BR112020022277A2 - métodos e kits de teste para determinar o estado de fertilidade masculina - Google Patents
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Abstract
Esta divulgação fornece um método
para determinar o estado de fertilidade masculina, e sua relação com a
probabilidade de gerar uma gravidade, conforme calculado usando um
modelo de regressão. O método compreende a determinação dos padrões de
localização GM1 após a capacitação induzida indução do esperma, a
identificação da porcentagem de vários padrões, particularmente a razão
de [(AA+APM)/número total de padrões de localização GM1] e determinar se
a porcentagem de certos padrões de localização GM1 em resposta à
capacitação induzida é alterada. Com base na mudança na porcentagem dos
padrões de localização de certos padrões em resposta à capacitação
induzida, isoladamente ou em combinação com outros atributos do esperma,
o estado de fertilidade masculina pode ser identificado.
Description
[0001] Esta invenção relata geralmente para o campo da fertilidade masculina e mais especificamente, para determinar o estado de fertilidade masculina baseado nos padrões de distribuição de gangliosídeos GM1 após capacitação induzida de espermatozoide.
[0002] Nos EUA, 10% dos casais têm consultas médicas relacionada com infertilidade com 40% dos casos de infertilidade associados ao sexo masculino. Globalmente, isso se traduz em mais de 73 milhões de casais inférteis. Tipicamente os exames de saúde reprodutivo masculino avaliam o número, aparência e motilidade dos espermatozoides. Infelizmente, metade dos homens inférteis têm espermatozoide que atendem aos parâmetros normais para esses critérios descritivos e só são identificados como tendo “infertilidade idiopática” depois de falhas repetidamente na concepção natural e técnicas de reprodução assistida, tal como inseminação intra-uterina (Intra-Uterine Insemination - IUI). Como cada ciclo fracassado inflige grandes prejuízos físicos, emocionais e financeiros aos casais e custa ao sistema de saúde dos Estados Unidos mais de US $5 bilhões anualmente, existe uma necessidade enorme para um teste prático sobre a função do espermatozoide. Os dados sobre função do espermatozoide permitiram aos médicos direcionar seus pacientes para uma tecnologia de reprodução assistida que lhes daria a melhor chance de engravidar.
[0003] Após entrada no trato feminino, os espermatozoides não são imediatamente capazes de fertilizar um óvulo. Em vez disso, eles devem passar por um processo de maturação funcional conhecido como “capacitação.” Este processo depende de sua capacidade de responder a estímulos específicos por ter alterações específicas em sua membrana celular, a saber uma alteração no padrão de distribuição de gangliosídeos GM1 em resposta à exposição a estímulo de capacitação.
[0004] Vários padrões de localização GM1 foram identificados e associados com capacitação ou não capacitação. Em particular, padrões de localização acrossomo apical (AA) GM1 e padrões de localização da membrana plasmática acrossomal (APM) GM1 foram associados com capacitação em espermatozoide bovino e humano. A capacitação do espermatozoide pode ser expressa quantitativamente como um valor Cap-Score™, gerado através do Teste de Função do Espermatozoide Cap-Score™ ou Cap-Score™ Fertilidade masculina Ensaio (“Cap-Score™ Test” ou “Cap-Score™”), que definido como ([número de acrossomo apical (AA) padrões de localização GM1 + número de padrões de localização da membrana plasmática acrossomal (APM) GM1]/número total de padrões de localização rotulado GM1) onde o número de cada padrão de localização é medido e então finalmente convertido para uma pontuação percentual. Além dos padrões de localização APM GM1 e padrões de localização AA GM1, os outros padrões de localização rotulado incluíram padrões de localização Célula Alinhada GM1, padrões de localização intermediário (INTER) GM1, padrões de localização pós membrana plasmática acrossomal (PAPM) GM1, padrões de localização apical acrossomo / pós acrossomo (AA/PA) GM1,
padrões de localização do segmento equatorial (ES) GM1, e padrões de localização difusos (DIFF) GM1. (Travis et al., “Impacts of common semen handling methods on sperm function”, The Journal of Urology, 195 (4), e909 (2016)).
[0005] Em uma concretização da invenção, são divulgados neste documento métodos e kits para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, esta divulgação descreve um método para identificar o estado de fertilidade masculina baseado em uma mudança no número de certos padrões de localização GM1 em resposta a pelo menos um estímulo de capacitação.
[0006] Uma concretização divulgada neste documento é um método para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, o método compreende as seguintes etapas: Uma amostra de células de espermatozoide expostos para estímulo de capacitação é tratada com um rotulo fluorescente. Uma ou mais imagens fluorescentes de tais células de espermatozoide são obtidas caracterizadas por as imagens exibirem um ou mais padrões de localização GM1. células de espermatozoide que expressam um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) são atribuídos a um estado capacitado e todos os outros padrões de localização rotulado fluorescente GM1 são atribuídos para um estado não capacitado. Os padrões de localização GM1 não capacitado incluem INTER, PAPM (Pós membrana plasmática acrossomal), AA/PA (Apical acrossomo / pós acrossomo), ES (segmento equatorial) DIFF (Difuso), e Célula Alinhada. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é determinada. Em uma concretização, um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é determinado, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é baseada na estatística de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem de um desvio padrão abaixo porcentagem média de referência indicada fértil; menos do que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indica sub fértil; menos de uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indica infértil. Em uma concretização, a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1total] para os rotulados, amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0007] Em outra concretização, um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1total] é determinado, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização
GM1 total] é baseado nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicada para fertilidade masculina normal; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicada para fertilidade masculina anormal. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] for o rotulado, amostra de espermatozoide capacitada fixa é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0008] Em outra concretização divulgada neste documento é um método para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, o método inclui expor uma primeira porção de uma amostra de espermatozoide de um homem com condições de não capacitação para obter uma amostra de espermatozoide não capacitada in vitro; expor uma segunda porção da amostra de espermatozoide para condições de capacitação para obter uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro; fixar a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro com um fixador por um período de tempo de pelo menos: uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, dez horas, onze horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas; tratar a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro fixa e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa com uma molécula rotulada por padrões de localização
GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável; identificação de mais de um padrão de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide não capacitada rotulada in vitro rotulada fixa e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa, a referida padrões de localização GM1rotulado tendo um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização da Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1rotulado; comparar os padrões de localização GM1 rotulado com a amostra de espermatozoide não capacitado in vitro fixa rotulada como os padrões de localização GM1 rotulado para as amostras de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa; com base na comparação, atribuindo o padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e o padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) para um estado capacitado e atribuindo o padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado; e caracterizar um estado de fertilidade do homem com base em padrões de localização GM1 rotulado identificado para a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro fixa marcada e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa.
Em uma concretização, a etapa de caracterizar compreender as etapas de: determinar um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa; caracterizado por a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indica fértil; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando sub fértil; maior que dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando infértil. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0009] Em outra concretização, um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] é determinada, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina normal; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina anormal. A porcentagem de [(padrões de localização
AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0010] Em uma concretização, antes da etapa de exposição, uma amostra sêmen é tratada para diminuir a viscosidade do sêmen usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica a membrana do espermatozoide escolhido a partir dos vários reagentes que são usados para reduzir a viscosidade do sêmen. Em algumas dessas concretizações, os reagentes que potencialmente danificam a membrana podem incluir (i) uma protease; (ii) uma nuclease (iii) um agente mucolítico; (iv) uma lipase; (v) uma esterase e (vi) hidrolases de glicosídeo. Em algumas concretizações, a etapa de identificação é repetida até que o número de Célula Alinhada GM1 padrões de localização seja substancialmente constante. Em uma tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, a determinação do número de Célula Alinhada GM1 padrões de localização, para o espermatozoide capacitado in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a 5%, inferior a 3% do número total de células rotuladas; ou variar de 1% a 5%, 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em outra tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, o número de Célula Alinhada GM1 padrões de localização, para o espermatozoide não capacitado in vitro rotulado fixo ser determinado até o número ser inferior a:
25%, 20%, 15% ou 10% do número total de células rotuladas; ou variar de 2% a 25%; 2% a 20%; 2 a 15%; 2 a 10%; 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em algumas concretizações a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1 mm, 1,2 mm ou 1,4 mm.
[0011] Em outra tal concretização, a etapa de caracterizar adicionalmente inclui as etapas de: determinar o número de cada GM1 padrões de localização rotulado para um número predeterminado do amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulado fixo; determinar o número de cada GM1 padrões de localização rotulado para um número predeterminado da amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa; calcular uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de GM1 padrões de localização rotulado para a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulado fixo; e calcular uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de GM1 padrões de localização rotulado para uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa.
[0012] Em uma concretização divulgada neste documento o método inclui adicionalmente as etapas de: comparar a razão de espermatozoide não capacitado in vitro rotulado fixo com uma razão de espermatozoide não capacitado in vitro rotulado fixo, tendo um estado de fertilidade conhecido; e comparar a razão para o espermatozoide capacitado in vitro rotulado fixo com uma razão de espermatozoide capacitado in vitro rotulado fixo, tendo um estado de fertilidade conhecido.
[0013] Ainda em outra concretização divulgada neste documento está um método para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, o método inclui as etapas de: obter uma primeira porção de uma amostra de espermatozoide de um homem que foi exposto à condição de não capacitação in vitro, fixado em um fixador por pelo menos: uma hora, duas horas, quatro horas, oito horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas, e tratada com a molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável; obter uma segunda porção da amostra de espermatozoide que foi exposta a condições de capacitação in vitro, fixada em um fixador, e tratada com a molécula rotulada por padrões de localização GM1; identificar mais que um padrão de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa, sendo os referidos padrões de localização GM1 rotulado um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; comparar os padrões de localização GM1 rotulado com a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa com o padrões de localização GM1 rotulado com a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa; com base na comparação, atribuir o padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e a padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) para um estado capacitado e atribuir o padrão de localização da Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado; e caracterizar um estado de fertilidade do homem com base na identificação dos padrões de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa.
Em uma tal concretização, a etapa de caracterizar compreende as etapas de: determinar um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa; caracterizado por a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1total], com base em estatísticas de distribuição de uma população fértil correspondente conhecida para: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fértil; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando sub fértil; inferior a uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando infértil; comparando a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] para uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada para a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização
GM1 total] e identificar o limite de fertilidade com base na comparação.
[0014] Em outra concretização, um limite de fertilidade associado com a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é determinada, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicada para fertilidade masculina normal; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade anormal. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0015] Em algumas concretizações, a etapa de identificação é repetida até que o número de padrões de localização de Célula Alinhada GM1 seja substancialmente constante. Em uma tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização Célula Alinhada GM1, para os espermatozoide capacitados in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a 5%, inferior a 3% do número total de células rotuladas; ou varie de 1% a 5%, 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em outra tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização de Célula Alinhada GM1, para os espermatozoides não capacitados in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a: 25%, 20%, 15% ou 10% do número total de células rotuladas; ou variar de 2% a 25%; 2% a 20%; 2 a 15%; 2 a 10%; 2 a 5% do número total de células rotuladas.
[0016] Em uma concretização de tal método, o método inclui adicionalmente as etapas de: determinar o número de cada padrões de localização GM1 rotulado para um número predeterminado da amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa, e calcular uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma do número total de padrões de localização GM1 cada para a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa.
[0017] Em outra concretização, a etapa de caracterizar inclui adicionalmente as etapas de: comparar a razão para uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa para razões de padrões de localização GM1 de espermatozoide capacitado in vitro para homens, tendo um estado de fertilidade conhecido; e comparar a razão para amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulado fixo com as razões de padrões de localização GM1 espermatozoide não capacitado in vitro para homens, tendo um estado de fertilidade conhecido.
[0018] Ainda em outra concretização um método é divulgado neste documento para determinar o estado de fertilidade masculina.
Em uma concretização, o método inclui as etapas de: expor, a amostra de espermatozoide in vitro, de um homem para condições de capacitação; fixar a amostra de espermatozoide capacitada com um fixador por pelo menos: uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, dez horas, onze horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas; tratar a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa com uma molécula rotulada para padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável; identificar mais de um padrão de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa, os referidos padrões de localização GM1 rotulado, tendo um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; atribuir o padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e o padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) para um estado capacitado e atribuir o padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulados para um estado não capacitado; e caracterizar o estado de fertilidade do homem.
Em uma concretização, a etapa de caracterizar compreender as etapas de: determinar um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/total padrões de localização GM1] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa; caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fértil; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando sub fértil; inferior a dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando infértil; comparar a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa para a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] e identificar o limite de fertilidade com base na comparação.
[0019] Em outra concretização, um limite de fertilidade associado com a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] é determinada, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina normal; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina anormal. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] para uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0020] Em uma concretização, antes da etapa de exposição, uma amostra de sêmen é tratada para reduzir a viscosidade do sêmen, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica a membrana do espermatozoide escolhido a partir de vários reagentes que são utilizados para reduzir a viscosidade do sêmen. Em algumas concretizações, o reagente que danifica a membrana pode ser potencialmente selecionado a partir do grupo consistindo em: (i)um a protease; (ii) uma nuclease (iii) um agente mucolítico; (iv) uma lipase; (v) uma esterase e (vi) hidrolases de glicosídeo. Em algumas concretizações, a etapa de identificação é repetida até que o número de Célula Alinhada GM1 padrões de localização seja substancialmente constante. Em uma tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de Célula Alinhada GM1 padrões de localização, para os espermatozoides capacitados in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a 5%, inferior a 3% do número total de células rotuladas; ou varie entre 1% a 5%, 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em outra tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de Célula
Alinhada GM1 padrões de localização, para o espermatozoide não capacitado in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a: 25%, 20%, 15% ou 10% do número total de células rotuladas; ou varie entre 2% a 25%; 2% a 20%; 2 a 15%; 2 a 10%; 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em algumas concretizações a pipeta de orifício largo tem um tamanho de calibre de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1 mm, 1,2 mm ou 1,4 mm.
[0021] Em uma concretização de tal método, o método inclui adicionalmente as etapas de: comparar a razão de padrões de localização GM1 com as razões de padrões de localização GM1 para homens, tendo um estado de fertilidade conhecido. Em uma tal concretização, a etapa de comparar inclui as etapas de: determinar o número de cada padrões de localização GM1 rotulado para um número predeterminado de amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulado fixa, e calcular uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1rotulado.
[0022] Em outra concretização é divulgado neste documento um método para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, o método inclui as etapas de: obter uma primeira porção de uma amostra de espermatozoide de um homem que foi exposta a condições de capacitação in vitro, fixada em um fixador por pelo menos: uma hora, duas horas, quatro horas, oito horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas, e marcada com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável; identificar mais que um padrão de localização GM1rotulado para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa, o referido padrão de localização GM1 sendo um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; atribuir o padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e o padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) para um estado capacitado e atribuir o padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado; e caracterizar um estado de fertilidade do homem.
Em algumas concretizações, a etapa de caracterizar compreende as etapas de: determinar um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa; caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indica fértil; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que é dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando sub fértil; inferior a uma porcentagem que é dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando infértil; comparar a porcentagem de [(padrões de localização
AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] com a amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] e identificar o limite de fertilidade com base na comparação.
[0023] Em outra concretização, um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] é determinado, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina normal; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina anormal. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] para uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0024] Em algumas concretizações, a etapa de identificação é repetida até que o número de Célula Alinhada GM1 padrões de localização seja substancialmente constante. Em uma tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada,
determinar o número de Célula Alinhada GM1 padrões de localização, para os espermatozoides capacitados in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a 5%, inferior a 3% do número total de células rotuladas; ou varie entre 1% a 5%, 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em outra tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de Célula Alinhada GM1 padrões de localização, para os espermatozoides não capacitados in vitro fixo rotulado até que o número seja inferior a: 25%, 20%, 15% ou 10% do número total de células rotuladas; ou varie de 2% a 25%; 2% a 20%; 2 a 15%; 2 a 10%; 2 a 5% do número total de células rotuladas.
[0025] Em uma concretização de tal método, o método inclui adicionalmente as etapas de: comparar a razão de padrões de localização GM1 com as razões de padrões de localização GM1 para homens, tendo um estado de fertilidade conhecido. Em uma tal concretização, a etapa de comparação inclui as etapas de: determinar o número de cada padrão de localização GM1 rotulado com um número predeterminado da amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa, e calcular uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e o número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1 rotulado.
[0026] Em outra concretização é divulgado neste documento um método para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, o método inclui as etapas de: obter uma amostra de espermatozoide, caracterizada por pelo menos uma porção da amostra de espermatozoide ser exposta a condições de capacitação in vitro para obter espermatozoide capacitado in vitro, foi exposto a um fixador por pelo menos:
uma hora, duas horas, quatro horas, oito horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas, e foi marcado por GM1; obtendo valores para um ou mais parâmetros de sêmen da amostra de espermatozoide; determinar um Cap-Score da amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulada fixa com base em um ou mais padrões de localização GM1 rotulado, os referidos padrões de localização GM1rotulado, tendo um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um pós padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; e calcular um valor de índice de fertilidade masculina (MFI - Male Fertility Index) do homem com base na pontuação CAP determinada e um ou mais parâmetros de sêmen obtidos. Em uma concretização, um ou mais parâmetros de sêmen da amostra de espermatozoide são selecionados a partir do grupo, consistindo em volume da amostra original de espermatozoide, concentração de espermatozoide, motilidade de espermatozoide, e morfologia de espermatozoide. Em algumas concretizações, a etapa de identificação é repetida até que o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada seja substancialmente constante
[0027] Em uma tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada, para os espermatozoides capacitados in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a 5%, inferior a 3% do número total de células rotuladas; ou varie entre 1% a 5%, 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em outra tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada,
determinar o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada, para os espermatozoides não capacitados in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a: 25%, 20%, 15% ou 10% do número total de células rotuladas; ou varie de 2% a 25%; 2% a 20%; 2 a 15%; 2 a 10%; 2 a 5% do número total de células rotuladas.
[0028] Em várias concretizações dos métodos descritos neste documento, mais do que um dos padrões de localização GM1 rotulado compreende o padrão de localização AA GM1, padrão de localização, APM GM1 padrão de localização Célula Alinhada GM1, padrão de localização intermediário (INTER) GM1, padrão de localização pós membrana plasmática acrossomal (PAPM) GM1, padrão de localização apical acrossomo / pós acrossomo (AA/PA) GM1, padrão de localização do segmento equatorial (ES) GM1, e padrão de localização difuso (DIFF) GM1.
[0029] Em uma concretização, expor a primeira porção da amostra de espermatozoide para a condição de não capacitação e expor a segunda porção da amostra de espermatozoide para a condição de capacitação que ocorrem simultaneamente.
[0030] Em uma concretização é divulgado neste documento um kit para identificar um estado de fertilidade de um homem, compreendendo: um diagrama que ilustra um ou mais padrões de localização GM1 de espermatozoide capacitados e um dos mais padrões de localização GM1 de espermatozoide não capacitado, caracterizado por os referidos padrões de localização GM1 de espermatozoide capacitados e padrões de localização GM1 de espermatozoide não capacitado são reflexos do estado de fertilidade conhecido; uma pipeta de orifício largo, tendo um orifício de tamanho suficiente em diâmetro para evitar o cisalhamento de uma membrana de espermatozoide; um ou mais dos seguintes: meio capacitante, meio não capacitante, composição fixadora, reagentes de marcação para determinar os padrões de localização GM1; com a condição de que a composição fixadora não danifique a membrana do espermatozoide, caracterizado por o meio capacitante e o meio não capacitante, quando aplicados in vitro para células de espermatozoide, produzir padrões de localização GM1 indicativos de espermatozoide capacitados e padrões indicativos de espermatozoide não capacitado conforme refletido no diagrama. Em uma concretização, o kit contém instruções para o manuseio do espermatozoide, de modo a evitar danificar a membrana de espermatozoide. Em algumas concretizações a pipeta de orifício largo tem um tamanho de calibre de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1 mm, 1,2 mm ou 1,
[0031] Em certas concretizações descritas neste documento, as condições de capacitação in vitro inclui exposição para um ou mais íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um mediador de efluxo de esterol. Em algumas concretizações, o mediador de efluxo de esterol é 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, lipoproteína alta densidade, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultrafiltrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou lipossomas. Em uma concretização, o mediador de efluxo de esterol é 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina.
[0032] Em uma concretização, as condições de não capacitação incluem a falta de exposição a um ou mais íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um mediador de efluxo de esterol.
[0033] Em certas concretizações descritas neste documento, o fixador é um fixador de aldeído. Em uma concretização, o fixador inclui paraformaldeído, glutaraldeído ou suas combinações. Em certas concretizações, a molécula de afinidade para GM1 é a subunidade b da toxina da cólera rotulada com fluorescência.
[0034] Em certas concretizações descritas neste documento, o método compreende caracterizar um estado de fertilidade do homem, aplicando um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado para os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide, caracterizado por os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide compreender uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado (por exemplo, uma razão de espermatozoide, exibindo um estado capacitado para um número total de espermatozoide atribuídos) é descrito.
[0035] Em certas concretizações da invenção descritas neste documento, o classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado é um modelo de regressão logístico (por exemplo, da forma: 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) caracterizado por: f(X) ser uma medida de fertilidade, i ser um número inteiro positivo, α ser parâmetro determinado durante o preparo do classificador pré-preparado, e β0, β1, . . ., βi serem parâmetros determinados durante o preparo do classificador pré-preparado, e cada Xj em {X1, . . ., Xi} ser um dado nos dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide).
[0036] Em certas concretizações é descrito um sistema para preparar um classificador de fertilidade para caracterizar um estado de fertilidade de um homem. Em uma concretização, o sistema compreender pelo menos um processador e memória endereçável por pelo menos um processador, a memória de armazenamento pelo menos um programa para execução por pelo menos um processador, ou pelo menos um programa compreendendo instruções para: A) obter um conjunto de preparo que compreende dados da amostra de espermatozoides de uma pluralidade de homens associados com um resultado conhecido de uma tentativa de reprodução assistida (por exemplo, inseminação intrauterina (IUI)), caracterizado por os dados de cada respectiva amostra de sêmen compreender uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado de espermatozoide na respectiva amostra de sêmen (por exemplo, uma razão de espermatozoide, exibindo um estado capacitado para um número total de espermatozoide atribuído); e B) preparar um ou mais classificadores de fertilidade com base em pelo menos uma correspondência entre o resultado da reprodução assistida e a proporção correspondente entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado de espermatozoide em cada respectiva amostra de sêmen.
