CN105388300A - 结核病免疫诊断分子标识及其疫苗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及结核病免疫诊断分子标识及其疫苗用途。具体地，本发明涉及选自氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备结核病诊断剂中的用途；优选地，所述结核病为肺结核。SEQ？ID？NO:1-4中任一序列所示的蛋白可以作为结核病(例如肺结核)免疫诊断分子标识，并且具有良好的符合率和反应强度；此外，还具有应用于制备结核病疫苗的潜力。

Description

结核病免疫诊断分子标识及其疫苗用途
技术领域
本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及结核病免疫诊断分子标识及其疫苗用途。
背景技术
结核分枝杆菌是对人类健康威胁最大的病原体之一，结核病是当今世界上成年人中的主要传染病，已对国际公共卫生构成严峻挑战。结核菌在感染人体以后，多处于潜伏状态或持续感染状态，它能在感染宿主细胞内逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主达到一种微妙的平衡，感染者一生中的任何时候都有可能发病。一般情况下，10％的感染者将发展为活动性肺结核。一个未经治疗的活动性肺结核病人，一年能传染10－15人。
近五十年来，结核病的控制理论与技术、临床诊断治疗水平与研究均有长足的进步。由于有效化疗药物(异烟肼、利福平、吡嗪酰铵、链霉素、乙胺丁醇等)的普遍应用和卡介苗在世界范围的推广，使得结核病的发病率曾一度降低，以至于人们乐观地认为，结核病将同天花一样被人类彻底消灭。但在八十年代中期，由于过分乐观的估计形势，减少投资、缩减机构，放松对结核病的治疗与管理，结核病又在许多国家死灰复燃，发病率在全世界范围内再次回升。1993年WHO宣布结核病处于“全球紧急状态”，并呼吁“迅速采取行动与结核病危机进行斗争”，这在WHO历史上发表这样的声明尚属首次。耐药及耐多药结核病也已成为当前结核病控制工作中的重大威胁。
在常用的肺结核诊断技术中存在着阳性率低、周期长、操作复杂、假阳性率高等问题。故此需要一种快速、简便、敏感、特异的诊断方法。
目前结核病毒诊断方法有：(一)痰菌检查：痰涂菌检查和痰结核菌检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。它虽然是诊断肺结核“金指标”但诊断率低，培养周期长。痰结核菌培养，结果可信度高，并能做结核菌药敏试验，但需时6－8周，应用受到限制。(二)Ⅹ射线检查：胸部Ⅹ线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般Ⅹ线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)肺结核病免疫学诊断：1.常用的有结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)试验，该试验阳性是感染过结核菌的证据之一，但是假阳性率高，容易误诊。2.血中、痰中结核抗体检测阳性也有助于诊断，也容易出现假阳率。3.BACTEC法测结核分枝杆菌的代谢物，一般两周可分离出分枝杆菌，但菌量多少能影响阳性结果出现的天数。4.聚合酶链反应(PCR)，优点是敏感性可达98％－100％，缺点是特异性较差。(四)其他检查：只能作为辅助诊断，不能作为诊断依据。1.纤维支气管镜检查，可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变，并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能，对于诊断和鉴别诊断特别有用。2.胸腔镜和纵隔镜检查，均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结，并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3.超声波检查，主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。
结核分枝杆菌(MTB)培养物滤液中有一种早期分泌抗原靶蛋白(earlysecretoryantigenictarget，ESAT-6)，GenBank登录号为：NC_00962，gi：57117165，相对分子质量为6000，在MTB感染早期即可被机体的免疫系统所识别，是重要的T细胞抗原抗原。ESAT-6来源的合成多肽被广泛地用于外周血MTB特异性γ-干扰素(IFN-γ)应答情况的检测，临床上用于诊断是否有MTB感染指标之一[RavnP.MunkME.AndersenABProspectiveevaluationofawhole-bloodtestusingMycobacteriumtuberculosis-specificantigensESAT-6andCFP-10fordiagnosisofactivetuberculosis2005；HarbceM.OetteingerT.WikerHGEvidenceforoceurrenceoftheESAT-6proteininMycobacteriumtuberculosisandvirulentMycobacteriumbovisandforitsabsenceinMycabacteriumbovisBCG1996；Zhang,M.,H.Wang,M.Liao,etal.(2010)."DiagnosisoflatenttuberculosisinfectioninbacilleCalmette-GuerinvaccinatedsubjectsinChinabyinterferon-gammaELISpotassay."IntJTubercLungDis14(12):1556-1563.]。
