向頭部振幅);WOB(擺動);PROG(前向);和BCF(搏動數(Beat cross number))等。參見例如世界衛生組織,“WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Sperm,”(Fifth Ed.2010)。
雄性生育力指數可以體現為測量雄性個體的生育力狀態的方法。獲得精子樣本,其中該精子樣本來自被測量的個體,並且其中至少一部分精子樣本如上所述業經暴露於體外獲能條件、暴露於固定劑、且GM1染色。針對精子樣本獲得一或多個精液參數的值,例如來自個體的原始樣本的體積、和/或樣本的精子的濃度、活動力和/或
形態。根據一或多個GM1型態的數量(例如“CAP”分數)和所獲得的一或多個精液參數值確定MFI。在本文中所使用之的例子中,Cap-Score是獲能條件下三小時的一或多個GM1型態的百分比,但是根據本揭露,Cap-Score的其他變體將是顯而易見的(例如,在其他時間間隔,GM1型態的數量從非獲能至獲能的變化等)。
在一個實施態樣中,可以根據下列方程式對男性樣本計算雄性生育力指數評分:雄性生育力指數/具生育力組=a+b1*x1+b2*x2+...+bm*xm其中a是常數,b 1 到b m 是回歸係數,x 1 和x m 是男性生育力變量,如Cap-Score、活動力、形態、體積、和濃度。判別式函數分析可用於判定哪個生育力變量在兩或更多個天然存在的群體之間進行區分。例如,為了確定個體是否屬於可孕、次可孕或不孕的群體,將收集描述精子功能和精液質量的許多生育力變量的數據。然後可以使用判別分析來確定哪個變量是具生育力組的最佳預測因子,並且相對於每個生育力變量應該加權多少。
雄性生育指數可由讀取GM1局部化定位測定的實驗室產生。實驗室可以從一或多個機構(例如生育診所、精子庫等)獲得精子樣本和對應於精子樣本的精液分析。精液分析信息可以包含於伴隨GM1局部化定位測定套組的卡上、以電子方式發送到實驗室、和/或以其他方式提供。在另一例示性實施態樣中,實驗室獲得精子樣本的Cap-Score,並且還獲得精子樣品的精液分析信息。在一
個實施態樣中,實驗室基於獲得的Cap-Score和所獲得的精液分析數據計算雄性生育力指數。
用於鑑定雄性的生育力狀態的例示性方法包含將來自個體之精子樣本暴露於體外非獲能和體外獲能條件。精子係經固定,並且判定經固定之精子中選定的GM1型態的百分比。比較暴露於體外非獲能和體外獲能條件下的精子中不同GM1型態的百分比。暴露於體外獲能條件下的精子相對於在暴露於體外非獲能條件下的精子中的一或多種選擇的GM1型態的百分比變化表明個體的生育力狀態。所選的GM1型態可以是襯細胞、INTER、AA和/或APM。在一個實施態樣中,個體生育力狀態係藉由下者而判定:計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比(針對經獲能之精子)。
用於鑑定雄性的生育力狀態的例示性方法包含將來自個體之精子樣本暴露於體外獲能條件。精子係經固定,並且判定經固定之精子中選定的GM1型態的百分比。將不同GM1型態的百分比與對照的百分比進行比較,其中對照精子樣本業經暴露於相同的體外獲能條件和相同的固定劑。一或多種選擇的GM1型態的百分比的改變相對於對照的改變係代表個體生育力狀態不同於對照生育力狀態GM1型態可係襯細胞、INTER、AA和/或APM。在一個實施態樣中,個體生育力狀態係藉由下者而判定:計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總
和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比(針對經獲能之精子)。在一個實施態樣中,在暴露步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用選自用於降低精液黏度的各種試劑之不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。在一些實施態樣中,該損害細胞膜用試劑係選自由下列所組成之群組(i)蛋白酶;(ii)核酸酶;(iii)黏液分解劑;(iv)脂酶;(v)酯酶及(vi)醣苷水解酶。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。
在例示性方法中,對照可以是來自已知具有正常生育力狀態的個體或已知具有異常生育力狀態的個體的精子樣本。對照可以是獲自包含複數個體的數據集之值,例如包含至少50位個體。
用於鑑定雄性的生育力狀態係不孕、次可孕、或可孕的例示性方法包含將來自個體之精子樣本暴露於體外獲能條件。判定樣本中的GM1型態。將一或多種GM1型態的百分比與生育力閾值進行比較,其中小於生育力閾值的百分比表示生育力問題。例如,比生育力閾值低的百分比可以表示不孕或次可孕的生育力狀態。GM1型態可係襯細胞、INTER、AA和/或APM。在一個實施態樣中,個體生育力狀態係藉由下者而判定:計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1
經標記之局部化型態的總數之總和的比(針對經獲能之精子)。在一個實施態樣中,在暴露步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用選自用於降低精液黏度的各種試劑之不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。在一些實施態樣中,該損害細胞膜用試劑係選自由下列所組成之群組(i)蛋白酶;(ii)核酸酶;(iii)黏液分解劑;(iv)脂酶;(v)酯酶及(vi)醣苷水解酶。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。
在例示性方法中體外獲能條件可包括暴露至i)重碳酸鹽離子及鈣離子,及ii)固醇流出(sterol efflux)之調介物諸如2-羥基丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂質囊胞(phospholipid vesicle)、胎兒臍帶血清超濾液、脂肪酸結合蛋白、或脂質體。在該例示性方法,將對照曝露至獲能或非獲能條件可與試樣平行完成。
