CN110475568A - 多发性硬化症相关的自身抗原及其在疗法和诊断中的用途 - Google Patents

多发性硬化症相关的自身抗原及其在疗法和诊断中的用途 Download PDF

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Abstract

致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源性表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的T细胞表位，所述组合物包含治疗性T细胞表位，所述治疗性T细胞表位包含与SEQ ID NO:5的亚序列相差0‑2个残基取代、缺失和/或插入的8个连续氨基酸残基的序列，或者所述组合物包含编码所述治疗性T细胞表位的核酸。用于确定测试受试者中多发性硬化症(MS)相关自身免疫的程度的方法，包括提供包含活T细胞的源自测试受试者的测试样品；体外定量响应于包含T细胞表位的测试抗原的测试样品的T细胞的抗原特异性激活，其中所述T细胞表位如上述治疗性T细胞表位；并将定量的抗原特异性激活与相关参照进行比较，以确定测试受试者中MS相关自身免疫的程度。

Description

多发性硬化症相关的自身抗原及其在疗法和诊断中的用途
技术领域
本发明涉及多发性硬化症的治疗和诊断。
发明背景
多发性硬化症
多发性硬化症(MS，ICD 10代码G35)是免疫介导的中枢神经系统(CNS)的慢性疾病。目前的范例提出它是导致脱髓鞘和轴突破坏的自身免疫性炎症性疾病。主要影响20和40岁之间的年轻人，全世界共有250万受影响的人，MS是发达国家中年轻人残疾的主要原因之一，并且导致人群中的大量发病率以及由于需要的护理导致社会的高成本。
MS的特征在于自身反应性T细胞通过血脑屏障(BBB)浸润到CNS中，其中它们可能通过抗原呈递细胞(APC)得以激活。随后，这些自身反应性T细胞引起MS的典型特征，神经炎症、脱髓鞘和轴突破坏；创造特征性组织病理学标志-斑块。局灶性破坏导致涉及运动、感觉、视觉和自主系统的各种病理临床表现。炎症通常是短暂的，并且在炎症时期(inflammatory episode)之间发生一些髓鞘再生，导致神经功能障碍增加的明显突然发作(称为复发)，随后是部分恢复的时期。然而，随着时间的推移，恢复变得缺乏并且持续的症状积累。
MS中的T细胞和自身抗原
CD4+ T细胞和MS
CD4+ T细胞的主要生理作用是识别通过APC经由MHC II类分子呈递的外来抗原，并随后激活和释放细胞因子以调节免疫应答。每个CD4+ T细胞克隆具有特异性细胞表面表达的T细胞受体(TCR)，对一种特异性的抗原敏感。CD4+ T细胞，通常称为T辅助细胞，可以进一步基于功能和它们产生的细胞因子分为亚组。简单地说，1型辅助(Th1)T细胞的主要功能是协调针对细胞内病原体的免疫应答，Th2细胞针对寄生虫感染和细胞外病原体以及Th17针对真菌和细菌感染。
作为适应性免疫应答的一部分，CD4+ T细胞及其TCR的目的是针对外来病原体具有特异性。然而，由于受体是通过编码基因的随机重排生成的，因此可能发生具有针对自身结构的特异性的TCR的T细胞，引起自身反应性。在健康个体中自身反应性T细胞得以负选择并被去除，但是中枢和外周耐受性的缺陷可以产生持久的自身反应性T细胞。据信此类CD4+T细胞在MS的发病机理中起核心作用。编码MHC II类的某些基因与该疾病密切相关并且在MS病变中检测到大量CD4+ T细胞的事实表明，APC的抗原呈递和随后的CD4+ T细胞激活在疾病中起至关重要的作用。同样，CD8+ T细胞也存在于MS病变中，并且虽然它们在疾病病理生理学中的确切作用仍不清楚，但它们很可能也起作用。广泛使用的模拟MS的小鼠模型实验性自身免疫性脑炎(EAE)经由用髓磷脂衍生肽免疫小鼠而诱导，进一步表明自身反应性在MS中起作用。器官特异性自身免疫疾病如MS通常被认为是Th1介导的，但是最近的研究表明Th17细胞可以类似地驱动自身免疫反应。
T细胞和APC两者都存在于通常称为外周血单核细胞(PBMC)的细胞的级分中。PBMC是源自含有T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和树突状细胞的外周血的异源细胞群。
T细胞的细胞因子
在通过APC激活后，CD4+ T细胞的不同亚组产生各种不同的细胞因子。它们的功能可以是诱导其他细胞的增殖和成熟，或者是调节炎症的总体强度和持续时间。
干扰素gamma(IFNγ)是一种多能促炎细胞因子，其由Th1细胞高度表达，并作为Th1细胞的主要产物。IFNγ促进其他细胞的细胞毒活性、激活巨噬细胞、调节MHC I类和II类的表达，并有助于初始T细胞的进一步Th1细胞分化。当APC在某些情况下激活抗原特异性CD4+ T细胞时，大量的IFNγ得以释放以驱使T细胞向Th1分化。白细胞介素17A(IL-17A)是CD4+ T细胞亚群Th17的主要细胞因子，并且上调其他细胞的促炎细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶的产生和分泌。已经显示IL-17A参与MS并且已经发现在EAE的小鼠模型以及患有其他自身免疫疾病如RA、银屑病和炎性肠病的患者中IL-17A得以上调。白细胞介素22(IL-22)存在于激活的T细胞中，主要由记忆CD4+ T细胞、Th17细胞和最近表征的Th22细胞表达。已经发现其与IL-17A一起促进BBB破坏和CNS炎症，并且认为其是MS发病机理中的重要细胞因子。
MS中的自身抗原
为了使CD4+ T细胞得以激活，其必须识别由APC呈递的特异性抗原。在自身反应性T细胞的情况下，抗原是自身蛋白质，所谓的自身抗原。已经提出并研究了MS中若干种不同的自身抗原(Elong Ngono A,Pettre S,Salou M,Bahbouhi B,Soulillou JP,Brouard S,et al.Frequency of circulating autoreactive T cells committed to myelindeterminants in relapsing-remitting multiple sclerosis patients.ClinImmunol.2012；144(2):117-26.)。研究最多的包括髓磷脂、星形胶质细胞和神经元衍生的抗原，但也有其他的建议(Riedhammer C,Weissert R.Antigen Presentation,Autoantigens,and Immune Regulation in Multiple Sclerosis and Other AutoimmuneDiseases.Front Immunol.2015；6:322)。研究的候选自身抗原中有髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、CNP酶、S100β和转醛醇酶，其中MBP是受到最彻底地研究的。对于这些候选物，已经在一些人类研究和动物模型中发现了T细胞自身反应性或自身抗体。但结果尚无定论并且数据缺乏一致性。尽管难以找到证据，但仍认为自身抗原及其CD4+ T细胞的激活在MS的发病机理中起关键作用(Hohlfeld R,Dornmair K,Meinl E,Wekerle H.Thesearch for the target antigens of multiple sclerosis,part 1:autoreactive CD4+T lymphocytes as pathogenic effectors and therapeutic targets.LancetNeurol.2015)。
T细胞表位
对抗原特异的T细胞不识别该抗原的整个氨基酸(aa)序列，而是识别该抗原中某处含有的短得多的特异性T细胞表位。当在MHC I类分子中呈递时表位通常在8-11aa长之间，当在MCH II类分子中呈递时表位通常在13-17aa长之间。当APC内化抗原时，它被消化成较短的肽片段，然后经由APC表面上的MHC分子呈递至T细胞。这些消化的抗原的片段是潜在的特异性T细胞表位。
抗原特异性免疫疗法
抗原特异性免疫疗法被认为是MS的潜在有效的未来治疗方法。该治疗的目的是通过耗尽自身抗原特异性、驱动疾病的T细胞或诱导有利的免疫应答(调节性)来诱导免疫耐受。实现这一目的的主要方法之一是经由口服、皮肤或皮下注射途径以致耐受性方式应用自身抗原，例如免疫显性肽表位，或者使用抗原特异性T细胞或其受体作为疫苗来诱导调节反应。不同方法的共同主题是使用的抗原靶标。该治疗策略在一般情况下是成功的，因为已经确定T细胞耐受性可以经由各种方法诱导。在MS、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型中已经报道了令人鼓舞的结果，但到目前为止在人体试验中取得的成功有限，导致无效或较小的效果。其中一个主要原因是，与EAE不同，MS中的靶自身抗原尚未完全知晓，并且可能尚未使用最佳靶标或足够的靶标；“发现和开发抗原特异性疗法的主要障碍之一当然是我们对多发性硬化症的靶抗原的无知”(Hohlfeld R,Dornmair K,Meinl E,WekerleH.The search for the target antigens of multiple sclerosis,part 1:autoreactive CD4+ T lymphocytes as pathogenic effectors and therapeutictargets.Lancet Neurol.2015)。
知识的差距
总之，通过APC及其识别的自身抗原激活CD4+ T细胞被认为是MS发病机理中起关键作用。MHC II类和MS之间的关联、靶向T细胞的免疫调控疗法(例如那他珠单抗)的有效性、MS病变中CD4+ T细胞的发现以及早期研究中发现的一些自身反应性T细胞都强化了这一假设。然而，究竟哪些自身抗原触发自身反应性T细胞并驱动炎症仍然未知，尽管若干种已经得以研究。考虑到抗原特异性免疫疗法的前景，自身抗原的鉴定变得越来越重要。然而，迄今为止的发现尚无定论，并且本领域需要鉴定参与MS发病机理的另外的抗原。
因此，本发明的一个目的是提供用于确定受试者中多发性硬化症相关自身免疫的改进的或替代的手段和方法，以及提供用于治疗MS的改进的手段、方法和组合物。
定义
序列一致性以百分比表示，定义为通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗口中序列的一部分可以包含与参照序列(其不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(即空位)。通过确定两个序列中都存在的相同的氨基酸残基的位置的数量产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数并将结果乘以100得到序列一致性的百分比，来计算百分比。除非另有说明，否则比较窗口是所参照的序列的整个长度。在这种情况下，最佳比对是BLASTP算法产生的比对，BLASTP算法由美国国家生物技术信息中心(US National Center for BiotechnologyInformation)在线实施(参见NCBI手册[互联网]，第16章)，其输入参数如下：字长＝3，矩阵＝BLOSUM62，空位成本＝11，空位延伸成本＝1。
术语抗原在本发明的上下文中是指含有特异性T细胞表位的分子(通常是多肽)。
术语特异性T细胞表位定义为被T细胞识别的抗原部分。典型地，特异性T细胞表位是当在MHC I类分子中呈递时长8-11aa和在MCH II类分子中呈递时长13-17aa的氨基酸序列。
术语MS抗原是指在多发性硬化症(MS)的病理学中相关的抗原。
内毒素，例如脂多糖(LPS)，其包含共价连接的脂质和在革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的外壁细胞壁上发现多糖亚基。
CD4+ T细胞或T辅助细胞是通过细胞因子分泌来协调免疫应答的细胞。它们可以抑制或增强其他免疫细胞，例如刺激B细胞的抗体类别转换、细胞毒性T细胞的扩增或增强吞噬细胞。它们通过经由APC上的MHC II类的抗原呈递而得以激活，并且它们表达对特定抗原内约13-17个氨基酸的段(所谓的T细胞表位)具有特异性的T细胞受体(TCR)。
CD8+ T细胞或细胞毒性T细胞是杀伤肿瘤细胞、被感染的细胞或以其他方式受损的细胞的细胞。与CD4+ T细胞不同，它们不需要专门的APC来激活。它们的T细胞受体识别由MHC I类呈递的抗原衍生肽(大约8-11个氨基酸长)，所有有核细胞上均表达该蛋白。
抗原特异性T细胞激活是需要TCR和MHC(HLA)分子上呈递的确定肽之间的相互作用结合共刺激的过程。
抗原呈递细胞(APC)典型地是树突状细胞(DC)、B细胞或巨噬细胞，其是吞噬细胞或内化细胞外有机体或蛋白质(即抗原)的细胞，并且在加工后将MHC II类上的抗原衍生肽呈递至CD4+ T细胞。在血液中，单核细胞是最丰富的抗原呈递细胞。
可吞噬颗粒定义为能够由免疫系统的细胞，特别是单核细胞吞噬的颗粒。
外周血单核细胞(PBMC)是通过全血的密度梯度离心制备的人血液的级分。PBMC级分主要由淋巴细胞(70-90％)和单核细胞(10-30％)组成，而红细胞、粒细胞和血浆已得以去除。
蛋白质表位特征标签(Protein epitope signature tag，PrEST)代表人蛋白质的独特部分的短重组10-12kDa肽(Lindskog M,Rockberg J,Uhlen M,Sterky F.Selectionof protein epitopes for antibody production.Biotechniques.2005；38(5):723-7.)。
术语肽模拟物在本申请的上下文中定义为肽样聚合物链，其经设计以在结构上模拟肽但在一些方面具有不同或改进的特性。
术语治疗在本上下文中是指对患有待治疗状况的受试者或患者产生有益效果的治疗，包括任何程度的缓解，包括轻微缓解、大幅缓解、重大缓解以及治愈。优选地，缓解的程度至少是轻微缓解。由于MS是具有发作性复发特征的疾病，因此在本上下文中的治疗还涉及预防复发或降低复发的可能性。
术语预防在本上下文中是指预防措施，其导致发展待预防的状况或状况再发生或复发的可能性有任何程度的降低，包括发展或再发展状况的可能性的轻微、大幅或重大降低以及全面预防。优选地，可能性降低的程度至少是轻微降低。
附图简述
图1.多发性硬化症患者的自身抗原筛查，针对125种蛋白质的文库。当用含有来自1-2种不同人蛋白质的PrEST的抗原库刺激时，来自MS患者的PBMC的T细胞激活与来自健康对照的PBMC的T细胞激活的比较。图A，IFNγ-FluoroSpot的激活测定。图B，IL17-FluoroSpot的激活测定。图C，IL22-FluoroSpot的激活测定。患者的T细胞对文库中的某些蛋白质反应显著更多。空心方块和实心圆圈分别表示患者和对照的PBMC中的平均激活，订书钉形线(staple)表示CI95％的平均值。使用双向ANOVA确定P值。星号表示P值。
图2.当用MS中的疑似自身抗原刺激时，比较多发性硬化症(MS)患者和健康对照中的T细胞激活的IFNγ/IL-22/IL-17 Fluorospot测定法。结果基于与图1中相同的数据，表示本申请中含有的每个新MS标志物。16名患者和9名对照包括在内。图A，用抗原库18(含有FABP7(SEQ ID NO:1和6)和CYB561D2)刺激时的激活。图B，用抗原库23(含有PROK2(SEQ IDNO:2)和NOVA2)刺激时的激活。图C，用抗原库26(含有RTN3(SEQ ID NO:3)和SDK2)刺激时的激活。图D，用抗原库29(含有SNAP91(SEQ ID NO:4)和SNAP25)刺激时的激活。用曼-惠特尼U检验确定P值并在发现时写入。订书钉形线表示CI95％的平均值。
