CN107367614B - Rv2657c蛋白在诊断或辅助诊断结核潜伏感染中的应用 - Google Patents

Rv2657c蛋白在诊断或辅助诊断结核潜伏感染中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Rv2657c蛋白在诊断或辅助诊断结核潜伏感染中的应用。Rv2657c蛋白为b1)至b3)中的任一种：b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；b3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明，重组蛋白Rv2657c对结核分枝杆菌处于潜伏感染状态的识别度较高，随着结核分枝杆菌活动度增高，其识别度下降。因此，Rv2657c蛋白在诊断或辅助诊断结核潜伏感染，或者，区分结核潜伏感染和活动感染方面具有重要的应用价值。

Description

Rv2657c蛋白在诊断或辅助诊断结核潜伏感染中的应用
技术领域
本发明属于医学免疫学诊断技术领域，具体涉及Rv2657c蛋白在诊断或辅助诊断结核潜伏感染中的应用。
背景技术
结核病是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的传染病，主要通过呼吸道传播。据报道2015年结核病患者已超过1000万，严重威胁着人类的健康。MTB感染人体后可出现三种不同的结果，一是机体免疫力较好，MTB直接被清除；二是MTB被机体免疫抑制，但也不能完全清除，发展为结核潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)；三是MTB在机体内迅速增殖，发展成活动性结核病。世界卫生组织估计全球1/3的人口是MTB的潜伏感染人群，而新发现的肺结核患者有85％-90％是由潜伏感染人群发展而来，由此可见LTBI的筛查对于结核病的防控具有重要的意义和价值，若能早期诊断LTBI人群，并尽早对其进行预防治疗可以大大降低结核病的发病率。
目前国内外诊断LTBI的方法主要包括结核菌素皮肤试验(tuberculin skintest，TST)及γ干扰素释放试验(interferon gamma release assays，IGRA)。TST及IGRA都是通过检测机体主要的抗结核免疫即细胞免疫应答来评价结核感染情况。国内现多将TST做为主要检测手段，一般将纯蛋白衍化物(PPD)强阳性或短期内从阴性转为阳性而无临床结核病证据者判断为结核菌潜伏感染者。由于TST特点是操作简单、价格低廉，其已成为目前临床上最常用且最简便的一种结核菌感染诊断方法。但PPD是从结核分枝杆菌中粗提的抗原混合物，包含200多种蛋白，其中很多是非结核分枝杆菌及卡介菌的共同抗原成分，因此决定了TST检测特异性差，在卡介苗(BCG)接种人群和非结核分枝杆菌感染人群中易产生假阳性结果。TST只能根据皮肤的反应强弱辅助诊断，其灵敏度只有70-80％。另外TST存在检测费时、需要受试者回访(72h)、皮试操作和结果解释存在主观依赖性等缺点。IGRA是采用酶联免疫吸附试验(ELISA)或酶联免疫斑点实验(ELISPOT)方法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原(ESAT6、CFP10及TB7.7)的IFN-γ检测释放反应，从而用于结核菌感染的诊断。2007年10月，应用ESAT-6、CFP-10和TB7.7作为特异性抗原并经过不断改良的QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)技术，成为FDA批准使用的检测结核感染方法。2008年7月，由英国牛津免疫技术公司研发，利用ESAT6和CFP10分别刺激外周血中T淋巴细胞，然后检测分泌IFN-γ的外周血T淋巴细胞数目的T SPOT-TB试验盒被FDA正式批准。这两种技术中所应用的抗原ESAT6、CFP10及TB7.7选自结核分枝杆菌基因组差异区，其在卡介菌和大部分环境分枝杆菌中都表达缺失，可以避免与这些菌种的交叉反应，弥补了TST的不足，提高了结核分枝杆菌感染检测的特异性。但是IGRA依然难以区分活动性结核病和潜伏结核感染。综上所述，目前对于LTBI的监测和诊断始终缺乏有效而可靠的标志物和方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何诊断或辅助诊断结核潜伏感染。