用於鑑定雄性的生育力狀態係不孕、次可孕、或可孕的例示性方法包含將來自個體之精子樣本暴露於獲能條件。判定樣本中的各GM1型態之百分比。將一或多種GM1型態的百分比與不孕閾值進行比較,其中小於不孕閾值的百分比表示生育力問題。在例示性方法中獲能條件可包括暴露至i)重碳酸鹽離子及鈣離子,及ii)固醇
流出(sterol efflux)之調介物諸如2-羥基丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂質囊胞(phospholipid vesicle)、胎兒臍帶血清超濾液、脂肪酸結合蛋白、或脂質體。一或多種GM1局部化型態可係襯細胞、INTER、AA和/或APM。在一個實施態樣中,個體生育力狀態係藉由下者而判定:計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比(針對經獲能之精子)。在一個實施態樣中,在暴露步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用選自用於降低精液黏度的各種試劑之不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。在一些實施態樣中,該損害細胞膜用試劑係選自由下列所組成之群組(i)蛋白酶;(ii)核酸酶;(iii)黏液分解劑;(iv)脂酶;(v)酯酶及(vi)醣苷水解酶。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有計量尺寸(gauge size)至少規號(gauge)18、規號16或規號14。在一些實施態樣中,該寬孔吸量管具有孔口尺寸(orifice size)至少1mm、1.2mm或1.4mm。
例示性方法中的生育力閾值可以是族群生育力不再實質上增加的AA+APM型態百分比。例如,生育力閾值可以是族群內超過50%是可孕的AA+APM水平;族群內超過60-85%是可孕的AA+APM水平;或35-40(含)(總GM1型態的相對百分比)範圍內的AA+APM水平。生育力閾值可以是38、38.5、39或39.5%的AA+
APM(相對於總GM1型態)。
例示性方法可另包含將一或多種GM1型態的百分比與不孕閾值進行比較,其中小於不孕閾值的百分比表示不孕。例如,不孕閾值可以是族群生孕力開始實質上增加的AA+APM型態百分比;族群內小於50%是可孕的AA+APM水平;族群內超過60-85%是可孕的AA+APM水平;或14-18(含)(總GM1型態的相對百分比)範圍內的AA+APM水平。不孕閾值可以是14、14.5、15、或15.5%的AA+APM(相對於總GM1型態)。
用於鑑定雄性之生育力狀態的例示性方法包含獲得精子樣本,其中該精子樣本係來自個體,並且其中該精子樣本業經暴露於非獲能或獲能條件下、經固定、並GM1染色。判定精子中所選GM1型態的數量。比較暴露於體外非獲能和體外獲能條件下的精子中不同GM1型態的百分比。暴露於體外獲能條件下的精子相對於在暴露於體外非獲能條件下的精子中的一或多種選擇的GM1型態的百分比變化表明個體的生育力狀態。GM1型態可選自由AA、APM、INTER、襯細胞、及彼等之組合所組成之群組。在一個實施態樣中,個體生育力狀態係藉由下者而判定:計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比(針對經獲能之精子)。
用於鑑定雄性之生育力狀態的例示性方法包含獲得精子樣本,其中該精子樣本來自個體,並且其中該
精子樣本業經暴露於體外獲能條件、經固定、且針對GM1存在之染色。判定精子中所選GM1型態的數量。將一或多個不同GM1型態的百分比與來自對照或預定標準的型態的百分比進行比較。對照精子樣本業經暴露於相同的體外獲能條件和相同的固定劑。一或多種選擇的GM1型態的百分比的改變相對於對照的改變係代表個體生育力狀態不同於對照生育力狀態。
用於鑑定雄性之生育力狀態的例示性方法包含獲得精子樣本,其中該精子樣本來自個體,並且其中該精子樣本業經暴露於體外獲能條件、經固定、且針對GM1型態染色。判定樣本中的GM1局部化型態。將一或多種GM1型態的百分比與不孕閾值進行比較,其中小於不孕閾值的百分比表示生育力問題。
用於測量雄性之生育力狀態的例示性方法包含獲得精子樣本,其中該精子樣本來自個體,並且其中該精子樣本業經暴露於體外獲能條件、業經暴露至固定劑、且業經針對GM1染色。獲得針對原始樣本的體積、濃度、活動力、及原始樣本中的精子形態的一或多者之值。以樣本中一或多種GM1局部化型態百分比判定精子樣本的Cap-score。基於所判定之Cap-Score及該一或多個所獲得之體積、濃度、活動力、及形態來計算該個體之雄性生育力指數(MFI)值。例如,可以藉由乘以Cap-Score、體積、濃度、活動力值、和形態值來計算MFI值。活動力可以是活動的精子的百分比。形態可以是形態正常的精子的百
分比。
用於測量雄性之生育力狀態的例示性方法包含以樣本中一或多種GM1局部化型態之百分比獲得個體精子樣本Cap-score。獲得針對原始樣本的體積、濃度、活動力、及原始樣本中的精子形態的一或多者之值。基於所判定之Cap-Score及該一或多個所獲得之體積、濃度、活動力、及形態來計算該個體之雄性生育力指數(MFI)值。
本發明係進一步藉由下列例示性實施例來描述,該等例示性實施例不被解釋為限制性的。
此實施例提供以人精子所獲得的GM1局部化型態之示範。自雄性供給者收集經射精之精子,並在37℃使之液化20mins,並接著進行體積、初始計數、活動力及形態評估。於15ml的錐形管中,將1ml的精液樣本分層於1ml的密度梯度(90% Enhance-S;Vitrolife,San Diego,California,USA)上。將該管在300 x g下離心10分鐘。將底部的1ml級分轉移至新的15ml管並接著再懸浮於4ml的mHTF。將此管在600 x g下離心10分鐘。將上清液移除,並將精子片狀沉澱物再懸浮於0.5ml的mHTF。將經洗滌之精子接著評估濃度及活動力。將等體積精子接著加至二個管,而使各管最終體積係300μl,且精子最終濃度係1,000,000/ml。第一管含有mHTF(非獲能條件)且第二管含有mHTF加上2-羥基-丙基-β-環糊精,
最終濃度3mM(獲能條件)。將精子培育歷時不同時間長度,但通常使用3小時。這些培育係在37℃下進行。
