CN103044548A - 一种原发性胆汁性肝硬化的特异性自身抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种原发性胆汁性肝硬化的特异性自身抗体和相应抗原，所述特异性自身抗体是以胆管癌细胞RBE总蛋白作为抗原，利用免疫印迹法检测原发性胆汁性肝硬化PBC患者血清，检测到针对分子量约20kD蛋白的自身抗体，将其命名为Sp20抗体，然后利用双向电泳从PBC患者血清中分离得到该Sp20抗体。本发明还提供该Sp20抗体在制备诊断原发性胆汁性肝硬化试剂盒中的应用。通过研究Sp20抗体在PBC发病中的机制，为PBC患者早期诊断、早期治疗及预后的判断提供理论依据。有助于对AMA阴性的PBC患者的诊断，以及有助于与其它自身免疫病的鉴别诊断。

Description

一种原发性胆汁性肝硬化的特异性自身抗体及应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地说，涉及一种原发性胆汁性肝硬化的特异性自身抗体、其相应抗原和它们的应用。 

背景技术

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一种慢性、进行性胆汁淤积性肝脏疾病，一般认为与自身免疫有关。病变特点是以肝内小胆管的非化脓性炎症为特征。PBC在中老年女性中多见，男女比例为1：8。目前该病尚无治愈的方法,但早期及时治疗能改善生化指标及肝脏组织学病变,从而延缓病情进展,一旦进入晚期,则肝移植为唯一可行的治疗手段,因此早诊断早治疗至关重要。但因该病早期临床表现不典型及临床重视程度不够、诊断水平等原因，近年来，该病在城市人口中有增高的趋势。PBC的具体病因与发病机制仍不清楚，该病常合并其他器官自身免疫性疾病。在该病中几乎所有患者均存在特异性自身抗体和自身反应性T细胞反应，因此被称为是一种器官特异性的自身免疫性疾病。抗线粒体抗体(antimitochondrialautoantibodies,AMA)是该病的主要诊断指标，但仍有部分患者该抗体阴性，极易误诊。因此，寻找PBC患者除AMA、抗核抗体(antinuclearantibodies,ANA)以外一种新的自身抗体及其靶抗原，分析其在PBC患者中的临床意义，探讨其与PBC发病机制的关系，以期有助于PBC患者的早期诊断、早期治疗以及预后的判断。 

近年来国外研究发现在PBC中存在一种新的自身抗原成分，它可以共价的连接Sp100和PML蛋白，被称为微小泛素相关的修饰因子(small ubiquitin-related modifiers,SUMO)。SUMO-1和SUMO-2及SUMO-3蛋白是存在于其他核点蛋白中的特殊蛋白质。它们能够通过 相似的泛素结合途径，共价的连接到其他细胞蛋白上，但并不形成泛素化。SUMO结合的蛋白并不会导致其降解，而是稳定的结合靶蛋白及调节细胞的结构和功能。有研究显示，在99例抗Sp100和PML抗体阳性的PBC患者中可检测到抗SuMO-2和SUMO-1抗体，其在PBC中的阳性率为42%和15%。但在抗核点抗体阴性的PBC患者中并没有发现抗SUMO抗体，因此认为抗SUMO抗体也是PBC的一种新型自身抗体类型。最近Alessandro Granito等首次报道Sp140是一种新的、高度特异的PBC自身抗原。对135例PBC患者和157例疾病对照组（自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、系统性红斑狼疮）血清抗Sp140抗体进行检测阳性率为15%（20/135），而在疾病对照组中未检测到，由此可见，抗Sp140抗体是PBC高度特异的自身抗体。在AMA阴性的PBC患者中抗Sp140抗体的阳性率（53%）显著高于AMA阳性的PBC患者（9%）。AMA是PBC诊断的重要血清学标志，超过90%的PBC患者出现AMA，仍有10%PBC患者AMA为阴性；而抗gp210、抗LBR、抗P62、抗Sp140抗体仅出现在少部分PBC患者，因此，寻找新的特异性的自身抗体对PBC患者的早期诊断有重要意义，有助于对AMA阴性的PBC患者的诊断，以及AMA阳性的PBC患者的诊断，同时特异性抗原的鉴定是研究PBC发病机制的条件之一，有助于与其它自身免疫病的鉴别诊断。 