为解决上述技术问题，本发明首先保护Rv2657c蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下a1)至a4)中的至少一种：a1)诊断或辅助诊断结核潜伏感染；a2)诊断或辅助诊断待测者是否为结核菌潜伏感染者；a3)区分活动性结核病和潜伏结核感染；a4)防控结核病。
本发明还保护Rv2657c蛋白和记载有方法甲的载体在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下a1)至a4)中的至少一种：a1)诊断或辅助诊断结核潜伏感染；a2)诊断或辅助诊断待测者是否为结核菌潜伏感染者；a3)区分活动性结核病和潜伏结核感染；a4)防控结核病；
所述方法甲依次可包括如下步骤：
(1)收集待测者的淋巴细胞；
(2)用所述Rv2657c蛋白刺激步骤(1)得到的淋巴细胞，检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的比例，根据检测结果判断待测者是否为结核菌潜伏感染者。
本发明还保护Rv2657c蛋白和检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下a1)至a4)中的至少一种：a1)诊断或辅助诊断结核潜伏感染；a2)诊断或辅助诊断待测者是否为结核菌潜伏感染者；a3)区分活动性结核病和潜伏结核感染；a4)防控结核病。
上述应用中，所述“检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的物质”具体可为IFN-γELISPOT检测试剂盒(MABTECH公司的产品)。
本发明还保护Rv2657c蛋白、IFN-γELISPOT检测试剂盒和记载有方法乙的载体在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下a1)至a4)中的至少一种：a1)诊断或辅助诊断结核潜伏感染；a2)诊断或辅助诊断待测者是否为结核菌潜伏感染者；a3)区分活动性结核病和潜伏结核感染；a4)防控结核病；
所述方法乙可包括如下步骤：通过酶联免疫斑点实验检测待测者的淋巴细胞中分泌IFN-γ的淋巴细胞的比例，根据检测结果判断待测者是否为结核菌潜伏感染者；
所述酶联免疫斑点实验中，以IFN-γ单克隆捕获抗体为包被原，以含有所述Rv2657c蛋白和待测者的淋巴细胞的溶液为待测溶液，以IFN-γ检测抗体为一抗；
所述IFN-γ单克隆捕获抗体和所述IFN-γ检测抗体为IFN-γELISPOT检测试剂盒中的组件。
所述IFN-γELISPOT检测试剂盒具体可为MABTECH公司的产品。
所述方法乙依次可包括如下步骤：
(1)取96孔板，以IFN-γ单克隆捕获抗体为包被原进行包被；
(2)加入Rv2657c蛋白溶液；
(3)加入待测者的淋巴细胞(待测者疑似为结核菌潜伏感染者)；
(4)加入一抗；所述一抗为IFN-γ检测抗体；
(5)加入二抗；所述二抗为碱性磷酸酶标记的链亲合素；
(6)加入显色剂；
(7)检测着色斑点，得到斑点形成细胞数目。
上述方法中，所述BCIP/NBT底物液为Mabtech公司的产品，产品目录号为3650-10。
上述任一所述淋巴细胞可为从外周血中分离的淋巴细胞。
上文中，所述“检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的比例”具体可通过检测每2.5×105个淋巴细胞中斑点形成细胞(SFCs)的数目来实现。
上文中，“根据检测结果判断待测者是否为结核菌潜伏感染者”的判断标准为：如果待测者外周血中每2.5×105个淋巴细胞中斑点形成细胞(SFCs)的数目大于8，则所述待测者为或疑似为结核菌潜伏感染者[如本发明的实施例中，结核菌潜伏感染者的每2.5×105个淋巴细胞中斑点形成细胞(SFCs)的数目为37.5±55(37.5表示中位数，55表示四分位数间距)]；如果待测者外周血中每2.5×105个淋巴细胞中斑点形成细胞(SFCs)的数目为8以下，则所述待测者不为或疑似不为结核菌潜伏感染者[如本发明的实施例中，活动结核病患者的每2.5×105个淋巴细胞中斑点形成细胞(SFCs)的数目为1.5±8.5(1.5表示中位数，8.5表示四分位数间距)]。