尽管如此，目前尚需要发现新的诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的标识，以及新的检测诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的方法和试剂。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，惊奇地发现，氨基酸序列如SEQIDNO:1-4中的任一序列所示的蛋白，具有很强的抗原性和良好的抗原特异性，与ESAT-6的符合率较高，反应强度较高，能成为筛选诊断结核病例如肺结核的理想靶抗原，可以作为细胞水平的免疫诊断分子标识；另外，还具有应用于制备结核病疫苗的潜力。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备结核病诊断剂或者结核分枝杆菌检测剂中的用途；优选地，所述结核病为肺结核。
所述结核病诊断剂是指用于诊断结核病的药物或者试剂。所述结核分枝杆菌检测剂是指用于检测结核分枝杆菌的药物或者试剂。
本发明还涉及一种诊断结核病(特别是肺结核)或者检测结核分枝杆菌的方法，包括检测氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白(作为免疫诊断分子标识)的步骤。所用样品可以是痰液、血液、淋巴液或者肺部组织等。
本发明的另一方面涉及一种抗体，其能够特异性结合或者识别选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白；优选地，所述抗体还连接有可检测的标记；优选地，所述可检测的标记为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
本发明的再一方面涉及一种结核病诊断剂或者结核分枝杆菌检测剂，其包含一种或者几种本发明上面所述的抗体，以及可选的一种或多种药学上可接受的辅料。在本发明的一个实施方案中，所述结核病诊断剂包含上述4种蛋白中的任意2种、3种或4种的抗体。
本发明的再一方面涉及选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的药物或者制备抑制结核杆菌的药物中的用途；优选地，所述药物为疫苗；优选地，所述疫苗为结核病疫苗；优选地，所述结核病为肺结核。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白，以及可选的一种或几种药学上可接受的载体或赋形剂；优选地，所述药物组合物为疫苗，并且所述药学上可接受的载体或赋形剂为疫苗用载体或赋形剂；优选地，所述疫苗为结核病疫苗；优选地，所述结核病为肺结核。
本发明的再一方面涉及一种预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的方法，包括给予受试者有效量的本发明的药物组合物的步骤。
本发明的再一方面涉及选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备提高受试者或细胞因子的水平的药物中的用途，所述细胞因子选自如下的至少一种(例如任意的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或9种)：
GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α；优选地，所述细胞为淋巴细胞。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外提高细胞因子的水平的方法，包括使用有效量的选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白的步骤，所述细胞因子选自如下的至少一种(例如任意的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或9种)：
GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α。
本发明的实施例5的结果表明，选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白能够提高上述9种细胞因子的水平，说明蛋白有很强的抗原性，可以作为结核病例如肺结核的免疫诊断标识，预防和治疗。
本发明的再一方面涉及选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备或者作为工具药的用途，所述工具药用于筛选预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的药物或者用于筛选抑制结核杆菌的药物；优选地，所述结核病为肺结核。
例如，可以通过被筛选的药物是否能够检测本发明的蛋白，来判断被筛选的药物是否能够用作诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者抗结核杆菌的药物。
本发明的再一方面涉及选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备促进淋巴细胞(例如CD4细胞或CD8细胞)增殖的药物中的用途。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外促进淋巴细胞(例如CD4细胞或CD8细胞)增殖的方法，包括使用有效量的选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白的步骤。