发明内容

本发明的目的是提供一种原发性胆汁性肝硬化的特异性自身抗体、其相应抗原和它们的应用。 

为了实现本发明目的，本发明的一种原发性胆汁性肝硬化的特异性自身抗体和相应抗原，所述特异性自身抗体是以胆管癌细胞RBE总蛋白作为抗原，利用免疫印迹法检测原发性胆汁性肝硬化PBC患者血清，检测到针对分子量约20kD蛋白（即，相应抗原）的自身抗体，将其命名为Sp20抗体，然后利用双向电泳从PBC患者血清中分离得到 该Sp20抗体。 

利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法对Sp20进行鉴定。 

间接免疫荧光法检测抗Sp20抗体荧光模型，对结果进行分析。 

对比抗Sp20抗体阳性与阴性PBC患者在临床表现、生化免疫指标、自身抗体、肝脏病理分期、对UDCA的治疗反应及预后进行比较等方面指标，分析抗Sp20抗体的临床意义。 

本发明还提供上述的Sp20抗体在制备诊断原发性胆汁性肝硬化试剂盒中的应用。 

本发明提供了一种新的PBC特异性自身抗体，通过研究其在PBC发病中的机制，为PBC患者早期诊断、早期治疗及预后的判断提供理论依据。有助于对AMA阴性的PBC患者的诊断，以及有助于与其它自身免疫病的鉴别诊断。为临床研发新的PBC诊断试剂提供科学依据。 

附图说明

图1为本发明较佳实施例采用免疫印迹法检测患者血清，1-8为PBC患者血清，9为SS患者血清，均出现针对分子量20kD蛋白的自身抗体，N为阴性对照血清。 

图2为Sp20抗体阳性和阴性PBC患者1年至7年的平均生存概率的比较。 

图3为Sp20抗体阳性和阴性PBC患者5年的生存率。 

图4为以RBE细胞裂解液的细胞核、细胞浆、全细胞为抗原，以含有抗PDC-E2、抗Sp20的PBC患者血清为抗体利用免疫印迹法的检测结果，1以全细胞为抗原；2以细胞浆为抗原；3以细胞核为抗原。其中74kD条带对应PDC-E2，20kD条带对应Sp20。 

图5为Sp20在细胞核、细胞浆、全细胞中相对灰度值的比较。 

图6为采用免疫印迹法检测Sp20在来自人不同器官组织的细胞系、大鼠肝细胞及大肠杆菌中的分布，1-8分别为人肝癌细胞株HepG2.2.15、人宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞株Mcf-7、人黑色 素瘤细胞株Mel-ed1、人低分化胃腺癌细胞株BCG-823、人小细胞肺癌细胞株NC1-H446、人胆管癌细胞株RBE及大鼠肝细胞株BRL，在以上细胞中均出现sp20；9为大肠杆菌E.coli.JM109。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

除非特殊说明，以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。 

实施例1  Sp20自身抗体在PBC患者中的检测 

一、病例选择 

1．35例PBC患者为来自北大人民医院肝病科1995年至2004年的住院病人，其中女性34例，男性1例，年龄34-77岁，平均(54±10)岁。对照组选择慢性乙型肝炎患者8例，慢性丙型肝炎患者5例，干燥综合征20例，自身免疫性肝炎8例，9例健康献血者。干燥综合征患者血清为北大人民医院免疫科实验室提供，健康献血者血清为北大人民医院血库提供，原发性胆汁性肝硬化、慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和自身免疫性肝炎患者血清由肝病科提供，研究所用的血清均-20℃保存。 

2.诊断标准：PBC参考2000年AASLD(美国肝病学会)的诊断指南1）血清碱性磷酸酶水平等胆汁淤积的指标升高；2）通过腹部B超或CT排除其他胆道梗阻因素；3）血清AMA或AMA-M2亚型阳性；4）AMA阴性患者则进行肝脏组织学检查，符合PBC的病理改变。干燥综合征采用2002年欧洲-美国干燥综合征的诊断标准，自身免疫性肝炎诊断参照国际自身免疫性肝炎联盟的诊断指标。慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎诊断符合2000年全国传染病及肝病年会所制定标准。 

3.肝脏病理学检查：共对32例PBC患者进行肝脏病理检查，肝组织常规石蜡包埋，HE及Masson染色，由同一位病理医师阅片。组织学分期参照以下标准：Ⅰ期为仅限于汇管三角的胆管炎症；Ⅱ期为显著的汇管区及汇管周围炎症，无间隔纤维化或桥接样坏死；Ⅲ为小叶纤维化和/或桥接样坏死；Ⅳ期为肝硬化。 