[0037] Em certas concretizações é descrito um método para identificar uma abordagem reprodutiva. Em uma concretização, o método inclui determinar um Cap-Score de acordo com a presente invenção, determinar uma probabilidade de gravidez dentro de três meses de concepção natural dentro de três tentativas de inseminação intrauterina, usando um modelo de regressão logístico como descrito na presente invenção, e determinar uma abordagem reprodutiva para alcançar a gravidez com base no referido valor.
[0038] O resumo anterior, bem como a seguinte descrição detalhada de concretizações dos métodos e kits para determinar o estado de fertilidade masculina, serão mais bem compreendidos, quando lidos em conjunto com os desenhos anexos. Deve ser entendido, no entanto, que a invenção não está limitada para as precisas disposições e instrumentalidades mostradas.
[0039] Nos desenhos:
[0040] A Figura mostra padrões de localização de GM1 de INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES, e DIFF em espermatozoide e espermatozoide humanos normais de homens inférteis sob condições de não capacitação ou condições de capacitação;
[0041] A Figura 2A mostra a distribuição relativa dos padrões de localização de GM1 de INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES, e DIFF em espermatozoide humano normal sob condições de não capacitação;
[0042] A Figura 2B mostra as distribuições relativas dos padrões de localização de GM1 de INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES, e DIFF em espermatozoide humano normal sob condições de capacitação;
[0043] A Figura 2C mostra as distribuições relativas dos padrões de localização de GM1 de INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES, e DIFF em espermatozoide humano de homens inférteis sob condições de capacitação;
[0044] A Figura 3 mostra o número relativo dos padrões de localização APM e AA combinados como uma função de tempo de incubação no espermatozoide humano para um grupo de homens normal e em espermatozoide humano para um grupo de homens inférteis, sob condições de capacitação e condições de não capacitação, e os resultados clínicos para cada grupo de homens;
[0045] A Figura 4 mostra a porcentagem de padrões de localização AA e APM em espermatozoide de doadores férteis incubados com estímulos que promovem capacitação;
[0046] A Figura 5 mostra uma comparação da porcentagem de padrões de localização AA e APM em espermatozoide de doadores suspeitos de serem sub férteis/inférteis com os limiares estatísticos de homem fértil; e
[0047] As Figuras 6A, 6B, 6C, e 6D mostram padrões de localização GM1 de GM1 de Célula Alinhada em espermatozoide de homens inférteis sob condições de capacitação.
[0048] A Figura 7 ilustra um modelo de regressão logístico de fertilidade masculina com base no conjunto de preparo de resultados de reprodução assistida em várias clínicas escritas no Exemplo 7.
[0049] As Figuras 8A, 8B, 8C, e 8D mostram o uso de regressão logística para demonstrar a forte relação entre Cap-Score™ e a probabilidade de gerar uma gravidez em três tentativas de inseminação intrauterina (PGP). A Figura 8A mostra dados do Exemplo 7, PGP=1/[1+exp[-[-2,863+0,0776*Cap-Score]]]; n=124;
p<0,01. Para teste de ajuste do modelo, 128 pontos de dados adicionais foram acrescentados, para um total de n=252. A Figura 8B mostra os dados do Exemplo 8, PGP=1/[1+exp[-[- 2,263+0,0593*Cap-Score]]]; p<0,001. Só uma pequena mudança de média foi observada (média de 2,6%) para qualquer Cap- Score™, e o ajuste do modelo melhorou. As Figuras 8C e 8D ilustram os resultados de PGP versus gravidezes observadas em 3 tentativas de inseminação intrauterina.
[0050] Com referência aos desenhos anexos, várias concretizações da presente invenção são descritas mais detalhadamente abaixo. Algumas, mas não todas as concretizações da presente invenção, são mostradas. Na verdade, várias concretizações da invenção podem ser realizadas de muitas formas diferentes e não deve ser interpretada como limitada para as concretizações expressamente descritas. Deve ser entendido que pelo menos algumas das figuras e descrições da invenção foram simplificadas para concentrar nos elementos que são relevantes para uma compreensão clara da invenção, embora eliminada, para o propósito de clareza, outros elementos que aqueles experientes na matéria apreciarão também podem compreender uma parte da invenção. No entanto, porque tais elementos são bem conhecidos na matéria, e porque eles não facilitam necessariamente uma melhor compreensão da invenção, uma descrição de tais elementos não é fornecida neste documento.
[0051] Toda e qualquer referência identificada neste documento é incorporada por referência em sua totalidade.
[0052] A menos que especificamente estabelecido neste documento, os termos “um”, “uma”, “o” e “a” não estão limitados para um elemento, mas em vez disso devem ser lidos como significando “pelo menos um”.
[0053] “Cerca de” é entendido para significar um intervalo de + e – 10% do valor referenciado. No entanto, o uso de “cerca de” em referência para um valor não exclui a possibilidade do valor de referência sozinho. Por exemplo, “cerca de 1 hora” é entendido como suportar total de “54 minutos,” “1 hora,” e “66 minutos.”
[0054] A presente divulgação é baseada nas observações que certos padrões de localização GM1 podem fornecer informações com relação ao estado de fertilidade masculina. A determinação de padrões de localização GM1 é descrito na Patente USA Nos. 7,160,676, 7,670,763, e 8,367,313, cuja divulgação estão incorporadas neste documento por referência. Estas divulgações fornecem métodos e kits para determinação do estado de fertilidade masculina. Em certas concretizações, o método é baseado na alteração na porcentagem de certos padrões de localização GM1 após exposição para estímulo de capacitação in vitro. Em outras concretizações, o método é baseado especificamente em uma alteração na porcentagem de um padrão de localização Célula Alinhada GM1 após a exposição para estímulos de capacitação in vitro.
[0055] Em uma concretização, é divulgado neste documento um método para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, o método inclui submeter uma amostra de espermatozoide de um indivíduo para condição de capacitação in vitro e condições de não capacitação in vitro, determinar uma alteração na porcentagem de certos padrões de localização GM1 após a exposição para condições de capacitação in vitro,
e com base no nível de alteração, identificar o estado de fertilidade.
[0056] O termo espermatozoide “capacitado in vitro” refere- se a espermatozoides que foram incubados sob condições que promovem o processo de capacitação. Em uma concretização, as condições de capacitação incluem a presença no meio de um ou mais de íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um aceitador de esterol, por exemplo, albumina sérica ou a ciclo dextrina. Em uma concretização, condições de capacitação in vitro inclui a presença de íons de bicarbonato e de cálcio no meio e a presença de um aceitador de esterol. Em uma concretização, um aceitador de esterol é um mediador de efluxo de esterol. Os espermatozoides capacitados adquiriram a capacidade de sofrer exocitose acrossômica e adquirir um hiperativado de motilidade. O termo espermatozoide “não capacitado in vitro” refere-se a espermatozoides que não são incubados com um ou mais dos estímulos listados acima para capacitação. Em uma concretização, as condições de não capacitação incluem a ausência de condições de capacitação. Em outra concretização, as condições de não capacitação incluem a ausência de um ou mais dos estímulos necessários para a capacitação. Os espermatozoides não capacitados não sofrem exocitose acrossômica induzida por ligante fisiológico, tal como a zona pelúcida, proteínas solubilizadas da zona pelúcida, ou progesterona. Além disso, os espermatozoides incubados sob condições de não capacitação também não demonstrarão motilidade hiperativada.
[0057] Em uma concretização, a capacitação pode ser induzida in vitro pela exposição a estímulos externos, tal como bicarbonato e íons de cálcio, e mediadores de efluxo de esterol, por exemplo, 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, alta densidade lipoproteína, vesículas de fosfolipídios, lipossomas, etc. Em certas concretizações, uma mudança identificável no padrão de localização GM1 é observado, quando os espermatozoides são expostos para um ou mais desses estímulos in vitro.
[0058] Em uma concretização, após a coleta, as amostras de sêmen são tipicamente processadas de alguma forma, incluindo um ou mais dos seguintes: liquefação, lavagem e/ou enriquecimento. Em algumas concretizações, a liquefação envolve permitir que a amostra liquefaça à temperatura ambiente ou a 37˚C (ou qualquer temperatura entre elas) por vários períodos de tempos (tipicamente 15-20 minutos, mas variando de 10-60 minutos). A liquefação é um processo através do qual o plasma seminal se transforma de um gel para uma consistência mais fluido/líquido. O plasma seminal normalmente se liquefaz sem qualquer manipulação, mas com amostras especialmente viscosas, ou se houver um desejo de acelerar o processo ou fazer um protocolo de liquefação consistente pelo qual todas as amostras são manipuladas, indivíduos podem manipular a amostra para alcançar a liquefação. Em certas concretizações, a amostra de sêmen é manipulada para reduzir a viscosidade do sêmen, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico. Em algumas concretizações a pipeta de orifício largo tem um tamanho de calibre de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1 mm, 1,2 mm ou 1,4 mm. Em certas concretizações, também se pode alcançar a liquefação, adicionando vários reagentes que não danificam a membrana do espermatozoide. Os reagentes que devem ser evitados são aqueles que danificam a membrana do espermatozoide. O espermatozoide pode ser lavado por centrifugação e ressuspenso e submetido a análise de sêmen e/ou ser submetido para processos de seleção, incluindo: camadas no topo, e centrifugação através de um gradiente de densidade; camadas no topo, e centrifugação através de um gradiente de densidade, seguido pela coleta da fração enriquecida de espermatozoide, seguida por ressuspensão e lavagem; camadas no topo, e centrifugação através de um gradiente de densidade seguido pela coleta da fração enriquecida do espermatozoide e sobreposição no topo desse meio menos denso para o qual os espermatozoides móveis irão flutuar; ou sobrepondo um meio menos denso no topo da amostra e permitindo que o espermatozoide móvel flutue para dentro dele.
[0059] Após o processamento inicial, os espermatozoides podem ser contados, e um determinado número de espermatozoides podem ser colocados em recipientes (tais como tubos), contendo meio não capacitado in vitro ou meio capacitado in vitro para alcançar as concentrações finais desejadas. Em uma concretização, a concentração final típica de espermatozoides é 1.000.000/ml (os intervalos de concentração final podem variar de 250.000/ml-
250.000.000/ml).
[0060] O meio de base para incubar o espermatozoide sob condições de não capacitação in vitro e capacitação in vitro pode ser uma solução fisiológica tamponada, tal como, mas não limitada para, fluido tubário humano (HTF - Human Tubal
Fluid); fluido tubário humano modificado (mHTF - modified Human Tubal Fluid); meio de Whitten; meio de Whitten modificado; KSOM; solução salina tamponada de fosfato; solução salina tamponada de HEPES; solução salina tamponada de Tris; F-10 de Ham; meio de Tyrodeo; meio de Tyrodeo modificado; tampão yolk TES-Tris (TEST); ou meio Biggers, Whitten e Whittingham (BWW). O meio de base pode ter uma ou mais fontes definidas ou complexas de proteína e outros fatores adicionados, incluindo soro de cordão fetal ultrafiltrado, Plasmanato, gema de ovo, leite desnatado, albumina, lipoproteínas, ou proteínas de ligação de ácidos graxos, para promover viabilidade ou em concentrações suficientes para ajudar a induzir a capacitação. Os estímulos típicos para capacitação incluem um ou mais dos seguintes: bicarbonato (tipicamente a 20-25 mM, com intervalo de 5-50 mM), cálcio (tipicamente a 1-2 mM, com intervalo de 0,1-10 mM), e/ou ciclo dextrina (tipicamente a 1-3 mM, com intervalo de 0,1-20 mM). As ciclo dextrinas podem compreender 2- hidroxi-propil-β-ciclo dextrina e/ou metil-β-ciclo dextrina. As temperaturas de incubação são tipicamente 37°C (variando de 30°C-38°C), e os tempos de incubação são tipicamente 1-4 horas (variando de 30 minutos a 18 horas), embora as amostras de linha base possam ser coletadas no início do período de incubação (“tempo zero”).
[0061] Em uma concretização, para geração de padrões de GM1, os espermatozoides são lavados com um meio de base padrão (por exemplo, solução salina tamponada de fosfato, meio de Whitten modificado, ou outro meio semelhante) e incubados com uma molécula rotulada para GM1 que tem um rótulo detectável no mesmo. Uma vez que GM1 possui resíduos de açúcar extracelular que podem servir com um epitope, ele pode ser visualizado sem a necessidade de fixar e permeabilizar as células. No entanto, a fixação das células resulta em melhor preservação do espécime, visualização mais fácil (comparada com padrões discerníveis em espermatozoide nadadores) e permite maior tempo de visualização, ao mesmo tempo que contribui para a formação de padrões. Vários fixadores conhecidos para estudo histológico de espermatozoides estão dentro do alcance dos experientes na matéria. Os fixadores adequados incluem paraformaldeído, glutaraldeído, fixador de Bouin, e fixadores, compreendendo cacodilato de sódio, cloreto de cálcio, ácido pícrico, ácido tânico e semelhantes. Em uma concretização, paraformaldeído, glutaraldeído ou suas combinações são usados.
[0062] As condições de fixação podem variar de cerca de 0,004% (peso/volume) de paraformaldeído a cerca de 4% (peso/volume) paraformaldeído, embora cerca de 0,01% a cerca de 1% (peso/volume) paraformaldeído seja tipicamente usado. Em uma concretização, cerca de 0,005% (peso/volume) de paraformaldeído a cerca de 1% (peso/volume) paraformaldeído pode ser usado. Em uma concretização, cerca de 4% paraformaldeído (peso/volume), cerca de 0,1% glutaraldeído (peso/volume) e cerca de 5 mM CaCl2 em solução salina tamponada de fosfato possam ser usados.
[0063] O período de tempo que uma amostra de espermatozoide é fixada em um fixador pode variar. Em uma concretização, uma amostra de espermatozoide é fixada em fixador por cerca de 5 horas ou menos. Em uma concretização, uma amostra de espermatozoide é fixada em um fixador por mais de cerca de 5 horas. Em outra concretização, uma amostra de espermatozoide é fixada em um fixador por cerca de 0,5 horas, por cerca de 1 hora, por cerca de 1,5 horas, por cerca de 2 horas, por cerca de 2,5 horas, por cerca de 3 horas, cerca de 3,5 horas, cerca de 4 horas, cerca de 4,5 horas, cerca de 5 horas, cerca de 5,5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 6,5 horas, cerca de 7 horas, cerca de 7,5 horas, cerca de 8 horas, cerca de 8,5 horas, cerca de 9 horas, cerca de 9,5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 10,5 horas, cerca de 11 horas, cerca de 11,5 horas, cerca de 12 horas, cerca de 12,5 horas, cerca de 13 horas, cerca de 13,5 horas, cerca de 14 horas, cerca de 14,5 horas, cerca de 15 horas, cerca de 15,5 horas, cerca de 16 horas, cerca de 16,5 horas, cerca de 17 horas, cerca de 17,5 horas, cerca de 18 horas, cerca de 18,5 horas, cerca de 19 horas, cerca de 19,5 horas, cerca de 20 horas, cerca de 20,5 horas, cerca de 21 horas, cerca de 21,5 horas, cerca de 22 horas, cerca de 22,5 horas, cerca de 23 horas, cerca de 23,5 horas, cerca de 24 horas, cerca de 24,5 horas, cerca de 25 horas, cerca de 25,5 horas, cerca de 26 horas, cerca de 26,5 horas, cerca de 27 horas, cerca de 27,5 horas, cerca de 28 horas, cerca de 28,5 horas, cerca de 29 horas, cerca de 29,5 horas, cerca de 30, ou qualquer intervalo determinável a partir dos tempos anteriores (por exemplo, cerca de 26 horas a cerca de 28 horas, ou cerca de 3 horas a cerca de 5 horas).
[0064] O padrão de localização de GM1 em espermatozoides vivos ou fixos pode ser obtido, usando técnicas de marcação de ligação. Uma molécula que tenha afinidade específica com os gangliosídeos GM1 pode ser usada. A molécula rotulada pode ser diretamente ligada a um rótulo detectável (tal como um fluoróforo), ou pode ser detectado por uma segunda molécula rotulada, que tenha um rótulo detectável no mesmo.
Por exemplo, a subunidade b da toxina cólera é conhecida por se ligar especificamente a GM1. Portanto, uma subunidade b da toxina da cólera rotulada (tal como rotulada com fluorescente) pode ser usada para obter um padrão de distribuição de GM1. Em uma concretização, as concentrações finais da subunidade b da toxina da cólera ligada ao fluoróforo são cerca de 10 µg/ml a cerca de 15 µg/ml.
Em outra concretização, as concentrações finais da subunidade b da toxina da cólera ligada ao fluoróforo são cerca de 0,1 µg/ml a cerca de 50 µg/ml.
Alternativamente, a anticorpo rotulado para GM1 pode ser usado.
Ainda em outra alternativa, um anticorpo rotulado à subunidade b da toxina da cólera pode ser usada para visualizar o padrão de coloração de GM1. E ainda em outra alternativa, um anticorpo secundário rotulado, que liga ao anticorpo primário, que liga diretamente ao GM1 ou ao anticorpo primário, que se liga para a subunidade b da toxina da cólera pode ser usada.
O termo “coloração GM1” ou “coloração de GM1” ou “rotulagem” ou termos relacionados como usado neste documento significa a coloração observada nas células, devido à ligação de moléculas de afinidade rotulada com GM1. Por exemplo, quando a subunidade b da toxina da cólera rotulada ou rotulada fluorescente é usada para localização de GM1, o sinal ou coloração é da subunidade b da toxina da cólera, mas é indicativo da localização de GM1. Os termos “sinal” e “coloração” e “rotulagem” são usados intercambiáveis.
O rótulo detectável é tal que é capaz de produzir um sinal detectável.
Estes rótulos incluem a radionuclídeo, uma enzima, um agente fluorescente ou um cromóforo.
O rótulo (ou coloração) e visualização de distribuição de GM1 em espermatozoide é realizado por técnicas padrão. As moléculas rotuladas diferentes da subunidade b da toxina da cólera também podem ser usadas. Estes incluem anticorpos policlonais e monoclonais. Anticorpos específicos para gangliosídeos GM1 podem ser gerados por protocolos de imunização de rotina, ou pode ser adquirido comercialmente (por exemplo, Matreya, Inc., State College, PA). Os anticorpos podem ser elevados contra GM1 ou podem ser gerados, usando mimetizadores de peptídeo de epítopos relevantes da molécula GM1. A identificação e geração de mimetizadores de peptídeo é bem conhecida por experientes na matéria. Além disso, a ligação da subunidade b para a toxina de cólera pode ser mimetizada por uma molécula pequena. A identificação de moléculas pequenas com propriedades de ligação semelhantes a um determinado reagente é bem conhecida dos experientes na matéria.
[0065] Para o espermatozoide humano, oito padrões de localização (ver detalhe no Exemplo 1) foram observados, quando o espermatozoide estava sob condições de capacitação in vitro. Esses padrões são designados como INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES, DIFF, e Células Alinhadas. Os padrões INTER, APM, AA, PAPM, AA/PA, ES, e DIFF são mostrados na Figura 1 e o padrão de Célula Alinhada é mostrado nas Figuras 6A, 6B, 6C, e 6D, cada um adas quais estão adicionalmente descritas abaixo: • INTER: A grande maioria da fluorescência está em uma faixa em torno do segmento equatorial, com algum sinal na membrana plasmática sobreposta ao acrossoma. Geralmente há um gradiente de sinal, com a maior parte do segmento equatorial e então progressivamente menos em direção à ponta.
Frequentemente, existe um aumento na intensidade do sinal nas bordas da cabeça do espermatozoide na faixa ao longo do segmento equatorial. • APM (Membrana Plasmática Acrosomal): Comparada ao INTER há menor distinção neste padrão entre o sinal equatorial e aquele que se move em direção à ponta apical.
Isto é, o sinal na membrana plasmática que recobre o acrossomo é distribuída de maneira mais uniforme.
O sinal APM sinal é visto da banda INTER equatorial brilhante movendo-se apicalmente em direção à ponta, ou pode começar mais para acima em direção à ponta e ser encontrado em região menor, pois é um contínuo com o AA. • AA (Acrossoma apical): Neste padrão, a fluorescência está se tornando cada vez mais concentrada em direção à ponta apical, com brilho aumentado e reduzido na área com sinal. • PAPM (Membrana Plasmática Pós Acrossomal): O sinal é exclusivamente na membrana plasmática pós acrossomal. • AA/PA (Acrossomo Apical / Pós Acrossomo): Sinal está em ambas na membrana plasmática que recobre o acrossoma e +membrana plasmática pós acrossomal.
Falta de sinal a partir do segmento equatorial. • ES (Segmento equatorial): O sinal brilhante é visto somente no segmento equatorial.
Pode ser acompanhado de espaçamento da cabeça do espermatozoide na região equatorial. • DIFF (Difuso): O sinal difuso é visto em toda a cabeça do espermatozoide.
• Célula Alinhada: o sinal é visto no topo da região pós acrossomal e na membrana plasmática que recobre o acrossoma, bem como na parte inferior do segmento equatorial (isto é, a banda pós acrossoma/banda equatorial). Falta sinal em torno do segmento equatorial.
[0066] O termo “padrão de localização GM1” é usado intercambiável com “padrão” ou “padrão de localização”.
[0067] As Figuras 6A, 6B, 6C, e 6D mostram padrões de localização de GM1 de Célula Alinhada GM1 em espermatozoide de macho infértil sob condições de capacitação. Especificamente, a Figura 6A mostra um padrão de localização de Célula Alinhada GM1, onde o sinal é distribuído uniformemente na banda pós acrossoma/equatorial e na membrana plasmática sobreposta ao acrossoma. A Figura 6B mostra um padrão de localização de Célula Alinhada GM1, onde o sinal na membrana plasmática sobreposta ao acrossoma é mais brilhante que o sinal na banda pós acrossoma/equatorial. As Figuras 6C e 6D mostra um sinal da banda pós acrossoma/equatorial, que é mais brilhante do que o sinal da membrana plasmática sobreposta ao acrossoma.