为解决上述技术问题，本发明还提供了试剂盒甲和试剂盒乙。
本发明提供的试剂盒甲，可包括Rv2657c蛋白和检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的物质；所述试剂盒具有如下a1)至a4)中至少一种功能：a1)诊断或辅助诊断结核潜伏感染；a2)诊断或辅助诊断待测者是否为结核菌潜伏感染者；a3)区分活动性结核病和潜伏结核感染；a4)防控结核病。
上述试剂盒甲中，所述“检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的物质”可为IFN-γELISPOT检测试剂盒(MABTECH公司的产品)。
本发明提供的试剂盒乙，可包括包被IFN-γ单克隆捕获抗体的ELISpot板、Rv2657c蛋白和IFN-γ检测抗体；所述试剂盒具有如下a1)至a4)中至少一种功能：a1)诊断或辅助诊断结核潜伏感染；a2)诊断或辅助诊断待测者是否为结核菌潜伏感染者；a3)区分活动性结核病和潜伏结核感染；a4)防控结核病。
所述IFN-γ单克隆捕获抗体和所述IFN-γ检测抗体具体可为IFN-γELISPOT检测试剂盒(MABTECH公司的产品)中的组件。
上述任一所述Rv2657c蛋白可为b1)至b3)中的任一种：
b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
上述任一所述编码Rv2657c蛋白的核酸分子可为c1)至c4)中的任一种：
c1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
c2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
c3)与c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Rv2657c蛋白的DNA分子；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Rv2657c蛋白的DNA分子。
编码Rv2657c蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
实验证明，重组蛋白Rv2657c对结核分枝杆菌处于潜伏感染状态的识别度较高，随着结核分枝杆菌活动度增高，其识别度下降。因此，Rv2657c蛋白在诊断或辅助诊断结核潜伏感染，或者，区分结核潜伏感染和活动感染方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1步骤二的实验结果。
图2为实施例1步骤三中3的实验结果。
图3为实施例1步骤三中4的实验结果。
图4为实施例2的实验结果。
图5为实施例3的实验结果。
图6为实施例3的实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
预染蛋白Marker为北京天根生化科技有限公司的产品。Ni Sepharose 6FastFlow树脂按试剂盒为GE Healthcare Life Sciences公司的产品。载体pET30a为Novagen公司的产品，产品目录号为69909-3。载体pUC57为苏州金唯智生物科技有限公司的产品。
融合蛋白CFP10-ESAT6记载于如下文献中：李娟，吴雪琼，张俊仙，李香兰，张灵霞，梁建琴.结核分支杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达.中国防痨杂志，2004，26(4)：204-208.
实施例1、重组蛋白Rv2657c的表达和纯化
Rv2657c蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。编码Rv2657c蛋白的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
一、重组质粒pET30a-Rv2657c的构建
本发明的发明人在不改变Rv2657c蛋白的氨基酸序列的前提下，依据E.coli密码子偏好对Rv2657c蛋白进行了密码子改造。改造后的编码Rv2657c蛋白的基因(以下简称为Rv2657c基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
