CN113287569B - 一种免疫低下动物模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物模型建模技术领域，具体涉及一种免疫低下动物模型的构建方法。本发明的构建方法为：通过对动物腹腔注射顺铂注射液得到。本发明还提供该方法得到的动物模型及顺铂在免疫低下动物模型构建中的用途。本发明构建的动物模型脏器指数、吞噬指数K、吞噬系数α、刺激指数SI、CD³⁺、CD⁴⁺、CD⁸⁺、CD⁴⁺/CD⁸⁺均异常，HE染色测试表明模型组的肝脏、脾脏和胸腺有明显的病理损伤改变。该动物模型在免疫缺陷病的研究及相关药物开发中具有很高的应用价值。

Description

一种免疫低下动物模型的构建方法

技术领域

本发明属于动物模型建模技术领域，具体涉及一种免疫低下动物模型的构建方法。

背景技术

免疫缺陷是指机体免疫系统中任何一个成分缺少、缺失或功能不全的现象。免疫缺陷病则是一种由于人体免疫系统发育缺陷或免疫反应障碍导致的人体抗感染能力低下，临床表现主要为反复感染或严重感染性疾病，它是机体免疫功能不全所出现的临床综合征。

在免疫缺陷病相关的医学研究中，免疫缺陷动物模型具有重要的应用价值。免疫缺陷动物模型是由于先天遗传缺陷或人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物模型。

常用的免疫缺陷动物模型的构建方法包括免疫器官切除、大剂量激素、使用免疫抑制剂或放射性照射等方法。这些模型的构建方法存在操作较复杂、试剂成本较高或对设备要求较高的问题。因而，有必要提出新的免疫缺陷动物模型的构建方法。

顺铂，又名顺式-二氯二氨合铂，是一种含铂的抗癌药物，呈橙黄色或黄色结晶性粉末，微溶于水、易溶于二甲基甲酰胺，在水溶液中可逐渐转化成反式和水解。临床上，顺铂对卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示疗效。目前尚缺少相关研究，表明顺铂是否能够诱发动物免疫缺陷。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供一种免疫低下动物模型的构建方法，其目的在于：提供一种新的免疫低下动物模型的构建方法，该方法简单、建模周期短、成本较低，为免疫缺陷相关研究的动物造模提供了一种新的选择。

顺铂在免疫低下动物模型构建中的用途。

本发明还提供一种免疫低下动物模型的构建方法，通过对动物给与顺铂溶液得到免疫低下动物模型。

优选的，所述动物为大鼠、小鼠。

优选的，所述动物为BALB/c小鼠

优选的，所述顺铂溶液为顺铂注射液；和/或，所述顺铂溶液中顺铂的浓度为2-20mg/kg。

优选的，所述顺铂溶液的给药方式为腹腔注射。

优选的，所述腹腔注射的频率为每周一次，一共两次。

优选的，所述免疫缺陷动物是巨噬细胞的吞噬能力下降，T细胞和B细胞增殖水平降低，脏器系数异常，CD³⁺、CD³⁺CD⁴⁺、CD³⁺CD⁸⁺淋巴细胞占总淋巴细胞比例异常，以及CD⁴⁺/CD⁸⁺比例下降的动物。

本发明还提供上述方法构建的动物模型。

本发明还提供上述动物模型在免疫缺陷病研究和/或免疫缺陷病药物研发中的用途。

本发明将顺铂用于免疫低下动物模型的构建，通过实验发现，本发明构建的动物模型脏器指数、吞噬指数K、吞噬系数α、刺激指数SI、CD³⁺、CD⁴⁺、CD⁸⁺、CD⁴⁺/CD⁸⁺均异常，且通过HE染色观察发现动物模型的肝脏、脾脏和胸腺的显微图像与正常对照组有较大差别。可见，本发明通过一种操作简单、周期较短的方法成功建立了免疫低下的动物模型。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为通过HE染色观察本发明建立的动物模型和正常对照组动物的肝脏、脾脏和胸腺的显微图像的结果。

具体实施方式

以下实施例和实验例所用实验试剂和材料均为市售。

实施例1顺铂诱导免疫低下动物模型的建立

本实施例采用BALB/c小鼠，同时对6只BALB/c小鼠进行建模，在建模的第1天和第8天(注：首次腹腔注射顺铂注射液为造模第1天)，分别腹腔注射8mg/kg顺铂注射液，即得诱导免疫功能低下模型。本实施例中，所用顺铂注射液为顺铂生理盐水溶液。

本实施例得到的动物模型作为模型组进行实验例的测试。

对比例1

本对比例采用BALB/c小鼠，同时对6只BALB/c小鼠进行饲养，不注射顺铂注射液。即为实验例中的正常对照组小鼠。

取实施例1和对比例1中的模型组小鼠和正常对照组小鼠，按照如下实验例检测模型的吞噬指数K、吞噬活性α、脏器系数、刺激指数SI、T淋巴细胞亚群，并用HE染色测试观察小鼠内脏变化。