在該培育時段結束,將各管內容物輕混,並自各管取出18μl並轉移至分離的微量離心管。加入2μl的1%(重量/體積)聚甲醛以達到最終濃度0.1%。在另一實施態樣中,加入0.1%(重量/體積)聚甲醛以達到最終濃度0.01%。將這些管輕混並在室溫下培育15分鐘,在此時加入0.3μl的1mg/ml霍亂菌毒素b次單元。再度將二管的內容物輕混且使之在室溫下培育額外5分鐘。自各管,移出5μl並置於載玻片上以供螢光顯微鏡評估。為提供對比染色、快速判定聚焦面、並增加螢光訊號之長效,有時加入3μl的DAPI/Antifade。
如圖2所示,正常人精子中GM1的局部化型態反映了對獲能條件的反應。只有正常生育力的男性才能看到完全反應;在以前嘗試子宮內授精(IUI)或體外受精(IVF)失敗的無法解釋不孕之男性中,反應型態大大地減少或不存在。圖1顯示人精子中的GM1型態。然而,為了診斷測定的目的,反映異常的型態,如PAPM、AA/PA、ES、和DIFF可以被分組以便於分析。圖2A-2C顯示在非獲能條件(NC;圖2A)或獲能條件(CAP;圖2B)下培育的正常精液中不同型態的相對分佈。在暴露於CAP時,正常精液中觀察到INTER型態的減少(圖2C),而也觀察到AA型態和APM型態也顯著增加。與這些正常數據相比,來自一組已知具有無法解釋不孕的男
性的精子也進行了GM1測定。在這些精子中,在獲能條件下,AA型態或APM型態幾乎沒有增加。
在這個例子中,研究了34名患者的臨床病史,以進行他們相對於曾達到懷孕臨床證據歷史的GM1檢定分數。如果患者夫婦在3個或更少的周期內達到受精/臨床懷孕的一些證據(即使僅限於生物化學證據或超音波上未有心跳的胚囊),也將男性患者定義為“可孕”。
對這34名患者的資料進行分析顯示,如果在3小時的時間點經獲能之樣本的得分應用了40%的截值(APM+AA),則7/8係“通過”(具有分數為39.5%或更高)者經發現被指定為“可孕”(87.5%)。26名“失敗”(得分為39.4分或更低),只有3/26名有臨床懷孕證據(11.5%)。(見下表1)。
如果減少截值,可以預測更多的臨床上次可孕能力的人將獲得通過分數並且通過測定並在3次內可孕的百分比應該下降。有趣的是,該結果就生育力(由<=3次標準來定義)並非平滑梯度或連續曲線。也就是說,無論是否在40或35定義的測試失敗,與生育機會任何顯著變化並不相關,總是很低(介於11.5-14.3%)。相反地,35相對於40通過測定對應於生育機會差異非常大(分別範圍為53.8-87.5%)。為了加強和重申這一點,APM+AA組合百分比的5%的變化對應於生育史改變超過30%。
這些結果表明,雄性生育力更像是一個“階梯函數(step function)”,其中男性生育力分數範圍對應“可孕”、“次可孕”或“不孕”的分類,而不是等同對應小且連續的男性生育力改變(實現臨床懷孕的機會)之分數。這些數據強烈地表明,大約38.5-40的分數將是指示“次可孕”或“可孕”之間的截值。進一步檢查數據表明,可以使用<14.5%的截值作為指定可能“不孕”之指示。
或者,可以藉由比較在獲能條件下的APM和/或AA型態隨培育時間的相對數量的變化,或者相對在非
獲能條件下的相對數量,來評估樣品的生育力。例如,可以在獲能條件下培育3小時後的APM+AA相對數與培育開始時的該些型態相對數量進行比較。在又另一實施態樣中,可以將APM和/或AA頻率的變化與從連續時間點(如1、2和3小時)獲得的結果進行比較。實際上,可以繪製Y軸上的相對頻率和X軸上的時間點,並評估在非獲能及獲能條件下的一或多個INTER、APM和/或AA樣本的增加數量的斜率或變化率。當對一群63位患者進行分析時,鑑定了31名男性的分數與正常參考組相匹配,其中經歷1、2和3小時的培育,在非獲能中及在獲能培養基中的基線GM1型態分別為17%-22%-28%和26%-31%-38%(見圖3)。鑑定了32名低於參考值男性,在非獲能中係15%-20%-24%,且在獲能培養基中係20%-25%-29%。精子分析參數,數量、活動力和正常形態百分比(使用嚴格的WHO標準)在兩組之間是相當的。正常範圍GM1型態的族群,子宮內授精(IUI)妊娠率為45.2%(14/31),其中8例(25.8%)產生至少一例胎心跳。這組中另外三組夫婦自然懷孕。對於低於參考GM1型態的男性,IUI臨床妊娠率僅為6.3%(2/32;P=0.03)。在該定群中,13例接受ICSI,6例懷孕(46.2%)。
如實施例1所述處理精子細胞,但在固定劑中培育24小時。然後藉由螢光顯微鏡評估經標記之精子
細胞。如圖6A、6B、6C和6D中所描繪,鑑定新的GM1局部化型態,即襯細胞。在襯細胞中,如圖6A所示,在赤道節段底部/頂體後區域頂部、和覆蓋頂體的質膜上存在GM1信號。信號均勻分佈在頂體後/赤道區域及覆蓋頂體的質膜。赤道節段還有一沒有信號的色帶。如圖6B顯示,覆蓋頂體的質膜的信號比在頂體後/赤道色帶的信號更亮。如圖6C和6D顯示,在頂體後/赤道色帶發現的信號比覆蓋頂體的質膜的信號更亮。
洗滌來自單一供給者的精子細胞,在獲能(刺激)和非獲能(非刺激)條件兩者下培育,然後在第0天(維持固定劑中大約5小時)和第1天(維持固定劑中大約27.5小時)兩者時計分。刺激處理的第0天至第1天的襯細胞百分比幾乎沒有變化。相比之下,無刺激處理的第0天至第1天的襯細胞百分比從3增加到22%。伴隨此變化,後續有INTER從76%下降到51%。這些數據與自第0天具有inter型態的細胞第1天發展的襯細胞型態一致。
洗滌來自單一供給者的細胞,在獲能(刺激)和非獲能(非刺激)條件兩者下培育,然後在第0天(維持固定劑中大約4小時)和第1天(維持固定劑中大約25小時)兩者時計分。由於在第0天觀察到很少的襯細胞,因此在第0天有或未有包括襯細胞數來判定Cap-Score均獲得類似的Cap-Score。然而,隨著第1天的襯細胞的出現,可以根據如何解讀襯細胞獲得不同的Cap-ScoreTM值。例如,當將襯細胞視為非獲能處理時,刺激和非刺激處理獲得相似Cap-ScoresTM。然而,如果襯細胞視為經獲能、分離或從Cap-ScoreTM計算中移除,則相對於刺激處理,非刺激處理獲得較大的Cap-Score。非刺激處理具有較大Cap-ScoreTM值是無意義,因為這些精子細胞在基礎條件下培育,因此不會顯示與獲能相關的GM1型態。這些觀察結果提供進一步的補充證據,即襯細胞代表非經獲能態,並且在計算Cap-ScoreTM時應該被視為是這樣。