图3.来自抗原筛选的抗原库的分裂。来自筛选实验的抗原库进一步分裂，对于其检测到患者和对照之间的激活的显著差异。这些库中的每一个都含有来自2种不同人蛋白质的PrEST，在图中称为#1和#2。在IFNγ/IL-22/IL-17 Fluorospot中再次用独立的抗原测试4名在筛选中以高程度的激活反应的患者。所有测试均一式三份进行。用Student’s t检验确定P值，比较每个孔中激活的细胞的数量(每个抗原n＝12)。订书钉形线表示SD。阳性抗原为：18#2-FABP7.23#2-PROK2.26#1-RTN3.29#2-SNAP91。
图4.患者之间的反应性概况。在患者之间观察到的激活的模式。每条线连接一名患者的数据点。对于概况1a、1b和3，虚线表示对照平均值+2SD。对于概况2，虚线表示三名患者平均IL-22概况。只有3名患者对抗原26(RTN3)反应显著，并且只有产生IFNγ的细胞的激活，使得关于抗原26的来自先前图的结果对于显示这些特定患者而言是非最佳的。然而，图清楚地显示了与该抗原反应的不同组患者，本文称为概况2。在健康对照之间未鉴定出这样的模式。
图5.用作诊断标志物时单个抗原、灵敏度和特异性的ROC曲线。单独地，FABP7(来自库18)显示出作为疾病的标记物的最大前景，并且分别达到75％和85％的灵敏度和特异性。A-D显示了孤立使用的每种抗原的ROC曲线。对于图5E，对于每个特定个体(同样适用于患者和对照)使用PROK2或SNAP91的激活的细胞数中的较高者。这种仅选择和分析最高应答的方式比单独分析它们产生甚至更好的ROC曲线。使用(PROK2和SNAP91的)平均值导致类似的改善的ROC曲线，尽管不如仅使用最高者那样好。图5F基于抗原18的全长重组形式，FABP7同种型2(SEQ ID NO:1)。
图6.当用全长重组FABP7同种型2刺激时，比较多发性硬化症(MS)患者和健康对照中的T细胞激活的IFNγ/IL-22/IL-17 Fluorospot测定法。13名患者(其中7名由在先前包括的患者的第一次采样后一年的新的采样组成，以及6名先前未进行过测试，空心方块)和7名对照(以前的测试中均未包括)进一步用内部生产的重组形式的FABP7同种型2蛋白质(SEQ ID NO:1)进行测试。使用曼-惠特尼检验计算P值。订书钉形线表示平均值和CI95％。
图7.用来自自身抗原的重叠肽刺激患者细胞的IFNγ/IL-22/IL-17 Fluorospot测定法。跨越整个FABP7同种型2和PROK2的重叠肽(15aa长，10aa重叠)汇集在各自含有5-7个肽的库中。在FluoroSpot测定法中针对这些对来自6名MS患者的细胞进行测试。图A，用来自FABP7(SEQ ID NO:1)的6个不同的重叠肽库刺激时的激活。图B，用来自PROK2(SEQ IDNO:2)的3个不同的重叠肽库刺激时的激活。表4中提供了详细的肽信息。订书钉形线表示CI95％。图中激活的T细胞的负数是由于平均应答低于阴性对照。
图8.当用全长重组抗原(FABP7、PROK2、RTN3、SNAP91)刺激时，比较多发性硬化症(MS)患者和健康对照中的T细胞激活的IFNγ/IL-22/IL-17 Fluorospot测定法。在FluoroSpot测定法中，对于针对重组全长形式的自身抗原的T细胞激活，对52名多发性硬化症患者和24名健康对照进行测试。A：FABP7同种型2(SEQ ID NO:1)。B：PROK2(SEQ ID NO:2)。C：RTN3SEQ ID NO:3。D：SNAP91SEQ ID NO:4。使用曼-惠特尼检验计算的P值。订书钉形线表示平均值和CI95％。
图9.当用作诊断标志物时全长抗原、灵敏度和特异性的ROC曲线。单独地，四种抗原作为疾病的诊断标志物表现相似，均达到～50％的灵敏度，特异性为95％。A：FABP7同种型2。B：PROK2。C：RTN3。D：SNAP91。E：使用所有四种抗原的组合作为诊断测试实现更高的灵敏度和特异性。具体地，利用针对该四种抗原的平均应答的IL-17除以IFNγ应答的平方根的比率实现70％的灵敏度，特异性>95％。
图10.FABP7和PROK2肽与HLA DRB5 01:01的结合亲和力程度的实例。跨越整个FABP7(SEQ ID NO:1和6)和PROK2(SEQ ID NO:2)的重叠肽在竞争性结合测定法中测试它们对多发性硬化症相关HLA DRB5 01:01的亲和力。亲和力的程度分为四类，并呈现代表性结合曲线：A：-无结合，B：+弱结合，C：++中度结合，D：+++强结合。黑点表示参照H1N1流感肽结合，三角表示测试的自身抗原肽。完整结果见表4。
发明概述
本发明基于发明人在PCT/EP2016/081141中先前公开的T细胞反应性平台上进行的筛选的发现。
来自多发性硬化症(MS)患者和对照的T细胞的样品针对45个库中的125个候选抗原的文库进行筛选(实施例1)。将阳性抗原库18、23、26和29分裂成单个蛋白质并重新测试，从而允许FABP7(SEQ ID NO:1)、PROK2(SEQ ID NO:2)、RTN3(SEQ ID NO:3)和SNAP91(SEQID NO:4)鉴定为MS中的新型自身抗原(实施例2)。还发现个体患者对新型自身抗原显示出几种不同类型的反应性概况(实施例3)。
通过接受者操作特征(receiver-operator-characteristic，ROC)分析证明了新型自身抗原的诊断效用(实施例4)。在个体抗原中，灵敏度和特异性(总是权衡)对于FABP7最有希望，其显示出75％灵敏度和85％特异性。对于所有四种抗原的组合，灵敏度和特异性最有希望，其中灵敏度为70％，特异性>95％。
通过测试每种抗原的全长重组形式进一步验证自身抗原(实施例7)，并且使用覆盖FABP7和PROK2的整个序列的重叠肽(15aa，10aa重叠)证明了特异性T细胞表位的鉴定原理(实施例6)。此外，证明了不同肽表位的HLA结合特性(实施例6)。
鉴于现有技术已经证明可以用包含疾病相关T细胞表位的致耐受性组合物成功地治疗MS，发明人认识到自身抗原的发现进一步提供了对MS的新治疗方法(参见实施例8)。
如在背景部分中所讨论的，用于诱导T细胞耐受的方法是已知的，但是由于缺乏可以诱导T细胞耐受的合适抗原，MS的治疗受到阻碍。创造性的MS治疗的生物学机制基于诱导抗原特异性T细胞耐受，这是本领域公认的。
虽然最初的学术研究是基于四种新型自身抗原作为独立实体的概念(由于它们的天然生物学背景)，但后来认识到，鉴于在诊断和疗法两者中使用的T细胞表位的短的性质以及结合所有四种自身抗原改进诊断结果(ROC分析)的事实，将所有四种新型自身抗原的汇集的序列视为用于本发明中的特异性T细胞表位(SEQ ID NO:5)的单一来源是可能和有利的。SEQ ID NO:5的序列是FABP7同种型2(SEQ ID NO:1)、PROK2(SEQ ID NO:2)、RTN3(SEQID NO:3)、SNAP91(SEQ ID NO:4)和FABP7同种型1(SEQ ID NO:6)的独特部分的序列的组合。
本发明具体涉及以下项目。以下项目中公开的主题应被视为以与专利权利要求中公开主题相同的方式公开。
1.致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位，
组合物包括包含n个连续氨基酸残基的序列的治疗性T细胞表位，所述n个连续氨基酸残基的序列：
a.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
b.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2。
2.致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位，
组合物包括编码包含n个连续氨基酸残基的序列的治疗性T细胞表位的核酸，所述n个连续氨基酸残基的序列：
a.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
b.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2。
3.致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位，
组合物包括离体暴露于包含n个连续氨基酸残基的序列的治疗性T细胞表位的抗原呈递细胞，所述n个连续氨基酸残基的序列：
a.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
b.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2。
4.根据前述项目中任一项使用的组合物，治疗方法包括确定患者针对包含在SEQID NO:5的氨基酸序列中的T细胞表位的T细胞自身反应性。
5.根据项目4使用的组合物，其中确定用根据项目43-110中任一项的方法进行。
6.根据项目1-5中任一项使用的组合物，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1-166中。
7.根据项目1-5中任一项使用的组合物，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基167-295中。
8.根据项目1-5中任一项使用的组合物，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基296-1327中。
9.根据项目1-5中任一项使用的组合物，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1328-2234中。
10.根据项目1-5中任一项使用的组合物，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基2235-2250中。
11.根据项目1-5中任一项使用的组合物，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1-2234中。
12.根据项目1-5中任一项使用的组合物，其中亚序列包含在表4中任一个的肽的序列中。
13.根据前述项目中任一项使用的组合物，其中n是至少11。
14.根据前述项目中任一项使用的组合物，其中n是至少13。
15.根据前述项目中任一项使用的组合物，其中n是至少15。
16.根据前述项目中任一项使用的组合物，其中n是至少17。
17.根据前述项目中任一项使用的组合物，其中n是至少19。
18.根据前述项目中任一项使用的组合物，其中n是至少50、至少75，更优选至少100。
19.根据前述项目中任一项使用的组合物，其中m是2。
20.根据项目1-18中任一项使用的组合物，其中m是1。
21.根据项目1-18中任一项使用的组合物，其中m是0。
22.根据前述项目中任一项使用的组合物，其中所述T细胞表位与亚序列相差不超过m个残基取代，并且与亚序列相比不包含取代或缺失。
23.根据项目1或3或其任何从属项目使用的组合物，其中治疗性T细胞表位是肽或肽模拟物(peptidomimetic)。
24.根据项目23使用的组合物，其中治疗性T细胞表位是与SEQ ID NO:5的亚序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％序列一致性的肽或肽模拟物。
25.根据项目1或其任何从属项目使用的组合物，其中组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的治疗性T细胞表位，所述不同的治疗性T细胞表位各自满足项目1中所述的标准。
26.根据项目2或其任何从属项目使用的组合物，其中组合物包含编码2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的治疗性T细胞表位的核酸，所述不同的治疗性T细胞表位各自满足项目2中所述的标准。
27.根据项目3或其任何从属项目使用的组合物，其中抗原呈递细胞已暴露于2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的治疗性T细胞表位，所述不同的治疗性T细胞表位各自满足项目3中所述的标准。
28.根据项目25-27中任一项使用的组合物，其中不同的治疗性T细胞表位选自项目6-11中所述的序列区间的一个、两个、三个、四个、五个或六个。
29.根据项目1或其任何从属项目使用的组合物，其中组合物包含与固体载体偶联的治疗性T细胞表位，所述固体载体例如生物相容性聚合物、颗粒或细胞。
30.根据项目29使用的组合物，其中经由共价键偶联。
31.根据前述项目中任一项使用的组合物，组合物配制用于诱导针对患者的所述治疗性T细胞表位的T细胞耐受性。
32.根据项目1或其任何从属项目使用的组合物，组合物包含能够与所述内源表位特异性结合相同的T细胞受体的治疗性T细胞表位。
33.根据项目2或其任何从属项目使用的组合物，组合物包含编码治疗性T细胞表位的核酸，所述治疗性T细胞表位能够与所述内源表位特异性结合相同的T细胞受体。
34.根据项目3或其任何从属项目使用的组合物，组合物包含暴露于治疗性T细胞表位的核酸的抗原呈递细胞，所述治疗性T细胞表位能够与所述内源表位特异性结合相同的T细胞受体。
35.根据前述项目中任一项使用的组合物，方法包括选择治疗性T细胞表位，使得其对应于患者表现出T细胞自身反应性所针对的表位。
36.根据项目35使用的组合物，其中选择治疗性T细胞表位基于其能够与所述内源表位特异性结合相同的TCR。
37.根据前述项目中任一项使用的组合物，治疗方法包括以致耐受性方式将组合物施用于受试者，从而诱导患者中针对所述T细胞表位的T细胞耐受性。
38.根据前述项目中任一项使用的组合物，治疗方法包括口服、粘膜、皮内、透皮或皮下施用组合物。
39.根据项目1或2或其任何从属项目使用的组合物，治疗方法包括将组合物体外施用于抗原呈递细胞，然后将所述抗原呈递细胞施用于患者。
40.根据项目2或其任何从属项目使用的组合物，其中所述核酸包括在载体中，可操作地与允许在细胞(优选抗原呈递细胞)中表达的启动子偶联。
41.根据项目40使用的组合物，其中所述载体是基因疗法载体或病毒载体。
42.根据项目3或其任何从属项目使用的组合物，其中抗原呈递细胞是树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞(优选衍生自PBMC)或小胶质细胞。
43.用于确定测试受试者中多发性硬化症(MS)相关自身免疫的程度的方法，其包括：
a.提供包含活T细胞的源自测试受试者的测试样品；
b.体外定量响应于包含T细胞表位的测试抗原的测试样品的T细胞的抗原特异性激活，其中所述T细胞表位包含n个连续残基的氨基酸序列，所述n个连续残基的氨基酸序列：
i.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
ii.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2；和
c.将定量的抗原特异性激活与相关参照进行比较，以确定测试受试者中MS相关自身免疫的程度。
44.根据项目43的方法，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1-166中。
45.根据项目43的方法，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基167-295中。
46.根据项目43的方法，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基296-1327中。