[0068] Foi observado que embora os padrões INTER, AA, APM e combinações desses padrões se correlacionam positivamente com espermatozoide viáveis com arquitetura de membrana de espermatozoide normal e portanto, fertilidade, os padrões PAPM, AA/PA, ES, DIFF e as Células Alinhadas não se correlacionam positivamente com a viabilidade, arquitetura de membrana normal e fertilidade. Se incubado sob condições de não capacitação, a maioria dos espermatozoides viáveis com arquitetura de membrana normal exibirão o padrão INTER, que é caracterizado pela maioria do rotulado que está próximo do segmento equatorial, com o resto se estendendo através da membrana plasmática sobreposta ao acrossoma. Adicionalmente, ocorre um aumento no número dos padrões APM e AA, quando da exposição a estímulos de capacitação. O padrão APM mostra um sinal mais uniforme na membrana plasmática sobreposta ao acrossoma, enquanto o padrão AA mostra intensidade crescente de sinal na parte rostral da cabeça do espermatozoide, o acrossomo apical, e sinal reduzido, movendo-se caudalmente em direção ao segmento equatorial. Os espermatozoides incubados sob condições de não capacitados in vitro para indivíduos inférteis têm padrões de localização GM1 que são semelhantes aos padrões de localização GM1 de espermatozoide incubados sob condições não capacitados in vitro para indivíduos normais.
[0069] Em uma concretização, um método para determinar o estado de fertilidade masculina é divulgada neste documento. Em uma concretização, o método inclui as etapas de expor uma primeira porção de uma amostra de espermatozoide de um homem em condições de não capacitação para obter uma amostra de espermatozoide não capacitada in vitro; expor uma segunda porção da amostra de espermatozoide para condições de capacitação para obter uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro; fixar a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro com um fixador por um período de tempo de pelo menos: uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, dez horas, onze horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas, tratar a amostra fixada de espermatozoide não capacitada in vitro e a amostra fixa de espermatozoide capacitada in vitro com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada tem um rótulo detectável; identificação de mais de um padrões de localização GM1 rotulado ou a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulado fixo e amostra de espermatozoide capacitada in vitro rotulado fixo, os referidos padrões de localização GM1 rotulado sendo um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; comparar os padrões de localização GM1 rotulado ou a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulado fixo para os padrões de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada; com base na comparação, atribuir o padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e o padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) para um estado capacitado e atribuir o padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado; e caracterizar um estado de fertilidade dos machos com base nos padrões de localização GM1 rotulado identificado para a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulado fixo e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulado.
Em uma concretização, a etapa de caracterizar compreender as etapas de: determinar um limite de fertilidade associado com a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] para as amostras de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada; caracterizado por a porcentagem de referência de
[(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicar fértil; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicar subfértil; inferior a uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicar infértil; comparar a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] para uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada para a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] e identificar o limite de fertilidade com base na comparação.
[0070] Em outra concretização, a limite de fertilidade associado a uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é determinada, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indica fertilidade masculina normal; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina anormal. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0071] Em uma concretização, antes da etapa de exposições, uma amostra de sêmen é tratada para reduzir a viscosidade do sêmen, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica a membrana do espermatozoide escolhido a partir de vários reagentes que são usados para reduzir a viscosidade do sêmen. Em algumas concretizações, o reagente que danifica a membrana é selecionado a partir do grupo que consiste de (i) uma protease; (ii) uma nuclease (iii) um agente mucolítico; (iv) uma lipase; (v) uma esterase e (vi) hidrolases de glicosídeo. Em algumas concretizações, a etapa de identificação é repetida até que o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada seja substancialmente constante. Em uma tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada, para os espermatozoides capacitados in vitro rotulado fixo, até que o número seja inferior a 5%, inferior a 3% do número total de células rotuladas; ou varie de 1% a 5%, 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em outra tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de Célula Alinhada GM1 padrões de localização, para os espermatozoides não capacitados in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a: 25%, 20%, 15% ou 10% do número total de células rotuladas; ou varie entre 2% a 25%; 2% a 20%; 2 a 15%; 2 a 10%; 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em algumas concretizações a pipeta de orifício largo tem um tamanho de calibre de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1 mm, 1,2 mm ou 1,4 mm.
[0072] Em uma tal concretização, a etapa de caracterização pode incluir as etapas de: determinar o número de cada padrões de localização GM1 rotulado para um número predeterminado da amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa; determinar o número de cada padrões de localização GM1 rotulado a um número predeterminado da amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada; calcular uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa; e calcular uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada.
[0073] Em uma tal concretização, o método pode adicionalmente incluir as etapas de: comparar a razão dos espermatozoides não capacitados in vitro fixo rotulado para a razão de espermatozoides não capacitados in vitro rotulado fixo, tendo um estado de fertilidade conhecido; e comparar a razão para os espermatozoides capacitados in vitro rotulado fixo para uma razão de espermatozoide capacitados in vitro rotulado fixo, tendo um estado de fertilidade conhecido.
[0074] Em uma concretização divulgada neste documento é um método para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, o método inclui as etapas de: obter uma primeira porção de uma amostra de espermatozoide de um homem que foi exposta em condições de não capacitação in vitro, fixar em um fixador por pelo menos: uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, dez horas, onze horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas, e tratar com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável; obter uma segunda porção da amostra de espermatozoide que foi exposta em condições de capacitação in vitro, fixar em um fixador, e tratar com a molécula rotulada por padrões de localização GM1; identificar mais que um padrão de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, sendo os referidos padrões de localização GM1 rotulado um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; comparar the padrões de localização GM1 rotulado com a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa com os padrões de localização GM1 rotulado com a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada; com base na comparação, atribuir o padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e o padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) para um estado capacitado e atribuir o padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado com um estado não capacitado; e caracterizar um estado de fertilidade do homem com base nos padrões de localização GM1 rotulado identificado para as amostras de espermatozoide não capacitada in vitro rotulada fixa e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada.
Em uma concretização, a etapa de caracterizar compreende as etapas de: determinar um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada; caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é o desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fértil; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indica sub fértil; inferior a uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indica infértil; comparar a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] e identificar o limite de fertilidade com base na comparação.
[0075] Em outra concretização, um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é determinado, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina normal; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina anormal. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0076] Em algumas concretizações, a etapa de identificação é repetida até que o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada seja substancialmente constante. Em uma tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada, para os espermatozoides capacitados in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a 5%, inferior a 3% do número total de células rotuladas; ou varie entre 1% a 5%, 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em outra tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização GM1 de Células Alinhada, para os espermatozoides não capacitados in vitro rotulado fixo até que o número seja inferior a: 25%, 20%, 15% ou 10% do número total de células rotuladas; ou varie entre 2% a 25%; 2% a 20%; 2 a 15%; 2 a 10%; 2 a 5% do número total de células rotuladas.
[0077] Em uma concretização de tal método, o método inclui adicionalmente as etapas de: determinar o número de cada padrão de localização GM1 rotulado para um número predeterminado da amostra de espermatozoide não capacitada in vitro fixa rotulada e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, e calcular uma razão para a soma de número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1 para cada amostra de espermatozoide não capacitada in vitro fixa rotulada e a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada.
[0078] Em uma tal concretização, a etapa de caracterizar pode adicionalmente incluir as etapas de: comparar a razão para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada com as razões de padrões de localização GM1 de espermatozoide capacitados in vitro para homens, tendo um estado de fertilidade conhecido; e comparar a razão com a amostra de espermatozoide não capacitada in vitro fixa rotulada com razões de padrões de localização GM1 de espermatozoide não capacitado in vitro para homens, tendo um estado de fertilidade conhecido.
[0079] Em uma concretização é divulgado neste documento um método para determinar o estado de fertilidade masculina.
Em uma concretização, o método inclui as etapas de: expor, in vitro, a amostra de espermatozoide de um homem para condições de capacitação; fixar a amostra de espermatozoide capacitada com um fixador por pelo menos: uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, dez horas, onze horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas, tratar a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável; identificar mais de um padrão de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, os referidos padrões de localização GM1 rotulado, sendo um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; atribuir o padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e o padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) para um estado capacitado e atribuir o padrão de localização de Células Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado; e caracterizar um estado de fertilidade do macho.
Em uma concretização, a etapa de caracterizar compreender as etapas de: determinar um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada;
caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indica fértil; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que é dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indica sub fértil; inferior a uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indica infértil; comparar a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] par a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] e identificar o limite de fertilidade com base na comparação.
[0080] Em outra concretização, um limite de fertilidade associado com a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é determinado, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina normal; inferior a um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina anormal. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0081] Em uma concretização, antes da etapa de exposição, uma amostra de sêmen é tratada para reduzir a viscosidade do sêmen, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica a membrana do espermatozoide escolhido a partir de vários reagentes que são usados para reduzir a viscosidade do sêmen. Em algumas concretizações, o reagente que danifica a membrana é selecionado a partir do grupo que consiste em (i) a protease; (ii) uma nuclease (iii) um agente mucolítico; (iv) um lipase; (v) uma esterase e (vi) hidrolases de glicosídeo. Em algumas concretizações, a etapa de identificação é repetida até que o número de padrões de localização GM1 de Células Alinhadas seja substancialmente constante. Em uma tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada, para os espermatozoides capacitados in vitro fixo rotulado, até que o número seja inferior a 5%, inferior a 3% do número total de células rotuladas; ou variar entre 1% a 5%, 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em outra tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada, para os espermatozoides não capacitados in vitro rotulado fixo, até que o número seja inferior a: 25%, 20%, 15% ou 10% do número total de células rotuladas; ou varie entre 2% a 25%; 2% a 20%; 2 a 15%; 2 a 10%; 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em algumas concretizações a pipeta de orifício largo tem um tamanho de calibre de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1 mm, 1,2 mm ou 1,4 mm.
[0082] Em uma concretização de tal método, o método pode adicionalmente incluir as etapas de: comparar a razão de padrões de localização GM1 com as razões de padrões de localização GM1 para homens, tendo um estado de fertilidade conhecido. Em uma concretização, o estado de fertilidade conhecido corresponde a machos férteis. Em outra concretização, o estado de fertilidade conhecido corresponde a machos inférteis. Em uma tal concretização, a etapa de comparação inclui as etapas de: determinar o número de cada padrão de localização GM1 rotulado para um número predeterminado da amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, e calcular uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1 rotulado.
[0083] Em uma concretização é divulgado neste documento um método para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, o método inclui as etapas de: obter uma primeira porção de uma amostra de espermatozoide de um homem que foi exposta em condições de capacitação in vitro, fixada em um fixador por pelo menos: uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas,
oito horas, nove horas, dez horas, onze horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas, e rotulada com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável; identificar mais que um padrão de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, o referido padrão de localização sendo o padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização GM1 de Célula Alinhada e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; atribuir o padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e o padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) para um estado capacitado e atribuir o padrão de localização GM1 de Célula Alinhada e todo os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado; e caracterizar um estado de fertilidade do macho.
Em uma concretização, a etapa de caracterizar compreende as etapas de: determinar um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada; caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fértil; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indica sub fértil; inferior a uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indica infértil; comparar a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] e identificar o limite de fertilidade com base na comparação.
[0084] Em outra concretização, um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é determinado, caracterizado por a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina normal; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina anormal. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização
GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0085] Em algumas concretizações, a etapa de identificação é repetida até que o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada é substancialmente constante. Em uma tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada para os espermatozoides capacitados in vitro fixo rotulado até que o número seja inferior a 5%, inferior a 3% do número total de células rotuladas; ou varie entre 1% a 5%, 2 a 5% do número total de células rotuladas. Em outra tal concretização, após a etapa de identificação ser realizada, determinar o número de padrões de localização GM1 de Célula Alinhada, para os espermatozoides não capacitados in vitro fixo rotulado até que o número seja inferior a: 25%, 20%, 15% ou 10% do número total de células rotuladas; ou variem entre 2% a 25%; 2% a 20%; 2 a 15%; 2 a 10%; 2% a 5% do número total de células rotuladas.
[0086] Em uma concretização de tal método, o método pode adicionalmente incluir as etapas de: comparar a razão de padrão de localização GM1 com razões de padrões de localização GM1 para homens, tendo um estado de fertilidade conhecido. Em uma concretização, o estado de fertilidade conhecido corresponde a machos férteis. Em outra concretização, o estado de fertilidade conhecido corresponde a machos inférteis. Em uma tal concretização, a etapa de comparação inclui as etapas de: determinar o número de cada padrão de localização GM1 rotulado para um número predeterminado da amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, e calcular uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e o número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de GM1 padrões de localização GM1 rotulado.
[0087] Em uma concretização é divulgado neste documento um método para determinar o estado de fertilidade masculina. Em uma concretização, o método inclui as etapas de: obter uma amostra de espermatozoide, caracterizado por pelo menos uma porção da amostra de espermatozoide ser exposta em condições de capacitação in vitro para obter espermatozoide capacitados in vitro, ser exposta para um fixador por pelo menos: uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, sete horas, oito horas, nove horas, dez horas, onze horas, doze horas, dezoito horas ou vinte quatro horas, e ser rotulada por GM1; obter valores para um ou mais parâmetros de sêmen da amostra de espermatozoide; determinar uma Cap-Score da amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada com base nos um ou mais padrões de localização GM1 rotulado, o referido padrão de localização GM1 rotulado ser um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um post-padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização GM1 de Célula Alinhada e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; e calcular um valor de índice de fertilidade masculina (MFI - macho Fertility Index) do macho com base na pontuação CAP determinada e um ou mais parâmetros de sêmen obtidos. Em uma concretização, o um ou mais parâmetros de sêmen da amostra de espermatozoide são selecionados a partir do grupo, consistindo em volume da amostra de espermatozoide original, concentração de espermatozoide, motilidade de espermatozoide e morfologia de espermatozoide.
[0088] Uma concretização divulgada neste documento é um método para determinar o estado de fertilidade masculina.
Em uma concretização, o método compreende as seguintes etapas.
Uma amostra de espermatozoide capacitados in vitro é tratada com um rótulo fluorescente.
Uma ou mais imagens fluorescentes capacitadas são obtidas caracterizado por as imagens exibirem um ou mais padrões de localização GM1 associadas com células de espermatozoide capacitados in vitro com rótulo fluorescente.
Um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) são cada um atribuído para um estado capacitado e um padrão de localização GM1 de Célula Alinhada e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado são atribuídos para um estado não capacitado cada um exibindo nas imagens fluorescentes cap.
Um número por padrões de localização GM1 é medido, os padrões, compreendendo padrão de localização AA GM1, padrão de localização APM GM1, padrão de localização GM1 de Célula Alinhada e todos os padrões de localização GM1 rotulado, para as células de espermatozoide capacitados in vitro rotulados com fluorescência, exibido nas imagens fluorescentes capacitadas para determinar uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total]. Um limite de fertilidade associado com uma porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é determinada, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], correspondendo a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo a porcentagem média de referência indica fértil; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência e maior que uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando sub fértil; inferior a uma porcentagem que são dois desvios padrões abaixo da porcentagem média de referência indicando infértil. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0089] Em outra concretização, um limite de fertilidade associado com a porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] é determinado, caracterizado por uma porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total], com base nas estatísticas de distribuição de uma população fértil conhecida correspondente a: maior que uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade masculina normal; inferior a uma porcentagem que é um desvio padrão abaixo da porcentagem média de referência indicando fertilidade anormal. A porcentagem de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total] para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada é comparada com a porcentagem de referência de [(padrões de localização AA GM1 mais padrões de localização APM GM1)/ padrões de localização GM1 total]. O limite de fertilidade é identificado com base na comparação.
[0090] Em uma tal concretização, a etapa de identificação também é baseada em um ou mais dos seguintes: dados demográficos do paciente, estado reprodutivo da parceira feminina, concentração de espermatozoide, motilidade total, motilidade progressiva, volume do sêmen, pH do sêmen, viscosidade do sêmen e/ou morfologia do espermatozoide e suas combinações.
[0091] Em várias concretizações dos métodos descritos neste documento, os espermatozoides são tratados in vitro com condições de capacitação por um período de tempo de capacitação de: pelo menos uma hora; pelo menos 2 horas; pelo menos 3 horas; pelo menos 12 horas; pelo menos 18 horas; pelo menos 24 horas; por um período de tempo de capacitação, variando entre 0,5 horas a 3 horas; 3 horas a 12 horas; 6 horas a 12 horas; 3 horas a 24 horas; 12 horas a 24 horas; ou 18 horas a 24 horas.
[0092] Em várias concretizações dos métodos descritos neste documento, as células de espermatozoides capacitados in vitro são tratados com um fixador por um período de tempo de: pelo menos 0,5 hora; pelo menos 3 horas; pelo menos 12 horas; pelo menos 18 horas; pelo menos 24 horas; pelo menos 30 horas; pelo menos 36 horas; ou pelo menos 48 horas, por um período de tempo de fixação, variando entre 0,5 horas a 3 horas; 3 horas a 12 horas; 6 horas a 12 horas; 3 horas a 18 horas; 6-18 horas; 6-24 horas; 12 horas a 24 horas; 18 horas a 24 horas; 18-30 horas; 18-36 horas; 24-30 horas; 24- 26 horas; 18-48 horas; 24-48 horas; ou 36-48 horas.
[0093] Em várias concretizações dos métodos descritos neste documento, mais de um dos padrões de localização rotulado compreender padrão de localização AA GM1, APM GM1 padrão de localização, padrão de localização GM1 de Célula Alinhada, padrão de localização GM1 intermediária (INTER), padrão de localização GM1 pós membrana plasmática acrossomal (PAPM), padrão de localização GM1 apical acrossomo / pós acrossomo (AA/PA), padrão de localização GM1 do segmento equatorial (ES), e padrão de localização GM1 difuso (DIFF).
[0094] Em uma concretização, a exposição da primeira porção da amostra de espermatozoide para condições de não capacitação e a exposição da segunda porção da amostra de espermatozoide para condições de capacitação que ocorrem simultaneamente.
[0095] Os indivíduos masculinos pode ser um humano ou um animal não humano. No caso de um animal não humano, a identificação de padrões que estão correlacionados com o estado de fertilidade pode ser realizada com base nos ensinamentos fornecidos neste documento. Os animais não humanos incluem cavalo, gado, cão, gato, suíno, cabra, ovelha, veado, coelho, galinha, peru, várias espécies de peixes e várias espécies zoológicas.
[0096] Em uma concretização, o método desta divulgação fornece um método para designar um macho como provavelmente infértil, compreendendo a obtenção de padrões de localização GM1 (por exemplo, um ou mais de Célula Alinhada, AA, APM, e todos os outros padrões de localização GM1) em um espermatozoide do indivíduo e de um controle normal que foram incubados sob capacitação e condições de não capacitação e opcionalmente fixados, e comparar os padrões de localização
GM1. No controle normal, uma mudança estatisticamente significativa na porcentagem de espermatozoide, exibindo certos padrões de localização seria observada.
Se a mesma mudança não for observada no espermatozoide do indivíduo testado, então o indivíduo é designado como tendo um estado de fertilidade anormal.
Em uma concretização, os padrões que são informativos de estado de fertilidade normal e anormal são padrões de localização Célula Alinhada, INTER, AA e/ou APM.
Assim, em uma amostra de um indivíduo que é conhecido por ter um estado de fertilidade normal (que pode ser usada como um controle), existe uma maior porcentagem de espermatozoide, exibindo padrões de localização AA e/ou APM, e um menor porcentagem de espermatozoide, exibindo o padrão de localização de Célula Alinhada e/ou INTER após a exposição para condições de capacitação in vitro, quando comparada com os espermatozoides, sendo expostos condições de não capacitação in vitro.
Se nenhuma diferença ou nenhuma diferença significativa for observada nas percentagens de um ou mais desses padrões de localização após a exposição para condições de capacitação in vitro comparada com quando o espermatozoide é exposto para condições de não capacitação in vitro, então, o indivíduo é designado como tendo problemas de fertilidade.
Em uma variação da concretização acima, o controle pode ser de um indivíduo conhecido como sendo infértil ou sub fértil.
Nesta concretização, se as mudanças nos padrões de GM1 do indivíduo de teste após a capacitação padrões de localização nas Células Alinhadas, INTER, AA e/ou APM in vitro são as mesmas do controle, então o indivíduo pode ser considerado como sub fértil ou infértil.
[0097] Ainda em outra variação da concretização acima, a amostra de um indivíduo de teste pode ser avaliada sem comparação com um controle. Se nenhuma mudança, ou nenhuma mudança significativa, for observada no número de padrões de Célula Alinhada, INTER, AA e/ou APM após exposição à condições de capacitação in vitro, então o indivíduo pode ser considerado como anormal e pode ser designado para testes adicionais, ao passo que se forem observadas alterações, de modo que as Células Alinhadas e/ou INTER seja reduzida, AA seja aumentada, e/ou APM seja aumentada, então o indivíduo pode ser designado como tendo fertilidade normal.
[0098] Em uma concretização, o método compreende a análise de GM1 padrões de localização GM1 para identificar o número de padrões AA e APM no espermatozoide exposto para condições de capacitação in vitro. O número pode ser expresso como uma porcentagem de um ou mais dos padrões de distribuição GM1 em relação ao total. Em uma concretização, a fertilidade é prevista com base na comparação do número de padrões de localização AA e/ou APM contra um limite de fertilidade predeterminado, por exemplo, o nível do limite (isto é, corte) entre indivíduos classificados como inférteis e sub férteis, ou o nível do limite entre indivíduos classificados como sub férteis e aqueles classificados como férteis.
[0099] Em outras concretizações, os limites de fertilidade podem ser determinados por análise estatística dos padrões encontrados no espermatozoide de uma população de homem, com fertilidade conhecida. Em uma concretização, um macho é considerado fértil ou tem fertilidade masculina normal, se o macho tiver uma parceira grávida ou se for pai de um filho em três anos, usando concepção natural ou três ou menos ciclos de inseminação intra-uterina. Em uma concretização, um macho é considerado sub fértil se o macho não conseguiu engravidar com seis a doze meses, sem uso de contracepção, e precisou de mais de três ciclos de inseminação intra- uterina para alcançar a gravidez. Em uma concretização, um macho é considerado infértil, se o macho não conseguiu engravidar em um ano, sem o uso de contracepção, e não conseguiu engravidar, usando repetidos ciclos de inseminação intra-uterina. Em uma concretização, a fertilidade masculina anormal inclui machos sub férteis e inférteis.
[00100] Como mostrado na Figura 4, 73 amostras de sêmens foram obtidas de 24 homens conhecidamente férteis. Seus espermatozoides foram incubados com estímulo por capacitação, neste caso 4 mM 2-hidroxi-propil-β ciclo dextrina, fixados com 0,01% paraformaldeído (concentração final). A porcentagem de células, tendo padrões indicativos de ser capacitado (por exemplo, AA + APM) foi avaliada. A porcentagem média de espermatozoide tendo padrões AA e APM foi de 41%, e dois desvios padrões da média foram calculados como 27% e 55%.