洗滌來自18位不同供給者的四十份不同精液樣本,精子在獲能(刺激)和非獲能(非刺激)條件兩者下培育,然後在第0天和第1天兩者計分。當襯細胞視為非獲能來處理時,在第0天及第1天所獲得的刺激Cap-ScoreTM值之間觀察到顯著共相關(r=0.32;n=40;p<0.05)。當襯細胞視為經獲能、基於GM1局部化型態分成獲能或非獲能儲位(bin)、或直接自Cap-ScoreTM移除,在第0天及第1天之間未觀察到共相關。這些觀察結果支持這樣一種觀點:當精子保持過夜時,襯細胞的局部化型態發展,而在第0天,這些精子表現出inter/非獲能的型態。將襯細胞視為非獲能來處理,穩定隨時間之Cap-ScoreTM,且與反映不孕之細胞的此型態一致。此外,這些數據表明,將襯細胞解讀為非獲能適用於該族群。儘管如此,在第1天,襯細胞的出現是供給者依賴性。這提高了觀察這些襯細胞可提供關於這些供給者的附加信息和它們的精子受精能力的可能性。
雖然本揭露已就一或多個具體實施態樣來說明,但應了解的是,本揭露的其他實施態樣可在不悖離本揭露精神及範圍來實施,且此等其他實施態樣係意欲屬本揭露之範圍內。
Claims (65)
- 一種用於判定雄性生育力狀態之方法,其包含:將來自男性的精子樣本之第一部分暴露至非獲能條件以獲得體外非獲能精子樣本;將該精子樣本之第二部分暴露至獲能條件以獲得經體外獲能之精子樣本;將該體外非獲能精子樣本及該經體外獲能之精子樣本各以固定劑固定至少一小時之時段;將該經固定的體外非獲能精子樣本及該經固定的經體外獲能之精子樣本各以針對GM1局部化型態之標記分子處理,其中該標記分子具有可偵測性標記;針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及針對該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本,鑑定多於一種經標記之GM1局部化型態,該GM1經標記之局部化型態包含頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態、中間(INTER)GM1局部化型態、頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、赤道節段(ES)GM1局部化型態、和擴散(DIFF)GM1局部化型態;比較針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的該經標記之GM1局部化型態與針對該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的該經標記之GM1局部化型態; 基於該比較,將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態、該中間(INTER)GM1局部化型態、該頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、該頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、該赤道節段(ES)GM1局部化型態、和該擴散(DIFF)GM1局部化型態指派至非經獲能態;及基於針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的經鑑定之GM1經標記之局部化型態,表徵該男性之生育力狀態。
- 如請求項1之方法,其中該表徵步驟包含下列步驟:針對經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關之生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕(fertile)族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕(infertile);比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的 [(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比;以及基於該比較鑑定生育力閾值。
- 如請求項2之方法,其中該表徵步驟進一步包含:針對經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本,計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比;及針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比。
- 如請求項1之方法,其中該獲能條件包括暴露至重碳酸鹽離子、鈣離子、及固醇流出(sterol efflux)之調介物的一或多者。
- 如請求項4之方法,其中該固醇流出之調介物係2-羥基丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、血清白蛋白、高密度 脂蛋白、磷脂質囊胞(phospholipid vesicle)、胎兒臍帶血清超濾液、脂肪酸結合蛋白、或脂質體。
- 如請求項4之方法,其中該固醇流出之調介物係2-羥基丙基-β-環糊精。
- 如請求項1之方法,其中該非獲能條件包括缺少暴露至重碳酸鹽離子、鈣離子、及固醇流出之調介物的一或多者。
- 如請求項1之方法,其中該固定劑包含聚甲醛、戊二醛或彼等之組合。
- 如請求項1之方法,其中用於該多於一種GM1經標記之局部化型態的該標記分子係經螢光標記之霍亂菌毒素b次單元(cholera toxin b subunit)。
- 如請求項1之方法,其中該鑑定步驟係在該暴露步驟後的2至24小時來進行。
- 如請求項1之方法,其中將該精子樣本之該第一部分暴露至非獲能條件及將該精子樣本之該第二部分暴露至獲能條件係同時發生。
- 如請求項3之方法,其進一步包含下列步驟比較該經標記之經固定的體外非獲能精子的比與具有已知生育力狀態的經標記之經固定的體外非獲能精子的比;及比較該經標記之經固定的經體外獲能精子的比與具有已知生育力狀態的經標記之經固定的經體外獲能精子的比。