本发明的实施例4的实验结果表明，选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白能够有效地促进淋巴细胞的增殖，增强机体的免疫能力，起到对结核病例如肺结核的预防作用。
在本发明中，所述“选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白”，是指选自SEQIDNO:1-4中任意1个、任意2个、3个或者4个序列所示的蛋白。优选地，其包括选自SEQIDNO:1-4中任意1个序列，以及选自其余3个序列中的任意2个或3个序列。本领域技术人员能够理解，这些方案均能实现本发明的技术效果。
在本发明中，术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.EditedbyGennaroAR,19thed.Pennsylvania:MackPublishingCompany,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
在本发明中，术语“疫苗用载体或赋形剂”是指选自如下物质的一种或多种，包括但不限于：pH调节剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂。具体地，例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。其中，非离子型表面活性剂包括但不限于:Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
在本发明中，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
在本发明中，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
在本发明中，术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
在本发明中，术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
在本发明中，术语“结核杆菌”，包括但不限于，例如，结核分枝杆菌；术语“结核分枝杆菌”包括但不限于，结核分枝杆菌H37Rv。
在本发明中，术语“结核病”，包括但不限于，例如由“结核杆菌”感染引起的疾病和/或病症。
发明的有益效果
本发明的蛋白可以作为作为结核病(例如肺结核)或结核杆菌细胞免疫诊断分子标识，具有良好的符合率和反应强度。具有应用于制备结核病疫苗的潜力。
附图说明
图1：蛋白的ELISPOT鉴定中对照设置以及读值示意图。植物凝集素PHA作为阳性指控条件(终浓度5μg/ml)，ESAT-6是阳性对照(ELISPOT试剂盒自带)。
图2：流式细胞仪测定CD4CD8内分泌因子IFN-γ和IL-2染色结果。图2A，CD4+分泌INF-γ的细胞占全部外周淋巴细胞的比值；图2B，CD8+分泌INF-γ的细胞占全部外周淋巴细胞的比值。图2C，CD4+分泌IL-2的细胞占全部外周淋巴细胞的比值；图2D，CD8+分泌IL-2的细胞占全部外周淋巴细胞的比值。
图3：细胞增殖实验结果。图3A，CD4细胞增殖结果。图3B，CD8+细胞增殖结果。其中，图3A和3B纵坐标中的“细胞增殖情况”的是指增殖的数是减去了正常培养没有加相应刺激物的结果，是去掉本底后的结果，也是一个百分比数。
图4：细胞增殖后上清中细胞因子测定结果。图4A，GM-CSF；图4B，IL-2；图4C，IL-4；图4D，IL-6；图4E，IL-12p40；图4F，IL-17；图4G，IFN-γ；图4H，IP-10；图4I，TNF-α。
序列信息
表1
序列1(SEQIDNO:1)138aa
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序列3(SEQIDNO:3)417aa
MPDGGHRHRAQPVSVRPNRHRRTRVSRAQRRHAQQIRRRRRVAGGFALSLLVVVVVVAVVVGAKLWQTMLGFGNDYTGPGKRDIVIQIRAGDSTTAVGETLLKHGVVATVRAFVDAAHGNTAISSIQPGFYRMRTEISAASAVARLTDPHNRVGKLVIPEGRQLDDTTDMKTNVVNPGIFALISRATCVDLDGTQRCVSVADLRAAASRSTPTMLSVPRWAVGPVMELGTDHRRIEGLIAPGTFNIDPSASAETILATLISAGAVEYMKSGLVDTAKSLGLSPYDILVVASLVQQEANTQDFPKVARVIYNRLHEHRTLEFDSTVNYPLDRREVATSDTDRAQRTPWNTYMAQGLPATAICSPGVDALRAAEHPVPGDWLYFVTIDSQGTTLFTRDYQQHLANIELAKHNGVLDSAR
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QVVGTPYIPGGDSPAGTDCSELASWVSNAATARPVFGDRFNTGNEEAALAARGFQQGTAPNALVIGWNGHHTAVTLPDGTPVSSGEGGGVRVGGGGAYQPKFTHHMYLPMDVDAGEDQPPAPDEPVTAVDDVEPEMPAPCPTQRPPVTPRHNLCNKLRTMPGALSAALAAAAPVWPAPISGCRGFSTSLLAKRNHPVIVGK