1、人工合成序列表中序列3所示的双链DNA分子(该双链DNA分子是在序列表中序列1所示的双链DNA分子的5’末端增加限制性内切酶NheI的识别位点，3’末端增加限制性内切酶EcoRI的识别位点得到的)。
2、将步骤1合成的双链DNA分子和载体pUC57连接，得到重组质粒pUC57-rv2657c。
3、采用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切重组质粒pUC57-rv2657c，回收约270bp的DNA片段。
4、采用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切载体pET30a，回收约5.3kb的载体骨架。
5、将步骤3得到的DNA片段和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pET30a-Rv2657c。
将重组质粒pET30a-Rv2657c进行测序。根据测序结果，对重组质粒pET30a-Rv2657c进行结构描述如下：将载体pET30a的限制性内切酶NheI和EcoRI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒pET30a-Rv2657c中，序列表的序列1所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，表达具有His-tag标签的Rv2657c蛋白(以下简称重组蛋白Rv2657c)。
二、重组蛋白Rv2657c的表达
1、将重组质粒pET30a-Rv2657c导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21(DE3)/pET30a-Rv2657c。
2、取BL21(DE3)/pET30a-Rv2657c的单克隆，接种至5mL LB液体培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)，37℃、180rpm振荡培养12h，得到培养菌液。
3、取培养菌液，按体积比为1∶100接种至LB液体培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)，37℃、180rpm振荡培养至OD600nm值达到0.8，然后加入IPTG并使其浓度为0.05mmol/L，37℃、120rpm振荡培养4h，得到诱导菌液。
取lmL诱导菌液或培养菌液，4℃、6000rpm离心15min，收集菌体沉淀。向所述菌体沉淀中加入50μL蒸馏水，吹打混匀；再加入50μL2×载样缓冲液，吹打混匀；最后100℃沸水浴5min，12000g离心10min，取20μL上清液进行SDS-PAGE。电泳条件：积层胶恒压80V，分离胶恒压120V。
2×载样缓冲液：含4％(4mg/l00mL)SDS、0.2％(v/v)溴酚兰、20％(v/v)甘油和200mMβ-巯基乙醇或二硫苏糖醇的pH6.8、100mM的Tris-HCl缓冲液。
实验结果见图l(M为预染蛋白Marker，1为IPTG诱导前(即培养菌液)，2为IPTG诱导4h(即诱导菌液)，箭头为重组蛋白Rv2657c)。结果表明，重组质粒pET30a-Rv2657c表达的重组蛋白Rv2657c的分子量约为12.8kDa，与预期实验结果完全一致。
三、重组蛋白Rv2657c的纯化
1、取步骤二中3得到的诱导菌液，4℃、6000rpm离心15min，收集菌体沉淀。
2、取菌体沉淀，加入pH7.4、0.01M的PBS缓冲液重悬，超声破碎(超声波功率200W，循环程序为：破碎4s，停6s，共15min)，然后4℃、10000rpm离心10min，得到菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀。
3、将菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀分别进行SDS-PAGE。
实验结果见图2(M为预染蛋白Marker，l为IPTG诱导前(即步骤二中2的培养菌液)，2为IPTG诱导4h(即步骤二中3的诱导菌液)，3为菌体破碎上清液，4为菌体破碎沉淀，箭头为重组蛋白Rv2657c)。结果表明，重组蛋白Rv2657c存在于上清液和沉淀(即包涵体)中，大小约为12.8kDa。