实验例1吞噬指数K和吞噬活性α的测定

1、测试方法

给药第15天(即第一次腹腔注射后的第15天)，尾静脉注射生理盐水稀释4倍的印度墨汁，分别于2、10min从内眦静脉采血20μL，加至2mL 0.1％Na₂CO₃溶液中，于600nm处测定吸光度，计算吞噬指数K和吞噬系数α。

计算方法为：

吞噬指数K＝(logOD1-logOD2)/(t2-t1)，其中OD1、OD2为不同时间所取血样的光密度，t2-tl为取两血样的时间差；

吞噬系数α＝K^1/3×体重/(肝重量+脾重量)。

2、测试结果

巨噬细胞是负责吞噬和清除外源病原物的重要免疫活性细胞，其吞噬能力的强弱可反映非特异性免疫功能的强弱。通过本实验例测试得到的模型组与正常对照组动物的吞噬指数K和吞噬系数α如表1所示。与正常对照组相比，模型组的吞噬指数K和吞噬系数α的值显著下降(P<0.05或P<0.01)。说明模型组的巨噬细胞的吞噬能力下降。

表1吞噬指数K和吞噬系数α

注：

与正常对照组比较有显著性差异(P<0.05)。

与溶剂对照组比较有显著性差异(P<0.01)。

实验例2脏器系数的测定

脏器系数又称脏体比，是实验动物某脏器的重量与其体重之比值。正常时各脏器与体重的比值比较恒定。动物染毒后，受损脏器重量可以发生改变，故脏器系数也随之而改变。脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。免疫系统主要由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成。中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，外周免疫器官包括脾脏、淋巴结和黏膜免疫系统。胸腺、脾脏可最直观地体现机体的免疫功能。本实验例选用胸腺、肝脏、脾脏，评估供试品对顺铂诱导动物免疫低下的影响。

各组的脏器指数如表2所示：与正常对照组相比，模型对照组的造模后体重、肝脏重量、胸腺重量、胸腺指数显著下降(P<0.05或P<0.01)。

表2脏器系数表

注：

与溶剂对照组比较有显著性差异(P<0.05)。

与溶剂对照组比较有显著性差异(P<0.01)。

实验例3刺激指数SI的测定

1、测试方法

给药第15天，处死小鼠后，无菌取脾脏，制备细胞浓度为1×10⁷个/mL的脾细胞悬液。每只小鼠的脾细胞悬液样本接种96孔板9个孔中(每孔50 μL)，其中3孔加入50μL的10μg/ml脂多糖(LPS)，另外3孔加入50μL的5μg/mLConA，剩余3孔加入50μL培养液作为空白对照。在37℃，5％CO₂下培养48h后加入10μL的CCK-8，测量OD值。SI＝实验孔OD/空白孔OD。

2、测试结果

T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。刀豆蛋白A(ConA)作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖，脂多糖(LPS)则刺激B细胞发生增殖。淋巴细胞的增值和分化是免疫应答过程的一个重要的阶段，检测淋巴细胞的增殖水平是细胞免疫的一种常用的方案。刺激指数SI如表3所示：与正常对照组相比，模型组的刺激指数SI(LPS)和刺激指数SI(ConA)的值显著下降(P<0.05)。可见，模型组的T细胞和B细胞增殖水平降低。