[00101] Os padrões de localização GM1 em 14 amostras de 14 homens buscam avaliação médica de seus estados de fertilidade foram analisados. As percentagens relativas de espermatozoides, tendo padrões de localização AA + APM foram comparadas com os limites estatísticos identificados na população de homens férteis conhecidos (Figura 5). Não foram observadas diferenças nas amostras incubadas sob linha de base (não estimulantes, condições de não capacitação). No entanto, 5 dos 14 homens produziram amostras que mostraram porcentagens baixas de espermatozoide com padrões AA + APM quando incubado com 4 mM 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina. Todas essas 5 amostras caíram abaixo de dois desvios padrões da média. Acredita-se que aproximadamente 30-50% dos casais tendo dificuldade para conceber tenham um componente do fator masculino. Esses dados estão dentro do intervalo esperado.
[00102] Em uma concretização, a presente divulgação fornece kits para determinação de estado de fertilidade masculina. O kit compreende um ou mais dos seguintes: uma pipeta tendo um orifício de tamanho suficiente em diâmetro para evitar o cisalhamento de uma membrana de espermatozoide, agentes que podem atuar como estímulos para capacitação in vitro, meio capacitante, meio não capacitante, fixadores, reagentes de rotulação para determinar de padrões de localização GM1, um diagrama que ilustra um ou mais padrões de localização GM1 de espermatozoide capacitados e um de mais padrões de localização GM1 de espermatozoide não capacitado. Tais padrões de localização GM1 de espermatozoide capacitados e padrões de localização GM1 de espermatozoide não capacitado refletem o estado de fertilidade conhecido. Em tal concretização de kit, a composição fixadora não deve danificar a membrana de espermatozoide. Em tais concretizações, o reagente que pode danificar a membrana do espermatozoide é escolhido dos vários reagentes que são usados para reduzir a viscosidade do sêmen. Em algumas concretizações, o reagente que danifica a membrana inclui um ou mais de uma protease, uma nuclease, um agente mucolítico, uma lipase, uma esterase e hidrolases de glicosídeo. E outra concretização do kit, os meios capacitante e os meios não capacitante, quando aplicados in vitro às células de espermatozoide, produzem padrões de localização GM1 indicativo de espermatozoide capacitados e padrões indicativos de espermatozoide não capacitado conforme refletido no diagrama.
[00103] Em uma concretização, o kit compreende um agente, tendo 4% de ciclo dextrina para estimular a capacitação.
[00104] Em uma concretização, o meio capacitante compreende: fluido tubário humano modificado com acréscimo de 2-hidroxi- propil-β-ciclo dextrina, de modo a dar uma concentração final de 3 mM; o meio não capacitante compreende fluido tubário humano modificado; o fixador é paraformaldeído 1%; e o reagente para determinar os padrões GM1 é a subunidade b da toxina de cólera (concentração final de 15 µg/ml). Em outras concretizações, a concentração final de paraformaldeído é de 0,01%.
[00105] Um kit exemplar compreende meio HTF modificado com gentamicina tamponada com HEPES (Irvine Scientific, referência 90126). Nenhuma diferença em padrões de localização GM1, viabilidade ou recuperação de espermatozoide, e a capacitação foi observada se o meio tamponado com bicarbonato ou HEPES foi usado. Portanto, meio tamponado com bicarbonato também pode ser usado. O uso do tampão HEPES permite que o ensaio seja realizado em clínicas, usando incubadora de ar ou banhos de água, em oposição a ser compatível apenas com incubadoras de CO2. Similarmente, a adição de proteínas suplementares, sejam comerciais (HTF- SSSTM, Irvine Scientific or plasmanate), ou albumina em pó não alterou a recuperação ou viabilidade, e aumentou favoravelmente o estado de capacitação.
[00106] O kit exemplar pode adicionalmente compreender meio de isolamento de célula (tal como meio de isolamento de célula Enhance S-Plus, 90% da Vitrolife, referência: 15232 ESP-100-90%). Foi demostrado que os reagentes, consumíveis e procedimentos exemplares produziram rotulação vantajosa GM1 no espermatozoide humano.
[00107] O kit exemplar pode adicionalmente compreender pontas de pipeta de orifício largo (ponta de orifício grande de 200 µl, USA scientific, 1011-8400). O kit exemplar pode adicionalmente compreender pipetas de transferência de orifício largo (General Purpose Transfer Pipettes, Standard Bulb referência número: 202-20S. VWR catalog número 14670- 147). Em uma concretização, a pipeta é não metálica. Em algumas concretizações a pipeta de orifício largo tem um tamanho de calibre de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1 mm, 1,2 mm ou 1,4 mm.
[00108] O kit exemplar pode adicionalmente compreender tubos de 1,5ml (Treatment cap, noncap, CD) (USA Scientific 14159700)— contendo um ciclo de dextrina em forma de pó para estimular a capacitação, e um vazio para condições de não capacitação de meio apenas. Em algumas concretizações, é possível que o ciclo dextrina seja encontrado em tubo separado, ao qual o meio será adicionado para fazer uma solução estoque, que por sua vez será adicionada ao tubo de capacitação.
[00109] Quando isolado o espermatozoide do plasma seminal é comum para laboratórios de andrologia humana para coletar espermatozoide, usando gradientes de densidade. O kit exemplar pode adicionalmente compreender materiais de gradiente de densidade e/ou instruções para remover o plasma seminal do gradiente de densidade e em seguida coletar o espermatozoide paletizado, usando uma pipeta de transferência fresca.
[00110] O kit exemplar pode adicionalmente compreender adicionalmente o fixador (tal como 0,1% PFA), e opcionalmente compreender formulários informativos (tal como formulários de requisição de paciente), rótulos e recipientes/sacos/bolsas e semelhantes úteis para envio, armazenagem ou propósito regulamentares. Por exemplo, o kit pode conter uma bolsa de lâmina, um saco de risco biológico com absorvente para enviar a amostra do paciente, um saco resselável com absorvente, e um suporte para tubo de espuma.
[00111] O kit exemplar pode adicionalmente incluir instruções que descrevem qualquer um dos métodos divulgados neste documento.
[00112] Em outro aspecto, é fornecido um método para medir a fertilidade de um indivíduo macho. O ensaio de localização GM1 pode mostrar se os espermatozoides podem se capacitar, e, portanto, tornar-se competente para fertilizar um ovo. Conforme descrito acima, o ensaio pode ser pontuado como porcentagens do espermatozoide morfologicamente normal que tem padrões específicos de localização de GM1 na cabeça do espermatozoide. Os padrões APM e AA aumentam, à medida que os espermatozoides respondem aos estímulos de capacitação. Os cortes podem ser usados para distinguir a fertilidade relativa dos ejaculados, separando as amostras de sêmens em grupos com base na fertilidade masculina (por exemplo, distinguindo homens férteis de sub férteis de inférteis). No entanto, porque o número de espermatozoide, motilidade e morfologia também pode influenciar a fertilidade masculina,
a presente divulgação fornece métodos para criar um índice de fertilidade masculina (a “índice de fertilidade masculina” ou “MFI” – “Male Fertility Index”) que engloba Cap-Score e um ou mais parâmetros de sêmen relevantes (por exemplo, número, motilidade, e morfologia, etc.). Cap-Score (também referido como pontuação GM1) é o número de um ou mais padrões GM1. Por exemplo, um Cap-Score pode ser um número de um ou mais de Célula Alinhada, INTER, AA e APM.
Diferentes índices podem ser gerados para enfatizar parâmetros específicos do sêmen.
Por exemplo, os índices de acordo com a presente divulgação incluem: • Cap-Score × % com motilidade progressiva × número absoluto; • Cap-Score × % espermatozoides morfologicamente normais × número absoluto; • Cap-Score × % motilidade total × número absoluto × % espermatozoides morfologicamente normais; e • outras variações ou combinações de Cap-Score e esses parâmetros, ou outros parâmetros específicos, incluindo aqueles obtidos usando CASA (Computer Assisted Espermatozoide Analysis - análise de esperma assistida por computador), tais como: VSL (Velocity Straight Line - linha reta de velocidade)); STR (straightness - retidão); LIN (Linearity - Linearidade); VCL (Curvilinear Velocity - velocidade curvilínea); VAP (Velocity Average Path – caminho médio da velocidade); % motilidade; duração de motilidade; LHA (Lateral Head Amplitude – amplitude lateral da cabeça); WOB (wobble - oscilação); PROG (progression - progressão); e BCF (Beat Cross Number – número cruzado de batimento), etc.
Ver, por exemplo, Organização Mundial da Saúde, “WHO
Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Sperm,” (Quinta Ed. 2010).
[00113] O índice de fertilidade masculina pode ser incorporado como um método para medir o estado de fertilidade de um indivíduo macho. Uma amostra de espermatozoide é obtida, caracterizado por a amostra de espermatozoide é do indivíduo sendo medido e caracterizado por pelo menos uma porção da amostra de espermatozoide exposta em condições de capacitação in vitro, exposto para um fixador, e rotular para GM1, como descrito acima. Os valores de um ou mais parâmetros de sêmen são obtidos para a amostra de espermatozoide, tal como, por exemplo, o volume da amostra original do indivíduo, e/ou a concentração, motilidade, e/ou morfologia do espermatozoide da amostra. Um MFI é determinado a partir do número de um ou mais padrões GM1 (por exemplo, o CAP–Score™) e o um ou mais valores de parâmetros de sêmen obtidos. Nos exemplos usados neste documento, o Cap-Score™ é a porcentagem de um ou mais padrões GM1 sob condições de capacitação em três horas, mas outras variantes de Cap-Scores serão aparentes à luz desta divulgação (por exemplo, número em outros intervalos de tempo, mudança no número de um padrão GM1 em capacitado de não capacitado, etc.)
[00114] Em uma concretização, uma pontuação de índice de fertilidade masculina pode ser calculada para uma amostra de homens de acordo com a seguinte equação: Índice de Fertilidade masculina /Grupo de Fertilidade = a + b1*x1 + b2*x2 + ... + bm*xm onde a é uma constante, b1 a bm são coeficientes de regressão e x1 a xm são variáveis de fertilidade masculina, tal como Cap-Score, motilidade, morfologia, volume e concentração. A análise da função discriminante pode ser usada para determinar quais variáveis de fertilidade discriminam entre dois ou mais grupos de ocorrência natural. Por exemplo, para determinar se um indivíduo cai em um grupo fértil, sub fértil ou infértil, os dados seriam coletados para inúmeras variáveis de fertilidade que descrevem a função do espermatozoide e a qualidade de sêmen. Uma Análise Discriminante pode então ser usada para determinar quais variáveis(s) é/são os melhores preditores do grupo de fertilidade e relativamente quanto cada variável de fertilidade deve ser ponderada.
[00115] O índice de fertilidade masculina pode ser gerado por um laboratório que lê o ensaio de localização GM1. O laboratório pode obter uma amostra de espermatozoide, e uma análise de sêmen correspondente para a amostra de espermatozoide, de uma ou mais instalações (por exemplo, clínica de fertilidade, banco de espermatozoide, etc.). As informações da análise de sêmen podem ser incluídas em um cartão incluído com um kit de ensaio de localização GM1, enviado eletronicamente para o laboratório e/ou fornecido de outra forma. Em outra concretização exemplar, o laboratório obtém o Cap-Score de uma amostra de espermatozoide e também obtém as informações de análise para a amostra de espermatozoide. Em uma concretização, o laboratório calcula o índice de fertilidade masculina com base no Cap-Score obtido e nos dados de análise de sêmen obtido.
[00116] Um método exemplar para identificar o estado de fertilidade de um macho compreende a exposição de uma amostra de espermatozoide do indivíduo para condições de não capacitação in vitro e capacitação in vitro. Os espermatozoides são fixados e uma porcentagem de padrões GM1 selecionados no espermatozoide fixado é determinado. A porcentagem para diferentes padrões GM1 em espermatozoide expostos em condições de não capacitação in vitro e capacitação in vitro é comparada. Uma mudança na porcentagem de um ou mais padrões GM1 selecionados em espermatozoide expostos para as condições de capacitação in vitro sobre os espermatozoides expostos para condições de não capacitação in vitro é indicativo do estado de fertilidade do indivíduo. Os padrões GM1 selecionados podem ser Célula Alinhada, INTER, AA e/ou APM. Em uma concretização, o estado de fertilidade do indivíduo é determinado pelo cálculo de uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1 rotulado para o espermatozoide capacitado.
[00117] Um método exemplar para identificar o estado de fertilidade de um macho compreende a exposição de uma amostra de espermatozoide do indivíduo para condições de capacitação in vitro. Os espermatozoides são fixados e uma porcentagem dos padrões GM1 selecionados no espermatozoide fixado é determinado. A porcentagem para diferentes padrões GM1 é comparada com a porcentagem de um controle, caracterizado por a amostra de espermatozoide de controle ser exposta para as mesmas condições de capacitação in vitro e ao mesmo fixador. Uma mudança na porcentagem de um ou mais padrões GM1 selecionado em relação à mudança no controle é indicativa do estado de fertilidade diferente do indivíduo do que o estado de fertilidade do controle. Os padrões GM1 podem ser Célula Alinhada, INTER, AA e/ou APM. Em uma concretização, o estado de fertilidade do indivíduo é determinado calculando uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1 rotulado para os espermatozoides capacitados. Em uma concretização, antes da etapa de exposição, uma amostra de sêmen é tratada para reduzir a viscosidade do sêmen, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica a membrana do espermatozoide escolhido entre os vários reagentes que são usados para reduzir a viscosidade do sêmen. Em algumas concretizações, o reagente que danifica a membrana é selecionado a partir do grupo, consistindo em (i) uma protease; (ii) uma nuclease (iii) um agente mucolítico; (iv) uma lipase; (v) uma esterase e (vi) hidrolases de glicosídeo. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de calibre de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1mm, 1,2mm ou 1,4mm.
[00118] No método exemplar, o controle pode ser uma amostra de espermatozoide de um indivíduo que é conhecido por ter um estado de fertilidade normal ou um indivíduo que é conhecido por ter um estado de fertilidade anormal. O controle pode ser um valor obtido a partir de um conjunto de dados que compreende uma pluralidade de indivíduos, por exemplo, um conjunto de dados que compreende pelo menos 50 indivíduos.
[00119] Um método exemplar para identificar o estado de fertilidade de um macho como infértil, sub fértil, ou fértil, compreende a exposição de uma amostra de espermatozoide do indivíduo a condições de capacitação in vitro. Os padrões GM1 na amostra são determinados. A porcentagem de um ou mais padrões GM1 é comparado a um limite de fertilidade caracterizado por uma porcentagem inferior do que o limite de fertilidade é indicativo de problemas de fertilidade. Por exemplo, uma porcentagem inferior do que o limite de fertilidade pode ser indicativo de um estado de fertilidade de infértil ou sub fértil. Os padrões GM1 pode ser Célula Alinhada, INTER, AA e/ou APM. Em uma concretização, o estado de fertilidade do indivíduo é determinado, calculando uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1 rotulado para o espermatozoide capacitado. Em uma concretização, antes das etapas de exposição, uma amostra de sêmen é tratada para reduzir a viscosidade do sêmen, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica a membrana do espermatozoide escolhido a partir dos vários reagentes que são usados para reduzir a viscosidade do sêmen. Em algumas concretizações, o reagente que danifica a membrana é selecionado a partir do grupo, consistindo em (i) uma protease; (ii) uma nuclease (iii) um agente mucolítico; (iv) uma lipase; (v) uma esterase e (vi) hidrolases de glicosídeo. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de calibre de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1 mm, 1,2 mm ou 1,4 mm.
[00120] As condições de capacitação in vitro nos métodos exemplares podem incluir a exposição a i) bicarbonato e íons de cálcio, e ii) mediadores de efluxo de esterol tais como 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina,
albumina sérica, lipoproteína de alta densidade, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultrafiltrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou lipossomas. Nos métodos exemplares, a exposição do controle a condições de capacitação ou de não capacitação pode ser feita em paralelo com a amostra de teste.
[00121] Um método exemplar para identificar o estado de fertilidade de um macho como infértil, sub fértil, ou fértil, compreende a exposição de uma amostra de espermatozoide do indivíduo para condições de capacitação. A porcentagem de cada padrão GM1 na amostra é determinada. A porcentagem de um ou mais padrões GM1 é comparada a um limite de infertilidade caracterizado por uma porcentagem inferior que o limite de infertilidade é indicativo de problemas de fertilidade. As condições de capacitação no método exemplar podem incluir a exposição a i) bicarbonato e íons de cálcio, e ii) mediadores de efluxo de esterol tais como 2-hidroxi- propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, alta densidade lipoproteína, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultra filtrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou lipossomas. Os um ou mais padrões de localização GM1 pode ser Célula Alinhada, INTER, AA e/ou APM. Em uma concretização, o estado de fertilidade do indivíduo é determinado, calculando uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma soma do número total de padrões de localização GM1 rotulado para o espermatozoide capacitado. Em uma concretização, antes da etapa de exposição, uma amostra de sêmen é tratada para reduzir a viscosidade do sêmen, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica a membrana do espermatozoide escolhido a partir de vários reagentes que são usados para reduzir a viscosidade do sêmen. Em algumas concretizações, o reagente que danifica a membrana é selecionado a partir do grupo, consistindo em (i) uma protease; (ii) uma nuclease (iii) um agente mucolítico; (iv) uma lipase; (v) uma esterase e (vi) hidrolases de glicosídeo. Em algumas concretizações a pipeta de orifício largo tem um tamanho de calibre de pelo menos 18 calibre, 16 calibre ou 14 calibre. Em algumas concretizações, a pipeta de orifício largo tem um tamanho de orifício de pelo menos 1 mm, 1,2 mm ou 1,4 mm.
[00122] O limite de fertilidade nos métodos exemplares pode ser a porcentagem do padrão AA + APM em que a fertilidade de uma população deixa de aumentar substancialmente. Por exemplo, o limite de fertilidade pode ser um nível de AA + APM no qual mais de 50% da população é fértil; um nível de AA + APM na qual mais de 60-85% da população é fértil; ou um nível de AA + APM no intervalo de 35-40 (porcentagem relativa dos padrões GM1 total), inclusive. O limite de fertilidade pode ser 38, 38,5, 39, ou 39,5% AA + APM (em relação aos padrões GM1 totais).
[00123] Um método exemplar pode adicionalmente compreender comparar a porcentagem de um ou mais padrões GM1 para um limite de infertilidade caracterizado por uma porcentagem inferior do que o limite de infertilidade é indicativo de infertilidade. Por exemplo, o limite de infertilidade pode ser a porcentagem do padrão AA + APM no qual a fertilidade de uma população começa a aumentar substancialmente; um nível de AA + APM no qual inferior a 50% da população são férteis;
um nível de AA + APM no qual mais de 60-85% da população é fértil; ou um nível de AA + APM no intervalo de 14-18 (porcentagem relativa dos padrões GM1 totais), inclusive. O limite de infertilidade pode ser 14, 14,5, 15 ou 15,5% AA + APM (em relação aos padrões GM1 totais).
[00124] Um método exemplar para identificar o estado de fertilidade de um macho compreende a obtenção de amostra de espermatozoides, caracterizado por a amostra de espermatozoides ser de indivíduo e em que a amostra de espermatozoides foram expostas para condições de não capacitação e capacitação, fixadas e rotuladas para GM1. O número de padrões GM1 selecionados nos espermatozoides é determinado. A porcentagem para diferentes padrões GM1 em espermatozoide expostos a condições de capacitação in vitro e não capacitação in vitro é comparada. Uma mudança na porcentagem de um ou mais padrões GM1 selecionados em espermatozoide expostos em condições de capacitação in vitro sobre espermatozoide expostos em condições de não capacitação in vitro é indicativo do estado de fertilidade do indivíduo. O padrão GM1 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em AA, APM, INTER, Célula Alinhada e suas combinações. Em uma concretização, o estado de fertilidade do indivíduo é determinado, calculando uma razão para uma soma do número de padrões de localização AA GM1 e número de padrões de localização APM GM1 sobre uma do número total de padrões de localização GM1 rotulado para o espermatozoide capacitado.
[00125] Um método exemplar para identificar o estado de fertilidade de um indivíduo macho compreende obter uma amostra de espermatozoide, caracterizado por a amostra de espermatozoide ser do indivíduo e em que a amostra de espermatozoide foi exposta a condições de capacitação in vitro, foi fixada e foi rotulada com a presença de GM1. Um número de padrões GM1 selecionados no espermatozoide é determinado. A porcentagem para um ou mais padrões GM1 diferentes é comparada com a porcentagem de padrões de um controle ou critérios predeterminados. A amostra de espermatozoide de controle foi exposta às mesmas condições de capacitação in vitro e ao mesmo fixador. Uma mudança na porcentagem de um ou mais padrões GM1 selecionados em relação para a mudança no controle é indicativa de estado de fertilidade diferente do indivíduo do que o estado de fertilidade do controle.
[00126] Um método exemplar para identificar o estado de fertilidade de um indivíduo macho compreende a obtenção de uma amostra de espermatozoide, caracterizado por a amostra de espermatozoide ser do indivíduo, em que a amostra de espermatozoide foi exposta para condições de capacitação in vitro, foi fixada e foi rotulada para padrões GM1. Os padrões de localização GM1 na amostra são determinados. A porcentagem de um ou mais padrões GM1 é comparada com um limite de infertilidade caracterizado por uma porcentagem inferior que o limite de infertilidade é indicativo de problemas de fertilidade.
[00127] Um método exemplar para medir o estado de fertilidade de um indivíduo macho compreende obter uma amostra de espermatozoide, caracterizado por a amostra de espermatozoide ser do indivíduo, e em que a amostra de espermatozoide foi exposta para condições de capacitação in vitro, foi exposta para um fixador, e foi rotulada para GM1.
Os valores são obtidos para um ou mais volume da amostra original e concentração, motilidade e morfologia do espermatozoide na amostra original. Um Cap-Score da amostra de espermatozoide é determinado como a porcentagem de um ou mais padrões de localização GM1 na amostra. Um valor de índice de fertilidade masculina (MFI) do indivíduo é calculado com base no Cap-Score determinado e em um ou mais dos volumes obtidos, concentração, motilidade e morfologia. Por exemplo, o valor MFI pode ser calculado pela multiplicação do Cap- Score™, o volume, a concentração, o valor de motilidade e o valor de morfologia. A motilidade pode ser uma porcentagem dos espermatozoides que são capazes de se mover. A morfologia pode ser uma porcentagem dos espermatozoides que são morfologicamente normais.