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HLLGRPLGRLVDRDNAVEDEGLQPYQVRVICRPKAETYVRAHIVQRTSSNDITLRGIRTGPAGDDNITLTAHLLMVGHTPAKLERLVAELSLQPGVYAVHWYAGEHAQAE
序列6(SEQIDNO:6)95aa
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序列7(SEQIDNO:7)414bp
TGGCTGCTAGTACGCGGACACGGTCCGCAGCAACCCGAGATCAGCGCTTACTCGCACGGGCACCTGACCCGCGTGGGGCCCTATTTGTACTGCAACGTGGTCGACCTCGACGACTGTCAGACCCCGCAGGCGCAGGGCGAATTGCCGGTAAGCGAACGCTATCCCGTGCAGCTCTCGGTACCCGAAGTCATTTCCCGGGCGCCGTGGCGTTTGCTGCAGGTATACCAGGACCCCGCCAACACCACCAGCACCTTGTTTCGGCCGGACACCCGGTTGGCGGTCACCATCCCCACTGTCGACCCGCAGCGCGGGCGGCTGACCGGGATTGTCGTGCAGTTGCTGACGTTGGTGGTCGACCACTCGGGTGAACTACGCGACGTTCCGCACGCGGAATGGTCGGTGCGCCTTATCTTT
序列8(SEQIDNO:8)1539bp
ATGCCCATCCTGGCGACAAACGTCGTGTGCACGTCACAACCGCTGGCCGCGCAAGCGGGTCTTCGGATGCTGGCCGACGGCGGCAACGCGGTCGACGCCGCCGTCGCCACAGCCATCACCCTCACCGTGGTGGAACCGGTGTCCAATGGCATCGGCTCGGACGCCTTCAGCATCGTCTGGGACGGGCAAAAACTGCACGGCCTGAACGCGTCCGGCCGCTCACCCTCGGCGTGGACGCCAGAGTACTTCGGCGGCAACGCCGTTCCCGTGCTCGGCTGGAACTCCGTGACGGTGCCCGGTGCGGTGTCGGCCTGGGTGGAACTGCACGCCAGGTTCGGCAGGCTACCATTCGAAACACTCTTCGAGCCCGCCATCTCGTACGGCCGCAACGGCTTTCTGGTCTCACCGACCGTCGCGGCACAATGGGCGGCACAGGTGCCGTTGTTCGCATCCCAGCCCGGATTCGCCGATGCGTTCATGCCCGGCGGACGAGCGCCGAAACCCGGTGAGCTGTTTACCTTTCCTGACCACGCGGCGACGCTAGAGAAGATCGCGGCGACCAACGGTGAGGAGTTCTACCGGGGAGAGCTGGCCGCCAAACTCGAGGCGCACTCGGCGGCAAACGGCGGGGTGATGCGTGCCGACGACCTCGCCGCCCATCGCGTGGACTGGGTCGACACGATCACGGGAACCTACCGCGGGTACACCATCCACCAGATACCGCCCAACGGCCAGGGCATCGTGGCCTTGATCGCCCTCGGAATCCTCGAGCATTTCGATATGTCATCGTGGTCAGTGGATTCCGCTGAAAGTGTGCACGTGCAGATCGAAGCACTGAAGCTTGCCTTCGCCGACGCGCAAGCGTGTGTCGCCGACATCGACTACATGCCGGTGCACCCGAAGCGCCTGCTCGACAAGGAGTATCTGCGGCAGCGCGCCACGCTGATCGATCCAAAGAGGGCAATGCCGGCGGCCACCGGCATCCCGCGAGGCGGCACCGTCTATCTGGCCGCCGCCGATGCTGCGGGAATGATGGTGTCCATGATTCAGTCGAACTACCTTGGGTTCGGCTCCGGTGTGGTGGTGCCCGGCACCGGCATTTCGCTGCACAATCGCGGCTCGGATTTCACTGTGGTGCCGAGACATCCGAACCGGGTTGGGCCACGGAAGCGCCCCTATCACACGATCATCCCAGGTTTTGTGACCCGCGACGGTGCGCCGGTGATGAGCTTCGGGGTGATGGGCGGCATGATGCAACCCCAGGGTCACGTGCAGGTGCTGGTGCGCATCGCCGACTACGGCCAGAACCCCCAGGCGGCCTGTGACGGCCCTCGGTTCCGCTGGGTGAACGGTATGCGGGTCAGTTTCGAAAACGGCTTCCCGGATTCAACTCTCGATGAACTGCGGCAGCGTGGGCATGACTTGGTCGCAGTAGCGGACTACAGCCAGTTCGGGAGTTGTCAGGCAATCTGGCGGCTCGACGATGGGTACCTCGCGGCCAGCGATCCCCGCCGTGATGGCCAAGCCGCAGCCTGCTAG
序列9(SEQIDNO:9)1254bp