47.根据项目43的方法，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1328-2234中。
48.根据项目43的方法，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基2235-2250中。
49.根据项目43的方法，其中亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1-2234中。
50.根据项目43的方法，其中亚序列包含在表4中的任一个肽的序列中。
51.根据前述方法项目中任一项的方法，其中针对2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的T细胞表位定量抗原特异性激活，所述不同的T细胞表位各自满足项目43中所述的标准。
52.根据项目51的方法，其中不同的T细胞表位选自项目44-49中所述的序列区间的一个、两个、三个、四个、五个或六个。
53.根据前述方法项目中任一项的方法，其中针对至少两种、三种或四种测试抗原定量抗原特异性激活，所述至少两种、三种或四种测试抗原各自包含对应于选自下组的不同的MS抗原的特异性T细胞表位：FABP7(SEQ ID NO:1)、PROK2(SEQ ID NO:2)、RTN3(SEQ IDNO:3)和SNAP91(SEQ ID NO:4)。
54.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在FABP7(SEQ IDNO:1)残基1-82的序列中。
55.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在FABP7(SEQ IDNO:1)残基83-166的序列中。
56.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在FABP7(SEQ IDNO:1)残基105-166的序列中。
57.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在PROK2(SEQ IDNO:2)残基34-74的序列中。
58.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在PROK2(SEQ IDNO:2)残基106-128的序列中。
59.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在RTN3(SEQ ID NO:3)残基81-217的序列中。
60.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在RTN3(SEQ ID NO:3)残基345-483的序列中。
61.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在SNAP91(SEQ IDNO:4)残基378-480的序列中。
62.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在SNAP91(SEQ IDNO:4)残基481-572的序列中。
63.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述亚序列包括在SNAP91(SEQ IDNO:4)残基584-691的序列中。
64.根据前述方法项目中任一项的方法，其中n是至少11。
65.根据前述方法项目中任一项的方法，其中n是至少13。
66.根据前述方法项目中任一项的方法，其中n是至少15。
67.根据前述方法项目中任一项的方法，其中n是至少17。
68.根据前述方法项目中任一项的方法，其中n是至少19。
69.根据前述方法项目中任一项的方法，其中n是至少50、至少75，更优选至少100。
70.根据前述方法项目中任一项的方法，其中m是2。
71.根据项目43-69中任一项的方法，其中m是1。
72.根据项目43-69中任一项的方法，其中m是0。
73.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述T细胞表位与选择的MS抗原的亚序列相差不超过m个残基取代，并且与亚序列相比不包含取代或缺失。
74.根据前述方法项目中任一项的方法，其中所述T细胞表位是肽或肽模拟物。
75.根据前述方法项目中任一项的方法，其中包含特异性T细胞表位的抗原是与SEQ ID NO:1-4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的任一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％序列一致性的肽或肽模拟物。
76.根据前述方法项目中任一项的方法，其中受试者是诊断为MS的患者。
77.根据项目43-75中任一项的方法，其中受试者是怀疑患有MS的个体。
78.根据前述方法项目中任一项的方法，其中受试者是人。
79.根据前述方法项目中任一项的方法，其中测试样品源自血液样品。
80.根据前述方法项目中任一项的方法，其中测试样品是PBMC样品。
81.根据前述方法项目中任一项的方法，其中测试样品进一步包含抗原呈递细胞。
82.根据前述方法项目中任一项的方法，其中方法进一步包括：
a.提供活的抗原呈递细胞；
b.使测试抗原与抗原呈递细胞接触；
c.在允许响应于通过抗原呈递细胞呈递的抗原对T细胞进行抗原特异性激活的条件下，使测试样品体外接触与测试抗原接触的抗原呈递细胞；和
d.定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活。
83.根据前述方法项目中任一项的方法，其中方法包括提供与可吞噬颗粒紧密缔合的测试抗原。
84.根据项目83的方法，其中方法进一步包括步骤(a’)将测试抗原与可吞噬颗粒紧密缔合和/或(a”)使与颗粒缔合的测试抗原经受变性洗涤，导致内毒素水平低到足以不干扰后续步骤。
85.根据项目83-84中任一项的方法，其中颗粒的最大尺寸小于5.6μm，优选小于4μm，更优选小于3μm，甚至更优选在区间0.5-2μm中或最优选约1μm。
86.根据项目85的方法，其中颗粒大体上是球形的。
87.根据项目84-86中任一项的方法，其中变性洗涤涉及使具有缔合的测试抗原的颗粒经受高pH，如至少pH 13，更优选至少pH 14，最优选至少pH 14.3。
88.根据项目84-87中任一项的方法，其中变性洗涤涉及使具有缔合的测试抗原的颗粒经受低pH。
89.根据项目84-88中任一项的方法，其中变性洗涤涉及使具有缔合的测试抗原的颗粒经受高温，如至少90℃，更优选至少92℃，最优选至少95℃。
90.根据项目84-89中任一项的方法，其中变性洗涤涉及使具有缔合的测试抗原的颗粒经受变性剂，如处于足够浓度(如至少5M、6M、7M或8M)的尿素或盐酸胍。
91.根据项目84-90中任一项的方法，其中变性洗涤导致测试抗原中的内毒素量使得在该方法中，内毒素的最终浓度为小于100pg/ml，优选小于50pg/ml，更优选小于25pg/ml以及最优选小于10pg/ml。
92.根据项目83-91中任一项的方法，其中颗粒具有顺磁性特性。
93.根据项目83-92中任一项的方法，其中测试抗原与颗粒共价连接或经由金属螯合物与颗粒连接。
94.根据前述方法项目中任一项的方法，其中使用ELISpot或FluoroSpot技术或通过测量T细胞增殖来进行定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活。
95.根据前述方法项目中任一项的方法，其中定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活包括通过测量IFN-γ的分泌来确定T细胞应答。
96.根据前述方法项目中任一项的方法，其中定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活包括通过测量IL-17的分泌来确定T细胞应答。
97.根据前述方法项目中任一项的方法，其中定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活包括通过测量IL-22的分泌来确定T细胞应答。
98.根据前述方法项目中任一项的方法，其中定量测试细胞样品中的T细胞激活涉及确定样品中激活的T细胞的级分。
99.根据前述方法项目中任一项的方法，其中抗原特异性T细胞激活的定量包括以下步骤：
a.提供具有与其紧密缔合的测试抗原的可吞噬颗粒，其中具有缔合的测试抗原的颗粒已经受变性洗涤，导致内毒素水平低到足以不干扰后续步骤；
b.提供活的抗原呈递细胞；
c.在允许抗原呈递细胞对颗粒的吞噬作用的条件下使经洗涤的颗粒与抗原呈递细胞接触；
d.提供包含活T细胞的待测定的测试样品；
e.在允许响应于通过抗原呈递细胞呈递的抗原对T细胞进行抗原特异性激活的条件下，使测试样品体外接触与颗粒接触的抗原呈递细胞；和
f.定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活。
100.根据前述方法项目中任一项的方法，其中参照是来自没有病理性MS相关自身免疫的参照受试者的参照样品中的等同定量的抗原特异性激活。
101.根据项目43-99中任一项的方法，其中参照是来自一组没有病理性MS相关自身免疫的参照受试者的一组参照样品中的等同定量的抗原特异性激活的平均值。
102.根据项目101的方法，其中组包含至少10个参照受试者。
103.根据项目43-99中任一项的方法，其中参照是在不同时间点取得的来自相同受试者的样品中的等同定量的抗原特异性激活。
104.根据前述方法项目中任一项的方法，其中如果与参照相比测试样品中定量的抗原特异性激活高至少2倍，优选3倍，更优选5倍，最优选10倍，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
105.根据前述方法项目中任一项的方法，其中如果测试样品中定量的抗原特异性激活比来自一组没有病理性MS相关自身免疫的参照受试者的一组同等定量的参照样品的平均值高2倍的参照样品组的标准偏差，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
106.根据前述方法项目中任一项的方法，其中如果测试样品中定量的抗原特异性激活在用Student’s T检验计算的p值小于0.05的情况下统计学上显著高于参照，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
107.根据前述方法项目中任一项的方法，其中如果测试样品中定量的抗原特异性激活在用曼-惠特尼U检验计算的p值小于0.05的情况下统计学上显著高于参照，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
108.根据前述方法项目中任一项的方法，其中：
a.方法用于诊断受试者中的MS；
b.参照代表没有病理性多发性硬化症相关自身免疫的参照受试者中的同等定量的抗原特异性激活；和
c.与参照相比，测试样品中更高程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中的多发性硬化症。
109.根据前述方法项目中任一项的方法，其中：
a.方法用于跟踪受试者中MS的病程；
b.参照代表来自相同受试者的在不同时间点取得的样品中的同等定量的抗原特异性激活；和
c.与参照相比，测试样品中更高程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中更高的多发性硬化症疾病活性，并且反之亦然。
110.根据前述方法项目中任一项的方法，其中：
a.方法用于在受试者中进行MS病程的预后；
b.参照代表来自相同受试者的在不同时间点取得的样品中的同等定量的抗原特异性激活；和
c.与参照相比，测试样品中更高程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中增加的多发性硬化症疾病活性，并且反之亦然。
111.根据前述方法项目中任一项的方法，其中：
a.方法用于评估受试者对治疗性处理的反应；
b.参照代表在施用待评估的治疗性处理之前取自相同受试者的样品中的同等定量的抗原特异性激活；
c.测试样品来自开始治疗性处理后的相同受试者；和
d.与参照相比，测试样品中更低程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中针对多发性硬化症疾病活性的治疗功效，并且未改变的或更高程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中缺乏针对多发性硬化症疾病活性的治疗功效。
112.肽或肽模拟物在诊断或治疗MS中的用途，其中肽或肽模拟物包含对应于MS抗原的特异性T细胞表位，所述T细胞表位包含与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入的n个连续残基的氨基酸序列，其中m是0、1或2。
113.根据项目112的用途，其中亚序列选自SEQ ID NO:5的残基1-166、SEQ ID NO:5的残基167-295、SEQ ID NO:5的残基296-1327、SEQ ID NO:5的残基1328-2234、SEQ IDNO:5的残基2235-2250和/或SEQ ID NO:5的残基1-2234。
114.根据项目112或113的用途，其中n是至少11。
115.根据项目112或113的用途，其中n是至少13。
116.根据项目112或113的用途，其中n是至少15。
117.根据项目112或113的用途，其中n是至少17。
118.根据项目112或113的用途，其中n是至少19。
119.根据项目112-118中任一项的用途，其中m是1。
120.根据项目112-118中任一项的用途，其中m是0。
发明详述
用于治疗多发性硬化症的致耐受性组合物
在第一方面，本发明提供致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位，
组合物包括包含n个连续氨基酸残基的序列的治疗性T细胞表位，所述n个连续氨基酸残基的序列：
a.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
b.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2。
在第二方面，提供的是致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位，组合物包含编码治疗性T细胞表位 的核酸，所述治疗性T细胞表位如第一方面所定义。
在第三方面，提供的是致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位，组合物包含离体暴露于治疗性T细 胞表位的抗原呈递细胞，所述治疗性T细胞表位如第一方面所定义。
应理解为隐含治疗方法包括将组合物施用于患者。
治疗方法可以包括在施用组合物之前，优选通过以下作为本发明的第四方面所公开的方法，确定患者针对包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位的T细胞自身反应性的步骤。
应该注意的是，治疗性T细胞表位可以作为实际上任何较大的多肽的一部分包括在内(例如通过基因工程或化学肽合成)，鉴于患者的抗原呈递细胞(APC)将消化较大的多肽并将片段呈递至T细胞。换句话说，由于APC的消化，其中发现治疗性T细胞表位的序列背景几乎没有或没有差别。