[00128] Um método exemplar de medir o estado de fertilidade de um indivíduo macho compreende a obtenção de um Cap-Score™ de uma amostra de espermatozoide do indivíduo como a porcentagem de um ou mais padrões de localização GM1 na amostra. Os valores são obtidos para um ou mais de volume da amostra original e concentração, motilidade e morfologia do espermatozoide na amostra original. Um valor de índice de fertilidade masculina (MFI) do indivíduo é calculado com base no Cap-Score determinado e em um ou mais volume, concentração, motilidade e morfologia obtidos. Modelagem de Regressão e Aprendizagem por Computador
[00129] Em alguns aspectos, a presente divulgação fornece métodos, sistemas e meios legíveis por computador (por exemplo, meio legível por computador não transitório) para caracterizar o estado de fertilidade de um macho (por exemplo, prever uma probabilidade de que o uso do espermatozoide do macho irá gerar uma gravidez, (PGP), por exemplo, sob condições naturais ou sob um método de reprodução assistida, tal como inseminação intra-uterina (IUI)), usando um ou mais de uma ampla gama de métodos de classificação conhecidos pelos experientes na matéria. Em alguns aspectos, a presente divulgação também fornece métodos, sistemas, e meio legível por computador (por exemplo, meio legível por computador não transitório) para treinar um classificador de fertilidade para caracterizar o estado de fertilidade de um macho (por exemplo, prever uma probabilidade de gerar uma gravidez, por exemplo sob condições natural ou sob um método de reprodução assistida, tal coma inseminação intra-uterina (IUI), resultará em gravidez). Métodos de Classificação
[00130] Em algumas concretizações um modelo 214 é preparado, usando técnicas ou métodos de aprendizado de máquina. Os métodos de aprendizado de máquina permitem que um sistema de computador execute aprendizado automático (por exemplo, por meio de programas de software) a partir de um conjunto de dados factuais (por exemplo, conjunto de recursos de treinamento de amostra de sêmens de machos de casais que tentaram engravidar, usando métodos de reprodução assistida), pertencente a um campo de aplicação específico (por exemplo, domínio). Dado esse conjunto de treinamento, os métodos de aprendizado de máquina são capazes de extrair padrões e relacionamentos dos próprios dados. Uma extensa discussão sobre os métodos de aprendizado de máquina e suas aplicações podem ser encontrados em Mitchell, 1997, Machine Learning, McGraw-Hill e Patente U.S. No. 8,843,482, cada um dos quais é incorporado por referência neste documento. Os métodos de aprendizado de máquina bem conhecidos incluem árvores de decisão, regras de associação, redes naturais e método Bayesian.
[00131] Os padrões aprendidos e relacionamentos são codificados por métodos de aprendizado de máquina e um modelo quantitativo formal, que pode assumir diferentes formas, dependendo da técnica de aprendizado de máquina usada. Exemplos de formas para um modelo incluem regras lógicas, equações matemáticas e gráficos matemáticos. Um objetivo dos métodos de aprendizado de máquina é o de uma melhor compreensão e quantificação dos padrões dentro dos dados e relações entre os dados, a fim de obter um modelo como uma representação para os dados, por exemplo, um modelo para representar a fertilidade masculina.
[00132] Em algumas concretizações o modelo é preparado contra um único recurso em todo o conjunto de treinamento (por exemplo, se gravidez foi alcançada ou não usando um método reprodução assistida, tal como IUI). Em algumas concretizações, esta segunda característica única é categórica (por exemplo, grávida ou não grávida). Em algumas concretizações esta segunda característica única é numérica (por exemplo, o número de rodadas de reprodução assistida realizada antes da gravidez). Em algumas concretizações, o modelo é preparado conta uma combinação de recursos únicos em todo o conjunto de treinamento. Em algumas concretizações, os valores para o segundo recurso no conjunto de treinamento não são usados para treinar o modelo. Em algumas concretizações, técnicas de transformação de kernel e/ou técnicas de análise de componente principal são usadas para identificar o conjunto dos primeiros recursos (por exemplo, parâmetros {β0, β1, . . ., βi}) conforme divulgado em relação a algumas concretizações detalhadas abaixo. Como tal, será apreciado que, em algumas concretizações, o conjunto das primeiras características {β0, β1, . . ., βi} está na forma de componentes principais e são os componentes principais que são usados para treinar qualquer um dos modelos de fertilidade masculina descrito neste documento. Em outras concretizações, as medidas dos conjuntos de primeiras características {β0, β1, . . ., βi} em si, não na forma de componentes principais, são usados para treinar qualquer dos modelos descritos neste documento.
[00133] Em algumas concretizações, o modelo de fertilidade masculina é um modelo de regressão supervisionado e o modelo preparado fornece previsões de valores reais para um único segundo recurso (por exemplo, uma previsão de quantas rodadas de reprodução assistida serão necessárias antes de alcançar a gravidez). Tais abordagens são exemplos úteis em que a segunda caraterística alvo (por exemplo, tempo até a gravidez) é medida como um número contínuo.
[00134] Em algumas concretizações, o modelo de fertilidade masculina é um modelo de classificação supervisionado e o modelo preparado fornece uma previsão de uma classificação para um único segundo recurso (por exemplo, uma previsão quanto à chance de um casal engravidar, usando uma técnica de reprodução). Tais abordagens são exemplos úteis em que a segunda característica alvo (por exemplo, gravidez) é medida com uma indicação discreta.
[00135] Em algumas concretizações, o modelo 214 é um modelo de agrupamento não supervisionado ou um modelo de pesquisa de vizinho mais próximo. Nessa abordagem não supervisionada, os modelos quantificam a correspondência geral entre entidades de referência.
[00136] Em algumas concretizações, um conjunto (dois ou mais) de modelos é usado. Em algumas concretizações, a técnica de impulso, tal como AdaBoost é usada em conjunto com muitos outros tipos de algoritmos de aprendizagem para melhorar seu desempenho. Nesta abordagem, a saída de qualquer um dos modelos divulgados neste documento, ou seus equivalentes, é combinada em uma soma ponderada que representa a saída final do classificador de impulso. Ver Freund, 1997, "A decision-theoretic generalization of on- line learning and an application to boosting,"Journal of Computer and System Sciences 55, p. 119, que está incorporado neste documento por referência.
[00137] Em algumas concretizações, o modelo de fertilidade masculina preparado é um modelo de regressão linear. Em abordagens de regressão não linear, cada Xj em {X1, …, Xi} é modelado como um uma variável aleatória com uma média dada por uma função não linear f(x,β). Ver Seber and Wild, 1989, Nonlinear Regression, New York: John Wiley and Sons, ISBN 0471617601, que está incorporado neste documento por referência.
[00138] Em uma concretização, o modelo de fertilidade masculina preparado é um modelo de regressão logística, por exemplo, da forma: 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) onde f(X) é uma medida de fertilidade, i é um inteiro positivo, α é o parâmetro determinado durante o preparo do classificador pré preparado, β0, β1, . . ., βi são parâmetros determinados durante o preparo do classificador pré preparado, e cada Xj in {X1, . . ., Xi} é um dado nos dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide (por exemplo, incluindo um ou mais de uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, um volume da amostra de espermatozoide, uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, um termo de interação do mesmo, uma transformação de um dado do mesmo, uma expansão de base de um dado do mesmo, e um componente principal expresso como um componente linear de dois ou mais dados do mesmo.). Ver, Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, pp. 42-49; e Jolliffe, 1982, “A note on the Use de Principal Components in Regression,” Journal of the Royal Statistical Society, Series C. 31 (3), pp. 300–303, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.
[00139] Exemplos de uma transformação de um primeiro dado inclui, mas não são limitados para: um log, raiz quadrada, um quadrado ou, em geral, elevar o valor do dado para uma potência. Um exemplo de uma expansão de base do dado inclui, mas não são limitados para: representar o dado com um polinômio, um polinômio por partes ou um Splines de suavização (smoothing spline) como discutido em Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Capitulo 5, que é incorporado neste documento por referência. Um exemplo de uma interação entre dois ou mais dados é X1 ∙ X2.
[00140] Em algumas concretizações, o modelo de classificação de fertilidade masculina preparada é um modelo de regressão linear da forma: 𝑡 𝑓 (𝑋) = 𝛽0 + ∑ 𝑋𝑗 𝛽𝑗 𝑗=1 onde t é um inteiro positivo, f(X) é uma medida de fertilidade masculina, 𝛽0 , 𝛽1 , …, 𝛽𝑡 são parâmetros que são determinados para o preparo do modelo, e cada 𝑋𝑗 em {𝑋1 , …, 𝑋𝑡 } é um dados nos dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide (por exemplo, incluindo um ou mais de a razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, um volume da amostra de espermatozoide, uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, um termo de interação dos mesmos, uma transformação e um dado dos mesmos, um expansão de base de um dado do mesmo, e um componente principal expresso como um componente linear de dois ou mais dados dos mesmos). Ver, Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, pp. 42-49; e Jolliffe, 1982, “A note on the Use of Principal Components in Regression,” Journal of the Royal Statistical Society, Series C. 31 (3), pp. 300– 303, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.
[00141] Em algumas concretizações, o modelo de classificação de fertilidade masculina preparado é uma máquina de vetor de suporte (SVM - Support Vector Machine). Em tais concretizações, os SVMs são preparados para classificar uma entidade respectiva, usando medições dos dados da amostra de espermatozoide {X1, . . ., Xi} e um conjunto de preparo e uma medida de um resultado (por exemplo, gravidez e/ou tempo para gravidez) em todo o conjunto preparado.
OS SVMs são descritos em Cristianini and Shawe-Taylor, 2000, “An Introduction to Support Vector Machines,” Cambridge University Press, Cambridge; Boser et al., 1992, “A training algorithm for optimal margin classifiers,” in Proceedings of the 5th Annual ACM Workshop on Computational Learning Theory, ACM Press, Pittsburgh, Pa., pp. 142-152; Vapnik, 1998, Statistical Learning Theory, Wiley, New York; Mount, 2001, Bioinformatics: sequence and genome analysis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Duda, Pattern Classification, Second Edition, 2001, John Wiley & Sons, Inc., pp. 259, 262-265; and Hastie, 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer, New York; and Furey et al., 2000, Bioinformatics 16, 906-914, cada um dos quais é incorporado inteiramente neste documento por referência.
Quando usado para classificação, SVMs separam um determinado conjunto de dados preparados binários rotulado (por exemplo, o resultado alvo é fornecido com um rotulo binário de possuindo um resultado alvo (por exemplo, gravidez) ou não possuindo um resultado alvo (por exemplo, não engravidar) com um hiper plano que está maximamente distante dos dados rotulados.
Para casos em que nenhuma separação linear é possível, os SVMs podem trabalhar em combinação com a técnica de `kernels`, que automaticamente realiza um mapeamento não linear para um espaço espectral.
O hiperplano encontrado pelo SVM no espaço espectral corresponde a um limite de decisão não linear no espaço de entrada.
[00142] Em algumas concretizações, o modelo de classificação de fertilidade masculina preparado é um modelo de análise de componente principal (PCA - Principal Component Analysis). PCA pode ser usado para analisar os dados de característica de amostra de espermatozoide do conjunto preparado, de modo a construir uma regra de decisão que discrimine um rótulo (por exemplo, gravidez ou não gravidez). O PCA reduz a dimensionalidade do conjunto de preparo 206 pela transformação dos dados característicos da amostra de espermatozoide do conjunto de preparo para um novo de variáveis (componentes principais) que sumariza as características do conjunto de preparo. Ver, por exemplo, Jolliffe, 1986, Principal Component Analysis, Springer, New York, que é incorporado neste documento por referência. O PCA é também descrito em Draghici, 2003, Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman & Hall/CRC, que é incorporado neste documento por referência.
[00143] Os componentes principais (PCs - Principal Components) não estão correlacionados e são ordenados de modo que o k-ésimo PC tenha a k-ésima maior variação entro os PCs. O k-ésimo PC pode ser interpretado como a direção que maximiza a variação das projeções dos pontos de dados de modo que seja é ortogonal para os primeiros k-1 PCs. Os primeiros poucos PCs capturam a maior parte da variação no conjunto de preparo. Em contraste, os últimos poucos PCs costumam capturar apenas o “ruído” residual no conjunto de preparo. Como tal, PCA também pode ser usado para criar um modelo de acordo com a presente divulgação. Em tal abordagem, cada linha em uma tabela é construída e representa as medições para os dados característicos da amostra de espermatozoide de uma entidade de referência específica do conjunto de preparo e pode ser considerada um vetor. Como tal, os dados no conjunto de preparo podem ser vistos nas matrizes de vetores, cada vetor, representando uma respectiva entidade de referência e incluindo medições para dados característicos da amostra de espermatozoide dos respectivos machos no conjunto de preparo. Em algumas concretizações, esta matriz é representada em um método Free- Wilson de descrição binária qualitativa de monômeros (Kubinyi, 1990, 3D QSAR in drug design theory methods and applications, Pergamon Press, Oxford, pp 589-638), e distribuído em um espaço compactado ao máximo, usando PCA de modo que o primeira componente principal (PC) capture a maior quantidade de informações de variação possível, o segundo componente principal (PC) captura a segunda maior quantidade de todas as informações de variação, e assim por diante até que todas informações de variação na matriz tenham sido consideradas. Em seguida, cada um dos vetores (onde cada vetor representa uma entidade de referência do conjunto de preparo) é plotado. Métodos de Seleção de Recursos
[00144] Em algumas concretizações, os métodos de classificação de fertilidade usados e/ou preparados, como descrito neste documento, são baseados em características de amostra de espermatozoides que são selecionadas, usando um método de seleção de recursos, por exemplo, uma regressão de menor ângulo ou uma regressão stepwise. Os métodos de seleção de recursos são particularmente vantajosos na identificação, entre uma infinidade de variáveis (por exemplo, Cap-Score, número de espermatozoide (por exemplo, concentração),
motilidade do espermatozoide, morfologia do espermatozoide, outras métricas de movimento de espermatozoide, tais como VSL (linha reta de velocidade), STR (retidão), LIN (Linearidade), VCL (velocidade curvilínea), VAP (caminho médio de velocidade), % motilidade, duração da motilidade, LHA (amplitude lateral da cabeça), WOB (oscilação), PROG (progressão), e BCF (número cruzado de batida), e outros dados biométricos do sujeito macho, tais como idade, peso, etc.) presentes e todo o conjunto de preparo, cujas as características têm um efeito causal significativo em um determinado resultado (por exemplo, quais características de espermatozoide são causais para uma fertilidade masculina baixa e/ou uma fertilidade masculina alta). As técnicas de seleção de recursos são descritas, por exemplo, em Saeys et al., 2007, “A Review of Feature Selection Techniques in Bioinformatics,” Bioinformatics 23, 2507-2517, e Tibshirani, 1996, “Regression and Shrinkage and Selection via the Lasso,” J. R. Statist. Soc. B, pp. 267-288, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.
[00145] Em algumas concretizações, o método de seleção dos recursos inclui regularização (por exemplo, é Laço (Lasso), regressão de ângulo mínimo, ou rede Elástica) em todo o conjunto de preparo para melhorar precisão de previsão. Lasso é descrito em Hastie et al., 2001, The Elements de Statistical Learning, pp. 64-65, que é incorporado neste documento por referência. Least angle regression é descrito em Efron et al., 2004, "Least Angle Regression," The Annals of Statistics, pp. 407-499, que é incorporado neste documento por referência. A rede elástica, que engloba regressão de cume, é descrita em Hastie, 2005, "Regularization and
Variable Selection via the Elastic Net," Journal of the Royal Statistical Society, Series B: pp. 301-320, que é incorporado neste documento por referência.
[00146] Em algumas concretizações, o método de seleção de recursos compreende a aplicação de uma árvore de decisão ao conjunto de preparo. As árvores de decisão são descritas geralmente por Duda, 2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 395-396, que é incorporado neste documento por referência. Métodos baseados em árvore particiona o espaço de recursos em um conjunto de retângulos, e em seguida ajusta um modelo (como uma constante) em cada um. Em algumas concretizações, a árvore de decisão é regressão de floresta aleatória. Um algoritmo específico que pode ser usado é uma árvore de classificação e regressão (CART - Classification And Regression Tree). Outros algoritmos de árvore de decisão específico incluem, mas não são limitados para: ID3, C4.5, MART, e Random Forests. CART, ID3 e C4.5 são descritos em Duda, 2001, Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., New York. pp. 396- 408 e pp. 411-412, que é incorporado neste documento por referência. CART, MART, e C4.5 são descrito em Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer- Verlag, New York, Capitulo 9, que é incorporado inteiramente neste documento por referência. Florestas aleatórias são descritas em Breiman, 1999, "Random Forests--Random Features," Technical Report 567, Statistics Department, U.C. Berkeley, September 1999, que é incorporado inteiramente neste documento por referência.
[00147] Outro método de seleção de recursos que pode ser usado no sistema e métodos da presente divulgação é splines de regressão adaptativa multivariada (MARS - Multivariate Adaptive Regression Splines). MARS é um procedimento adaptativo para regressão, e é bem adequado para os problemas de alta dimensão endereçados pela presente divulgação. MARS pode ser visto como uma generalização de regressão linear stepwise ou uma modificação do método CART para melhorar o desempenho do CART na configuração de regressão. MARS é descrito em Hastie et al., 2001, The Elements of Statistical Learning, Springer-Verlag, New York, pp. 283-295, que é incorporado inteiramente neste documento por referência.
[00148] Em algumas concretizações, o método de seleção de recursos compreende a aplicação de regressão de processo Gaussiano para o conjunto de preparo. A Regressão de processo Gaussiano é divulgada em Ebden, August 2008, arXiv:1505.029652v2 (29 Aug 2015), "Gaussian Process for Dimensionality Reduction: A Quick Introduction," que é incorporado neste documento por referência. Métodos de Classificação Exemplar, Sistemas, e Meio Legível por Computador
[00149] Agora que uma visão geral de diferentes modelos de classificação e modelos de seleção de recursos que são usados em várias concretizações da presente divulgação foi delineada, mais detalhes de modelos específicos e modelo de treinamento são fornecidos.
[00150] Em um aspecto, a divulgação fornece um método para caracterizar um estado de fertilidade de um macho compreendendo: expor, in vitro, uma porção de uma amostra de espermatozoide de um homem para condições de capacitação, assim formando uma amostra de espermatozoide capacitada, fixando a amostra de espermatozoide capacitada com um fixador, formando assim uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa, tratando a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada tem um rótulo detectável, assim formando uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, identificando uma pluralidade de padrões de localização GM1 rotulado para uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, a referida pluralidade de 1 padrões de localização GM rotulado compreende um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1, atribuir o padrão de localização AA GM1 e o padrão de localização GM1 APM para um estado capacitado, atribuir o padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado, e caracterizar um estado de fertilidade do macho, aplicando um ou mais classificadores de fertilidade pré preparados aos dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide, caracterizado por os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide compreender uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado (por exemplo, uma razão de espermatozoide, exibindo um estado capacitado para um número total de espermatozoide atribuídos).
[00151] Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide consistem na razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado.
Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide, adicionalmente compreender um ou mais dados selecionados a partir do grupo, consistindo de (A) um volume da amostra de espermatozoide, (B) a concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, (C) uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e (D) uma combinação aritmética de qualquer dois de (por exemplo, um termo de interação): (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e APM GM1 padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (b) o volume da amostra de espermatozoide, (c) a concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e (d) a motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide.
Em algumas concretizações, a combinação aritmética é uma soma, uma diferença, um produto, ou uma razão de quaisquer duas medidas de dados.
Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide consiste de: (A) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e APM GM1 padrão de localização e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (B) o volume das amostras de espermatozoide, e (C) um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, e (b) o volume da amostra de espermatozoide.
[00152] Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado é um modelo de regressão linear. Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado é um modelo de regressão logística, por exemplo, da forma: 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) onde: f(X) é uma medida de fertilidade, i é um inteiro positivo, α é parâmetro determinado durante preparo do classificador pré-preparado, β0, β1, . . ., βi são parâmetros determinados durante preparo do classificador pré-preparado, e cada Xj em {X1, . . ., Xi} é um dado dos dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide (por exemplo, incluindo um ou mais de uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, um volume da amostra de espermatozoide, uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e um termo de interação da mesma).
[00153] Em algumas concretizações, as condições de capacitação incluem a exposição da porção da amostra de espermatozoide para um ou mais de íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um mediador de efluxo de esterol. Em algumas concretizações, o mediador de efluxo de esterol compreende 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, alta densidade lipoproteína, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultrafiltrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou lipossomas. Em algumas concretizações, o mediador de efluxo de esterol compreende 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina.
[00154] Em algumas concretizações, o fixador compreende paraformaldeído, glutaraldeído ou uma de suas combinações.
[00155] Em algumas concretizações, a molécula rotulada por padrões de localização GM1 compreende uma subunidade b da toxina da cólera rotulada por fluorescência.
[00156] Em algumas concretizações, a etapa de identificação é realizada de 2 a 24 horas após a etapa de exposição.
[00157] Em algumas concretizações, o método inclui adicionalmente a etapa de: antes da etapa de exposição, tratar a porção da amostra de espermatozoide para reduzir a viscosidade da porção da amostra de espermatozoide, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica as membranas do espermatozoide.
[00158] Em uma aspecto, a presente divulgação fornece um método que compreende: a obtenção de uma primeira porção de uma porção de uma amostra de espermatozoide de um homem que foi exposto a condições de capacitação in vitro, fixado em um fixador, e rotulada com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável, identificar uma pluralidade de padrões de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, a referida pluralidade de padrões de localização GM1, compreendendo um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado atribuir o padrão de localização AA GM1 e o padrão de localização APM GM1 para um estado capacitado, atribuir o padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado, e caracterizar um estado de fertilidade do macho, aplicando um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado para os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide, caracterizado por os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide compreender uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) uma combinação dos padrões de localização GM1 rotulado (por exemplo, uma razão de espermatozoide, exibindo um estado capacitado para um número total de espermatozoides distribuídos).
[00159] Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide consistem na razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado. Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide, adicionalmente compreende um ou mais dados selecionados a partir do grupo, consistindo de: (A) um volume da amostra de espermatozoide, (B) uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, (C) uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e (D) uma combinação aritmética de quaisquer dois de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (b) o volume da amostra de espermatozoide, (c) a concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e (d) a motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide. Em algumas concretizações, a combinação aritmética é uma soma, uma diferença, um produto, ou uma razão de quaisquer duas medidas de dados. Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide consiste em: (A) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (B) o volume da amostra de espermatozoide, e (C) um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, e (b) o volume da amostra de espermatozoide.