4、取菌体破碎沉淀，按照Ni Sepharose 6Fast Flow树脂按试剂盒的操作步骤进行纯化，得到纯化产物。
将纯化产物进行SDS-PAGE。实验结果见图3(M为预染蛋白Marker，l为纯化产物，箭头为重组蛋白Rv2657c)。结果表明，纯化产物即为重组蛋白Rv2657c的溶液。
按照上述步骤一至三，将序列表中序列1所示的双链DNA分子替换为序列表中序列4所示的双链DNA分子，其它步骤均不变，得到纯化产物甲。与上述步骤一至三得到的纯化产物相比，纯化产物甲中重组蛋白Rv2657c的浓度较低甚至难以检测到。
实施例2、采用Western Blot评价重组蛋白Rv2657c的免疫原性
结核分枝杆菌H37Ra为中国食品药品检定研究院的产品。结核分枝杆菌H37Ra是人型结核分枝杆菌减毒株，毒力极弱，对宿主安全。
PPD皮试判断标准：皮肤硬结的直径小于5mm，皮试阴性；如果皮肤硬结的直径在5mm以上，皮试阳性。
一、结核潜伏感染豚鼠的获得
1、取常规饲养于BSL-II级实验室的3周龄的豚鼠(体重为250-300g)，在其背部皮内注射0.1mL5IU人型PPD(即PPD皮试)，注射后72h，根据PPD皮试判断标准确定皮试阴性还是阳性。
2、完成步骤1后，取皮试阴性的豚鼠，于腹股沟皮下注射0.1mL含100CFU结核分枝杆菌H37Ra的生理盐水溶液，常规饲养3-5周后，再次在其背部皮内注射0.1mL5IU人型PPD，注射后72h，根据PPD皮试判断标准确定皮试阴性还是阳性。
3、完成步骤2后，对皮试阳性的豚鼠进行26周的抗结核治疗(每日治疗剂量：异烟肼10mg/Kg、利福平10mg/Kg)，然后再次在其背部皮内注射0.1mL5IU人型PPD，注射后72h，如果某豚鼠皮肤硬结的直径较治疗前显著变小，则该豚鼠为结核潜伏感染豚鼠。
二、采用Western Blot评价重组蛋白Rv2657c的免疫原性
待测豚鼠为29周龄的健康豚鼠或步骤一获得的结核潜伏感染豚鼠。
1、取待测豚鼠，摘眼球取血，然后6000rpm离心5min，分离血清，上层血清即为待测豚鼠的血清。
2、完成步骤1后，将重组蛋白Rv2657c进行SDS-PAGE，然后以待测豚鼠的血清作为一抗进行Western blot。
实验结果见图4(A为健康豚鼠：M为预染蛋白Marker，1为健康豚鼠；B为结核潜伏感染豚鼠：M为预染蛋白Marker，1为结核潜伏感染豚鼠)。结果表明，健康豚鼠的血清与重组蛋白Rv2657c不发生反应(即阴性反应)，而结核潜伏感染豚鼠的血清与重组蛋白Rv2657c发生强反应(即阳性反应)。因此，重组蛋白Rv2657c具有较高的免疫原性。
实施例3、重组蛋白Rv2657c在诊断或辅助诊断结核潜伏感染中的应用
一、实验标本
1、活动性结核病组：20个外周血标本。
20个外周血标本：分别抽取临床上经影像学、实验室检查及抗结核治疗而确诊的活动性肺结核病的20例患者(所有患者均知情同意)的外周血4-5mL，置于含肝素钠抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到20个外周血标本。20例患者的平均年龄为45.5岁(年龄在17岁-68岁之间)；其中男性14人，女性6人。
2、健康工作人员组：16个外周血标本。
16个外周血标本：分别抽取临床上无任何临床症状的16例健康人(均知情同意)的外周血4-5mL，置于含肝素钠抗凝采血管，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到16个外周血标本。16例健康人的平均年龄为27.75岁(年龄在22岁-58岁之间)；其中男性4人，女性12人。
根据外周血中单个核细胞对融合蛋白CFP10-ESAT6的反应和是否与活动性肺结核病患者接触，将健康工作人员组分为三组：CE阴性非防痨组(刺激斑点数＜16且未与活动性肺结核病患者接触)、CE阴性防痨组(刺激斑点数＜16且与活动性肺结核病患者接触)和CE阳性防痨组(刺激斑点数≥16且与活动性肺结核病患者接触)。CE阴性非防痨组共3例。CE阴性防痨组共7例。CE阳性防痨组共6例。
36个外周血标本需置于室温(勿冷冻或冷藏)，且放置时间小于6h。
二、实验仪器和试剂