ATGCCTGACGGTGGCCACCGCCACCGCGCCCAGCCGGTGTCGGTAAGACCGAACCGGCACCGCAGGACCCGAGTCAGCCGCGCTCAGCGCCGACACGCCCAACAAATCCGCCGGCGACGGCGCGTCGCCGGCGGATTTGCCCTGAGCCTGCTCGTCGTGGTGGTGGTGGTGGCCGTCGTCGTCGGCGCCAAGTTGTGGCAGACCATGTTGGGCTTCGGTAACGACTACACCGGTCCCGGCAAGCGAGACATCGTGATTCAGATCAGGGCCGGTGACTCGACCACGGCGGTCGGGGAGACGCTGCTCAAACACGGTGTAGTGGCCACCGTCCGAGCATTCGTCGATGCCGCGCACGGCAACACCGCGATTTCCTCGATCCAACCCGGGTTCTATCGGATGCGAACCGAGATTTCGGCGGCTTCCGCTGTCGCGCGGCTTACCGATCCGCACAACCGGGTGGGGAAGTTGGTCATACCGGAAGGGCGTCAGCTCGACGACACCACCGACATGAAGACCAACGTGGTGAATCCTGGCATATTCGCGCTGATCTCCCGTGCCACCTGTGTGGATCTCGACGGTACCCAACGCTGCGTCTCGGTGGCCGACCTCCGCGCGGCGGCGAGCAGGAGCACGCCGACGATGCTGTCAGTGCCGCGCTGGGCGGTTGGGCCGGTGATGGAGCTGGGCACTGACCATCGCCGGATCGAGGGGCTGATCGCACCGGGGACCTTCAACATCGACCCGTCGGCATCGGCTGAAACCATCTTGGCGACCTTGATCAGCGCCGGCGCCGTGGAGTACATGAAATCCGGGTTGGTAGACACCGCAAAGTCGCTGGGCCTGTCGCCCTATGACATTCTCGTGGTGGCCTCGCTGGTGCAGCAGGAAGCCAACACCCAGGATTTCCCGAAGGTGGCCCGGGTCATCTACAACCGGCTGCACGAACACCGCACGTTGGAGTTCGACTCGACCGTGAACTATCCGCTGGATCGCCGTGAGGTGGCCACCAGCGACACCGACCGTGCCCAGCGCACACCGTGGAACACCTACATGGCCCAGGGGCTGCCGGCCACCGCGATCTGTTCGCCCGGCGTCGACGCGCTGCGCGCCGCCGAGCATCCAGTACCTGGCGACTGGCTGTACTTCGTCACCATCGATTCCCAGGGCACGACGCTGTTCACCAGGGACTATCAGCAGCATCTGGCGAACATCGAGCTGGCCAAACACAACGGTGTCCTCGACAGCGCGCGATGA
序列10(SEQIDNO:10)603bp
CAAGTCGTCGGCACTCCGTATATTCCCGGTGGCGATTCTCCCGCCGGGACCGACTGCTCGGAGCTGGCTTCGTGGGTATCGAATGCGGCGACGGCCAGGCCGGTTTTCGGAGATAGGTTCAACACCGGCAACGAGGAAGCCGCCTTGGCGGCTCGGGGCTTTCAACAGGGAACCGCCCCCAATGCCTTGGTGATCGGTTGGAATGGCCACCACACGGCGGTGACGCTGCCCGATGGCACGCCCGTATCCAGTGGTGAAGGCGGTGGCGTGCGGGTCGGTGGCGGTGGCGCCTACCAGCCCAAATTCACCCACCACATGTATCTGCCGATGGATGTGGACGCGGGAGAAGACCAGCCGCCGGCGCCAGATGAGCCGGTCACCGCGGTCGACGACGTGGAACCGGAAATGCCTGCACCGTGCCCGACCCAGCGCCCGCCGGTGACCCCGAGACATAACCTGTGCAACAAACTCCGGACTATGCCAGGGGCGCTCTCGGCCGCGCTGGCCGCGGCGGCGCCGGTCTGGCCGGCCCCTATAAGCGGCTGCCGCGGGTTCAGCACGTCCCTCTTAGCAAAAAGAAATCACCCAGTAATCGTCGGGAAA
序列11(SEQIDNO:11)330bp
TCGAACTTGTTTGGGCAGAACGCGCCTGCGATCGCCGCGCTCGAATCCTTGTATGAGTGTATGTGGGCCCAGGATGCAGCGGCCATGGCGGGTTATTACGTTGGGGCTTCGGCGGTGGCCACACAGTTGGCATCGTGGCTGCAACGGCTACAGAGCATCCCCGGCGCCGCCAGTCTTGATGCCCGTCTGCCGAGCTCGGCCGAGGCACCGATGGGAGTCGTCCGCGCGGTCAACAGCGCGATCGCCGCCAATGCGGCTGCGGCACAAACCGTTGGCCTGGTCATGGGAGGCAGCGGCACGCCAATACCGTCGGCCAGATATGTCGAGCTC
序列12(SEQIDNO:12)285bp
ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCA
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：ELISPOT分析
Elispot分析使单细胞分泌产物可视化。这些分析异常敏感，因为它是在直接在分泌细胞的周围进行捕捉，而且是在表面被冲淡，或者被临近的细胞上的受体捕获，或降解之前。自身免疫检测、器官移植、疫苗和药品的研发与检测、T细胞功能研究、肿瘤研究、传染病的研究和检测、病毒研究等等。具体原理如下：细胞受到抗原刺激后产生细胞因子，此细胞因子抗原被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点，表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。结核病的临床检测也常用到这个检测方法，结核病特异性抗原可以刺激外周淋巴细胞产生特异性细胞因子INF-γ，因此本实验以临床病人的检测为依托，对ESAT-6检测阳性的病人为研究主体，提取其PBMC，按ELISPOT检测方法鉴定可用于细胞免疫诊断分子诊断标识的筛选。
1.实验材料