二、胆管癌细胞株 

人胆管癌细胞株RBE由北京大学肝病研究所提供，冻存于液氮中，复苏后培养于含10%FBS的RPMI1640中，5%CO₂培养箱中培养。 

三、实验方法 

1．免疫印迹法 

1.1SDS-PAGE：安装电泳仪及灌胶玻片；参照分子克隆提供的配胶方案配制18％分离胶和4%积层胶；于玻片间隙灌注分离胶，上铺一层双蒸水保持液面平整同时防止空气接触凝胶抑制聚合反应；待分离胶凝固后（约20分钟），倒去双蒸水，用面巾纸将残余水分吸干，灌入积层胶，插入梳子；积层胶聚合时，蛋白样品与2×上样缓冲液等体积混合，100℃煮沸5分钟使蛋白变性；待积层胶凝固后，拔出梳子，电泳槽内加入1×Tris-电泳缓冲液以电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上样孔；用微量移液器按预定顺序加样，每孔上样20μl总蛋白。上样后，60V稳压条件下进行电泳，直至溴酚兰到达分离胶底部，关闭电源结束电泳。 

电泳结束时，拆开玻璃板，把分离胶切成适当大小准备转膜。 

1.2转膜：裁剪NC膜，使其与分离胶的大小一致，漂浮于去离子水的水面上使排净NC膜上气泡；将六张大小与分离胶相同的3M滤纸和经上述处理的NC膜一起浸泡于转移缓冲液中；按如下的步骤安装电转移装置；平放夹板，3层3M滤纸放于其上，精确对齐，挤出气泡；将浸泡好的NC膜放在滤纸上，中间不留气泡；将凝胶转移到去离子水中漂洗一下，然后准确平放于NC膜上，排出气泡；另外3张滤纸放在凝胶之上，确保各层精确对齐，防止滤纸接触发生短路；根据凝胶面积按0.65mA/cm²稳流电转移8小时。 

1.3抗原抗体特异性结合：把NC膜转移到小塑料盒中，按0.1m1/cm²膜面积加入6%脱脂奶的1×TBST封闭液，排净气泡，37℃下摇床封闭3小时；将NC膜切成小条，按0.1ml/cm²膜面积加入6%脱脂奶的1×TBST封闭液及1:1000稀释度的待测患者的血清，排净气泡，4℃摇床反应2小时；1×TBST漂洗五次，每次10分钟；按0.1ml/cm²膜面积加入6%脱脂奶的1×TBST封闭液及1:5000稀释度的辣根过氧化物 酶标记的二抗IgG抗体，室温下摇床反应45分钟；1×TBST漂洗五次，每次10分钟。 

1.4显影：按0.125ml/cm²膜面积取ECL A液与B液等量混合，将NC膜浸入显色液中，反复振荡并翻转NC膜，30秒钟～45秒钟后取出，用面巾纸稍蘸干，置于压片盒内两张透明塑料膜间，覆以X光片，合夹曝光。3分钟后洗片，同时再压一张胶片，根据第一张胶片的显影情况，调整曝光时间。 

2．图像分析软件Quantity One对Sp20抗体滴度进行相对灰度值的测定。 

3．统计学方法：应用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，计量资料比较用t检验计量资料以均数±标准差表示。计数资料用Fisher确切概率法，计数资料用例数或百分数表示，P<0.05为差异有统计学意义。 

四、实验结果 

（一）抗-Sp20的检测结果：利用免疫印迹法观察到8(8/35)例PBC患者和1(1/20)例干燥综合征患者出现抗-Sp20的阳性条带，而在8例AIH患者、8例慢性乙型肝炎、5例慢性丙型肝炎和9例健康献血者则未出现抗-Sp20的阳性条带。每次实验均设立一抗和二抗的阴性对照。每份血清均检测三次,三次结果均出现抗-Sp20的阳性条带者被判定为抗-Sp20阳性。抗-Sp20在PBC患者中的阳性率为22.8%,特异性为98%。结果见表1及图1。 