优选第一方面的组合物包含一种以上的治疗性T细胞表位，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、100或更多种，每种都满足上述标准。如上文和背景部分中所讨论的，抗原呈递细胞将把任何用于抗原呈递的蛋白质消化成小片段，因此可能或甚至优选在将于相同的治疗范例内使用的较大的多肽或肽模拟物中包含一种或多种治疗性T细胞表位。为了避免任何不确定性，显然治疗性T细胞表位也可以是独立的化学实体。
这同样适用于第二方面的组合物，其具有以下修改，组合物包含一种或多种编码一种以上治疗性T细胞表位的核酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、100或更多种治疗性T细胞表位，每种表位满足上述标准。核酸可以编码一种以上的治疗性T细胞表位，因为如上所述，细胞将任何表达的用于抗原展示的蛋白质消化成小片段。或者或另外，由于上述原因，可以将治疗性T细胞表位作为较长序列的一部分包括，所述较长序列包含并非特异性T细胞表位的序列。
第三种组合物的抗原呈递细胞可以暴露于一种以上的治疗性T细胞表位，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、100或更多种，每种都满足上述标准。如前所述，即使在这种情况下，T细胞表位也可以包括在一个或多个较大的多肽中。
应当理解，在第三方面的上下文中“暴露”可以不仅指使抗原呈递细胞与包含治疗性T细胞表位的肽或肽模拟物接触，而且还指用编码治疗性T细胞表位的核酸转染抗原呈递细胞，导致细胞表达治疗性T细胞表位，从而暴露细胞。
亚序列
第一、第二或第三方面的亚序列可以包括在i)SEQ ID NO:5的残基1-166，ii)SEQID NO:5的残基167-295，iii)SEQ ID NO:5的残基296-1327，iv)SEQ ID NO:5的残基1328-2234中或v)SEQ ID NO:5的残基2235-2250中。优选地，亚序列包括在vi)SEQ ID NO:5的残基1-2234中。
第一方面的组合物可以包含一种以上如上定义的不同治疗性T细胞表位。优选地，一种以上不同的治疗性T细胞表位选自上文如i)-vi)呈现的两个、三个、四个、五个或六个不同的区间。
相同的原理适用于第二方面的核酸，比照适用。优选地，核酸编码如上定义的一种以上不同的治疗性T细胞表位。优选地，一种以上不同编码的T细胞表位选自上文如i)-vi)呈现的两个、三个、四个、五个或六个不同的区间。
同样地，第三方面的细胞可以已经暴露于如上定义的一种以上不同的治疗性T细胞表位。优选地，一种以上不同的治疗性T细胞表位选自上文如i)-vi)呈现的两个、三个、四个、五个或六个不同的区间。
亚序列可以包含在表4中的任一个肽的序列中。优选地，亚序列包含在表4中的任一个肽的序列中，其中HLA结合表示为“++”或“+++”，最优选“+++”。
优选地，n是至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22。n可以是至少50，至少75，甚至更优选至少为50。n可以是由上述数字形成的任何区间，例如8-22、9-21、8-17、8-15、8-12或8-100。当m＝0时，最优选n是8-19或8-17。优选地，m是2，更优选m是1，最优选m是0。
优选地，治疗性T细胞表位与亚序列相同(m＝0)。然而，与同SEQ ID NO:5的亚序列具有序列一致性的治疗性T细胞表位相比，在大多数情况下稍微改变序列并且仍然具有功能上完全或基本等同的治疗性T细胞表位是很有可能的。例如，就极性、电荷或疏水性而言，用氨基酸取代具有相似特征的另一种氨基酸可以是可容忍的。治疗性T细胞表位内的小的插入或缺失也可以是可容忍的，条件是与同SEQ ID NO:5的亚序列具有序列一致性的治疗性T细胞表位相比，它们产生功能上完全或基本等同的治疗性T细胞表位。优选地，m是2，更优选m是1，最优选m是0。
优选地，所述治疗性T细胞表位可以与亚序列相差不超过m个残基取代，并且与该亚序列相比不包含取代或缺失。
第一或第三方面的治疗性T细胞表位可以是肽或肽模拟物。第一或第三方面的治疗性T细胞表位可以是与SEQ ID NO:5的亚序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％序列一致性的肽或肽模拟物。
第二方面的核酸可以是DNA、PNA或能够编码用于在哺乳动物细胞中表达的蛋白质的任何其他核酸。
组合物配制
配制组合物用于诱导针对患者的所述治疗性T细胞表位的T细胞耐受性，所述患者可以是人或非人哺乳动物，优选人。
第一方面的组合物可以包含与固体载体偶联的治疗性T细胞表位，所述固体载体例如生物相容性聚合物(例如PLGA)、脂质体、固体颗粒或细胞。
偶联优选经由共价键，但也可以是其他偶联，包括金属螯合物结合、疏水相互作用或离子相互作用。EP2205273中公开了用于将抗原肽偶联至细胞的合适的偶联方案。Gholamzad及其同事公开了用于将抗原肽偶联至PLGA-微粒的合适的偶联方案(IranianJournal of Allergy,Asthma and Immunology 2017.16(3):271-281)。Pearson及其同事中公开了用于将抗原肽偶联至聚合物载体的合适的方案(Mol Ther.2017Jul 5；25(7):1655-1664.doi:10.1016/j.ymthe.2017.04.015)。
根据第一方面的组合物可以包含能够与所述内源表位特异性结合相同的T细胞受体的治疗性T细胞表位。在本发明的上下文中，特异性结合意指足够高以在体外或体内的生物学环境中导致T细胞激活的结合。
根据第二方面的组合物可以包含编码治疗性T细胞表位的核酸，所述治疗性T细胞表位能够与所述内源表位特异性结合相同的T细胞受体。
第三方面的抗原呈递细胞可以已经暴露于治疗性T细胞表位，所述治疗性T细胞表位能够与所述内源表位特异性结合相同的T细胞受体。
选择治疗性T细胞表位
第一、第二或第三方面的治疗方法可以包括选择治疗性T细胞表位，使其对应于患者表现出T细胞自身反应性所针对的内源T细胞表位。
可以基于其能够与所述内源表位特异性结合相同的TCR来选择治疗性T细胞表位。
第一、第二或第三组合物的治疗性T细胞表位可以单独定制或选择以匹配个体患者或待治疗的受试者的自身反应性。然而，在许多情况下，施用包含对应于最常见的内源T细胞表位的几种治疗性T细胞表位的组合物可能更实用，因为定制组合物是耗时的、昂贵的并且可能在许多司法管辖区域中带来监管挑战。
施用组合物
第一至第三方面的治疗方法优选包括以致耐受性方式将组合物施用于受试者，从而诱导针对患者的治疗性T细胞表位的T细胞耐受性。
治疗方法可以包括口服、粘膜、皮内、透皮或皮下施用组合物。施用可以通过注射。
第一或第二方面的治疗方法可以包括将组合物离体施用于抗原呈递细胞，然后将所述抗原呈递细胞施用于受试者。
优选在数周/月的时间内将治疗剂量从低剂量滴定至较高剂量。优选以低第一剂量开始治疗，然后在每次后续施用时增加剂量(例如加倍)。在数周/月的滴定期后，可以达到比起始剂量高10-100倍的维持水平并维持一段时间。
文献描述了用于在MS和其他状况中诱导T细胞耐受的几种方案，其可以适用于本发明，简单地通过将诱导对其耐受性的T细胞抗原替换为本文所述的治疗性T细胞表位。
Cathaway及其同事(Cathaway J,Martin K,Barrell K,Sharrack B,Stolt P,Wraith DC.Effects of ATX-MS-1467 immunotherapy over 16 weeks in relapsingmultiple sclerosis.Neurology 2018)进行了一项开放标签研究，以评估使用不同的治疗方案诱导对抗原的耐受性的抗原特异性免疫疗法对患有复发性多发性硬化症的患者的安全性、耐受性和疗效。
在一项双盲、安慰剂对照队列研究中，Walczak及其同事(Walczak A,Siger M,Szczepanik M,Selmaj K.Transdermal application of myelin peptides in multiplesclerosis treatment.JAMA Neurol.2013)已经在人类患者中使用髓磷脂肽的透皮应用证明了在多发性硬化症中有效的抗原特异性疗法。
Lutterotti及其同事已发表了在MS患者中的耐受性计划方案，其使用单一输注与七种髓鞘肽化学偶联的自体外周血单核细胞(Sci Transl Med.2013 Jun 5；5(188):188ra75)。该团队还在专利公开中公开了类似的计划方案，其中肽与红细胞偶联(EP2205273)。
Gholamzad及其同事(Iranian Journal of Allergy,Asthma and Immunology2017.16(3):271-281)公开了一种计划方案，该计划方案包括在实验性自身免疫性脑脊髓炎(MS的疾病模型)中静脉内注射具有致耐受性作用的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)包被的PLGA微粒。
Pujol-Autonell及其同事(Nanomedicine(Lond).2017Jun；12(11):1231-1242.Doi:10.2217/nnm-2016-0410)公开了一种基于磷脂酰丝氨酸-脂质体的免疫疗法的计划方案，该计划方案对多发性硬化症疾病模型具有治疗作用，其中MOG-肽作为抗原。
Pearson及其同事(Mol Ther.2017Jul 5；25(7):1655-1664.Doi:10.1016/j.ymthe.2017.04.015)报道了使用与聚(丙交酯-共-乙交酯)缀合的抗原性MOG肽在复发-缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎(R-EAE)(多发性硬化的小鼠模型)中的实验方案。聚合物缀合的肽有效抑制疾病。
通过根据第一方面修饰抗原肽，可以将上述任何计划方案和方案与第一方面的组合物一起使用。
基因疗法
一般而言，第二方面的核酸优选包括在载体中，可操作地与允许在患者的细胞，优选抗原呈递细胞中表达的启动子偶联。载体可以是基因转移载体，或本领域已知的病毒载体，例如逆转录病毒载体或腺相关病毒载体或腺病毒载体。可以通过本领域已知的任何方式施用裸DNA基因转移载体，包括电穿孔、基因枪、声孔效应(sonoporation)、磁转染或流体动力学递送。可以使用的用于增强载体递送的化学方法包括脂质体、脂质复合物(lipoflexes)、聚合物囊泡、聚合复合物、树枝状聚合物(dendrimer)、无机或有机纳米颗粒或细胞穿透肽。
取决于期望编码治疗性T细胞表位的序列在其中表达的组织，合适的启动子是本领域已知的。
Keeler及其同事(Mol Ther.2018 Jan 3；26(1):173-183)已证明基因疗法诱导的抗原特异性调节性T细胞(Tregs)可以抑制MS中的神经炎症和逆转性疾病，使用肝脏靶向基因转移载体，其在肝细胞中表达全长髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。所使用的材料和方法可以应用于根据第二方面的治疗方法，其中表达的核酸序列的修饰被本文对于第二方面定义的治疗性T细胞表位替换。
使用抗原呈递细胞的疗法
第三方面的抗原呈递细胞可以是树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞或B细胞，其可以优选地衍生自外周血单核细胞。或者，抗原呈递细胞可以是小胶质细胞，其可以是CNS衍生的。优选地，细胞对患者是自体的，但它们也可以来自关于MHC受体的供体匹配的不同个体。另外，还设想使用来自不同个体或甚至不同物种的经基因工程化的APC细胞系，其中MHC受体经工程化以匹配患者。
将细胞离体暴露于第三方面的组合物(治疗性T细胞表位)，使得细胞摄取表位并在施用于患者后将表位呈递至患者的免疫系统。由于细胞在表面上展示任何多肽之前对多肽进行处理和消化，因此可以将表位作为较大蛋白质或几种不同蛋白质的一部分给予细胞。同样适用于用编码治疗性T细胞表位的核酸构建体转染细胞，使得表位在细胞中表达。
Phillips等人(Front Immunol.2017；8:1279)在综述文章中讨论了使用致耐受性树突状细胞计划和正在进行的临床研究，用于MS和其他自身免疫疾病。
Jones和Hawiger(Front Immunol.2017 May 9；8:532.doi:10.3389/fimmu.2017.00532)讨论的实验表明，在外周免疫系统中以胸腺外形式形成的抗原特异性Treg细胞(pTreg细胞)在对相关神经元抗原的致耐受性反应期间可以改善或甚至完全阻止神经炎症，以及这些发现与MS治疗的相关性。
Iberg等人(Trends Immunol.2017 Nov；38(11):793-804.doi:10.1016/j.it.2017.07.007)讨论通过特异性递送T细胞抗原赋予的树突状细胞功能如何在临床环境中可以得以利用于耐受性诱导。
Huang等人报道了自身抗原脉冲的树突状细胞在Lewis大鼠中诱导对实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的耐受性(Clin Exp Immunol(2000)122(3):437-44.doi:10.1046/j.1365-2249.2000.01398.x)。
Menges等人报道了重复注射用肿瘤坏死因子alpha成熟的树突状细胞诱导小鼠免于自身免疫的抗原特异性保护(J Exp Med(2002)195(1):15-21.Doi:10.1084/jem.20011341)。
在上述原始研究和综述(包括其中引用的原始研究)中讨论的手段和方法可以适于与本发明的治疗性T细胞表位的组合物一起使用。
用于确定多发性硬化症(MS)相关自身免疫的程度的方法
在第四方面，本发明提供了用于确定测试受试者中多发性硬化症(MS)相关自身免疫的程度的方法，其包括：
a.提供包含活T细胞的源自测试受试者的测试样品；
b.体外定量响应于测试抗原的测试样品的T细胞的抗原特异性激活，所述测试抗原包含对应于MS抗原的特异性T细胞表位，其中所述T细胞表位包含n个连续残基的氨基酸序列，所述n个连续残基的氨基酸序列：
i.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
ii.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2；和
c.将定量的抗原特异性激活与相关参照进行比较，以确定测试受试者中MS相关自身免疫的程度。
第四方面的用于确定测试受试者中多发性硬化症(MS)相关自身免疫的程度的方法可以包括：
a.提供包含活T细胞的源自测试受试者的测试样品；
b.体外定量响应于测试抗原的测试样品的T细胞的抗原特异性激活，所述测试抗原包含对应于MS抗原的特异性T细胞表位；和
c.将定量的抗原特异性激活与相关参照进行比较，以确定测试受试者中MS相关自身免疫的程度；
其中MS抗原选自下组：FABP7(SEQ ID NO:1)、PROK2(SEQ ID NO:2)、RTN3(SEQ IDNO:3)和SNAP91(SEQ ID NO:4)；
其中所述T细胞表位包含n个连续残基的氨基酸序列，所述n个连续残基的氨基酸序列：
i.与选择的MS抗原的亚序列相同；或
ii.与选择的MS抗原的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；和
其中n是至少8，并且m是0、1或2。