目标蛋白样品：按照上面的表1中所示的4个蛋白(SEQIDNO:1-4)，可以人工化学合成得到，也可以由相应的编码核苷酸序列通过重组表达载体和重组宿主细胞表达纯化得到。
ELISPOT分析试剂盒：深圳达科生产的HumanIFN-γprecoatedElispotKit，货号：DKW22-1000-500。其中含有阳性对照ESAT-6。
细胞样品：ESAT-6检测阳性的病人的PBMC细胞，用淋巴细胞分离液(货号DKW-LSH-0250，深圳市达科为生物工程有限公司)分离细胞，并用PBS洗涤2次。共分离自73位ESAT-6阳性的肺结核病人，得到73份PBMC细胞样品。肺结核病人的入选标准是：ESAT-6大于40，且菌培或是痰涂是阳性。
2.实验方法
使用前述的ELISPOT分析试剂盒进行实验。
无血清细胞培养基(DKW34-EU0100，深圳市达科为生物工程有限公司)重悬，分配每孔100μl细胞悬液，细胞数2×105。同时，每孔加入一种待测蛋白样品，终浓度分别是5ng/孔；另外每板设通用阳性刺激物植物凝集素(PHA，10ng/ml)一孔，只加细胞的空白对照一孔，加细胞并加蛋白稀释缓冲液对照一孔，阳性对照ESAT-6(来自试剂盒，终浓度是10ng/ml)一孔。盖上板，放细胞于5％CO2孵箱，37℃培养15-20小时(在此期间不要摇动或平移平板)；
在洗涤槽上轻弹板子倒空液体，并在吸水纸上拍干；
每孔加100μl含0.1％Tween20的PBS，4℃放置2分钟；弃去液体，反复用含0.1％Tween20的PBS洗板5次，并彻底拍干；
加入已稀释好的100μl生物素标记的抗体(试剂盒自带)到10ml含1％BSA的PBS中，每孔加100μl，将封闭板子放于37℃，1小时；倒空板子并用含0.1％Tween20的PBS洗5次，拍干；
稀释10μl链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物(试剂盒自带)到10ml含1％BSA的PBS中，每孔加100μl，封闭板子放于37℃，1小时；倒空，用含0.1％Tween20的PBS洗5遍，反复用吸水纸吸以去尽所有残存的液体。
每孔加100μl备用显色溶液，让反应在室温进行5-20分钟。肉眼可见小斑点形成。
用蒸馏水洗三次。
干燥每孔，计数斑点。板子保存于室温，并避免直接光照。
3.判定方法
由于目标蛋白的浓度是阳性对照的二分之一，设置读值大于25个点判定为阳性(阳性对照的斑点数大于40)。图1是蛋白的ELISPOT鉴定中对照设置及读值示意图。
4.实验结果
4个目标蛋白的反应均为阳性且比较强，每个目标蛋白的斑点数(单个蛋白对应某位病人的PBMC形成的斑点数)与对照ESAT-6斑点数的比值均超过50％。
5.复验
参照上述方法，对4个目标蛋白进行了复验，肺结核病人数15位，健康人对照5位(H1～H5)。
结果发现，4个目标蛋白均与现今正在使用的阳性对照ESAT-6符合率较高，详细信息见下面的表2和表3。
表2：15位肺结核病人验证4个蛋白的ELISPOT结果
蛋白/多肽 阳性符合率 平均反应强度
Rv0875c 66.7％ 37.6％
Rv0773c 60.0％ 30.5％
Rv2553c 60.0％ 35.1％
Rv1115 40.0％ 26.6％
其中，
阳性符合率＝蛋白反应阳性人数/总人数。
平均反应强度＝(蛋白反应斑点数/ESAT-6反应斑点数)加和/总人数。
由表2可见，4个蛋白均可以作为结核病例如肺结核的诊断或疫苗的候选物。
表3：5个健康人重复验证4个目标蛋白的ELISPOT结果
(单位：斑点数)
健康人 Rv0875c Rv0773c Rv2553c Rv1115
H1 7 4 5 2
H2 21 21 4 2
H3 11 0 5 0
H4 0 1 3 0
H5 7 5 4 1
表3的结果说明，这4个蛋白在健康人的实验验证中反应点数很低，表现为阴性，具有较好的抗原特异性。
本实施例的结果表明，以上4个目标蛋白均与ESAT-6的符合率较高，能成为筛选诊断MTB的理想靶抗原，可以作为细胞水平的免疫诊断分子标识。
实施例2：动物免疫和淋巴细胞样品的制备
为了验证体外细胞免疫试验得到的结果，体内鉴定目的蛋白的抗原性也是很重要的一种验证方法，因此本发明人又进行了动物实验，选择的动物是C57BL/6MarkDoherty，是结核病研究的模式动物[T.MarkDoherty.TropicalMedicineandInternationalHealth.Newvaccinesagainsttuberculosis.2004(9):818-826.]。
1.实验动物和分组
C57BL/6小鼠(雌性，6-8周龄)，共50只，随机分组，每组6只，小鼠编号用剪耳的方法进行标记。另外，剩余2只作为全阴性对照，不进行免疫，留作观察。
第1组：PBS，作为阴性对照。
第2组：OVA，作为其它蛋白对照。
第3组：Rv1811，作为IFN-γ阴性蛋白对照(在ELISPOT筛选中结果为阴性蛋白)，参照SEQIDNO:5人工合成或者参照SEQIDNO:11人工表达。
第4组：Rv3875，作为阳性对照(Chen,X.,Yang,Q.,Zhang,M.,Graner,M.,Zhu,X.,Larmonier,N.,Liao,M.,Yu,W.,Deng,Q.,andZhou,B.,(2009)DiagnosisofactivetuberculosisinChinausinganin-housegammainterferonenzyme-linkedimmunospotassay.ClinVaccineImmunol16(6):p.879-84.)，用于确保动物实验的一致性，参照SEQIDNO:6人工合成或者参照SEQIDNO:12人工表达。
第5组：Rv0773c。
第6组：Rv0875c。
第7组：Rv1115。