表1  不同患者抗-Sp20的检测结果 

（二）Sp20抗体阳性与阴性PBC患者临床资料的对比 

1.PBC患者的一般情况和临床表现 

Sp20抗体阳性与阴性PBC患者临床方面的资料，年龄分布、性别比例、常见的临床表现及合并症无差异，见表2。 

表2  Sp20抗体阳性与阴性PBC患者的临床表现 

2.生化和免疫指标：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总蛋白(TP)、白蛋白（ALB）甘油三脂(TG)、胆固醇(TCHO)、免疫球蛋白(Ig)G、A、M和γ球蛋白的检测结果，抗-Sp20阳性和阴性 PBC患者的生化免疫指标对比无显著差异，见表3。 

表3  抗-Sp20阳性和阴性PBC患者的生化指标对比 

3.自身抗体的检测：抗-Sp20阳性与阴性PBC患者在AMA M2、抗-SSA、抗-SSB、抗-Sm阳性率及在核点型、斑型、核膜型、均质型、着丝点型ANA的分布上均无显著差异。见表4。另外8例AMA阴性PBC患者中2例出现Sp20抗体，Sp20抗体在AMA阴性PBC患者中阳性率为25%(2/8)，Sp20抗体在AMA阳性PBC患者中阳性率为22%(6/27)，见表5。 

表4  Sp20抗体阳性与阴性PBC患者的自身抗体 

表5  Sp20抗体与AMA的关系 

p值为1.000。 

4.肝脏组织病理学表现 

35例PBC患者中有32例接受肝脏病理学检查，32例患者根据Sp20抗体阳性与阴性分组比较肝脏组织学分期情况，结果两组患者在肝脏组织学分期上无差别，见表6。 

表6  抗-Sp20阳性和阴性PBC患者的肝脏组织学分期 

p值为0.370。 

5.对UDCA的治疗反应 

35例PBC患者中共有30例接受熊去氧胆酸10-15mg/kg/d的治疗，经过1年的随访，8例(26%,8/30)PBC患者出现完全的生化应答。完全的生化应答定义为血清总胆红素和AST或ALT同时恢复正常，并且ALP或GGT小于或等于正常值的1.5倍。在生化应答上，抗-Sp20阳性和阴性PBC患者对UDCA治疗反应无显著差异，而且出现生化应答患者多为处于病理早期的PBC患者，见表7和表8。 

表7  抗-Sp20阳性和阴性PBC患者对UDCA的治疗反应 

p值为0.137。 

表8  肝脏病理早期和晚期PBC患者对UDCA的治疗反应 

p值为0.012。 

6．预后评估及生存率比较 

1）利用Mayo模型对抗-Sp20自身抗体阳性和阴性PBC患者生存期的评估，首先计算出风险系数R。 

R(风险系数)＝0.871×log_e(胆红素mg/dl)-2.53×log_e(白蛋白g/dl)+0.039×年龄+2.38×log_e(凝血酶原时间)+0.859×水肿系数 

水肿系数0为无水肿并且无需利尿剂，0.5为出现水肿但未服利尿剂，1.0为使用利尿剂仍有水肿。 

根据模型中的基本生存函数，按S(t)=S₀(t)^exp(R-5.07)公式求得1年至7年患者的生存概率。对比抗-Sp20自身抗体阳性和阴性PBC患者风险系数和1年至7年得平均生存概率，发现两组患者无差异，见图2。 

2）根据Kaplan-Meier法计算Sp20抗体阳性和阴性PBC患者5年的生存率，两组患者无明显差异，见图3。 

7.结论 

在前期的PBC新的特异性自身抗体及其靶抗原的研究中，申请人先以胆管癌细胞RBE为抗原，由于免疫印迹法(immunoloblotting,IB)能够在蛋白质多肽水平上同时筛查多种抗体，并且对自身抗原的判定较间接免疫荧光法更加敏感而特异。因此，采用免疫印迹法检测35例PBC患者血清，观察到8例出现针对分子量约20kD蛋白的自身抗体， 将其命名为Sp20抗体，而50例对照组(8例AIH患者、20例干燥综合征，8例慢性乙型肝炎、5例慢性丙型肝炎和9例健康献血者)中仅有1例干燥综合征患者为Sp20抗体阳性。Sp20抗体在PBC患者中的阳性率为22.8%，特异性为98%。从而提示Sp20抗体可能是PBC患者特异性的自身抗体。另外8例AMA阴性PBC患者中2例出现Sp20抗体，Sp20抗体在AMA阴性PBC患者中阳性率为25%（2/8），提示Sp20抗体也可以出现在AMA阴性的PBC患者中。由于Sp20抗体特异性较高，可出现在AMA阴性的PBC患者中，因此Sp20抗体的检测将有助于AMA阴性PBC病人的诊断，为PBC患者早期诊断、早期治疗及预后的判断提供理论依据。 