表3刺激指数SI测试结果

注：

与溶剂对照组比较有显著性差异(P<0.05)。

与溶剂对照组比较有显著性差异(P<0.01)。

实验例4T淋巴细胞亚群的测定

1、测试方法

给药第15天，尾静脉采血，肝素钠抗凝，取100μL抗凝全血，通过流式细胞仪分析外周血T淋巴细胞亚群CD⁴⁺、CD⁸⁺、CD³⁺细胞比例、CD⁴⁺/CD⁸⁺比值。

2、测试结果

T淋巴细胞亚群的测定是检测机体细胞免疫功能的重要指标，且对某些疾病(如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等)的辅助诊断，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义。T淋巴细胞的表面标志有两大类:一类为T淋巴细胞所共有的CD³⁺标志，另一类为亚群特有标志，CD⁴⁺为辅助/诱导功能细胞，CD⁸⁺为抑制/杀伤功能细胞。T淋巴细胞对体内一切体液和细胞免疫反应类型和强度都有调节作用，其中主要的是CD³⁺、CD⁴⁺、CD⁸⁺细胞亚群。CD³⁺降低常见于自身免疫性疾病。其按CD表型分为CD⁴⁺和CD⁸⁺两大亚群。CD⁴⁺为辅助性T细胞，可协助B细胞分泌抗体，并具有调节其他T细胞免疫应答的作用。CD⁸⁺细胞多以细胞毒活性呈现，是主要的细胞毒效应细胞。正常情况下，CD³⁺、CD⁴⁺、CD⁸⁺、CD^{4 +}/CD⁸⁺值在正常范围内，CD⁴⁺、CD⁸⁺二者维持动态平衡，且为相互反馈调节状态，CD³⁺、CD⁴⁺、CD^{8 +}、CD⁴⁺/CD⁸⁺的变化表明机体免疫功能改变。CD⁴⁺/CD⁸⁺比值，判断机体免疫功能紊乱的临床诊断敏感指标，其值降低提示机体处于“免疫抑制”状态。以总淋巴细胞设门分析CD³⁺(％)、CD^{3 +}CD⁴⁺(％)、CD³⁺CD⁸⁺(％)淋巴细胞占总淋巴细胞比例，并计算CD⁴⁺/CD⁸⁺淋巴细胞亚群的测定结果如表4所示。从表中可以看到，模型组CD³⁺(％)、CD³⁺CD⁴⁺(％)、CD³⁺CD⁸⁺(％)淋巴细胞占总淋巴细胞比例发生变化，说明模型组的免疫功能紊乱。且模型组的CD⁴⁺/CD⁸⁺下降，说明模型组处于“免疫抑制”状态。

表4刺激指数SI测试结果测试结果

注：

与溶剂对照组比较有显著性差异(P<0.05)。

与溶剂对照组比较有显著性差异(P<0.01)。

实验例5HE染色测试

1、测试方法

①包埋：4％多聚甲醛固定的组织样本，经流水冲洗30min，进行组织修块，放入病理包埋塑料筐中进行脱水(75％乙醇6h，85％乙醇10h，95％乙醇4h，无水乙醇Ⅰ2h，无水乙醇Ⅱ2h)，透明(二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ15min)，浸蜡3h，包埋组织块于石蜡中。

②切片：采用Leica RM2235切片机将组织切成5μm厚的薄片，在温水中将组织展平后捞在载玻片上，60℃烘烤切片至少2h。

③染色：切片经二甲苯脱蜡后，流水洗涤20min，用苏木素染色30min，流水洗涤20min，盐酸酒精分化，伊红染色5min，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明后用树脂胶封片。

④显微镜下观察组织病理学变化，完整地浏览整张组织片，对正常组织或有明显病变部位均采用显微成像系统拍照记录。

2、测试结果

模型组和正常对照组的显微图片如图1所示。

正常对照组的肝细胞以水泡变性为主，个别肝细胞表现颗粒变性。模型组的肝细胞肿胀以颗粒变性为主，个别肝细胞呈水泡变性。正常对照组的脾脏红髓区和白髓区分界清晰，未见明显病理损伤改变。模型组的红髓区见有明显的脾窦淤血，淋巴细胞数量较正常对照组减少。正常对照组的胸腺皮髓质分界清晰，未见明显病理损伤改变。模型组的胸腺皮质区淋巴细胞数量较正常对照组有轻微减少。以上结果表明，相比于正常对照组，模型组的肝脏、脾脏和胸腺有明显的病理损伤改变。

根据试验例1～试验例5，本发明方法制备的模型，出现了吞噬指数K和吞噬系数α显著降低，脏器系数异常，CD³⁺(％)、CD³⁺CD⁴⁺(％)、CD³⁺CD⁸⁺(％)淋巴细胞占总淋巴细胞比例发生变化，CD⁴⁺/CD⁸⁺下降，HE染色测试表明模型组的肝脏、脾脏和胸腺有明显的病理损伤改变，说明免疫低下的动物模型造模成功。

综上所述，本发明通过简单、短周期的方法成功建立了免疫低下的动物模型。该动物模型在免疫缺陷病的研究及相关药物开发中具有很高的应用价值。

Claims (2)

1.顺铂在免疫低下动物模型构建中的用途，其特征在于：通过对动物在建模的第1天和第8天，分别腹腔注射8 mg/kg顺铂注射液，得到免疫低下动物模型；

所述免疫低下动物模型的脏器指数、吞噬指数K、吞噬系数α、刺激指数SI、CD³⁺、CD⁴⁺、CD^{8 +}、CD⁴⁺/CD⁸⁺均异常；

所述动物为BALB/c小鼠。

2.一种免疫低下动物模型的构建方法，其特征在于：通过对动物在建模的第1天和第8天，分别腹腔注射8 mg/kg顺铂注射液，得到免疫低下动物模型；

所述免疫低下动物模型的脏器指数、吞噬指数K、吞噬系数α、刺激指数SI、CD³⁺、CD⁴⁺、CD^{8 +}、CD⁴⁺/CD⁸⁺均异常；

所述动物为BALB/c小鼠。

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