应当注意，鉴于抗原呈递细胞(APC)将消化测试抗原，T细胞表位可以包括在实际上任何较大的多肽测试抗原中(例如通过基因工程)。由于测试抗原将被消化，在测试抗原中发现特异性T细胞表位所在其中的背景没有差别。因此，可以使用任何测试抗原，条件是测试抗原包含对应于以下新型MS抗原之一的特异性T细胞表位作为其序列的一部分：FABP7、PROK2、RTN3和SNAP91(均包含在SEQ ID NO:5中)。
如在背景部分所讨论的，最短的表位通常是8aa长，但是根据个体情况可以更长。因此，本发明要求T细胞表位与SEQ ID NO:5(即新型MS抗原之一)具有序列一致性或相似性，至少对于n个氨基酸的连续的段共享相似性。
n的值可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。优选地，n是至少11，更优选n是至少13，还更优选n是至少15，仍更优选n是至少17，甚至更优选n是至少19。或者，n可以是至少50，优选至少75，或最优选至少100。n可以是由上述数字形成的任何区间，例如8-22、9-21、8-17、8-15、8-12或8-100。最优选地，当m＝0时，n是8-19或8-17。
优选地，T细胞表位与亚序列相同(m＝0)。然而，在大多数情况下，可以稍微改变序列并且仍然具有对应于MS抗原的功能上完全或基本等同的特异性T细胞表位。例如，就极性、电荷或疏水性而言，用氨基酸取代具有相似特征的另一种氨基酸可以是可容忍的。特异性T细胞表位内的小的插入或缺失也可以是可容忍的，条件是它们产生对应于选择的MS抗原的功能上完全或基本等同的特异性T细胞表位。
优选地，差异仅等同于取代，即没有缺失或插入。更优选地，差异仅等同于涉及用氨基酸取代就极性、电荷和/或疏水性而言具有相似特征的另一种氨基酸的取代。优选地，m是2，更优选m是1，最优选m是0。
优选地，针对至少两种、三种或四种测试抗原定量抗原特异性激活，所述测试抗原各自包含对应于选自下组的不同MS抗原的特异性T细胞表位：FABP7(SEQ ID NO:1)、PROK2(SEQ ID NO:2)、RTN3(SEQ ID NO:3)和SNAP91(SEQ ID NO:4)。如实施例2中所示，并非所有MS患者都表现出对所有新型MS抗原的T细胞相关自身免疫。因此，特别是在筛选环境中，有利的是测试在测试受试者中针对一种以上特异性T细胞表位的MS相关自身免疫，所述特异性T细胞表位同时衍生自不同的MS抗原。还考虑可以有利地将针对新型MS标志物的自身免疫性的确定与其他已知MS标志物的确定相结合。
包含特异性T细胞表位的测试抗原可以是与SEQ ID NO:1-4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:6的任一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％序列一致性的肽或肽模拟物。
诊断方法中的亚序列
第四方面的亚序列可以包括在i)SEQ ID NO:5的残基1-166，ii)SEQ ID NO:5的残基167-295，iii)SEQ ID NO:5的残基296-1327，iv)SEQ ID NO:5的残基1328-2234中或v)SEQ ID NO:5的残基2235-2250中。优选地，亚序列包括在vi)SEQ ID NO:5的残基1-2234中。
第四方面的方法可以包括响应于如上定义的一种以上不同的T细胞表位来定量抗原特异性激活。优选地，一种以上不同的T细胞表位选自上文如i)-vi)呈现的两个、三个、四个、五个或六个不同的区间。
优选地，第四方面的方法可以包括响应于一种以上治疗性T细胞表位来定量抗原特异性激活，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40、50、100或更多种治疗性T细胞表位，每种都满足上述标准。
亚序列可以包含在表4中的任一个肽的序列中。优选地，亚序列包含在表4中的任一个肽的序列中，其中HLA结合表示为“++”或“+++”，最优选“+++”。
亚序列可以优选地衍生自本文所述的MS抗原的特定部分，其对应于实施例中使用的特定抗原蛋白质。
所述亚序列可以包括在FABP7(SEQ ID NO:1)残基1-82、残基83-166或残基105-166的序列中。
所述亚序列可以包括在PROK2(SEQ ID NO:2)残基34-74或残基106-128的序列中。
所述亚序列可以包括在RTN3(SEQ ID NO:3)残基81-217或残基345-483的序列中。
所述亚序列可以包括在SNAP91(SEQ ID NO:4)残基378-480、残基481-572或残基584-691的序列中。
测试受试者
受试者可以是诊断为MS的患者，或怀疑患有MS的个体。优选地，受试者是人。
测试样品
测试样品优选源自血液样品，并且更优选是PBMC样品。
最优选地，测试样品进一步包含抗原呈递细胞(APC)，其可以用于将测试抗原呈递至样品的T细胞。在定量中利用来自相同个体的APC(详情如下)消除了由APC上MCH受体的个体遗传变异引起的任何不确定性。
有关确定特异性T细胞激活的优选方法的细节
可用于确定MS相关自身免疫的T细胞反应性平台先前已由发明人在PCT/EP2016/081141中公开。
本发明的方法可以进一步包括：
a.提供活的抗原呈递细胞；
b.使测试抗原与抗原呈递细胞接触；
c.在允许响应于通过抗原呈递细胞呈递的抗原对T细胞进行抗原特异性激活的条件下，使测试样品体外接触与测试抗原接触的抗原呈递细胞；和
d.定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活。
优选抗原呈递细胞源自测试受试者。
该方法可以包括提供与可吞噬颗粒紧密缔合的测试抗原。颗粒与测试抗原一起由抗原呈递细胞吞噬。测试抗原被APC酶促消化，并将经消化的抗原表位呈递至T细胞。
使测试抗原与可吞噬颗粒紧密缔合的特别优点是可以通过变性洗涤除去任何污染的内毒素。不幸的是，确定T细胞激活的测定法的常见问题是即使与T细胞接触的低水平的内毒素也会导致激活，掩盖通常非常低水平的抗原特异性激活。只有小级分经测试的T细胞群以抗原特异性方式对给定抗原起反应(来自最近遇到抗原的受试者的血液中的1/10000量级)，而大级分的细胞会对内毒素产生反应，从而产生高水平的背景。鉴于普遍存在的内毒素污染，这在实践中可能是一个重大问题。
因此，方法可以进一步包括步骤(a’)将测试抗原与可吞噬颗粒紧密缔合和/或(a”)使与颗粒缔合的测试抗原经受变性洗涤，导致内毒素水平低到足以不干扰后续步骤。
颗粒优选地具有以下最大尺寸：小于5.6μm，优选小于4μm，更优选小于3μm，甚至更优选在区间0.5-2μm中或最优选约1μm。颗粒优选大体上是球形的。
变性洗涤可以涉及使具有缔合的测试抗原的颗粒经受高pH，如至少pH 13，更优选至少pH 14，最优选至少pH 14.3。变性洗涤可以涉及使具有缔合的测试抗原的颗粒经受低pH。变性洗涤可以涉及使具有缔合的测试抗原的颗粒经受高温，如至少90℃，更优选至少92℃，最优选至少95℃。变性洗涤可以涉及使具有缔合的测试抗原的颗粒经受变性剂，如处于足够浓度(如至少5M、6M、7M或8M)的尿素或盐酸胍。
优选地，变性洗涤导致测试抗原中的内毒素量使得在该方法中，内毒素的最终浓度为小于100pg/ml，优选小于50pg/ml，更优选小于25pg/ml以及最优选小于10pg/ml。
如果颗粒具有顺磁性特性，则是有利的，从而允许通过磁性保持容易处理。
优选地，测试抗原与颗粒共价连接或经由金属螯合物与颗粒连接。
抗原呈递细胞(APC)和T细胞样品
在本发明的上下文中，APC是专职的抗原呈递细胞，例如单核细胞/巨噬细胞或树突状细胞。APC可以是原代细胞或永生化细胞。
APC必须与T细胞样品的T细胞相容，使得它们能够在T细胞可以反应的抗原特异性环境(MHC限制)中将抗原呈递至T细胞。APC和T细胞样品优选从相同物种获得并且相对于MHC受体是供体匹配的。然而，还设想使用来自不同物种的基因工程化的APC。
如果抗原呈递细胞和T细胞样品源自相同个体，则避免了APC和T细胞之间不匹配的任何可能性。
抗原呈递细胞和T细胞样品可以衍生自相同的血液样品，这从实际观点来看是有利的。抗原呈递细胞和T细胞样品可以衍生自来自相同个体的PBMC样品。从外周血样品中获得PBMC是常规方案，其同时为来自相同个体的APC和T细胞两者提供了便利的来源。
PBMC样品可以新鲜使用或经受冷冻。从物流的观点来看，使用冷冻细胞的可能性具有很大的实际优势。
T细胞样品可以源自肿瘤，优选肿瘤中的淋巴管。
T细胞样品也可以源自腹水。
T细胞样品可以包含包括CD4+和CD8+ T细胞两者的完整的PBMC、纯化的T细胞群或缺乏一种或多种特定T细胞群的PBMC。
定量抗原特异性T细胞激活
抗原特异性T细胞激活的定量可以包括以下步骤：
a.提供具有与其紧密缔合的测试抗原的可吞噬颗粒，其中具有缔合的测试抗原的颗粒已经受变性洗涤，导致内毒素水平低到足以不干扰后续步骤；
b.提供活的抗原呈递细胞；
c.在允许抗原呈递细胞对颗粒的吞噬作用的条件下使经洗涤的颗粒与抗原呈递细胞接触；
d.提供包含活T细胞的待测定的测试样品；
e.在允许响应于通过抗原呈递细胞呈递的抗原对T细胞进行抗原特异性激活的条件下，使测试样品体外接触与颗粒接触的抗原呈递细胞；和
f.定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活。
可以使用ELISpot或FluoroSpot技术或通过测量T细胞增殖来进行定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活。重要的是要注意，尽管本实施例使用特定细胞因子的表达作为读出，但是存在许多可以使用的确定抗原特异性T细胞激活的另外的方法。例如，使用T细胞增殖作为读出(效用早期得以在PCT/EP2016/081141中证明)可以用于消除测量任何特定细胞因子的需要。
定量测试样品中的抗原特异性T细胞激活可以优选包括通过测量IFN-γ、IL-17和/或IL-22的分泌来确定T细胞应答。其中，IL-17和IL-22是特别优选的，因为它们给出了最稳健的结果(参见表3)。
优选地，定量测试细胞样品中的T细胞激活涉及确定样品中激活的T细胞的级分。定量测试细胞样品中的T细胞激活可以涉及确定使用两种不同测量检测的样品中激活的T细胞的比率。数字可以通过数值运算标准化，例如取对数或平方根。一种特别优选的定量涉及确定通过将IL-17阳性细胞数除以IFN-γ阳性细胞数的平方根而获得的测量。
相关参照
优选地，定量的抗原特异性激活相比较的相关参照是来自没有病理性MS相关自身免疫的参照受试者的参照样品中的同等定量的抗原特异性激活。
参照可以是来自一组没有病理性MS相关自身免疫的参照受试者的一组参照样品中的同等定量的抗原特异性激活的平均值。所述组可以包含至少10个参照受试者。
参照可以是在不同时间点取得的来自相同受试者的样品中的同等定量的抗原特异性激活。
诊断应用
方法的诊断效用如实施例3-7中所示。正如接受者操作特征(ROC)分析所证明的，灵敏度和选择性之间总是存在权衡。如果将断定病理存在的阈值设置得较低，则灵敏度增加(即假阴性的数量减少)，但是以降低选择性为代价(即假阳性的数量增加)。如果改为提高阈值，则降低灵敏度并且选择性提高。根据设置，假阴性和误报的容差将有所不同。例如，在数百万人接受检测的全人群筛查中，假阳性的数量必须非常低，否则需要随访的患者数量将是压倒性的。另一方面，如果将诊断测试用作单个患者的专家评估的一部分，其中在达到诊断之前将权衡若干其他因素，则更大比例的假阳性可以视为可容忍的。因此，用于做出结论的阈值在大多数情况需要考虑进行分析的环境来设置，并且确定通常适用的阈值既不合适也不必要。
如果与参照相比测试样品中定量的抗原特异性激活高至少2倍，优选3倍，更优选5倍，最优选10倍，则可以得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
如果测试样品中定量的抗原特异性激活比来自一组没有病理性MS相关自身免疫的参照受试者的一组同等定量的参照样品的平均值高2倍的参照样品组的标准偏差，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
如果测试样品中定量的抗原特异性激活在用Student’s T检验计算的p值小于0.05的情况下统计学上显著高于参照，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
如果所述测试样品中定量的抗原特异性激活在用曼-惠特尼U检验计算的p值小于0.05的情况下统计学上显著高于参照，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
特定环境中的应用
提供了根据第四方面的方法，其中：
a.方法用于诊断受试者中的MS；
b.参照代表没有病理性多发性硬化症相关自身免疫的参照受试者中的同等定量的抗原特异性激活；和
c.与参照相比，测试样品中更高程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中的多发性硬化症。
所述方法特别适于检测患者中MS的存在。
提供了根据第四方面的方法，其中：
a.方法用于跟踪受试者中MS的病程；
b.参照代表来自相同受试者的在不同时间点(优选较早)取得的样品中的同等定量的抗原特异性激活；和
c.与参照相比，测试样品中更高程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中更高的多发性硬化症疾病活性，并且反之亦然。
所述方法特别适于在已知患有MS的受试者中跟踪MS的病程。
提供了根据第四方面的方法，其中：
a.方法用于在受试者中进行MS病程的预后；
b.参照代表来自相同受试者的在较早的时间点取得的样品中的同等定量的抗原特异性激活；和
c.与参照相比，测试样品中更高程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中增加的多发性硬化症疾病活性，并且反之亦然。
所述方法特别适于在已知患有MS的受试者中进行MS病程的预后。鉴于MS的特征在于具有间歇性恢复的复发，预先检测即将发生的复发是有价值的，以允许预先施用治疗。
提供了根据第四方面的方法，其中：
a.方法用于评估受试者对治疗性处理的反应；
b.参照代表在施用待评估的治疗性处理之前取自相同受试者的样品中的同等定量的抗原特异性激活；
c.测试样品来自开始治疗性处理后的相同受试者；和
d.与参照相比，测试样品中更低程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中针对多发性硬化症疾病活性的治疗功效，并且未改变的或更高程度的定量的抗原特异性激活指示测试受试者中缺乏针对多发性硬化症疾病活性的治疗功效。
所述方法特别适于评估受试者对治疗性处理的反应。特别地，方法在进行临床试验、为个体患者选择合适的药物和为个体患者进行剂量探索方面是有价值的。
肽或肽模拟物的用途
在第五方面，提供了肽或肽模拟物在诊断或治疗MS中的用途，其中肽或肽模拟物包括包含在SEQ ID NO:5中的特异性T细胞表位，其中所述T细胞表位包含与选择的MS抗原的亚序列相差不超过0、1或2个残基取代、缺失和/或插入的n个连续残基的氨基酸序列。用途可以是体外的，特别是用于诊断用途。
亚序列可以选自SEQ ID NO:5的残基1-166、SEQ ID NO:5的残基167-295、SEQ IDNO:5的残基296-1327、SEQ ID NO:5的残基1328-2234、SEQ ID NO:5的残基2235-2250或SEQID NO:5的残基1-2234。
优选地，T细胞表位可以对应于选自下组的MS抗原：FABP7同种型2(SEQ ID NO:1)、PROK2(SEQ ID NO:2)、RTN3(SEQ ID NO:3)、SNAP91(SEQ ID NO:4)和FABP7同种型1(SEQ IDNO:6)。