- 如請求項1之方法,其進一步包含下列步驟:在暴露步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。
- 一種用於鑑定男性生育力狀態之套組,其包含:圖解,其描繪一或多種經獲能之精子之GM1局部化型態及一或多種非經獲能之精子之GM1局部化型態,其中該經獲能之精子之GM1局部化型態及非經獲能之精子之GM1局部化型態係反映已知生育力狀態;寬孔吸量管,其具有足夠直徑尺寸之孔口以預防精子細胞膜之剪切;密度梯度材料;及下列一或多個組成物:獲能用培養基、非獲能用培養基、固定劑組成物、用於判定GM1局部化型態之標記用試劑及降低黏度之試劑,其中該獲能培養基及該非獲能培養基,當體外施加至精子細胞時,製造如圖解中所反映之指 示為經獲能之精子之GM1局部化型態及指示為非經獲能之精子之型態;以及其中該密度梯度材料及該一或多個組成物不損害精子細胞膜。
- 如請求項14之套組,其中該寬孔吸量管具有至少規號18(18 gauge)之孔口尺寸(orifice size)。
- 如請求項14之套組,其中該寬孔吸量管係非金屬材料所製。
- 如請求項14之套組,其中該密度梯度材料及該一或多個組成物排除損害細胞膜用試劑,該損害細胞膜用試劑係選自由下列所組成之群組:(i)蛋白酶;(ii)核酸酶;(iii)黏液分解劑;(iv)脂酶;(v)酯酶及(vi)醣苷水解酶。
- 如請求項14至17中任一項之套組,進一步包含用於處理精子之使用說明以避免損害精子細胞膜。
- 一種用於判定雄性生育力狀態之方法,其包含:獲得來自男性的精子樣本之第一部分,其業經暴露至體外非獲能條件,於固定劑中固定至少一小時,且以針對GM1局部化型態之標記分子處理,其中該標記分子具有可 偵測性標記;獲得該精子樣本之第二部分,其業經暴露至體外獲能條件,於固定劑中固定,及以針對GM1局部化型態之標記分子處理;針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及針對該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本,鑑定多於一種經標記之GM1局部化型態,該GM1經標記之局部化型態包含頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態、中間(INTER)GM1局部化型態、頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、赤道節段(ES)GM1局部化型態、和擴散(DIFF)GM1局部化型態;比較針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的該經標記之GM1局部化型態與針對該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的該經標記之GM1局部化型態;基於該比較,將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態、該中間(INTER)GM1局部化型態、該頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、該頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、該赤道節段(ES)GM1局部化型態、和該擴散(DIFF)GM1局部化型態指派至非經獲能態;及基於針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及 該經標記之經固定的經體外獲能之精子樣本的經鑑定之GM1經標記之局部化型態,表徵該男性之生育力狀態。
- 如請求項19之方法,其中該表徵步驟包含下列步驟:針對經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關之生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比;以及基於該比較鑑定生育力閾值。
- 如請求項19之方法,其中該表徵步驟包含:針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經 標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,及各針對該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本及該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1局部化型態的總數之總和的比。
- 如請求項21之方法,其中該表徵步驟進一步包含:比較該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的比與具有已知生育力狀態之男性的經體外獲能精子之GM1局部化型態的比;及比較該經標記之經固定的體外非獲能精子樣本的比與具有已知生育力狀態之男性的GM1局部化型態體外非獲能精子的比。
- 如請求項22之方法,其中該已知生育力狀態包含可孕、非可孕及彼等之組合。
- 如請求項19之方法,其中該獲能條件包括暴露至重碳酸鹽離子、鈣離子、及固醇流出(sterol efflux)之調介物的一或多者。
- 如請求項24之方法,其中該固醇流出之調介物係2-羥基丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、血清白蛋白、高密 度脂蛋白、磷脂質囊胞(phospholipid vesicle)、胎兒臍帶血清超濾液、脂肪酸結合蛋白、或脂質體。
- 如請求項25之方法,其中該固醇流出之調介物係2-羥基丙基-β-環糊精。
- 如請求項19之方法,其中該非獲能條件包括缺少暴露至重碳酸鹽離子、鈣離子、及固醇流出之調介物的一或多者。
- 如請求項19之方法,其中該固定劑包含聚甲醛、戊二醛或彼等之組合。
- 如請求項19之方法,其中用於該GM1局部化型態的該標記分子係經螢光標記之霍亂菌毒素b次單元。
- 如請求項19之方法,其中該鑑定步驟係在該暴露步驟後的2至24小時來進行。