人外周血淋巴细胞分离液Ficoll-Paque PLUS为美国GE公司的产品。96孔板为Millipore公司的产品。AIM VTM Medium无血清培养基为gibco公司的产品，产品目录号为12055091。BCIP/NBT底物液为Mabtech公司的产品，产品目录号为3650-10。RPMI1640培养液为北京索莱宝科技有限公司的产品，产品目录号为31800。
IFN-γELISPOT检测试剂盒为MABTECH公司的产品。IFN-γ单克隆捕获抗体和IFN-γ检测抗体均为IFN-γELISPOT检测试剂盒中的组件。
洗涤液：含0.05％(v/v)吐温20的pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。
三、实验步骤
1、包被
(1)取96孔板，每孔加入100μL IFN-γ单克隆捕获抗体，4℃包被过夜。
(2)完成步骤(1)后，取所述96孔板，弃液相，加入pH7.4、0.01M的PBS缓冲液洗涤两次(每次1min)，拍干。
(3)完成步骤(2)后，取所述96孔板，每孔加入200μL含2％(v/v)BSA的pH7.4、0.01M的PBS缓冲液，37℃孵育1h。
(4)完成步骤(3)后，取所述96孔板，弃液相，加入RPMI1640培养液润洗一次。
2、淋巴细胞悬液的制备
(1)分别取步骤一中的外周血标本3mL，缓缓加入至装有3mL人外周血淋巴细胞分离液Ficoll-Paque PLUS的无菌离心管中，然后室温、2500rpm离心25min，由上而下分为三层。
(2)完成步骤(1)后，吸取淋巴细胞云雾层(中层)并转移至装有2mL的RPMIRPMI1640培养液的离心管中。
(3)完成步骤(2)后，加入8mL预热至37℃的RPMI1640培养液，用滴管轻轻吹打混匀，室温、2000rpm离心10min。
(4)完成步骤(3)后，弃上清，加入6mL预热至37℃的RPMI1640培养液重悬，室温、1500rpm离心8min。
(5)完成步骤(4)后，弃上清，加入预热至37℃的AIM VTM Medium无血清培养基重悬，得到浓度为2.5×106个/mL的淋巴细胞悬液。
3、免疫斑点检测
(1)取完成步骤1的所述96孔板，在每个检测孔加入50μL重组蛋白Rv2657c的水溶液(浓度为60μg/mL)；在每个对照孔加入50μL融合蛋白CFP10-ESAT6的水溶液(浓度为60μg/mL)；在每个阴性对照孔加入50μL无血清培养基；在每个阳性对照孔加入50μL植物血凝素溶液(植物血凝素溶解于AIM VTM Medium无血清培养基得到，浓度为60μg/mL)。
(2)完成步骤(1)后，每孔加入100μL步骤2制备的淋巴细胞悬液(约2.5×105个淋巴细胞)。
(3)完成步骤(2)后，将所述96孔板置于培养箱，37℃、5％CO2培养18-20h。
(4)完成步骤(3)后，取所述96孔板，弃上清，加入200μL预冷的冰水，先-20℃放置5min(目的为裂解细胞)，再4℃放置5min(目的为裂解细胞)。
(5)完成步骤(4)后，取所述96孔板，弃上清，用洗涤液洗涤7次(每次加入200μL洗涤液，每次洗涤1min)，拍干。
(6)完成步骤(5)后，取所述96孔板，每孔加入100μL IFN-γ检测抗体稀释液(由999体积份pH7.4、0.01M的PBS缓冲液和1体积份IFN-γ检测抗体混合而成)，37℃孵育1h。
(7)完成步骤(6)后，取所述96孔板，弃上清，用洗涤液洗涤5次(每次加入200μL洗涤液，每次洗涤1min)，拍干。
(8)完成步骤(7)后，取所述96孔板，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的链亲合素的稀释液(由999体积份pH7.4、0.01M的PBS缓冲液和1体积份碱性磷酸酶标记的链亲合素混合而成)，37℃孵育30min。
(9)完成步骤(8)后，取所述96孔板，弃上清，用洗涤液洗涤5次(每次加入200μL洗涤液，每次洗涤1min)，拍干。
(10)完成步骤(9)后，取所述96孔板，每孔加入100μL BCIP/NBT底物液，室温下闭光显色7-15min。
(11)完成步骤(10)后，取所述96孔板，用蒸馏水冲洗3次(目的为中止反应)，然后将所述96孔板置于37℃烘箱中烘干。
(12)完成步骤(11)后，取所述96孔板，使用斑点扫描仪S5Versa Analyzer(Cellular Technology Ltd.，Ohio，USA)及分析软件analyzed with(CTL Analyzer LLC)分析着色的斑点。