n的值可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。优选地，n是至少11，更优选n是至少13，还更优选n是至少15，仍更优选n是至少17，甚至更优选n是至少19。优选地m是1，更优选m是0。
第五方面的T细胞表位可以如第一方面的治疗性T细胞表位所定义。
与本公开相关的一般方面
术语“包含”应解释为包括但不限于。将本公开布置成具有标题和副标题的部分仅仅是为了提高易读性而并不应解释为以任何方式限制，特别地，该划分不以任何方式排除或限制不同标题和副标题下的特征相互组合。
所有参考文献均在此通过引用并入。
实施例
以下实施例不应视为限制。关于实验细节的进一步信息，技术读者可以参考标题为“材料和方法”的单独部分。
实施例1：通过FluoroSpot自身抗原筛选鉴定多发性硬化症中的自身抗原
本发明人使用IFNγ/IL-22/IL-17A FluoroSpot作为T细胞激活的测定法，测量响应于125个PrEST的文库的T细胞激活，所述文库被分成45个库并偶联到珠子上。筛选通过检测与健康对照相比，在来自MS患者的PBMC中刺激更高T细胞应答的那些抗原库来鉴定可能的自身抗原。如图1中所示，在对16名患者和9名健康对照的筛选中，当使用双向ANOVA分析时，可以看到激活的T细胞数量在患者平均和对照平均之间的统计学显著差异。对于分泌IL-22的激活的T细胞，对于以下5个抗原库可以看到差异：抗原#6(P<0.0001)、抗原#18(P<0.0001)、抗原#23(P<0.0001)、抗原#29(P<0.0001)和抗原#33(P<0.05)(图a)。对于分泌IL-17的T细胞，对于以下相同的5种抗原可以看到患者和对照之间的差异：抗原#6(P<0.05)、抗原#18(P<0.0001)、抗原#23(P<0.01)、抗原#29(P<0.0001)和抗原#33(P<0.05)(图b)。对于IFNγ，仅对于抗原#18(p<0.0001)可以看到差异(图c)。
图2显示了相同的数据，其呈现为针对上述抗原库个体患者和对照的激活。
实施例2：确定抗原库中含有的免疫原性抗原。
将实施例1中描述的抗原库18、23、26和29分裂成其中包含的单个蛋白质。对来自实施例1中针对这些特异性抗原库显示出高程度的T细胞激活的4名患者的PBMC再次测试针对单个蛋白质的激活。使用的方法和方案与实施例1中的相同。在每个库中，一种特定蛋白质引发明显的大部分T细胞激活。测试的蛋白质是：抗原库18,#1CYB561D2和#2FABP7(SEQID NO:1)。抗原库23，含有#1NOVA2和#2PROK2(SEQ ID NO:2)。抗原库26，含有#1RTN3(SEQID NO:3)和#2SDK2。抗原库29，含有#1SNAP25和#2SNAP91(SEQ ID NO:4)。结果呈现于图3中。
实施例3：基于反应性概况对患者进行分组。
当在个体受试者的水平上分析针对4种候选自身抗原的T细胞激活时，在患者中观察到四种不同的反应性概况。当用除#26之外的所有候选抗原刺激时，4名患者以显著激活产生所有细胞因子的细胞进行应答，称为“概况1a”。5名患者针对#18和1或2种更多的抗原以显著激活产生所有细胞因子的细胞进行应答，称为“概况1b”。3名患者针对#26仅以激活的产生IFNγ的细胞进行应答，称为“概况2”。4名患者为无应答者，称为“概况3”。概况呈现于图4中。
概况2中的患者太少而不能在平均患者和对照激活之间产生明显的统计学差异(参见图1和2C)，但具有在任何健康对照中未发现的显著独特的概况。
实施例4：诊断用途的证明
针对这些抗原的T细胞激活可以用作多发性硬化症的诊断工具和生物标志物。基于来自实施例1的数据，如果将T细胞激活用作诊断工具，则创建接受者操作特征(ROC)曲线以评估灵敏度和特异性。这些图表呈现于图5A-F以及表1和3中的数据中。当用抗原#18(含有FABP7PrEST)或全长FABP7同种型2(SEQ ID NO:1)刺激时，产生IL22和IL17的T细胞的激活是特别有希望的，分别达到约80％的灵敏度和特异性。对所有这些抗原的混合物测试患者和对照PBMC将很可能进一步提高这些数字。从表2中可以看出，与每种抗原本身相比，抗原23和29的组合给出了更灵敏的测试。
全长蛋白质也可以以类似的方式使用，见图9A-D。利用所有四种全长抗原，使用每个个体对四种抗原的平均应答，进一步提高灵敏度和特异性(图9E)。组合不同的读出，例如分析IL-17和IFNγ之间的比率，可以进一步提高测试的灵敏度(图9E，表2)。
表1.当使用特定数量的激活的产生IL17的细胞作为截止点时的灵敏度和特异性。对于该特定抗原和读出，当在>3个IL-17点处设置“阳性测试”的截止点时，灵敏度和特异性达到75％和100％。
对于18PrEST的IL-17激活的细胞的数量 灵敏度(％) 特异性(％)
0.25 93.75 33.33
0.75 93.75 55.56
1.25 81.25 55.56
1.75 81.25 66.67
2.25 75 77.78
2.75 75 88.89
3.25 75 100
4.25 62.25 100
5.5 50 100
表2.当使用针对抗原有反应性的产生IL-17的细胞的平均数量和产生IFNγ的细胞的平均数量之间的比率时的灵敏度和特异性。基于产生IL-17和IFNγ的细胞的数量的比率而不是绝对数量的ROC曲线产生甚至更强的诊断测试。比率计算为对抗原有反应性的产生IL-17的细胞的平均数量除以产生IFNγ的细胞的平均数量的平方根。
表3.图5A-E中呈现的ROC曲线的描述性参数。
实施例5：使用全长重组形式验证FABP7作为MS抗原
在大肠杆菌中产生重组形式的人FABP7同种型2(SEQ ID NO:1)。根据标准的大肠杆菌重组蛋白质方案，在室内产生蛋白质。将其经由his标签纯化进行纯化并与顺磁珠偶联并根据先前描述的方案进行洗涤。在先前描述的FluoroSpot测定法中测试了13名患者(其中7名由先前包括的患者的新样本组成并且6名先前未经测试)和7名对照(未包括在先前的测试中)的T细胞激活。
结果呈现于图6中。来自实施例1和3中的FABP7PrEST的结果，以及在本实施例中使用的全长重组形式彼此非常相似。
实施例6：鉴定特异性T细胞表位
覆盖FABP7的整个跨度的重叠肽(15aa长，具有10aa重叠)，大部分重叠的同种型2和1(分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6)和PROK2(SEQ ID NO:2)汇集为FABP7的6个级分和PROK2的3个级分，并用于在FluoroSpot测定法中刺激PBMC。对来自6名患者的PBMC进行了针对这些库的测试。如图7A和7B所示，对于每种抗原，患者对单个库反应更高(FABP7的库5，PROK2的库1)。与使用较长蛋白质的先前实施例相比，本实施例显示具有含有特异性T细胞表位的氨基酸序列的短肽也可以用于鉴定MS患者中的自身反应性T细胞。
进一步分裂阳性肽库并迭代地重复实验将允许甚至更详细地鉴定每种MS抗原内的特异性T细胞表位。然后可以设计并测试甚至短于15aa的肽以完全阐明特异性T细胞表位。
另外，发现可能的T细胞表位的互补方式是通过进行HLA结合实验。在竞争结合测定法中测试相同的重叠肽对多发性硬化症相关的HLA DRB5 01:01分子的结合亲和力。然后将结合亲和力与衍生自H1N1流感病毒的已知强结合肽的结合亲和力进行比较。对于FABP7和PROK2两者，在患者也起反应的相同肽库中发现最强的结合肽，表明它是T细胞表位候选物。结果呈现于表4中。不同结合亲和力的代表性实例显示于图10A-E中。
表4.来自FABP7和PROK 2的重叠肽与HLA DRB5 01:01的亲和力。
在竞争性结合测定法中测试亲和力。图注：-无结合，+弱结合，++中度结合，+++强结合。
实施例7：使用重组全长抗原验证自身抗原筛选
根据标准重组蛋白质生产方案在室内在大肠杆菌中产生重组全长形式的抗原FABP7(SEQ ID NO:1)、PROK2(SEQ ID NO:2)、RTN3(SEQ ID NO:3)、SNAP91(SEQ ID NO:4)，并经由his标签纯化进行纯化。如前所述，在IFNγ/IL17/IL22 FluoroSpot测定法中测试了52名患者和24名对照针对抗原的反应性。与先前测试的PrEST类似，除了对于SNAP91的IFNγ之外，对于分析的所有细胞因子，多发性硬化症患者PBMC针对所有四种抗原的反应性显著更高(参见图8A-D)。
实施例8：抗原特异性免疫疗法
在抗原特异性免疫疗法中使用先前已知的多发性硬化症自身抗原肽-表位的皮下、皮内或透皮施用有充分描述的先前研究。例如，Walczak等人(Walczak A,Siger M,Szczepanik M,Selmaj K.Transdermal application of myelin peptides in multiplesclerosis treatment.JAMA Neurol.2013)使用来自已知的自身抗原髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的已知表位的混合物，其在1年期间透皮应用，具有显著但适度的疾病活性降低。Chataway等人(Cathaway J,Martin K,Barrell K,Sharrack B,Stolt P,Wraith DC.Effects of ATX-MS-1467 immunotherapyover 16 weeks in relapsing multiple sclerosis.Neurology 2018)使用来自髓鞘碱性蛋白(MBP)的四种肽表位的混合物，在4周内以增加的剂量皮下注射，然后在16周内每两周一次最高剂量。同样，也看到了显著积极但适度的影响。这表明经由诱导针对自身抗原的T细胞耐受性的抗原特异性免疫疗法的方法是可行的方法。
基于本文档中先前描述的实施例和表位作图的已知方法，我们将首先鉴定FABP7、PROK2、RTN3和SNAP 91的特异性肽表位。然后，如前所述，将筛选患者针对这些自身抗原的T细胞反应性。基于筛选，将选择基于患者的肽表位的混合物，然后根据用于抗原特异性免疫疗法的已建立的方案用于治疗。用来自比以前使用的更多的自身抗原的肽表位进行治疗，由于个体化方法(并且因此不包括与患者无关的肽表位)保持相同，因此可以预期效力更大而并且具有耐受性。
材料和方法
蛋白质与含有游离羧酸基团的顺磁珠的共价偶联。
使用直径为1μm的MyOneTM羧酸(ThermoFischer Scientific)，并根据制造商的方案(使用NHS(N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide))和EDC(乙基碳二亚胺)的两步法)进行偶联规程。
用MES缓冲液(25mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，pH 6)洗涤珠子两次。然后通过将MES缓冲液中的50mg/ml NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和50mg/ml EDC(N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺)添加到珠子并且在室温下温育30分钟来激活羧酸基团。用磁铁收集珠子，除去上清液，并用MES缓冲液洗涤珠子两次。将蛋白质在MES缓冲液中稀释至1mg/ml的浓度，总共100ug，并且将其添加到珠子并在室温下温育1小时。用磁铁收集珠子，除去上清液并保存用于蛋白质浓度测量。用50mM Tris pH 7,4淬灭未反应的激活的羧酸基团15分钟。然后用PBS pH 7.4洗涤珠子，然后在-80℃下储存。
为了测量与珠子偶联的蛋白质的量，使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce BCAProtein Assay Kit，ThermoFisher Scientific)测量偶联前蛋白质的蛋白质浓度以及偶联后的上清液中的蛋白质浓度。根据制造商的方案使用BCA测定法。
通过变性洗涤去除内毒素。
珠子与在大肠杆菌中产生的重组蛋白质偶联。在几种不同的变性条件下洗涤蛋白质偶联的珠子以确保去除内毒素。为了去除内毒素，用以下3种不同的洗涤缓冲液洗涤珠子：2M NaOH pH 14.3、0.5M L-精氨酸和0.1％Triton X100，全部在室温下在无菌水中。将珠子悬浮在缓冲液中并摇动4分钟，用磁铁收集并除去上清液。重复5次。然后用无菌PBS洗涤珠子5次以除去任何剩余的洗涤缓冲液。使用单核细胞反应性测定法(IL1B/IL6FluoroSpot测定法，MABTECH，Sweden)测量剩余的内毒素。
患者
在神经诊所卡罗林斯卡大学医院(Neurological Clinic KarolinskaUniversity Hospital)，Solna和Huddige接受那他珠单抗治疗的共24名MS患者在他们的常规治疗就诊时捐献80ml静脉血。在原始取样后6-12个月再次对这些患者中的6名进行取样以用于进一步的实验(实施例5)。
表5.MS患者的纳入和排除标准
在机构和诊所的工作人员中招募年龄和性别匹配的健康对照。对照经历了与患者相同的血液采样规程。
根据标准方案，通过Ficoll-Paque(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)梯度离心从静脉血液样品(在BD Vacutainer EDTA管中取得)中分离PBMC。将细胞在冷冻培养基(45％FCS，45％RPMI，10％DMSO)中冷冻并储存在-150℃。
收集第二个、较大的人群以测试全长抗原。在该人群中，52名患者和24名健康对照包括在内。纳入/排除标准(表5)以及取样和PBMCs分离是相同的。
候选抗原文库
使用的抗原来自皇家理工学院(Royal Institute of Technology)(KTH，Sweden)和瑞典人类蛋白质图谱项目(Swedish Human Protein Atlas project)(Uhlen M,Fagerberg L,Hallstrom BM,Lindskog C,Oksvold P,Mardinoglu A,etal.Proteomics.Tissue-based map of the human proteome.Science.2015；347(6220):1260419)。它们由蛋白质表位特征标签(PrEST)(短重组10-12kDa肽，代表人蛋白质的独特部分)组成。PrEST已在大肠杆菌中产生并经由标签纯化。该项目的PrEST通过以下标准选择：1)根据公布的数据假定参与MS的蛋白质。2)髓鞘片(myelin sheet)的主要结构蛋白质。3)感兴趣的蛋白质，通过与该领域的专家沟通选择。4)高度表达的CNS特异性蛋白质，其先前与疾病无关。在该试验中共使用了来自70种不同蛋白质的125种PrEST。
生产全长抗原
选择从实施例1和2中描述的PrEST筛选中挑选的抗原(FABP7、PROK2、RTN3和SNAP91)用于进一步测试全长形式的蛋白质。通过将编码抗原和组胺标签的质粒转化到大肠杆菌中来产生全长抗原。生长后，裂解细菌，并经由固定化金属亲和层析柱上的6x组氨酸标签纯化从细菌裂解的上清液中纯化蛋白质。随后将抗原与珠子偶联，并如前所述洗涤内毒素。
FluoroSpot T细胞激活测定法