- 如請求項19之方法,其中將該精子樣本之該第一部分暴露至非獲能條件及將該精子樣本之該第二部分暴露至獲能條件係同時發生。
- 如請求項19之方法,其進一步包含下列步驟:在獲 得步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。
- 一種用於判定雄性生育力狀態之方法,其包含:將來自男性的精子樣本體外暴露至獲能條件;將該經獲能之精子樣本以固定劑固定至少1小時;將該經固定的經體外獲能之精子樣本以針對以針對GM1局部化型態之標記分子處理,其中該標記分子具有可偵測性標記;針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,鑑定多於一種GM1經標記之局部化型態,該GM1經標記之局部化型態包含頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態、中間(INTER)GM1局部化型態、頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、赤道節段(ES)GM1局部化型態、和擴散(DIFF)GM1局部化型態;將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態、該中間(INTER)GM1局部化型態、該頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、該頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、該赤道節段(ES)GM1局部化型態、和該擴散(DIFF)GM1局部化型態指派至非經 獲能態;及表徵該男性之生育力狀態。
- 如請求項33之方法,其中該表徵步驟包含下列步驟:針對經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關之生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比;以及基於該比較鑑定生育力閾值。
- 如請求項33之方法,其進一步包含下列步驟:比較GM1局部化型態的比與具有已知生育力狀態之男 性的GM1局部化型態的比。
- 如請求項35之方法,其中該比較步驟包含:針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,及計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比。
- 如請求項33之方法,其中該獲能條件包括暴露至重碳酸鹽離子、鈣離子、及固醇流出之調介物的一或多者。
- 如請求項37之方法,其中該固醇流出之調介物係2-羥基丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂質囊胞、胎兒臍帶血清超濾液、脂肪酸結合蛋白、或脂質體。
- 如請求項38之方法,其中該固醇流出之調介物係2-羥基丙基-β-環糊精。
- 如請求項35之方法,其中該已知生育力狀態對應可孕男性。
- 如請求項35之方法,其中該已知生育力狀態對應不 孕男性。
- 如請求項33之方法,其中該固定劑包含聚甲醛、戊二醛或彼等之組合。
- 如請求項33之方法,其中用於GM1局部化型態的該標記分子係經螢光標記之霍亂菌毒素b次單元。
- 如請求項33之方法,其中該鑑定步驟係在該暴露步驟後的2至24小時來進行。
- 如請求項33之方法,其進一步包含下列步驟:在暴露步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。
- 一種用於判定雄性生育力狀態之方法,其包含:獲得來自男性的精子樣本之第一部分,其業經暴露至體外獲能條件,於固定劑中固定至少1小時,且以針對GM1局部化型態之標記分子染色,其中該標記分子具有可偵測性標記;針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,鑑定多於一種GM1經標記之局部化型態,該GM1局部化型態包含頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體質膜(APM) GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態、中間(INTER)GM1局部化型態、頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、赤道節段(ES)GM1局部化型態、和擴散(DIFF)GM1局部化型態;將該頂端頂體(AA)GM1局部化型態和該頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將該襯細胞GM1局部化型態、該中間(INTER)GM1局部化型態、該頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、該頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、該赤道節段(ES)GM1局部化型態、和該擴散(DIFF)GM1局部化型態指派至非經獲能態;及表徵該男性之生育力狀態。
- 如請求項46之方法,其中該表徵步驟包含下列步驟:針對經標記之經固定的經體外獲能精子樣本,判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關之生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個 標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較針對該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本的[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比;以及基於該比較鑑定生育力閾值。
- 如請求項46之方法,其進一步包含下列步驟:比較GM1局部化型態的比與具有已知生育力狀態之男性的GM1局部化型態的比。