实施例2  Sp20蛋白的亚细胞定位分布及初步鉴定 

（一）材料与方法 

1、血清：从8例抗-Sp20阳性的PBC患者血清中，选择一例含抗PDC-E2和抗-Sp20的病人血清。 

2、细胞株 

人肝癌细胞株HepG2.2.15、人宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞株Mcf-7、人黑色素瘤细胞株Mel-ed1、人低分化胃腺癌细胞株BCG-823、人小细胞肺癌细胞株NC1-H446、大鼠肝细胞株BRL以及人胆管癌细胞株RBE，以上细胞株均购自北大人民医院外科实验室。细胞分化程度均来源于建株原始文献资料；其中RBE、Mcf-7、BRL使用含10%胎牛血清（PAA公司）的RPMI-1640培养液(Gibco公司)培养；其他5种细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养液(Gibco公司)培养，培养条件均为37℃、饱和湿度、5%CO₂。当细胞在培养瓶中生长到约80%时，使用胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化，经离心、洗涤后收集于Eppendorf管中，置于-70℃冰箱保存。 

3、细菌 

大肠杆菌E.coli.JM109购自鼎国生物技术公司，在LB中过夜培 养，收获约50毫克的大肠杆菌。大肠杆菌JM109在-70℃和37℃条件下反复冻融5次，并且超声破碎5分钟。 

（二）实验方法 

1、细胞核分离：将细胞培养瓶置于冰上，去除培养基，预冷的PBS洗两次；加入含蛋白酶抑制剂PMSF的细胞裂解液，4℃反应20分钟；裂解的细胞从培养瓶移入Ep管中反复摇动；4℃条件下12,000g离心裂解2分钟；分别保存上清和细胞核于－80℃。 

2、细胞总蛋白提取：加入1mM PMSF，2mM EDTA,10mM DTT不同配制的蛋白裂解液处理细胞；将加了裂解液的样品在冰浴下反应，避免产热和泡沫；将裂解后的样品在冰浴中超声破碎5min；10℃40000g 30min离心，吸取上清，分装后存于－80℃。 

3、改良的Bradford法测定细胞总蛋白质含量 

1）标准曲线的测定 

将9支干燥洁净的试管编号，分别加入不同浓度的蛋白标准液、0.1N盐酸和ddnH₂O，摇匀，室温放置半分钟后各管加入3.5ml考马斯亮蓝G-250测定工作液,摇匀，室温放置5min后，测定其余各管595nm处相对吸光度。 

2）样品的测定 

在一干燥洁净试管内，加入80μL ddnH₂O，再加入用稀释液调整蛋白浓度到测定范围的样品10μL，加入0.1N盐酸10μL混匀，加入3.5ml考马斯亮蓝G-250测定工作液,测定其在595nm处相对吸光度，测定两个平行样，取平均值。 

3）数据处理 

以吸光度为纵坐标，反应蛋白量（μg）为横坐标，测定数据用工作表中的Chart Wizard绘制标准曲线，回归出线性方程、线性相关系数r平方值，将样品测定结果用Paste Function中Forecast返回出待测样品的预测值y。 

4、免疫印迹法：实施例1。 

5、双向电泳和质谱。 

（三）实验结果 

1、Sp20的亚细胞定位 

细胞裂解液将RBE细胞分为细胞核和细胞浆，而后分别以细胞核、细胞浆、全细胞为抗原，以含有抗PDC-E2、抗Sp20的PBC患者血清为抗体利用免疫印迹法检测，结果Sp20在细胞核和细胞质均有分布，但是细胞核的Sp20信号明显强于细胞质，见图4。Sp20在细胞核、细胞浆、全细胞中含量的相对灰度值比较见图5。 