FluoroSpot测定法在细胞培养罩中在无菌条件下进行。将细胞在37℃的水浴中解冻，并用cRPMI(RPMI 1640培养基，Sigma Aldrich，含有10％胎牛血清，1％200mM L-谷氨酰胺，1％10,000U/ml青霉素-10mg/ml链霉素)洗涤。使用光学显微镜(Nikon TMS-F，Nikon，Japan)手动计数细胞，随后在cRPMI中稀释至2,5x106个细胞/ml的浓度。用PBS洗涤FluoroSpot板(人IFNγ/IL-22/IL-17A FluoroSpot试剂盒，预包被，Mabtech，Sweden)，然后在室温下用cRPMI封闭30分钟。然后弃去封闭的cRPMI，并将100μl新鲜cRPMI加入FluoroSpot板的每个孔中。根据具体布局，将抗原(3x10^6个珠子)一式两份加入每个孔中。根据制造商的方案，抗CD3用作阳性对照。未偶联的珠子和没有刺激的培养基两者都用作阴性对照。将100μl cRPMI中的PBMC(250,000个细胞)加入每个孔中(125,000个细胞用于抗CD3)。将板置于培养箱(37℃加湿，5％CO2)中44小时。根据制造商的方案准备斑点的显影。
重叠肽
跨越整个FABP7同种型1和2的连续重叠肽(长度为15个氨基酸，其中10个氨基酸重叠)和PROK2以来自商业供应商的冻干形式购买，随后悬浮在100％二甲基亚砜(DMSO)中至50-100mg/ml的浓度。然后将它们在无菌PBS中进一步稀释至5mg/ml的浓度。将它们汇集为FABP7的6个级分和PROK2的3个级分，每个级分含有5-7种肽。含有的每个库都在全长蛋白质上彼此相邻。根据先前描述的方案，在FluoroSpot测定法中针对这些对来自6个MS患者的细胞进行测试。细胞培养孔中每种肽的最终浓度为5μg/ml。
抗原特异性免疫疗法
将进行临床试验以评估靶向鉴定的自身抗原FABP7、PROK2、RTN3和SNAP91的抗原特异性免疫疗法的安全性、耐受性和功效。首先，如先前在实施例6中所解释的，鉴定来自每种抗原的免疫显性表位。其次，使用实施例7中所述的方法筛选研究参与者(多发性硬化症患者)针对自身抗原的T细胞活性。针对自身抗原具有反应性的患者将有资格纳入试验中。治疗可以由来自每种自身抗原的一种或几种免疫显性肽表位的混合物或仅来自患者在预纳入筛选中起反应的自身抗原的一种或几种免疫显性肽表位的混合物组成。
治疗方案将基于先前公布的成功的抗原特异性免疫疗法方案(Cathaway J,Martin K,Barrell K,Sharrack B,Stolt P,Wraith DC.Effects of ATX-MS-1467immunotherapy over 16 weeks in relapsing multiple sclerosis.Neurology 2018)(Walczak A,Siger M,Szczepanik M,Selmaj K.Transdermal application of myelinpeptides in multiple sclerosis treatment.JAMA Neurol.2013)。在一个备选方案中，治疗将由每周/每两周皮下或皮内注射肽-表位混合物组成，从低剂量开始，然后是剂量递增(up-dosing)期，直至达到所期望的更高剂量。然后在一段有限的时间内每周/每两周进行一段时间的较高剂量的注射。或者，肽-表位将以类似的方案施用，但是以皮肤、舌下或口服的方式。将对安全性和耐受性进行持续评估，同时在完全治疗后评估功效。终点将由功效参数组成，如基于磁共振成像的病变的数量和体积的评估与临床变量(包括扩展残疾状况评分(EDSS))的组合，和首次复发的时间或复发的频率。
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Met Val Glu Ala Phe Cys Ala Thr Trp Lys Leu Thr Asn Ser Gln Asn
1 5 10 15
Phe Asp Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe Ala Thr Arg Gln
20 25 30
Val Gly Asn Val Thr Lys Pro Thr Val Ile Ile Ser Gln Glu Gly Asp
35 40 45
Lys Val Val Ile Arg Thr Leu Ser Thr Phe Lys Asn Thr Glu Ile Ser
50 55 60
Phe Gln Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Thr Thr Ala Asp Asp Arg Asn
65 70 75 80
Cys Lys Ser Val Val Ser Leu Asp Gly Asp Lys Leu Val His Ile Gln
85 90 95
Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Asn Phe Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly
100 105 110
Lys Met Val Met Val Ser Asn Asp Asn Ser Pro Phe Phe Leu Val Phe
115 120 125
Phe Ser Ser Pro His Thr Ser His Leu Leu Pro Ser Ser Ser Leu Leu
130 135 140
Leu Pro Phe Phe Leu Leu Pro Ser Phe Phe Asn Asn Thr Ser Leu Ala
145 150 155 160
Arg Phe Phe Asn Tyr Met
165
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<211> 129
<212> PRT
<213> 人
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Met Arg Ser Leu Cys Cys Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Pro Leu Leu Leu Thr Pro Arg Ala Gly Asp Ala Ala Val Ile Thr Gly
20 25 30
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35 40 45
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Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Asn Asn Phe Gly Asn Gly
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85 90 95
Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly
100 105 110
Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe Ile Cys Leu Ala Gln
115 120 125
Lys
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<212> PRT
<213> 人
<400> 3
Met Ala Glu Pro Ser Ala Ala Thr Gln Ser His Ser Ile Ser Ser Ser
1 5 10 15
Ser Phe Gly Ala Glu Pro Ser Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly
20 25 30
Ala Cys Pro Ala Leu Gly Thr Lys Ser Cys Ser Ser Ser Cys Ala Asp
35 40 45
Ser Phe Val Ser Ser Ser Ser Ser Gln Pro Val Ser Leu Phe Ser Thr
50 55 60
Ser Gln Glu Gly Leu Ser Ser Leu Cys Ser Asp Glu Pro Ser Ser Glu
65 70 75 80
Ile Met Thr Ser Ser Phe Leu Ser Ser Ser Glu Ile His Asn Thr Gly
85 90 95
Leu Thr Ile Leu His Gly Glu Lys Ser His Val Leu Gly Ser Gln Pro
100 105 110
Ile Leu Ala Lys Glu Gly Lys Asp His Leu Asp Leu Leu Asp Met Lys
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Phe Pro Glu His Pro Ala Phe Leu Ser Lys Lys Ile Gly Gln Val
165 170 175
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210 215 220
Thr Tyr Ser Leu Ser Pro Ser Lys Val Ser Gly Asp Asp Val Ile Glu
225 230 235 240
Lys Asp Ser Pro Glu Ser Pro Phe Glu Val Ile Ile Asp Lys Ala Ala
245 250 255
Phe Asp Lys Glu Phe Lys Asp Ser Tyr Lys Glu Ser Thr Asp Asp Phe
260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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485 490 495
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500 505 510
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<213> 人
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Thr Ile Asp Thr Ser Pro Pro Val Asp Leu Phe Ala Thr Ala Ser Ala
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Ala Val Pro Val Ser Thr Ser Lys Pro Ser Ser Asp Leu Leu Asp Leu
340 345 350
Gln Pro Asp Phe Ser Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala
355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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Val Thr Ala Glu Val Asp Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ala Ala Ser Pro
435 440 445
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450 455 460
Thr Pro Val Ala Ala Ala Leu Asp Ala Cys Ser Gly Asn Asp Pro Phe
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr
530 535 540
Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ala Ala Thr Ala Thr Thr Ala Pro Pro Ala
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
Leu Thr Ala Asp Leu Leu Ser Val Asp Ala Phe Ala Ala Pro Ser Pro
610 615 620
Ala Thr Thr Ala Ser Pro Ala Lys Val Asp Ser Ser Gly Val Ile Asp
625 630 635 640
Leu Phe Gly Asp Ala Phe Gly Ser Ser Ala Ser Glu Pro Gln Pro Ala
645 650 655
Ser Gln Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ala Asp Leu Leu Ala Gly
660 665 670
Phe Gly Gly Ser Phe Met Ala Pro Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ala
675 680 685
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Leu Gly Asp Leu Leu Met Pro Thr Met Ala Pro Ala Gly Gln Pro Ala
725 730 735
Pro Val Ser Met Val Pro Pro Ser Pro Ala Met Ala Ala Ser Lys Ala
740 745 750
Leu Gly Ser Asp Leu Asp Ser Ser Leu Ala Ser Leu Val Gly Asn Leu
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145 150 155 160
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Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Thr Pro Arg Ala Gly Asp
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Ser Lys Val Glu Gly Ile Tyr Thr Tyr Ser Leu Ser Pro Ser Lys Val
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Ser Gly Asp Asp Val Ile Glu Lys Asp Ser Pro Glu Ser Pro Phe Glu
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Asn Leu Lys Thr Ser Thr His Gln Lys Thr Pro Val Cys Ser Ile Asp
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Ser Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Pro Pro
1685 1690 1695
Pro Ala Gly Gly Ala Thr Ala Trp Gly Asp Leu Leu Gly Glu Asp
1700 1705 1710
Ser Leu Ala Ala Leu Ser Ser Val Pro Ser Glu Ala Gln Ile Ser