- 如請求項48之方法,其中該比較步驟包含:針對該經標記之經固定的經獲能精子樣本的預定數目,判定各GM1經標記之局部化型態的數目,及計算AA GM1局部化型態數目與APM GM1局部化型態數目之總和對GM1經標記之局部化型態的總數之總和的比。
- 如請求項46之方法,其中該獲能條件包括暴露至重碳酸鹽離子、鈣離子、及固醇流出之調介物的一或多者。
- 如請求項50之方法,其中該固醇流出之調介物係2- 羥基丙基-β-環糊精、甲基-β-環糊精、血清白蛋白、高密度脂蛋白、磷脂質囊胞、胎兒臍帶血清超濾液、脂肪酸結合蛋白、或脂質體。
- 如請求項51之方法,其中該固醇流出之調介物係2-羥基丙基-β-環糊精。
- 如請求項48之方法,其中該已知生育力狀態對應可孕男性。
- 如請求項48之方法,其中該已知生育力狀態對應不孕男性。
- 如請求項46之方法,其中該固定劑包含聚甲醛、戊二醛或彼等之組合。
- 如請求項46之方法,其中用於GM1局部化型態的該標記分子係經螢光標記之霍亂菌毒素b次單元。
- 如請求項46之方法,其中該鑑定步驟係在該暴露步驟後的2至24小時來進行。
- 如請求項46之方法,其進一步包含下列步驟:在獲得步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用 不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。
- 一種用於判定雄性生育力狀態之方法,其包含下列步驟:獲得精子樣本,其中該精子樣本之至少部分業經曝露至體外獲能條件以獲得經體外獲能精子、業經曝露至固定劑至少1小時、且業經針對GM1染色;獲得一或多個該精子樣本之精液參數值;基於一或多種GM1經標記之局部化型態來判定該經標記之經固定的經體外獲能精子樣本之Cap-Score(獲能分數),該GM1經標記之局部化型態包含頂端頂體(AA)GM1局部化型態、頂體後質膜(APM)GM1局部化型態、襯細胞GM1局部化型態、中間(INTER)GM1局部化型態、頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、赤道節段(ES)GM1局部化型態、和擴散(DIFF)GM1局部化型態;及基於所判定之Cap-Score及該一或多個所獲得之精液參數來計算該男性之男性生育力指數(MFI)值。
- 如請求項59之方法,其中該精子樣本之該一或多個精液參數係選自由下列所組成之群組:原始精子樣本之體積、精子之濃度、精子活動力、及精子之形態。
- 如請求項59之方法,其進一步包含下列步驟:在獲得步驟之前,使用由非金屬材料製成的寬孔吸量管及使用不損害精子細胞膜的試劑來處理精液樣本以降低精液黏度。
- 一種用於判定雄性生育力狀態之方法,其包含下列步驟:以螢光標記處理經體外獲能之精子細胞之樣本;獲得一或多個經獲能之螢光影像,其中該等圖像展示與經螢光標記的經體外獲能之精子細胞相關聯之一或多個GM1局部化型態;將頂端頂體(AA)GM1局部化型態和頂體質膜(APM)GM1局部化型態指派至經獲能態,且將襯細胞GM1局部化型態、中間(INTER)GM1局部化型態、頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、赤道節段(ES)GM1局部化型態、和擴散(DIFF)GM1局部化型態指派至非經獲能態,其各展示在經獲能之螢光影像中;測量GM1局部化型態數量,該等型態包含該AA GM1局部化型態、該APM GM1局部化型態、該襯細胞GM1局部化型態、該中間(INTER)GM1局部化型態、該頂體後質膜(PAPM)GM1局部化型態、該頂端頂體/頂體後(AA/PA)GM1局部化型態、該赤道節段(ES)GM1局部化型態、和該擴散(DIFF)GM1局部化型態,針對經螢光 標記的經體外獲能之精子細胞,展示在經獲能之螢光影像以判定[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比;判定與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的百分比相關之生育力閾值;其中[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之參考百分比,基於已知可孕族群的分布統計,對應於:大於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比表示可孕;小於低於參考平均百分比的一個標準偏差的百分比且大於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示次可孕(sub-fertile);小於低於參考平均百分比的二個標準偏差的百分比表示不孕;比較[(AA GM1局部化型態及APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]之百分比與[(AA GM1局部化型態加上APM GM1局部化型態)/總GM1局部化型態]的參考百分比;以及基於該比較鑑定生育力閾值。
- 如請求項62之方法,其中該鑑定步驟亦係基於下列之一或多者:病患人口統計變項(patient demographics)、女性伴侶之生殖狀態、精子濃度、總活動力、前向活動力(progressive motility)、精液體積、精液pH、精液黏度和/或精子形態及彼等之組合。
- 如請求項62之方法,其中該精子細胞係以獲能條件來體外處理歷時下列之獲能時段:至少一小時;至少3小時;至少12小時;至少18小時;至少24小時;歷時獲能時段範圍在介於0.5小時至3小時;3小時至12小時;6小時至12小時;3小時至24小時;12小時至24小時;或18小時至24小時之間。
- 如請求項62之方法,其中該經體外獲能之精子細胞係以固定劑處理歷時下列之固定劑時段:至少0.5小時;至少3小時;至少12小時;至少18小時;至少24小時;至少30小時;至少36小時;或至少48小時;歷時固定時段範圍在介於0.5小時至3小時;3小時至12小時;6小時至12小時;3小時至18小時;6至18小時;6至24小時;12小時至24小時;18小時至24小時;18至30小時;18至36小時;24至30小時;24至26小時;18至48小時;24至48小時;或36至48小時之間。