第8组：Rv2553c。
2.动物免疫流程
实验动物购回后(50只)在相同饲养条件下饲养观察1周，一切正常后进行实验。
每种蛋白每只小鼠每次免疫20μg，每只小鼠的注射体积均为100μl，分为二点在小鼠后肢进行肌肉注射。注射前用酒精棉球进行皮肤的消毒，具体如下：
一周后进行第一次免疫，每只鼠腿部肌注20微克蛋白，50微升，分2点注射；其中，第1组注射50微升PBS，分2点注射。
间隔2周后进行第二次免疫，每只鼠腿部肌注20微克蛋白，50微升分2点注射；其中，第1组注射50微升PBS，分2点注射。
间隔2周后进行第三次免疫，每只鼠腿部肌注20微克蛋白，50微升分2点注射。其中，第1组注射50微升PBS，分2点注射。
3.淋巴细胞的收集和培养
第三次免疫后第七天开始，将小鼠处死，进行细胞免疫学检测。每组分3次进行，每次2只小鼠，免疫后10内做完，后面两次是重复实验验证。具体操作如下：
将小鼠颈部脱臼处死，固定于泡沫板，向胸腹部喷洒酒精消毒，用已经消毒的手术剪及镊子，无菌取出2只小鼠的脾脏组织及淋巴结，将其混合一起，置于1640培养基中。将组织置于滤网(BD)上研磨，用PBS冲洗并滤出细胞，2000rpm离心5min，弃上清，5mlPBS洗一遍，4℃，2000rpm离心15min。用2ml红细胞裂解液轻轻悬浮细胞沉淀，轻轻吹打若干次，放置2min，立即加入等体积1640完全培养基终止反应，2000rpm离心5min，弃上清，用1640完全培养基洗一遍，在用5ml1640完全培养基悬浮细胞。用细胞计数板进行细胞计数，调整细胞浓度用于后续实验，并计算细胞浓度。
如此得到一个批次的8份淋巴细胞样品(每组2只小鼠的细胞混合)，加上重复的两批次，共得到3个批次的共24份淋巴细胞样品。
实施例3：细胞内因子IFN-γ和IL-2的流式检测实验
1.实验样品和试剂
细胞样品：上面实施例2中8组小鼠样品的淋巴细胞(一个批次8份)。
试剂盒：invitrogen公司的CellTraceTMCFSECellProliferationKit(C34554)。
2.实验方法步骤
(1)将实施例2中收取的一个批次8份淋巴细胞按照2×106稀释，使用96孔板，每孔100μl，每份淋巴细胞设置3孔。富余的细胞设一孔对照(不加刺激物，不加染色抗体)。共25孔。
其中，刺激物分别是Rv0773c、Rv0875c、Rv1115、Rv2553c、PBS、OVA、阴性蛋白对照Rv1811、阳性对照Rv3875；并且各孔加入的刺激物，与前面实施例2中免疫所用的刺激物是对应的，例如，原先动物是Rv0773c免疫，则相应的细胞中加入的刺激物还是Rv0773c。加入的刺激物量均为终浓度10ng/μl。不加刺激物的细胞对照孔作为本底是要减去的。
同时，为了防止细胞分泌的因子INF-γ和IL-2释放到培养液里，所有细胞孔加入2μl的BDGolgiStopTMproteintransportinhibitor(BD，货号：554715)，37℃，5％二氧化碳，过夜(不超过12小时)。
(2)收集细胞到流式细胞管，每管加入2mlPBS，洗涤细胞，4℃，1200rpm，离心5分钟。
(3)弃上清，弹起细胞，每管加入2μl的Fc(BDpharmingen,553141)封闭非特异性染色，避光，30分钟。
(4)加入CD4抗体(BDpharmingen,550954)，CD8抗体(ebioscience,85-17-0083-81)，表面染色，按照试剂说明使用。
(5)加入2mlPBS洗涤细胞，4℃，1200rpm，离心5分钟，重复一次。
(6)固定和细胞破膜(目的在于让细胞内分泌的因子IFN-γ和IL-2释放出来)，边震荡边滴入Fixation/permeabilizationsolution(BDpharmingen,554715)，避光，2小时，之后用BDwashsolution(BDpharmingen,554715)洗涤细胞，弃上清，重复一次。
(7)将处理好的细胞一分为三，一份做IFN-γ染色(BDpharmingen，554411)，一份做IL-2染色(BDpharmingen，554428)，按照试剂说明使用，一份作为前述细胞染色抗体(抗体上标记上了荧光染料，荧光有不同颜色，用于区别不同细胞)的同型对照，以去除本底。染色避光，30分钟。
(8)BDwashsolution洗涤细胞，重复一次，弃上清后加入150μl的PBS上流式细胞仪(BDpharmingen,BDFACSCantoⅡ)检测。
使用实施例2中制备的后两个批次32份淋巴细胞样品，参照上面的步骤进行两次重复实验。
将3次实验的结果进行数据分析，取其平均值，并计算偏差。
3.实验结果
如图2A、2B所示，CD4+细胞分泌的INF-γ，Rv3875和Rv0773c与阴性对照(PBS组)差异显著，CD8+细胞分泌的INF-γ，Rv3875、Rv0773c和Rv1115与阴性对照PBS组差异显著。IFN-γ可使巨噬细胞活化，增强其吞噬杀伤等活性，可以诱导APC表达识别MHCΠ分子，促进抗原提呈作用。说明Th1细胞发挥作用，可以产生足够的IFN-γ抵御细菌侵袭。
如图2C、2D所示，CD4细胞(CD4抗体染色阳性)分泌的IL-2组Rv3875和阴性对照PBS组相比差异显著，其他组不明显。CD8细胞(CD8抗体染色阳性)分泌的IL-2组中Rv3875、Rv0773c、Rv0875c、Rv1115、Rv1811和阴性对照PBS组相比差异显著。IL-2可以促进TB细胞活化，增殖，分化，产生CK促进活化B细胞增殖及产生抗体。
实施例4：细胞增殖实验
1.实验样品和试剂
细胞样品：上面实施例2中8组小鼠样品的淋巴细胞一个批次8份。
试剂盒：FlowCytometryStainingBuffer(eBioscience，Cat.No.00-4222)
2.实验方法步骤