[00160] Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado é um modelo de regressão linear. Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado é um modelo de regressão logística, por exemplo, da forma: 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) onde: f(X) é uma medida de fertilidade, i é um inteiro positivo, α é o parâmetro determinado durante o preparo do classificador pré-preparado, β0, β1, . . ., βi são parâmetros determinados durante o preparo do classificador pré- preparado e cada Xj em {X1, . . ., Xi} é um dado nos dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide (por exemplo, incluindo um ou mais de uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM
GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1rotulado, um volume da amostra de espermatozoide, uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide e um termo de interação da mesma).
[00161] Em algumas concretizações, as condições de capacitação incluem exposição da porção da amostra de espermatozoide para um ou mais de íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um mediador de efluxo de esterol. Em algumas concretizações, o mediador de efluxo de esterol compreende 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, lipoproteína de alta densidade, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultrafiltrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou lipossomas. Em algumas concretizações, o mediador de efluxo de esterol compreende 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina.
[00162] Em algumas concretizações, o fixador compreende paraformaldeído, glutaraldeído ou uma de suas combinações.
[00163] Em algumas concretizações, a molécula rotulada por padrões de localização GM1 compreende uma subunidade b da toxina da cólera rotulada por fluorescência.
[00164] Em algumas concretizações, a etapa de identificação é realizada de 2 a 24 horas após a etapa de exposição.
[00165] Em algumas concretizações, o método inclui adicionalmente, antes da etapa de obtenção, o tratamento da porção da amostra de espermatozoide para reduzir a viscosidade da porção da amostra de espermatozoide, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica as membranas do espermatozoide.
[00166] Em um aspecto, a divulgação fornece um método que compreende as etapas de: obtenção de uma amostra de espermatozoide, caracterizado por pelo menos uma porção da amostra de espermatozoide ser exposta em condições de capacitação in vitro para obter um espermatozoide capacitado vitro, que foi exposto para um fixador, e foi rotulado por GM1, assim formando uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, determinando um Cap-Score da amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada com base um ou mais padrões de localização GM1 rotulado, os referidos padrões de localização GM1 rotulado, sendo um padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1, um post-padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado, e caracterizar um estado de fertilidade do macho, aplicando um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado para os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide, caracterizado por os dados compreender uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e o padrão de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado (por exemplo, uma razão de espermatozoide, exibindo um estado capacitado para um número total de espermatozoides atribuídos).
[00167] Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide consiste na razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado. Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide adicionalmente compreendem um ou mais dados selecionados a partir do grupo, consistindo de: (A) um volume da amostra de espermatozoide, (B) uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, (C) uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e (D) uma combinação aritmética de quaisquer dois de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (b) o volume da amostra de espermatozoide, (c) a concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide e (d) a motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide. Em algumas concretizações, a combinação aritmética é uma soma, uma diferença, um produto, ou uma razão de quais quer dois dados medidas. Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide consiste em: (A) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (B) o volume da amostra de espermatozoide, e (C) um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, e (b) o volume da amostra de espermatozoide.
[00168] Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado é um modelo de regressão linear. Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado é um modelo de regressão logística, por exemplo, da forma:
𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) onde: f(X) é uma medida de fertilidade, i é um inteiro positivo, α é parâmetro determinado durante preparo do classificador pré-preparado, β0, β1, . . ., βi são parâmetros determinados durante preparo do classificador pré-preparado, e cada Xj em {X1, . . ., Xi} é um dado nos dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide (por exemplo, incluindo um ou mais de uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, um volume da amostra de espermatozoide, uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide e um termo de interação dos mesmos).
[00169] Em algumas concretizações, o método inclui adicionalmente as etapas de: antes da etapa de obtenção, tratar a porção da amostra de espermatozoide para reduzir a viscosidade da porção da amostra de espermatozoide, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica as membranas dos espermatozoides.
[00170] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método, que compreende: caracterizar uma estado de fertilidade de um macho, aplicando um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado para dados obtidos de uma amostra de espermatozoide do homem, caracterizado por os dados compreender uma razão entre (i) uma combinação de acrossomo apical (AA) GM1 padrões de localização e padrões de localização da membrana plasmática acrossomal (APM) GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado em uma porção tratada da amostra de espermatozoide, caracterizado por a razão entre (i) a combinação dos padrões de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos padrões de localização GM1 rotulado ser determinada por: expor, in vitro, uma porção da amostra de espermatozoide do homem para condições de capacitação, assim formando uma amostra de espermatozoide capacitada, fixando a amostra de espermatozoide capacitada com um fixador, assim formando uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa, tratar a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável, assim formando uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, identificar uma pluralidade de padrões de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, a referida pluralidade de padrões de localização GM1 rotulado compreender um padrão de localização AA GM1, um padrão de localização APM GM1, um padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado, atribuir o padrão de localização AA GM1 e o padrão de localização APM GM1 para um estado capacitado, atribuir o padrão de localização Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado, e comparar (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 com (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado.
[00171] Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide consistem na razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado. Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide adicionalmente compreendem um ou mais dados selecionado a partir do grupo, consistindo de: (A) um volume da amostra de espermatozoide, (B) uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, (C) uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e (D) uma combinação aritmética de quaisquer dois de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (b) o volume da amostra de espermatozoide, (c) a concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e (d) a motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide. Em algumas concretizações, os dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide consiste em: (A) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (B) o volume da amostra de espermatozoide, e (C) um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, e (b) o volume da amostra de espermatozoide.
[00172] Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado é um modelo de regressão linear. Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré-preparado é um modelo de regressão logístico (por exemplo, da forma: 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) onde: f(X) é uma medida de fertilidade, i é um inteiro positivo, α é o parâmetro determinado durante o preparo do classificador pré-preparado, β0, β1, . . ., βi são parâmetros determinados durante o preparo do classificador pré- preparado, e cada Xj em {X1, . . ., Xi} é um dado nos dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide (por exemplo, incluindo um ou mais de uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1rotulado, um volume da amostra de espermatozoide, uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e um termo de interação dos mesmos).
[00173] Em algumas concretizações, as condições de capacitação incluíram a exposição da porção da amostra de espermatozoide para um ou mais de íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um mediador de efluxo de esterol. Em algumas concretizações, o mediador de efluxo de esterol compreende 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, lipoproteína de alta densidade, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultrafiltrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou lipossomas. Em algumas concretizações, o mediador de efluxo de esterol compreende 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina.
[00174] Em algumas concretizações, o fixador compreende paraformaldeído, glutaraldeído ou uma de suas combinações.
[00175] Em algumas concretizações, a molécula rotulada por padrões de localização GM1 compreende uma subunidade b da toxina da cólera marcada por fluorescência.
[00176] Em algumas concretizações, a etapa de identificação foi realizada de 2 a 24 horas após a etapa de exposição.
[00177] Em algumas concretizações, antes da etapa de exposição, a porção da amostra de espermatozoide foi tratada para reduzir a viscosidade da porção da amostra de espermatozoide, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica as membranas dos espermatozoides.
[00178] Em algumas concretizações, a presente divulgação fornece um sistema para preparar um classificador de fertilidade para caracterizar um estado de fertilidade de um macho, o sistema compreendendo: pelo menos um processador e memória endereçável por pelo menos um processador, a memória de armazenagem pelo menos um programa para execução por pelo menos um processador, o pelo menos um programa compreender instruções para: A) obter um conjunto de preparo que compreender dados de amostras de espermatozoides de uma pluralidade de machos associados com resultado conhecido de uma tentativa de reprodução assistida (por exemplo, inseminação intra-uterina (IUI)), caracterizado por os dados de cada amostra de sêmen respectiva compreender uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado de espermatozoide na respectiva amostra de sêmen (por exemplo, uma razão de espermatozoide, exibindo um estado capacitado para um número total de espermatozoide atribuído), e B) tratar um ou mais classificadores de fertilidade com base em pelo menos uma correspondência entre o resultado da tentativa de reprodução assistida e a razão correspondente entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado de espermatozoide em cada amostra de sêmen respectiva.
[00179] Em algumas concretizações, a razão entre (i) a combinação do padrão de localização de acrossomo apical (AA) GM1 e padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado de espermatozoide para cada respectiva amostra de espermatozoide da pluralidade de machos foi determinada por um método que compreende: expor, in vitro, uma porção da amostra de espermatozoide de um respectivo macho da pluralidade de machos para condições de capacitação, assim formando uma amostra de espermatozoide capacitada, fixando a amostra de espermatozoide capacitada com um fixador, assim formando uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa, tratando a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa com a molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por a molécula rotulada ter um rótulo detectável, assim formando uma amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, identificar uma pluralidade de padrões de localização GM1 rotulado para a amostra de espermatozoide capacitada in vitro fixa rotulada, a referida pluralidade de padrões de localização GM1 rotulado, compreendendo um padrão de localização AA GM1, um padrão de localização APM GM1, um padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado, atribuir o padrão de localização AA GM1 e o padrão de localização APM GM1 para um estado capacitado, atribuir o padrão de localização de Célula Alinhada GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado, e comparar (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 com (ii) s combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado de espermatozoide.
[00180] Em algumas concretizações, as condições de capacitação incluem a exposição da porção da amostra de espermatozoide para um ou mais de íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um mediador de efluxo de esterol. Em algumas concretizações, o mediador de efluxo de esterol compreende 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, lipoproteína de alta densidade, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultrafiltrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou lipossomas. Em algumas concretizações, o mediador de efluxo de esterol compreende 2-hidroxi-propil-β-ciclo dextrina.
[00181] Em algumas concretizações, o fixador compreende paraformaldeído, glutaraldeído ou uma de suas combinações.
[00182] Em algumas concretizações, a molécula rotulada por padrões de localização GM1 compreende uma subunidade b da toxina da cólera marcada por fluorescência.
[00183] Em algumas concretizações, a etapa de identificação é realizada de 2 a 24 horas após a etapa de exposição.
[00184] Em algumas concretizações, o método usado para determinar a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado de espermatozoide para cada respectiva amostra de sêmen adicionalmente compreender, antes da etapa de obtenção, tratar a porção da amostra de espermatozoide para reduzir a viscosidade da amostra de espermatozoide, usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica as membranas do espermatozoide.
[00185] Em algumas concretizações, os dados usados para preparar um ou mais classificadores de fertilidade consiste da razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado para cada respectiva amostra de sêmen da pluralidade de machos. Em algumas concretizações, os dados usados para preparar o classificador de fertilidade adicionalmente compreende, de cada respectiva amostra de sêmen da pluralidade de machos, um ou mais dados selecionados a partir do grupo, consistindo de: (A) um volume da amostra de espermatozoide, (B) uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, (C) uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e (D) uma combinação aritmética de quaisquer dois de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (b) o volume da amostra de espermatozoide, (c) a concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e (d) a motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide. Em algumas concretizações, os dados usados para preparar o classificador de fertilidade consiste em: de cada respectiva amostra de espermatozoide da pluralidade de machos: (A) a respectiva razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, (B) o volume da amostra de espermatozoide, e (C) um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, e (b) o volume da amostra de espermatozoide.
[00186] Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade é um modelo de regressão linear. Em algumas concretizações, um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade é um modelo de regressão logística, por exemplo, da forma: 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) onde: f(X) é uma medida de fertilidade, i é um inteiro positivo, α é o parâmetro determinado durante o preparo do classificador pré-preparado, β0, β1, . . ., βi são parâmetros determinados durante preparo do classificador pré-preparado, e cada Xj em {X1, . . ., Xi} é um dado nos dados obtidos a partir da amostra de espermatozoide (por exemplo, incluindo um ou mais de uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, um volume da amostra de espermatozoide, uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e um termo de interação dos mesmos).
[00187] Em uma concretização da invenção, o Cap-Score™ médio para um macho fértil normal é de cerca de 30 a cerca de 40, ou mais. Em uma concretização, Cap-Score™ médio é de cerca de 32 a cerca de 38. Em uma concretização, o Cap-Score™ médio é de cerca de 34 a cerca de 36. Em uma concretização, o Cap- Score™ é cerca de 35,3.
[00188] Em uma concretização da invenção, a probabilidade média percentual de gravidez (ou probabilidade de gravidez) é de cerca de 35% a cerca de 50%. Em uma concretização, a probabilidade média de gravidez é de cerca de 37% a cerca de 48%. Em uma concretização da invenção, a probabilidade média de gravidez é de cerca de 39% a cerca de 46%. Em uma concretização, a probabilidade média de gravidez é de cerca de 41% a cerca de 44%. Em uma concretização da invenção, a probabilidade média de gravidez é cerca de 43%.
[00189] Em uma concretização, a presente divulgação fornece um método para identificar uma abordagem reprodutiva para casais que tentam engravidar. Em uma concretização, o método compreende obter um Cap-Score para um indivíduo conforme estabelecido acima e executar o Cap-Score por meio de análise de regressão logística discutida acima para obter uma percentagem de gravidez de perspectiva do macho dentro dos três primeiros meses de tentativa de conceber por meio de concepção natural ou dentro de 3 ciclos de inseminação intrauterina (IUI). Este valor informará o médico e o paciente sobre o curso mais eficaz e eficiente de terapia reprodutiva, e em última análise economizará tempo, dinheiro e esforços para o paciente, o médico e a companhia de seguros. Por exemplo, um macho com um Cap-Score alto(Homem 1), depois de executar o Cap-Score através da análise de regressão logística, terá uma probabilidade percentual maior de alcançar uma gravidez dentro dos três primeiros meses de tentativa de engravidar através de concepção natural ou dentro de 3 rodadas de IUI do que um macho com um Cap-Score baixo (Homem 2). Portanto, um médico pode escolher fornecer medicamento de estimulação da fertilidade para a parceira do homem 1 e instrui-lo a tentar engravidar naturalmente, enquanto para o homem 2, o médico pode recomendar uma forma mais rigorosa de terapia reprodutiva, tal como, por exemplo, fertilização in vitro, ou um doador de espermatozoide.
[00190] As divulgações das Patentes US Publicações Nos. 2017-0184605, 2017-0234857, e 2017-0248584 são incorporadas inteiramente por referência neste documento.
[00191] A invenção é adicionalmente descrita através dos seguintes exemplos ilustrativos, que não devem ser interpretados como restritivos. EXEMPLO 1
[00192] Este exemplo fornece a demonstração dos padrões de localização GM1 obtidos com espermatozoide humano. Os espermatozoides ejaculados foram coletados de doadores macho, e liquefeitos por 20 minutos a 37˚C, e em seguida foram realizadas avaliações de volume, contagem inicial, motilidade e morfologia 1 ml da amostra de sêmen foi colocado em camadas sobre 1 ml de um gradiente de densidade (90% Enhance-S; Vitrolife, San Diego, California, USA) em um tubo cônico de 15 ml. O tubo foi centrifugado a 300 x g durante 10 minutos. A fração inferior de 1 ml foi transferida para um novo tubo de 15 ml e então ressuspenso em 4 ml de mHTF. Este foi centrifugado a 600 x g durante 10 minutos. O supernadante foi removido e o pellet de espermatozoide foi ressuspenso em 0,5 ml de mHTF. Os espermatozoides foram então avaliados, quanto à concentração e motilidade. Volumes iguais de espermatozoide foram então adicionados a dois tubos, de modo que o volume final de cada tubo fosse de 300 µl, e a concentração final de espermatozoide foi
1.000.000/ml. O primeiro tubo continha mHTF (condição não- capacitante) e o segundo tubo continha mHTF mais 2-hidroxi- propil-β-ciclo dextrina em uma final concentração de 3 mM (condição capacitante). Os espermatozoides foram incubados por vários períodos de tempo, mas normalmente foram utilizadas 3 horas. Essas incubações foram realizadas a 37˚C.
[00193] No final do período de incubação, o conteúdo de cada tubo foi misturado suavemente e 18 µl de cada tubo foi removido e transferido para tubos de micro centrífugas separados. 2 µl de paraformaldeído a 1% (peso/volume) foi adicionado para atingir uma concentração final de 0,1%. Em outra concretização, paraformaldeído 0,1% (peso/volume) foi adicionado para atingir uma concentração de 0,01%. Esses tubos foram misturados suavemente e incubado à temperatura ambiente por 15 minutos, momento no qual foi adicionado 0,3 µl de 1 mg/ml da subunidade b da toxina da cólera. O conteúdo dos dois tubos foi novamente misturado suavemente e deixado para incubar por 5 minutos adicionais à temperatura ambiente. De cada tubo, 5 µl foi removido e colocados em uma lâmina de vidro para avaliação por microscópio de fluorescência. Para fornecer uma contra coloração, determinação de velocidade de planos focais e aumentar a longevidade do sinal de fluorescência 3 µl de DAPI/Antifade foram de tempo em tempo adicionados.
[00194] Como mostrado na Figura 2, padrões de localização de GM1 em espermatozoides humanos normais refletem a resposta a condições de capacitação. A resposta completa é observada em homens com fertilidade normal; o padrão responsivo foi amplamente reduzido ou ausente em homens com infertilidade inexplicada, que falharam em tentativas anteriores de inseminação intrauterina (IUI - IntraUterine Insemination) ou fertilização in vitro (IVF - In Vitro Fertilization). A Figura 1 mostra os padrões GM1 no espermatozoide humano. No entanto, com a finalidade de ensaio de diagnóstico, os padrões que refletem anormalidades, tais como PAPM, AA/PA, ES, e DIFF podem ser agrupados para facilitar a análise. As Figuras 2A-2C mostra as distribuições relativas dos diferentes padrões no sêmen normal incubado sob condições de não capacitação (NC; Figura 2A), ou condições de capacitação (CAP; Figura 2B). Uma redução no padrão INTER é observada no sêmen normal após a exposição ao CAP (Figura 2C), enquanto aumentos significativos no padrão AA e no padrão APM são também observados. Em comparação com esses dados normais, os espermatozoides de um grupo de homens conhecidos com infertilidade inexplicada também foram submetidos ao ensaio GM1. Nesses espermatozoides, quase não houve aumento no padrão AA ou no padrão APM sob condições de capacitação. EXEMPLO 2
[00195] Neste exemplo, históricos clínicos de 34 pacientes foram estudados para realizar uma análise detalhada de suas pontuações de ensaio GM1 em relação à história de alguma vez alcançar evidência clínica de gravidez. Um paciente macho foi definido como “fértil” se um casal de paciente alcançou alguma evidência de fertilização/ gravidez clínica (mesmo se limitada a evidência bioquímica ou um saco sem batimento cardíaco na ultrassonografia) dentro de 3 ou menos ciclos.
[00196] A análise dos dados para estes 34 pacientes revelou que se alguém aplicasse um corte de 40% (APM + AA) para a pontuação das amostras capacitadas no ponto de tempo de 3 horas, então 7/8 que “passou” (tendo uma pontuação de 39,5% ou mais), foram considerados para ser designado “fértil” (87.5%). Dos 26 que “falharam” (tendo uma pontuação de 39,4 ou menos), apenas 3/26 tinham evidência de gravidez clínica (11,5%). (ver Tabela 1 abaixo).
[00197] Se for reduzido o corte, seria previsto que mais pessoas que são clinicamente sub férteis obterão uma pontuação de aprovação e a porcentagem que passa no ensaio e é fértil dentro de 3 ciclos deve diminuir. Interessantemente, o resultado não foi um gradiente suave ou uma curva contínua em termos de fertilidade (conforme definido pelo critério <= 3 ciclos). Ou seja, se alguém falhou no ensaio conforme definido em 40 ou 35 não se correlacionou com qualquer mudança significativa na chance de fertilidade, que foi sempre baixa (entre 11,5-14,3%). Por outro lado, passar no ensaio em 35 vs 40 correspondeu com uma diferença muito grande nas chances de fertilidade (variando de 53,8-87,5%, respectivamente). Para reforçar e reiterar este ponto, uma mudança em 5% das porcentagens combinadas APM + AA correspondeu a uma mudança de mais de 30% na história de fertilidade.
[00198] Esses resultados sugerem que a fertilidade masculina se assemelha mais com uma “função degrau”, em que o intervalo de pontuação para o ensaio de fertilidade masculina correspondem às categorizações de “fértil”, “sub fértil” ou “infértil,” em vez de pequenas alterações nas pontuações que equivalem a mudanças correspondentes pequenas, mas contínuas na fertilidade masculina (chance de alcançar gravidez clínica). Esses dados indicam fortemente que uma pontuação de aproximadamente 38,5-40 seria o ponto de corte entre as designações de “sub fértil” ou “fértil”. Um exame mais aprofundado dos dados sugere que um ponto de corte de < 14,5% pode ser usado como uma designação de provável “infértil.” Corte Fértil definido na concepção dentro de </ = 3 ciclos Passa 8 (7/8 fértil = 87,5%) 39,5 Falha 26 (3/26 fértil = 11,5%) Passa 8 (7/8 fértil = 87,5%) 38,5 Falha 26 (3/26 fértil = 11,5%) Passa 11 (7/11 fértil = 63,6%) 37,5 Falha 23 (3/23 fértil = 13,0%) Passa 11 (7/11 fértil = 63,6%) 36,5 Falha 23 (3/23 fértil = 13,0%) Passa 13 (7/13 fértil = 53,8%) 35,5 Falha 21 (3/21 fértil = 14,3%)
[00199] Sumarizando os dados para esses homens, que foram todos semelhantes em termos de parâmetros de sêmen parâmetro médio, sugerem os seguintes intervalos (com base em pontuação absoluta): Infértil: < 14,5, sub fértil: 14,5-38,4, fértil: ≥ 38,5.
[00200] Alternativamente, pode-se avaliar a fertilidade de uma amostra, comparando a mudança no número relativo dos padrões APM e/ou AA ao longo do tempo de incubação em condições de capacitação, ou contra o número relativo observado em condições de não capacitação.
Por exemplo, pode- se comparar o número relativo de APM + AA após de 3 horas de incubação em condições de capacitação com o número relativo desses padrões no início da incubação.
Ainda em outra concretização, pode-se comparar a mudança nas frequências de APM e/ou AA com os resultados obtidos a partir de pontos de tempos sucessivos (tal como 1, 2, e 3 horas). Na realidade, pode-se plotar as frequências relativas no eixo Y e ponto de tempo no eixo X, e avaliar a inclinação ou taxa de mudanças do número crescente de uma ou mais das amostras INTER, APM e/ou AA sob condições de não capacitação e capacitação.
Quando esta abordagem para a análise foi realizada em um grupo de 63 pacientes, 31 homens com pontuações correspondentes ao grupo referência normal foram identificados, com padrões GM1 de linha de base de 17%-22%- 28% em meio não capacitação e 26%-31%-38% em meio capacitante, respectivamente ao longo de 1, 2, e 3 horas de incubação (ver figura 3). Foram identificados 32 homens com valores de referência abaixo de 15%-20%-24% em meio não capacitante e 20%-25%-29% em meio capacitante.