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BR112021021574A2 (pt) * | 2019-04-30 | 2022-01-04 | Androvia Lifesciences Llc | Método para identificar uma abordagem reprodutiva em um indivíduo que sofre de uma varicocele |
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005009222A2 (en) * | 2003-07-23 | 2005-02-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method of determining sperm capacitation |
US20100248302A1 (en) * | 2003-07-23 | 2010-09-30 | Travis Alexander J | Method of Determining Sperm Capacitation |
TW201629488A (zh) * | 2014-09-17 | 2016-08-16 | 美國康奈爾大學 | 藉由測定精子獲能以鑑定雄性生殖力狀態 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5994086A (en) * | 1994-03-30 | 1999-11-30 | North Shore University Hospital | Method for assessing infertility by binding of mannose to sperm cells |
US6051603A (en) | 1998-01-20 | 2000-04-18 | Wayne Hughes Institute | Vanadium (IV) metallocene complexes having sperm motility inhibiting activity |
US6835717B2 (en) | 2000-03-08 | 2004-12-28 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | β-cyclodextrin compositions, and use to prevent transmission of sexually transmitted diseases |
US20020064849A1 (en) | 2000-09-05 | 2002-05-30 | Herr John C. | Human soluble testicular adenylyl cyclase |
AU2003239901A1 (en) | 2002-05-28 | 2003-12-12 | Kathy M. Ensrud | Crisp polypeptides as contraceptives and inhibitors of sperm capacitation |
US6913932B2 (en) | 2002-08-23 | 2005-07-05 | Beckman Coulter, Inc. | Formaldehyde-ammonium salt complexes for the stabilization of blood cells |
WO2005099222A1 (en) | 2004-04-05 | 2005-10-20 | Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) | Method, communication device and system for address resolution mapping in a wireless multihop ad hoc network. |
WO2008142396A1 (en) | 2007-05-18 | 2008-11-27 | Anthony Denis Maher | Methods of assessing male fertility using a uridine marker |
CA2761943A1 (en) * | 2009-05-14 | 2010-11-18 | Streck, Inc. | Sample processing cassette, system, and method |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005009222A2 (en) * | 2003-07-23 | 2005-02-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method of determining sperm capacitation |
US20100248302A1 (en) * | 2003-07-23 | 2010-09-30 | Travis Alexander J | Method of Determining Sperm Capacitation |
TW201629488A (zh) * | 2014-09-17 | 2016-08-16 | 美國康奈爾大學 | 藉由測定精子獲能以鑑定雄性生殖力狀態 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Selvaraj et al., "GM1 Dynamics as a Marker for Membrane Changes Associated With the Process of Capacitation in Murine and Bovine Spermatozoa", Journal of Andrology, 2007, 28(4), pp 588-599. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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