2、蛋白Sp20在人不同细胞系、大鼠肝细胞及大肠杆菌中的分布 

在来自人不同器官组织的细胞系、大鼠肝细胞及大肠杆菌中检测Sp20分布。结果在人肝癌细胞株HepG2.2.15、人宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞株Mcf-7、人黑色素瘤细胞株Mel-ed1、人低分化胃腺癌细胞株BCG-823、人小细胞肺癌细胞株NC1-H446、人胆管癌细胞株RBE及大鼠肝细胞株BRL中均出现Sp20，而大肠杆菌JM109未检测到Sp20，在来自人不同器官组织的细胞系、大鼠肝细胞及大肠杆菌中检测Sp20分布。结果在人肝癌细胞株HepG2.2.15、人宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞株Mcf-7、人黑色素瘤细胞株Mel-ed1、人低分化胃腺癌细胞株BCG-823、人小细胞肺癌细胞株NC1-H446、人胆管癌细胞株RBE及大鼠肝细胞株BRL中均出现Sp20，而大肠杆菌JM109未检测到Sp20，见图6。 

3、结论 

自身抗体及其靶抗原历来是自身免疫疾病研究的重点和热点，为了解Sp20蛋白在不同种属和不同器官组织中的分布，在来源于不同器官组织的人细胞系、大鼠肝细胞以及大肠杆菌E.coli.JM109对Sp20蛋白进行检测。结果人肝癌细胞株HepG2.2.15、人宫颈癌细胞株HeLa、人乳腺癌细胞株Mcf-7、人黑色素瘤细胞株Mel-ed1、人低分化胃腺癌 细胞株BCG-823、人小细胞肺癌细胞株NC1-H446、人胆管癌细胞株RBE及大鼠肝细胞株BRL中均出现Sp20，而在大肠杆菌E.coli.JM109中则未检测到Sp20。上述结果提示Sp20抗体存在于多种人细胞系和大鼠肝细胞中，也说明Sp20抗体可能是非种属、非器官特异性的自身抗体。 

而后将RBE细胞分为细胞核和细胞浆，分别以细胞核、细胞浆、全细胞为抗原，免疫印迹法的结果显示该蛋白在细胞核中的信号明显强于细胞浆中的信号，以上结果提示细胞核和细胞浆中均有Sp20蛋白分布，但是该蛋白主要位于细胞核。 

以往对自身抗原的鉴定多是通过分子生物学的方法，利用含自身抗体的患者血清对cDNA表达文库进行免疫筛选，获得表达该蛋白的cDNA克隆后再对其进一步鉴定。如AMA的靶抗原PDC-E2、BCOADC-E2、多核点型ANA的靶抗原Sp100等均通过此方法被发现并鉴定出来。近年来随着蛋白质组学的技术和方法不断发展完善，使得对微量蛋白质的快速分离和鉴定得以实现。因此采用双向电泳和质谱初步分离并且鉴定Sp20蛋白。 

随后利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)对蛋白Sp20进行了初步的鉴定。质谱分析法是通过测定样品离子的质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来进行成分和结构分析。首先基质辅助激光解吸电离离子源(Matrix Assisted LaserDesorption Ionization,MALDI)是将多肽成分转换成离子信号，而MALDI产生的离子利用飞行时间（Time-of-Flight，TOF）检测器作为质量分析仪器。依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽检测，最后由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白。此法称为肽质量指纹谱分析(peptidemass fingerprinting,PMF)。 

实施例3  Sp20抗体在制备诊断原发性胆汁性肝硬化试剂盒中的应用 

通过研究Sp20抗体在PBC发病中的机制，为PBC患者早期诊断、早期治疗及预后的判断提供理论依据。有助于对AMA阴性的PBC患者的诊断，以及有助于与其它自身免疫病的鉴别诊断。 

Sp20抗体可用于诊断原发性胆汁性肝硬化试剂盒的制备。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

Claims (3)

1.一种原发性胆汁性肝硬化的特异性自身抗体和相应抗原，其特征在于，所述特异性自身抗体是以胆管癌细胞RBE总蛋白作为抗原，利用免疫印迹法检测原发性胆汁性肝硬化PBC患者血清，检测到针对分子量20kD蛋白的自身抗体，将其命名为Sp20抗体，然后利用双向电泳从PBC患者血清中分离得到该Sp20抗体。

2.权利要求1所述的特异性自身抗体所对应的抗原，其分子量为分子量20kD。

3.权利要求1所述的特异性自身抗体和权利要求2所述的相应抗原在制备诊断原发性胆汁性肝硬化试剂盒中的应用。

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