细胞增殖实验：荧光染料CSFE标记。将上述收取的淋巴细胞按照2×106稀释，每份淋巴细胞在96孔板种植一孔，另外设置两个重复孔(共3个孔)，加入相应刺激物(共8组，刺激物分别是Rv0773c、Rv0875c、Rv1115、Rv2553c、PBS、OVA、阴性蛋白对照Rv1811、阳性对照Rv3875；加入的刺激物，与前面实施例2中免疫所用的刺激物是对应的。例如，原先动物是Rv0773c免疫，则相应的细胞中加入的刺激物还是Rv0773c。)，终浓度均为10ng/μl。培养箱培养72小时。
收集刺激和培养后的细胞(相同的3个孔的淋巴细胞合并)，离心，4℃，1200rpm，收集上清，待用(准备用于下面的实施例5)。
加入2mlPBS洗细胞，离心，4℃，1200rpm，弃上清，重复一次，
按照CSFE染色试剂盒染色，染色避光，30分钟。
加入2mlPBS洗细胞，离心，4℃，1200rpm，弃上清，重复一次，
弃上清后加入150μl的PBS上机(BDpharmingen,BDFACSCantoⅡ)检测。
3.实验结果
如图3A和3B所示。
由图3A可见，CD4细胞经培养72小时后，CD4细胞在各个样品刺激组与阴性对照(PBS组)相比，都有不同程度的增加，尤其是Rv2553c组明显，与Rv3875相比差异不大。说明四个蛋白均可以相对的刺激CD4细胞的增加，可以起到对结核病例如肺结核的预防作用。
由图3B可见，在各个样品刺激组与阴性对照(PBS组)相比，CD8细胞都有不同程度的增加，尤其是Rv2553c组与阴性对照相比差异显著，可以说明Rv2553c能明显地保护机体产生免疫细胞，起到对结核病例如肺结核的预防作用。
实施例5：细胞因子检测实验
1.实验样品
实验样品：实施例4中收集的8组细胞培养物1200rpm离心后的上清，轻轻吸取上面的上清，每组分成三份(两份是用于重复测定以便计算平均值)，每份25μl，待用。
试剂盒：MOUSECYTOKINE/CHEMOKINEMAGNETICBEADPANEL96-WellPlateAssay(Millipore，Cat.No:HCYTOMAG-60K)
2.实验方法步骤
取实施例4中的培养上清，每份25μl，用于细胞因子的测定公司的MOUSECYTOKINE/CHEMOKINEMAGNETICBEADPANEL96-WellPlateAssay)，共测定9种细胞因子，即GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α。具体操作按照试剂盒操作说明进行。
3.实验结果
如图4A-4I。
结果表明，8个组经过细胞增殖后，各组的9种因子和阴性对照PBS组的9种因子相比都有不同差异，说明蛋白有很强的抗原性，可以作为结核病例如肺结核的免疫诊断标识，预防和/或治疗。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备结核病诊断剂或者结核分枝杆菌检测剂中的用途；优选地，所述结核病为肺结核。
2.一种抗体，其能够特异性结合选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个蛋白；优选地，所述抗体还连接有可检测的标记；优选地，所述可检测的标记为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。
3.一种结核病诊断剂或者结核分枝杆菌检测剂，其包含一种或者多种权利要求2所述的抗体，以及可选的一种或多种药学上可接受的辅料。
4.选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的药物或者制备抑制结核杆菌的药物中的用途；优选地，所述药物为疫苗；优选地，所述疫苗为结核病疫苗；优选地，所述结核病为肺结核。
5.一种药物组合物，其包含选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白，以及可选的一种或几种药学上可接受的载体或赋形剂；优选地，所述药物组合物为疫苗，并且所述药学上可接受的载体或赋形剂为疫苗用载体或赋形剂；优选地，所述疫苗为结核病疫苗；优选地，所述结核病为肺结核。
6.选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备提高受试者或细胞的细胞因子的水平的药物中的用途，所述细胞因子选自如下的至少一种：
GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α；优选地，所述细胞为淋巴细胞。
7.一种在体内或体外提高细胞因子的水平的方法，包括使用有效量的选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白的步骤，所述细胞因子选自如下的至少一种：
GM-CSF、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IP-10以及TNF-α。
8.选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备或者作为工具药的用途，所述工具药用于筛选预防和/或治疗和/或辅助治疗结核病的药物或者用于筛选抑制结核杆菌的药物；优选地，所述结核病为肺结核。
9.选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白在制备促进淋巴细胞(例如CD4细胞或CD8细胞)增殖的药物中的用途。
10.一种在体内或体外促进淋巴细胞(例如CD4细胞或CD8细胞)增殖的方法，包括使用有效量的选自氨基酸序列如SEQIDNO:1-4所示的任意一个或多个蛋白的步骤。
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