实验结果见图5(1为CE阴性非防痨组，2为CE阴性防痨组，3为CE阳性防痨组，4为活动性结核病组，空白为阴性对照孔，CFP10-ESAT6为融合蛋白CFP10-ESAT6，Rv2657c为重组蛋白Rv2657c，PHA为植物血凝素(即阳性对照孔)，每个孔左上的数字表示着色的斑点数目)、图6(“非防痨组CE”为CE阴性非防痨组经融合蛋白CFP10-ESAT6刺激，“非防痨组Rv2657c”为CE阴性非防痨组经重组蛋白Rv2657c刺激，“CE阴性防痨组CE”为CE阴性防痨组经融合蛋白CFP10-ESAT6刺激，“CE阴性防痨组Rv2657c”为CE阴性防痨组经重组蛋白Rv2657c刺激，“CE阳性防痨组CE”为CE阳性防痨组经融合蛋白CFP10-ESAT6刺激，“CE阳性防痨组Rv2657c”为CE阳性防痨组经重组蛋白Rv2657c刺激，“结核组CE”为活动性结核病组经融合蛋白CFP10-ESAT6刺激，“结核组Rv2657c”为活动性结核病组经重组蛋白Rv2657c刺激)和表1。结果显示，重组蛋白Rv2657c刺激后，CE阴性非防痨组没有结核菌潜伏感染，其外周血单个核细胞中分泌IFN-γ的SFCs较低(8±9)；而CE阴性防痨组处于结核潜伏感染状态，其SFCs很高(37.5±55)；CE阳性防痨组有少量结核菌在体内增殖，其SFCs比CE阴性防痨组略低(21±13)；活动性结核病组有大量结核菌在体内活跃增殖，其SFCs显著降低(1.5±8.5)。因此，重组蛋白Rv2657c对结核分枝杆菌处于潜伏感染状态的识别度较高，随着结核分枝杆菌活动度增高，其识别度下降。
表1
上述结果表明，重组蛋白Rv2657c在诊断或辅助诊断结核潜伏感染，或者，区分结核潜伏感染和活动感染方面具有重要的应用价值。

Claims (7)

1.Rv2657c蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为区分活动性结核病和潜伏结核感染。
2.Rv2657c蛋白和记载有方法甲的载体在制备产品中的应用；所述产品的功能为区分活动性结核病和潜伏结核感染
所述方法甲依次包括如下步骤：
（1）收集待测者的淋巴细胞；
（2）用所述Rv2657c蛋白刺激步骤（1）得到的淋巴细胞，检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的比例，根据检测结果判断待测者是否为结核菌潜伏感染者。
3.Rv2657c蛋白和检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为区分活动性结核病和潜伏结核感染。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述“检测分泌IFN-γ的淋巴细胞的物质”为IFN-γ ELISPOT检测试剂盒。
5.Rv2657c蛋白、IFN-γ ELISPOT检测试剂盒和记载有方法乙的载体在制备产品中的应用；所述产品的功能为区分活动性结核病和潜伏结核感染；
所述方法乙包括如下步骤：通过酶联免疫斑点实验检测待测者的淋巴细胞中分泌IFN-γ的淋巴细胞的比例，根据检测结果判断待测者是否为结核菌潜伏感染者；
所述酶联免疫斑点实验中，以IFN-γ单克隆捕获抗体为包被原，以含有所述Rv2657c蛋白和待测者的淋巴细胞的溶液为待测溶液，以IFN-γ检测抗体为一抗；
所述IFN-γ单克隆捕获抗体和所述IFN-γ检测抗体为IFN-γ ELISPOT检测试剂盒中的组件。
6.如权利要求1至5任一所述的应用，其特征在于：所述Rv2657c蛋白为b1）或b2）：
b1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b2）在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
7.如权利要求1、2、3、4或5所述的应用，其特征在于：编码所述Rv2657c蛋白的核酸分子为c1）或c2）：
c1）编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
c2）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。
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