Os parâmetros de sêmen de número, motilidade e morfologia percentual normal (usando critérios estritos da OMS) foram comparados entre os dois grupos.
A população com intervalo normal de padrões GM1 teve uma taxa de gravidez de inseminação intrauterina (IUI) de 45,2% (14/31) dos quais 8 (25,8%) geraram pelo menos um batimento cardíaco fetal.
Três casais adicionais neste grupo engravidaram por conta própria.
Para homens com padrões GM1 abaixo da referência, a taxa de gravidez clínica IUI foi de apenas 6,3% (2/32; P=0,03). Neste corte, 13 submetidos a ICSI e 6 engravidaram (46,2%). EXEMPLO 3
[00201] As células de espermatozoide foram tratadas conforme descrito no Exemplo 1, mas incubadas em fixador por 24 horas. As células de espermatozoide marcadas foram então avaliadas por microscópio de fluorescência. Um novo padrão de localização GM1, Células Alinhadas foi identificado como ilustrado nas Figuras 6A, 6B, 6C e 6D. Em Células Alinhadas, conforme ilustrado na Figura 6A, existe sinal GM1 na parte inferior do segmento equatorial/parte superior da região pós acrossomal, e na membrana plasmática sobreposta ao acrossoma. O sinal é uniformemente distribuído na região pós acrossoma/equatorial e na membrana plasmática sobreposta ao acrossoma. Também existe uma banda no segmento equatorial que não tem sinal. Conforme ilustrado na Figura 6B, o sinal na membrana plasmática sobreposta ao acrossoma é mais brilhante do que o sinal na banda pós acrossoma/equatorial. Conforme ilustrado nas Figuras 6C e 6D, o sinal encontrado na banda pós acrossoma/equatorial é mais brilhante do que o sinal na membrana plasmática sobreposta ao acrossoma.
[00202] As células de espermatozoide de um único doador foram lavadas, incubadas em ambas as condições de capacitação (Stim) e não capacitação (Non-Stim) e em seguida ambos no dia 0 (mantido fixo por aproximadamente 5 horas) e no dia 1 (mantido fixo por aproximadamente 27,5 horas). Teve pouca mudança na porcentagem de células alinhadas do dia 0 ao dia 1 para o tratamento Stim. Em contraste, a percentagem de células alinhadas do dia 0 ao dia 1 aumento de 3 a 22% para o tratamento Não Stim. Em conjunto com esta mudança, houve uma redução subsequente no INTER de 76 a 51%. Esses dados são consistentes com padrões de células alinhadas que se desenvolvem no dia 1 a partir de células com um padrão Inter no dia 0. Tabela 1 % Células % % AA % APM % Inter Alinhadas Outros Dia 0 sem 0 16 76 3 6 Stim Dia 0 Stim 7 19 62 4 8 Dia 1 Sem 4 14 51 22 10 Stim Dia 1 Stim 4 24 53 3 16 EXEMPLO 4
[00203] Células de um único doador foram lavadas, incubadas em ambas as condições de capacitação (Stim) e não capacitação (Não Stim) e em seguida ambas pontuadas no dia 0 (mantido fixo por aproximadamente 4 horas) e dia 1 (mantido fixo por aproximadamente 25 horas). Uma vez que poucas células alinhadas foram observadas no dia 0, semelhante Cap-Scores foram obtidos no dia 0 com ou sem incluir o número de células alinhadas para determinar o Cap-Scores. No entanto, com o surgimento das células alinhadas no dia 1, diferentes valores de Cap-ScoreTM podem ser obtidos, dependendo de como as células alinhadas foram interpretadas. Por exemplo, quando as células alinhadas foram tratadas como Não Capacitadas, semelhantes Cap-Scores TM foram obtidos para ambos os tratamentos Stim e não Stim. No entanto, se as células alinhadas foram tratadas como capacitadas, separadas ou removidas do cálculo Cap-Score TM , maiores Cap-Scores foram obtidas para o tratamento Não Stim do que para o tratamento Stim. Ter maiores valores de Cap-ScoreTM para o tratamento de Não Stim não fez sentido, como essas células de espermatozoide foram incubadas em condições basais e, portanto, não teria mostrado padrões GM1 associado com capacitação. Essas observações fornecem evidências complementares adicionais de que as células alinhadas representam um estado não capacitado e devem ser tratadas como tal ao calcular Cap-ScoreTM. Tabela 2 Cap-ScoreTM computado com: Células Células Células Células alinhadas alinhadas alinhadas alinhadas como não como separadas removidas capacitadas capacitadas Não 18 20 20 19 Stim dia 0 Stim 28 31 30 29 dia 0 Não 35 52 52 42 Stim dia 1 Stim 36 39 38 37 dia 1 EXEMPLO 5
[00204] Quarenta amostras de sêmens diferentes, de 18 doadores únicos foram lavados, os espermatozoides foram incubados em ambas as condições capacitação (Stim) e não capacitação (Não Stim) e em seguida ambos pontuados no dia
0 e dia 1. Uma correlação significativa é observada entre os valores Stim Cap-ScoreTM obtidos no dia 0 e dia 1, quando as células alinhadas são tratadas como não capacitado (r=0,32; n=40; p<0,05). Em contraste, nenhuma correlação é observada entre o dia 0 e o dia 1, quando as células alinhadas são tratadas como capacitadas, separadas em caixas capacitadas ou não capacitadas com base no padrão de localização GM1, ou simplesmente removidas do Cap-ScoreTM. Estas observações suportam a visão de que padrão de localização de células alinhadas se desenvolvem, à medida que os espermatozoides são mantidos durante a noite e que no dia 0 esses espermatozoides apresentam padrão inter/não capacitado. O tratamento de células alinhadas como não capacitado, estabiliza o Cap-ScoreTM ao longo do tempo e é consistente com este padrão que reflete células que são inférteis. Além disso, esses dados demonstram que a interpretação das células alinhadas como não capacitada é aplicável à população. No entanto, o aparecimento de células alinhadas no dia 1 é dependente do doador. Isso levanta a possibilidade de que a observação dessas células alinhadas possa fornecer informações adicionais sobre estes doadores e a capacidade de fertilidade de seus espermatozoides. EXEMPLO 6
[00205] Dados da amostra de espermatozoides (isto é, amostras de sêmens) coletados de 56 indivíduos do sexo masculino, que usaram inseminação intra-uterina (IUI) para tentar engravidar com suas parceiras, em uma única clínica de fertilidade, foi usado como um conjunto de preparo para vários classificadores de reconhecimento de padrão de fertilidade. Cada entrada de dados inclui se o casal engravidou usando IUI, um Cap-ScoreTM, um volume da amostra de espermatozoide, uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide.
[00206] Em uma primeira tentativa de regressão logística foi usada para construir um classificador para caracterizar a fertilidade do macho. A regressão logística é uma técnica que modela dados categóricos, assumindo que as probabilidades das categorias são determinadas por uma transformação de um modelo linear em um conjunto de variáveis dadas. Para dados binários, tal como uma dicotomia grávida/não grávida, que se assume ser linear nas variáveis é o logit das probabilidades de sucesso: 𝑝 𝑙𝑜𝑔𝑖𝑡(𝑝) = log ( ) = 𝐴𝑥 1−𝑝 onde x é algum vetor de variáveis, e A é um conjunto de coeficientes, um para cada variável. As quatro variáveis foram Cap-Score, motilidade, concentração e volume. Para a análise discriminante linear (LDA - Linear Discriminant Analysis), essas variáveis foram centralizadas e escaladas, mas os modelos usaram os valores originais. Modelos usando todas as combinações das quatro variáveis (15 modelos), e modelos de interação selecionados por meio da seleção de variáveis passo a passo. Os dois melhores modelos foram baseados apenas no Cap-Score, e outro que usava o Cap-Score e volume. O Cap-Score sozinho foi preditivo do resultado de gravidez (p=0,05; intervalo de probabilidade de gerar gravidez (PGP - Probability of Generating Pregnancy): 6,97- 58,7%).
[00207] Uma medida de como o modelo explica bem os dados, desvio, sugere que o modelo mais complexo (por exemplo, usando Cap-Score e volume) é um modelo ligeiramente melhor que o modelo baseado apenas no Cap-Score. No entanto, modelos mais complexos tendem a ter um desvio menor apenas porque são mais flexíveis.
[00208] O AIC leva a complexidade do modelo em consideração, a fim de avaliar se o modelo mais complexo é realmente mais informativo ou se ele apenas parece mais informativo, porque é mais flexível. AIC sugere que o modelo usando apenas Cap-Score é ligeiramente melhor do que o modelo complexo (por exemplo, usando Cap-Score, volume, e um termo de interação que é o produto dos dois).
[00209] O desvio e as medidas de AIC não favorecem claramente um modelo sobre o outro. No entanto, nós usamos o modelo baseado apenas no Cap-Score que é vantajoso por pelo menos três razões. Primeiro, o modelo baseado apenas no Cap-Score é mais simples, e modelos mais simples tendem a ser mais robusto. Em segundo lugar, o volume é problemático por motivos médicos. Para valores moderados, o aumento do volume está associado ao aumento da fertilidade, mas os valores elevados estão associados à fertilidade reduzida. Em terceiro lugar, a saída do modelo logístico é diretamente interpretada como a probabilidade de sucesso, conforme discutido adicionalmente abaixo.
[00210] As medidas estatísticas para todas as quinze combinações das variáveis (excluindo os termos interação) são mostrados na Tabela 3, abaixo. Como descrito acima, o modelo usando apenas Cap-Score foi associado com um AIC mais baixo do que qualquer outro modelo, incluindo os modelos mais complexos associados com desvio mais baixo.
Tabela 3. Medidas Estatísticas de Ajuste para Modelo de Regressão Logística de Fertilidade Masculina de uma Única Clínica IUI.
Clínica Única Modelo Desvio AIC Cap-Score 61,71 65,71 Motilidade 63,50 67,50 Concentração 64,45 68,45 Volume 65,17 69,17 Cap-Score+Motilidade 60,59 66,59 Cap-Score+Concentração 60,45 66,45 Cap-Score+Volume 60,06 66,06 Motilidade+Concentração 63,24 69,24 Motilidade+Volume 62,76 68,76 Concentração+Volume 64,29 70,29 Cap-Score+Motilidade+Concentração 60,07 68,07 Cap-Score+Motilidade+Volume 58,82 66,82 Cap-Score+Concentração+Volume 59,46 67,46 Concentração+Motilidade+Volume 62,72 70,72 Cap-Score+Concentração+Motilidade+Volume 58,76 68,76
O modelo LDA, descrito acima, foi usado para fornecer uma subdivisão simples da fertilidade masculina em conjuntos de probabilidade de gravidez alta, média e baixa, com os limiares definidos pelo cálculo das duas funções de distribuição cumulativa empírica (ECDFs - Empirical Cumulative Distribution Functions) da Gestante (P - Pregnant) e Não Grávida Pregnant (NP - Not Pregnant) e encontrar os pontos de diferença máxima.
Uma vantagem importante para o modelo de regressão logística sobre o modelo LDA é que o modelo logístico estima a probabilidade de concepção de um indivíduo, em vez de fornecer uma categoria de triagem.
O modelo logístico pode ser usado também para criar categorias de triagem, mas é mais informativo do que isto.
Como o LDA não existe interpretação direta dos valores individuais do discriminante.
Os limiares de triagem são o resultado de um procedimento estatístico, e se uma amostra diferente tivesse ocorrido, os intervalos definidos por esses limiares teriam diferentes porcentagens da população.
As incertezas desses percentuais foram calculadas, usando bootstrap, que coleta amostras com substituição da população original para simular o efeito de uma nova população.
Mostramos que as porcentagens para os limiares têm um desvio padrão de cerca de 9%. Ou seja, só podem dizer com segurança que um dado percentual como 39% está entre 21% e 57%. Isso é verdade para as porcentagens de triagem calculadas a partir da análise LDA ou da regressão logística.
As probabilidades individuais mencionadas acima também possuem incertezas que podem ser avaliadas por simulação probabilística, e sua variabilidade é da mesma ordem de magnitude.
Com os dados atuais, nenhum número resultante de qualquer análise é garantido com precisão além da primeira casa decimal.
Outros modelos baseados em aprendizado de máquina também foram considerados, entretanto, eles não tiveram tanto sucesso como a abordagem regressão logística descrita acima.
Por exemplo, uma tentativa de construir uma rede neural com base nos quadros variáveis medidos no estudo de localização única descrito acima (por exemplo, Cap-ScoreTM, volume da amostra de espermatozoide, concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide e motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide) não convergiu. Da mesma forma, um método não supervisionado denominado clustering k-means colocou a maioria central dos dados em um cluster e separou pequenos clusters nas bordas.
[00211] Dois outros métodos estatísticos foram executados com sucesso, floresta aleatória e classificação do vizinho mais próximo. Entretanto, esses métodos funcionam mal em comparação com o modelo de regressão logística. O modelo de floresta aleatória, preparado nos dados de clínica única, classificou corretamente 58,8% dos casos de não grávidas, mas classificou corretamente apenas 22,7% dos casos de grávidas. A classificação do vizinho mais próximo identificou corretamente 59% dos casos de não grávida, mas classificou corretamente apenas 35,3% dos casos de grávida. As duas técnicas geram previsões inferiores, principalmente porque são técnicas locais que não podem “ver” o corpo inteiro dos dados de uma vez. Os dois métodos são muito diferentes, mas produzem resultados muito semelhantes: apenas ligeiramente melhores do que adivinhação para muitos casos. Os conjuntos de dados maiores determinariam pelo menos melhor a precisão da regressão logística ou análise discriminante linear; com essas técnicas não existe razão para esperar que o preparo em mais amostras faça com que tenha um desempenho melhor.
[00212] Também foi considerado se os modelos descritos acima poderiam ser usados para prever 17 casos de gravidez natural, que foram excluídos do conjunto de preparo. Usando o modelo LDA, apenas 7 dos 17 casos pontuaram na categoria “Alta” definida por essa análise, enquanto 4 pontuaram “Médio” e 6 pontuaram “Baixo”. Com o modelo de regressão logística, a previsão mediana de gravidez foi apenas 34%, apenas três casos tiveram previsão acima 50%, e a maior previsão foi de 56%. É claro que os dados de gravidez natural não “parecem” com os dados de gravidez IUI. EXEMPLO 7
[00213] Para determinar se um único modelo de regressão logística poderia ajustar dados tomados em várias clínicas de fertilidade, dados de amostras de espermatozoides (isto é, amostra de sêmens) de 124 sujeitos macho que usaram inseminação intra-uterina (IUI) em cinco clínicas diferentes. Cada entrada de dados inclui se o casal engravidou usando IUI, um Cap-ScoreTM, um volume da amostra de espermatozoide, uma concentração de espermatozoide na amostra de espermatozoide, e uma motilidade de espermatozoide na amostra de espermatozoide. Modelos de regressão logística foram calculados, como no Exemplo 5, para todas as combinações das quatro variáveis (15 modelos), e os modelos de interação selecionados por meio de seleção de variáveis passo a passo. As medidas estatísticas para todas as quinze combinações das variáveis (excluindo os termos de interação) são mostrados na Tabela 4, abaixo. Tabela 4. Medidas Estatísticas de Ajuste para Modelos de Regressão Logística da Fertilidade Masculina de cinco Clínicas IUI. Clínica Múltipla
Modelo Desvio AIC Cap-Score 148,56 152,56 Motilidade 157,67 161,67 Concentração 158,54 162,54 Volume 159,41 163,41 Cap-Score+Motilidade 147,47 153,47 Cap-Score+Concentração 147,75 153,75 Cap-Score+Volume 148,55 154,55 Motilidade+Concentração 157,47 163,47 Motilidade+Volume 157,57 163,57 Concentração+Volume 158,19 164,19 Cap-Score+Motilidade+Concentração 147,22 155,22 Cap-Score+Motilidade+Volume 147,46 155,46 Cap-Score+Concentrazãon+Volume 147,72 155,72 Concentração+Motilidade+Volume 157,25 165,25 Cap-Score+Concentração+Motilidade+Volume 147,21 157,21
[00214] Conforme relatado para os dados de clínica única, o modelo de regressão logístico, usando apenas Cap-Score (representado na Figura 7) foi associado com um AIC mais baixo do que qualquer outro modelo. Apenas Cap-Score foi preditivo do resultado de gravidez (p<0,001, intervalo de PGP 6,97-80,7%). A incorporação de dados de múltiplos locais resultou e uma queda muito leve nas medidas de qualidade do modelo, talvez indicando alguma não uniformidade nos métodos usados entre as diferentes instalações. No entanto, o modelo resultante é adequado para descrever qualquer um deles e reduziu a incerteza em comparação aos modelos calculados com base apenas nos dados clínicos de qualquer uma das cinco clínicas. O exercício de bootstrapping descrito no Exemplo
6 foi repetido para os dados de múltiplas clínicas para determinar as incertezas das previsões de probabilidade resultantes. Verificou-se que as incertezas diminuíram, pois o desvio padrão anterior de cerca de 9% (no estudo de clínica única) caiu para 4% (no estudo de múltiplas clínicas). Conforme previsto, os dados adicionais reduzem o erro das estimativas de previsão. EXEMPLO 8
[00215] A análise do sêmen falha em diagnósticos de muitos casos de fator de fertilidade do macho, porque falta um teste funcional que forneça informação com relação a capacidade do espermatozoide para fertilizar, e enfoca apenas nas características descritivas do espermatozoide e sêmen, tais como concentração, motilidade, morfologia e volume. O Cap- Score™ já demonstrou ter uma forte correlação com a fertilidade masculina, usando pontos de “corte” de fertilidade baixa e normal. No entanto, a fertilidade masculina é um contínuo, e os inventores pretendem mostrar, usando regressão logística, como o Cap-Score™ se relaciona com a probabilidade de gerar uma gravidez. Aqui, a relação entre a probabilidade prevista de gerar uma gravidez e os resultados reais da IUI são testados.
[00216] Cap-Scores™ e os resultados para 292 indivíduos macho foram obtidos de seis clínicas. Dos 292 indivíduos, 128 completaram o tratamento (isto é, engravidaram através de inseminação intrauterina (IUI) dentro de 3 ciclos ou completaram 3 tentativas sem gerar gravidez). O modelo PGP foi testado de duas maneiras. Teste 1: Os novos resultados foram adicionados aos 124 resultados anteriores do Exemplo 7 e o modelo foi executado novamente para determinar a mudança. Teste 2: os 128 resultados foram divididos em grupos ordenados por classificação de tamanho aproximadamente igual e a proporção de indivíduos, gerando com sucesso uma gravidez dentro de cada grupo foi comparada com a PGP média prevista dentro desse grupo, usando uma abordagem de regressão linear como descrito neste documento.
[00217] Resultados do Teste 1. Apenas uma ligeira mudança média foi observada, quando os 128 novos pontos de dados foram adicionados para os 124 pontos de dados anteriores do Exemplo 7 e um novo modelo de regressão logística foi gerado. A maior parte da mudança derivou das extremidades da curva, onde havia menos pontos de dados. A equação de regressão para os 124 pontos de dados foi PGP=1/[1+exp[-[- 2,86+0,08*Cap-Score™]]], com um valor de p de p<0.01, e a equação de regressão para os 252 pontos de dados (124 +128) foi PGP=1/[1+exp[-[-2,26+0,06*Cap-Score™]]], com a valor de p de P<0,001. As Figuras 8A e 8B ilustram a relação entre Cap-Score™ e PGP para o grupo n=124 e grupo n=252, respectivamente. Para ambos os grupos, foi observada uma forte associação entre Cap-Score™ e PGP, usando o modelo de regressão logístico divulgado neste documento, e, como mostrado na Figura 8B, com mais pontos de dados, o ajuste do modelo melhorou.
[00218] Resultados do Teste 2. Os 128 resultados foram divididos em 5 grupos e os PGPs calculados para cada grupo; os resultados foram também divididos em 6 grupos e os PGPs calculados para cada grupo. Quando os PGPs previstos foram comparados com as gravidezes observadas, foram observadas relações lineares significativas para os diferentes grupos. Para o grupo n=5, y=0,81x+0,10; R2=0,84; p=0,03, e para o grupo n=6, y=0,69x+0,14; R2=0,86; p<0.01. As inclinações não foram significativamente diferentes de 1 e os interceptos não foram significativamente diferentes de 0 (nos testes t, p>0,05). As Figuras 8C e 8D mostram a regressão das gestações observadas para os grupos n=5 e n=6, respectivamente. Para ambos os grupos, a relação mostra que a média de PGP dentro de um grupo foi efetivamente igual à proporção observada, gerando uma gravidez para aquele grupo. Esses resultados adicionalmente apoiam a demonstração de uma forte associação entre Cap-Score™, função do espermatozoide/capacidade de fertilização e a capacidade de gerar uma gravidez. EXEMPLO 9
[00219] Defeitos na capacitação de espermatozoide são altamente prevalente em homens que fazem exames de fertilidade por causa de questões sobre a sua fertilidade, mesmo que esses exames determinem que o macho é normospérmico (isto é, que a análise de volume, concentração e motilidade do sêmen são normais por critérios da Organização Mundial de Saúde (WHO - OMS)). Neste exemplo, as métricas de análise de sêmen, Cap-Score™, e a probabilidade de gerar uma gravidez dentro de três ciclos (PGP) foram analisados. Este foi um estudo de correlação – Cap-Score™, PGP e métricas de análise de sêmen de 1.610 homens foram comparados com os resultados de uma população fértil conhecida de 76 homens (identificados como tendo uma parceira grávida ou pai recente).
[00220] O sêmen foi coletado dos pacientes machos preocupados com potenciais problemas de fertilidade. As amostras foram coletadas de 9 clínicas diferentes ao longo de um período de cerca de 2,5 anos. O volume do sêmen, a concentração e motilidade dos espermatozoides foram avaliados nas amostras. Uma porção da amostra foi fixada e enviada para Androvia LifeSciences, de acordo com seu protocolo e analisado para Cap-Score™ e PGP.
[00221] Para avaliar a distribuição de Cap-Scores™ e seus PGPs associados em homens que questionam suas fertilidades, os PGPs foram divididos em caixas de ≤19%, 20-29%, 30-39%, 40-49%, 50-59%, e ≥60% e as distribuições de Cap-Scores™ e PGPs foram comparadas para os 1610 homens versus os resultados da população de 76 homens com fertilidade conhecida. Significativamente, mais homens questionando sua fertilidade foram encontrados nas caixas de PGP ≤19%, 20- 29%, e 30-39%, do que o esperado com base na distribuição em homens com fertilidade conhecida (p<0,001). Cinquenta e nove por cento (59%; 948/1610) de homens questionaram sua fertilidade e tendo a análise de sêmen foram encontrados para ser normoespérmico em relação ao volume, concentração e motilidade. Destes, 65% (616/948) tinham um Cap-Score™ inferior ou igual a 31, o que é indicativo de menor estado de fertilidade e menor PGP (inferior a 39%). Menos homens questionando sua fertilidade tinham um Cap-Score™ de 32 ou maior do que o esperado na distribuição de homens férteis. Esses resultados revelaram que uma alta prevalência de homens com métricas de sêmen normospérmico têm capacitação reduzida e/ou capacidade de fertilização na população de homens que buscam exames de fertilidade. Adicionalmente, os defeitos na função do espermatozoide foram igualmente prevalentes, independentemente da aprovação em qualquer métrica de análise de espermatozoide única ou múltipla; não houve diferença no PGP entre os diferentes grupos de pacientes: todos os pacientes, aqueles com uma única métrica de análise de sêmen normal (de acordo com a OMS), aqueles tendo mais de uma métrica de análise de sêmen normal (de acordo com a OMS), ou aqueles tendo mais de 10 milhões células móveis totais (p=0,990).Comparativamente ao grupo fértil, 65% dos machos normospérmicos, questionando sua fertilidade (616/948) tinham um Cap-Score™ de 31 ou menos, com uma probabilidade de gravidez de 39% ou menos, enquanto apenas 25% (19/76) do grupo fértil conhecido tinha um Cap-Score™ neste intervalo.
Por outro lado, apenas 35% (322/948) de homens normospérmicos que buscam exames de fertilidade tinham um Cap-Score™ de 32 ou maior, com uma probabilidade de gravidez de 40% ou mais, enquanto 75% do grupo fértil conhecido tinha um Cap-Score™ neste intervalo.
Esses dados apoiam a conclusão de que a análise de sêmen tradicional não é suficiente para identificar potenciais problemas de fertilidade masculina, e, portanto, contribuir para uma alta porcentagem de homens sendo diagnosticados com infertilidade idiopática.
Esses dados indicam que um teste de capacitação de espermatozoide (isto é, a análise Cap-Score) reduziria a porcentagem de homens diagnosticados com infertilidade idiopática, e poderia identificar intervenções potenciais que melhorariam a capacitação de espermatozoide, assim melhorando o PGP.
Tabela 5: Resultados do Estudo do Exemplo 9 % de todos % de homens % homens, os homens, normospérmicos fazendo Cap- fazendo homens, exames de % de Score PGP exames de fazendo exames fertilidade homens (%) (%) fertilidade de fertilidade >10M TMC férteis ≤ 8 6 7 1 ≤ 18 19 (133/1.610) (58/948) (110/1.489) (1/76)
19 - 28 27 28 9 - 25 (456/1.610) (255/948) (412/1.489) (7/76) 29 30 26 - 32 32 32 14 - 31 (513/1.610) (303/948) (482/1.489) (11/76) 39 40 32 - 17 19 18 36 - 36 (271/1.610) (181/948) (262/1.489) (27/76) 49 50 37 - 9 10 9 24 - 42 (144/1.610) (93/948) (135/1.489) (18/76) 59 ≥ 6 6 6 16 > 42 60 (93/1.610) (58/948) (88/1.489) (12/76)
[00222] Embora a presente divulgação tenha sido descrita com respeito a uma ou mais concretizações particulares, será entendido que outras concretizações da presente divulgação podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da presente divulgação, e tais outras concretizações serão pretendidas estar dentro do escopo desta divulgação.
Claims (61)
1.Método compreendendo: a. expor, in vitro, uma porção de uma amostra de esperma de um homem para condições de capacitação, assim formando uma amostra de esperma capacitada; b. fixar a amostra de esperma capacitada com um fixador, assim formando uma amostra de esperma capacitada in vitro fixa; c. tratar a amostra de esperma capacitada in vitro fixa com uma molécula rotulada para padrões de localização GM1, caracterizado por: a molécula rotulada tem um rótulo detectável, assim formando uma amostra de esperma capacitada in vitro fixa rotulada; d. identificar uma pluralidade de padrões de localização rotulado com GM1 para a amostra de esperma capacitada in vitro fixa rotulada, a referida pluralidade de padrões de localização rotulado com GM1 compreendendo padrão de localização de acrossoma apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização Lined-Cell GM1 e todos os outros padrões de localização rotulado GM1; e. atribuir o padrão de localização APM GM1 e o padrão de localização APM GM1 para um estado capacitado; f. atribuir o padrão de localização Lined-Cell GM1 e todos os outros padrões de localização rotulado com GM1 para um estado não capacitado; e g. caracterizar um estado de fertilidade masculina aplicando um ou mais classificadores de fertilidade pré treinados aos dados obtidos da amostra de esperma, caracterizado por:
os dados obtidos da amostra de esperma compreender uma razão (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 (por exemplo, uma razão de esperma exibindo um estado capacitado para um número total de esperma atribuído).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma consistirem na razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulados GM1.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma compreenderem ainda um ou mais dados selecionados a partir do grupo consistindo em: i.um volume da amostra de esperma, ii.uma concentração de esperma na amostra de esperma, iii.uma motilidade de esperma na amostra de esperma, e iv.uma combinação aritmética de quaisquer dois entre: (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, (b) o volume da amostra de esperma, (c) a concentração de esperma na amostra de esperma, e (d) a motilidade de esperma na amostra de esperma.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma consistir em: a. a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, b. o volume a amostra de esperma e c. um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, e (b) o volume da amostra de esperma.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por: um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré treinados ser um modelo de regressão não linear.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por: um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré preparado ser um modelo de regressão logística (por exemplo, da forma): 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) onde: a. f(X) ser uma medida de fertilidade, b. i ser um inteiro positivo, c. α do classificador pré preparado, e d. β0, β1, . . ., βi serem parâmetros determinados durante o preparo do classificador pré preparado, e e. cada Xj em {X1, . . ., Xi} ser um dado nos dados obtidos da amostra de esperma).
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado por: as condições de capacitação incluírem a exposição da porção da amostra de esperma para um ou mais de íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um mediador de efluxo de esterol.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por: o mediador de efluxo de esterol compreender 2- hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, lipoproteína alta densidade, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultrafiltrao, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou liposomas.
9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por: o mediador de efluxo de esterol compreender 2- hidroxi-propil-β-ciclo dextrina.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado por: o fixador compreender paraformaldeído, glutaraldeído ou uma de suas combinações.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado por: a molécula rotulada para padrões de localização de GM1 compreender uma GM1.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado por:
a etapa de identificação ser realizada de 2 a 24 horas após a etapa de exposição.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, compreendendo adicionalmente a etapa de: antes da etapa de exposição, tratar a porção da amostra de esperma para diminui a viscosidade da porção da amostra de esperma usando um pipeta de orifício largo feita de material de não metálico e usando um reagente que não danifica as membranas dos esperma.
14. Método compreendendo: a. obter uma primeira porção de uma porção de uma amostra de esperma de um homem que foi exposto a condições de capacitação in vitro, fixado em um fixador, e marcado com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por: a. molécula rotulada ter um rótulo detectável; b. identificar uma pluralidade de padrões de localização rotulado de GM1 para a amostra de esperma capacitada in vitro fixa marcada, a referida pluralidade de padrões de localização GM1 compreender um padrão de localização de acrossoma apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM), um padrão de localização Lined-Cell GM1 e todos os padrões de localização GM1 rotulados; c. atribuir o padrão de localização AA GM1 e o padrão de localização APM GM1 para um estado capacitado; d. atribuir o padrão de localização Lined-Cell GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 marcados para um estado não capacitado; e e. caracterizar um estado de fertilidade masculina aplicando um ou mais classificadores pré preparados fertilidade aos dados obtidos da amostra de esperma, caracterizado por: os dados obtidos da amostra de esperma compreender a razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de padrões de localização rotulado GM1 (por exemplo, uma razão de esperma exibindo uma estado capacitado para um número total esperma atribuído).
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma consistir na razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulados GM1.
16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma adicionalmente compreender um ou mais dados selecionados a partir do grupo consistindo de: a. um volume da amostra de esperma, b. uma concentração de esperma na amostra de esperma, c. uma motilidade de esperma na amostra de esperma, e d. uma combinação aritmética de qualquer dos dois (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, (b) o volume da amostra de esperma, (c) a concentração de esperma na amostra de esperma, e (d) a motilidade de esperma na amostra de esperma.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma consistindo em: a. a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, b. o volume da amostra de esperma, e c.um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 e (b) o volume da amostra de esperma.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-17, caracterizado por: um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré preparado ser um modelo de regressão linear.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-17, caracterizado por: um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré preparado ser um modelo regressão logístico (por exemplo, da forma): 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 ))
caracterizado por: a. f(X) ser uma medida de fertilidade, b. i ser número inteiro positivo, c. α ser parâmetro determinado durante o preparo do classificador pré preparado, e d. β0, β1, . . ., βi ser parâmetros determinados durante o preparo do classificador pré preparado, e e. cada Xj em {X1, . . ., Xi} ser um dado nos dados obtidos a partir da amostra de esperma).
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-19, caracterizado por: as condições de capacitação incluir a exposição da porção da amostra de esperma para um ou mais íons de bicarbonato, íons de cálcio e um mediador de efluxo de esterol.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por: o mediador de efluxo de esterol compreender 2- hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, alta densidade lipoproteína, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultrafiltrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou lipossomas.
22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por: o mediador de efluxo de esterol compreender 2- hidroxi-propil-β-ciclo dextrina.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-22, caracterizado por:
o fixador compreender paraformaldeído, glutaraldeído ou uma de suas combinações.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-23, caracterizado por: a molécula rotulada por padrões de localização GM1 compreender uma subunidade b da toxina da cólera marcada por fluorescência.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-24, caracterizado por: a etapa de identificação ser realizada de 2 a 24 horas depois da etapa de exposição.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-25, adicionalmente compreendendo a etapa de: antes da obtenção, tratar a porção da amostra de esperma para reduzir a viscosidade da porção da amostra de esperma usando a pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifique as membranas do esperma.
27. Método compreendendo as etapas de: a. obter uma amostra de esperma, caracterizado por: pelo menos uma porção da amostra de esperma ser exposta em condições de capacitação in vitro para obter um esperma capacitado in vitro, foi exposto para um fixador, e fo marcado por GM1, assim formando uma amostra de esperma capacitado in vitro rotulada fixa; b. determinar um Cap-Score da amostra de esperma capacitada in vitro rotulada fixa baseada em um ou mais padrões de localização rotulado GM1, um referido padrões de localização rotulado GM1 sendo um padrão de localização de acrossoma apical (AA) GM1, um padrão de localização GM1 da membrana plasmática pós acrossomal (APM), um padrão de localização Lined-Cell GM1 e todos os outros padrões de localização GM1; e c. caracterizar um estado de fertilidade masculina aplicando um ou mais classificadores de fertilidade pré preparado para os dados obtidos a partir da amostra de esperma, caracterizado por: os dados compreender uma razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e o padrão de localização APM GM1 e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 (por exemplo, uma razão de esperma exibindo um estado capacitado par ao número total de esperma atribuído).
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma consistir da razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1.
29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma adicionalmente compreender um ou mais dados selecionados a partir do grupo consistindo de: a. a volume da amostra de esperma, b. uma concentração de esperma na amostra de esperma, c. uma motilidade de esperma na amostra de esperma, e d. uma combinação aritmética de qualquer dois de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, (b) o volume da amostra de esperma, (c) a concentração de esperma na amostra de esperma, e (d) a motilidade de esperma na amostra de esperma.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma consistir em: a. a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, b. o volume da amostra de esperma, e c. um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, e (b) o volume da amostra de esperma.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-30, caracterizado por: um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré preparado ser um modelo de regressão linear.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-30, caracterizado por:
um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré preparado ser um modelo de regressão logístico (por exemplo, da forms: 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) caracterizado por: v.f(X) ser uma medida de fertilidade, vi.i ser um número inteiro positivo, vii.α ser parâmetro determinado durante preparo do classificador pré preparado, e viii.β0, β1, . . ., βi serem parâmetros determinados durante preparo do classificador pré preparado, e ix.cada Xj em {X1, . . ., Xi} ser um dado nos dados obtidos a partir da amostra de esperma).
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-32, adicionalmente compreendendo a etapa de: antes da etapa de obtenção, tratar a porção da amostra de esperma para reduzir a viscosidade da porção da amostra de esperma usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica membrada do esperma.
34. Método, compreendendo: a. caracterizar um estado de fertilidade de um homem pela aplicação de um ou mais classificadores de fertilidade pré preparado para dados obtidos a partir de uma amostra de esperma do homem, caracterizado por: os dados compreender uma razão entre (i) uma combinação de apical acrosome (AA) GM1 e padrões de localização e acrosomal plasma membrana (APM) e (ii) uma combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 em uma porção tratada da amostra de esperma, b. caracterizar a razão entre (i) a combinação dos padrões de localização AA GM1 e padrões de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 ser determinado por: a. expor, in vitro, uma porção da amostra de esperma do homem para condições de capacitação, assim formando uma a amostra de esperma capacitada; b. fixar a amostra de esperma capacitada com um fixador, assim formando uma amostra de esperma capacitada in vitro fixa; c. tratar a amostra de esperma capacitada in vitro fixa com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por: a molécula rotulada ter um rótulo detectável, assim formando uma amostra de esperma capacitada rotulada in vitro fixa; d. identificar um a pluralidade de padrões de localização rotulado GM1 para uma amostra de esperma capacitada rotulada in vitro fixa, a referida pluralidade de padrões de localização rotulado GM1 compreender um padrão de localização AA GM1, um padrão de localização APM GM1, um padrão de localização Lined-Cell GM1 e todos os outros padrões de localização rotulado GM1; e. atribuir o padrão de localização AA GM1 e o padrão de localização APM GM1 para um estado capacitado; f. atribuir o padrão de localização Lined-Cell GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado; e g. comparar (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 com (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma consistirem da razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os GM1 padrões de localização rotulado GM1.
36. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por: os dados obtidos a partir da amostra de esperma adicionalmente compreender um ou mais dado selecionado a partir do grupo consistindo em: a. um volume da amostra de esperma, b. uma concentração de esperma na amostra de esperma, c. uma motilidade de esperma na amostra de esperma, e d. uma combinação aritmética de qualquer dos (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, (b) o volume da amostra de esperma, (c) a concentração de esperma na amostra de esperma, e (d) a motilidade de esperma na amostra de esperma.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por:
os dados obtidos a partir da amostra de esperma consistir em: a. a razão entre (i) a combinação dos padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, b. o volume da amostra de esperma, e c. um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1, e (b) o volume da amostra de esperma.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-37, caracterizado por: um classificador en um ou mais classificadores de fertilidade pré preparado ser um modelo de regressão linear.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-37, caracterizado por: um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade pré preparado ser um modelo de regressão logístico (por exemplo, da forma: 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) onde: a. f(X) ser uma medida de fertilidade, b. i ser um número inteiro positivo, c. α AWE parâmetro determinado durante a preparação do classificador pré preparado, e d. β0, β1, . . ., βi serem parâmetros determinados durante preparação do classificador pré preparado, e e. cada Xj em {X1, . . ., Xi} ser um dado nos dados obtidos a partir da amostra de esperma).
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-39, caracterizado por: as condições de capacitação incluir a exposição da porção da amostra de esperma para um ou mais íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um mediador de efluxo de esterol.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por: o mediador de efluxo de esterol compreender 2- hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, lipoproteína de alta densidade, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultra filtrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou liposomas.
42. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por: o mediador de efluxo de esterol compreender 2- hidroxi-propil-β-ciclo dextrina.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-42, caracterizado por: o fixador compreender paraformaldeído, glutaraldeído ou uma de suas combinações.
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-43, caracterizado por: a molécula rotulada por padrões de localização GM1 compreender uma subunidade b da toxina da cólera marcada com fluorescência
45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-44, caracterizado por:
a etapa de identificação ser realizada de 2 a 24 horas depois da etapa de exposição.
46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-45, caracterizado por: antes da etapa de exposição, a porção da amostra de esperma ser tradada para reduzir a viscosidade da porção da amostra de esperma usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica a membrada do esperma.
47. Sistema para preparar um classificador de fertilidade parar caracterizar um estado a fertilidade de um homem, o sistema compreendendo: a. Pelo menos um processador e memória endereçável por pelo menos um processador, a memória armazenando pelo menos um programa para execução ´por pelo menos um processador, o pelo menos um programa compreender instruções para: i.Obter um conjunto de preparação que compreende dados a partir da amostra de espermas de uma pluralidade de homens associados com um resultado conhecido de uma tentativa de reprodução assistida (por exemplo, inseminação intra uterina (IUI- Intra-Uterine Insemination), caracterizado por: os dados de cada respectiva amostra de sêmen compreender uma razão entre (x) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (y) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1de esperma na respectiva amostra de sêmen (por exemplo, uma razão de esperma exibindo um estado capacitado para um número total de esperma atribuído); e ii.Preparar um ou mais classificadores de fertilidade baseado em pelo menos uma correspondência entre o resultado da tentativa de reprodução assistida e a correspondente razão entre (i) uma combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 de esperma em cada respectiva amostra de sêmen.
48. Sistema da reivindicação 47, caracterizado por: a razão entre (i) a combinação do padrão de localização de acrossoma apical (AA) GM1 e padrão de localização GM1 da membrana plasmática acrossomal (APM) e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 de esperma para cada respectiva amostra de esperma da pluralidade de homens ser determinada por um método compreendendo: a. expor, in vitro, uma porção da amostra de esperma a partir de um respectivo homem na pluralidade de homens para condições de capacitação, assim formando uma amostra de esperma capacitada; b. fixar a amostra de esperma capacitada com um fixador, assim formando uma amostra de esperma capacitada in vitro fixa; c. tratar a amostra de esperma capacitada in vitro fixa com uma molécula rotulada por padrões de localização GM1, caracterizado por: a molécula rotulada ter um rótulo detectável, assim formando uma amostra de esperma rotulada capacitada in vitro fixa;
d. identificação de uma pluralidade de padrões de localização rotulado GM1 para a amostra de esperma rotulada capacitada in vitro fixa, a referida pluralidade de padrões de localização rotulado GM1 compreender um padrão de localização AA GM1, um padrão de localização APM GM1, um padrão de localização Lined-Cell GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado; e. atribuir o padrão de localização AA GM1 e o padrão de localização APM GM1 para um estado capacitado f. atribuir o padrão de localização Lined-Cell GM1 e todos os outros padrões de localização GM1 rotulado para um estado não capacitado; e g. comparar (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 com (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 de esperma.
49. Sistema da reivindicação 48, caracterizado por: as condições de capacitação incluir a exposição da porção da amostra de esperma para um ou mais íons de bicarbonato, íons de cálcio, e um mediador de efluxo de esterol.
50. Sistema da reivindicação 49, caracterizado por: o mediador de efluxo de esterol compreender 2- hidroxi-propil-β-ciclo dextrina, metil-β-ciclo dextrina, albumina sérica, lipoproteína de alta densidade, vesículas de fosfolipídios, soro de cordão fetal ultrafiltrado, proteínas de ligação de ácidos graxos, ou liposomas.
51. Sistema da reivindicação 49, caracterizado por:
o mediador de efluxo de esterol compreender 2- hidroxi-propil-β-ciclo dextrina.
52. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-51, caracterizado por: o fixador compreender paraformaldeído, glutaraldeído ou uma de suas combinações.
53. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-52, caracterizado por: a molécula rotulada por padrões de localização GM1 compreender uma subunidade b da toxina da cólera marcada com fluorescência.
54. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-53, caracterizado por: a etapa de identificação ser realizada de 2 a 24 horas antes da etapa de exposição.
55. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 48-54, caracterizado por: o método usado para determinar a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 de esperma para cada respectiva amostra de sêmen adicionalmente compreender, antes da etapa de obtenção, tratar a porção da amostra de esperma para reduzir a viscosidade da amostra de esperma usando uma pipeta de orifício largo feita de material não metálico e usando um reagente que não danifica a membrada do esperma.
56. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 47-55, caracterizado por:
os dados usados para preparar um ou mais classificadores de fertilidade consistir da razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização rotulado GM1 de cada respectiva amostra de sêmen da pluralidade de homens.
57. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 47-55, caracterizado por: os dados usados para preparar o classificador de fertilidade adicionalmente compreender, de cada respectiva amostra de sêmen da pluralidade de homens, um ou mais dado selecionado a partir do grupo consistindo de: a. um volume da amostra de esperma, b. uma concentração de esperma na amostra de esperma, c. uma motilidade de esperma n amostra de esperma, e d. UMA combinação aritmética de qualquer dois de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os GM1 padrões de localização rotulado GM1, (b) o volume da amostra de esperma, (c) a concentração de esperma na amostra de esperma, e (d) a motilidade de esperma na amostra de esperma.
58. Sistema de reivindicação 57, caracterizado por: os dados usados para preparar o classificador de fertilidade consistir em, de cada respectiva amostra de esperma da pluralidade de homens:
a. a respectiva razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, b. o volume da amostra de esperma, e c. um produto de (a) a razão entre (i) a combinação do padrão de localização AA GM1 e padrão de localização APM GM1 e (ii) a combinação de todos os padrões de localização GM1 rotulado, e (b) o volume da amostra de esperma.
59. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 47-58, caracterizado por: um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade ser um modelo de regressão linear.
60. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 47-58, caracterizado por: um classificador em um ou mais classificadores de fertilidade ser um modelo de regressão logístico (por exemplo, da forma: 1 𝑓 (𝑋 ) = 1 + exp (−(𝛽0 + ∑𝑖𝑗=1 𝛽𝑗 𝑋𝑗 )) onde: a. f(X) ser uma medida de fertilidade, b. i ser um número inteiro positivo, c. α ser parâmetro determinado durante preparo do classificador pré preparado, e d. β0, β1, . . ., βi serem parâmetros determinado durante preparo do classificador pré preparado, e e. cada Xj in {X1, . . ., Xi} ser um dado nos dados obtidos a partir da amostra de esperma).
61. Método para identificação de uma abordagem reprodutiva compreendendo: a.
Determinar para probabilidade percentual de gravidez usando o método da reivindicação 6 e b.
Determinar uma abordagem reprodutiva apropriada com base no valor identificado na etapa a.
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