1715 1720 1725
Asp Pro Phe Ala Pro Glu Pro Thr Pro Pro Thr Thr Thr Ala Glu
1730 1735 1740
Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ser Ala Ser Thr Thr Thr Thr Val Thr
1745 1750 1755
Ala Val Thr Ala Glu Val Asp Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ala Ala
1760 1765 1770
Ser Pro Gly Glu Ala Pro Ala Ala Ser Glu Gly Ala Ala Ala Pro
1775 1780 1785
Ala Thr Pro Thr Pro Val Ala Ala Ala Leu Asp Ala Cys Ser Gly
1790 1795 1800
Asn Asp Pro Phe Ala Pro Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ala Ala Pro
1805 1810 1815
Glu Leu Asp Leu Phe Ala Met Lys Pro Pro Glu Thr Ser Val Pro
1820 1825 1830
Val Val Thr Pro Thr Ala Ser Thr Ala Pro Pro Val Pro Ala Thr
1835 1840 1845
Ala Pro Ser Pro Ala Pro Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr
1850 1855 1860
Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ala
1865 1870 1875
Ala Thr Ala Thr Thr Ala Pro Pro Ala Leu Asp Ile Phe Gly Asp
1880 1885 1890
Leu Phe Glu Ser Thr Pro Glu Val Ala Ala Ala Pro Lys Pro Asp
1895 1900 1905
Ala Ala Pro Ser Ile Asp Leu Phe Ser Thr Asp Ala Phe Ser Ser
1910 1915 1920
Pro Pro Gln Gly Ala Ser Pro Val Pro Glu Ser Ser Leu Thr Ala
1925 1930 1935
Asp Leu Leu Ser Val Asp Ala Phe Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr
1940 1945 1950
Thr Ala Ser Pro Ala Lys Val Asp Ser Ser Gly Val Ile Asp Leu
1955 1960 1965
Phe Gly Asp Ala Phe Gly Ser Ser Ala Ser Glu Pro Gln Pro Ala
1970 1975 1980
Ser Gln Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ala Asp Leu Leu Ala
1985 1990 1995
Gly Phe Gly Gly Ser Phe Met Ala Pro Ser Pro Ser Pro Val Thr
2000 2005 2010
Pro Ala Gln Asn Asn Leu Leu Gln Pro Asn Phe Glu Ala Ala Phe
2015 2020 2025
Gly Thr Thr Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Phe Asp Pro Ser
2030 2035 2040
Val Phe Asp Gly Leu Gly Asp Leu Leu Met Pro Thr Met Ala Pro
2045 2050 2055
Ala Gly Gln Pro Ala Pro Val Ser Met Val Pro Pro Ser Pro Ala
2060 2065 2070
Met Ala Ala Ser Lys Ala Leu Gly Ser Asp Leu Asp Ser Ser Leu
2075 2080 2085
Ala Ser Leu Val Gly Asn Leu Gly Ile Ser Gly Thr Thr Thr Lys
2090 2095 2100
Lys Gly Asp Leu Gln Trp Asn Ala Gly Glu Lys Lys Leu Thr Gly
2105 2110 2115
Gly Ala Asn Trp Gln Pro Lys Val Ala Pro Ala Thr Trp Ser Ala
2120 2125 2130
Gly Val Pro Pro Ser Ala Pro Leu Gln Gly Ala Val Pro Pro Thr
2135 2140 2145
Ser Ser Val Pro Pro Val Ala Gly Ala Pro Ser Val Gly Gln Pro
2150 2155 2160
Gly Ala Gly Phe Gly Met Pro Pro Ala Gly Thr Gly Met Pro Met
2165 2170 2175
Met Pro Gln Gln Pro Val Met Phe Ala Gln Pro Met Met Arg Pro
2180 2185 2190
Pro Phe Gly Ala Ala Ala Val Pro Gly Thr Gln Leu Ser Pro Ser
2195 2200 2205
Pro Thr Pro Ala Ser Gln Ser Pro Lys Lys Pro Pro Ala Lys Asp
2210 2215 2220
Pro Leu Ala Asp Leu Asn Ile Lys Asp Phe Leu Thr Leu Thr Phe
2225 2230 2235
Gly Asp Val Val Ala Val Arg His Tyr Glu Lys Ala
2240 2245 2250
<210> 6
<211> 132
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Met Val Glu Ala Phe Cys Ala Thr Trp Lys Leu Thr Asn Ser Gln Asn
1 5 10 15
Phe Asp Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe Ala Thr Arg Gln
20 25 30
Val Gly Asn Val Thr Lys Pro Thr Val Ile Ile Ser Gln Glu Gly Asp
35 40 45
Lys Val Val Ile Arg Thr Leu Ser Thr Phe Lys Asn Thr Glu Ile Ser
50 55 60
Phe Gln Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Thr Thr Ala Asp Asp Arg Asn
65 70 75 80
Cys Lys Ser Val Val Ser Leu Asp Gly Asp Lys Leu Val His Ile Gln
85 90 95
Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Asn Phe Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly
100 105 110
Lys Met Val Met Thr Leu Thr Phe Gly Asp Val Val Ala Val Arg His
115 120 125
Tyr Glu Lys Ala
130

Claims (91)

1.致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位，
所述组合物包括包含n个连续氨基酸残基的序列的治疗性T细胞表位，所述n个连续氨基酸残基的序列：
a.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
b.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2。
2.致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位，
所述组合物包括编码包含n个连续氨基酸残基的序列的治疗性T细胞表位的核酸，所述n个连续氨基酸残基的序列：
a.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
b.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2。
3.致耐受性组合物，其用于治疗多发性硬化症(MS)患者中的MS的方法中，所述MS患者表现出针对内源表位的T细胞自身反应性，所述内源表位对应于包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的特异性T细胞表位，
所述组合物包括离体暴露于包含n个连续氨基酸残基的序列的治疗性T细胞表位的抗原呈递细胞，所述n个连续氨基酸残基的序列：
a.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
b.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2。
4.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，所述治疗方法包括确定患者针对包含在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的T细胞表位的T细胞自身反应性。
5.根据权利要求4使用的组合物，其中所述确定用根据权利要求40-84中任一项的方法进行。
6.根据权利要求1-5中任一项使用的组合物，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1-166中。
7.根据权利要求1-5中任一项使用的组合物，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基167-295中。
8.根据权利要求1-5中任一项使用的组合物，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基296-1327中。
9.根据权利要求1-5中任一项使用的组合物，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1328-2234中。
10.根据权利要求1-5中任一项使用的组合物，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基2235-2250中。
11.根据权利要求1-5中任一项使用的组合物，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1-2234中。
12.根据权利要求1-5中任一项使用的组合物，其中所述亚序列包含在表4中的任一个肽的序列中。
13.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中n是至少11。
14.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中n是至少13。
15.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中n是至少15。
16.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中n是至少17。
17.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中n是至少19。
18.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中n是至少50、至少75，更优选至少100。
19.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中m是2。
20.根据权利要求1-18中任一项使用的组合物，其中m是1。
21.根据权利要求1-18中任一项使用的组合物，其中m是0。
22.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，其中所述T细胞表位与亚序列相差不超过m个残基取代，并且与所述亚序列相比不包含取代或缺失。
23.根据权利要求1或3或其任何从属权利要求使用的组合物，其中所述治疗性T细胞表位是肽或肽模拟物(peptidomimetic)。
24.根据权利要求23使用的组合物，其中所述治疗性T细胞表位是与SEQ ID NO:5的亚序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％序列一致性的肽或肽模拟物。
25.根据权利要求1或其任何从属权利要求使用的组合物，其中所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的治疗性T细胞表位，所述不同的治疗性T细胞表位各自满足权利要求1中所列的标准。
26.根据权利要求2或其任何从属权利要求使用的组合物，其中所述组合物包含编码2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的治疗性T细胞表位的核酸，所述不同的治疗性T细胞表位各自满足权利要求2中所列的标准。
27.根据权利要求3或其任何从属权利要求使用的组合物，其中所述抗原呈递细胞已暴露于2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的治疗性T细胞表位，所述不同的治疗性T细胞表位各自满足权利要求3中所列的标准。
28.根据权利要求25-27中任一项使用的组合物，其中所述不同的治疗性T细胞表位选自权利要求6-11中所述的序列区间的一个、两个、三个、四个、五个或六个。
29.根据权利要求1或其任何从属权利要求使用的组合物，其中组合物包含与固体载体偶联的治疗性T细胞表位，所述固体载体例如生物相容性聚合物、颗粒或细胞。
30.根据权利要求1或其任何从属权利要求使用的组合物，所述组合物包含能够与所述内源表位特异性结合相同T细胞受体的治疗性T细胞表位。
31.根据权利要求2或其任何从属权利要求使用的组合物，所述组合物包含编码治疗性T细胞表位的核酸，所述治疗性T细胞表位能够与所述内源性T细胞表位特异性结合相同的T细胞受体。
32.根据权利要求3或其任何从属权利要求使用的组合物，所述组合物包含暴露于治疗性T细胞表位的抗原呈递细胞，所述治疗性T细胞表位能够与所述内源性T细胞表位特异性结合相同的T细胞受体。
33.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，所述方法包括选择所述治疗性T细胞表位，使得其对应于所述患者表现出T细胞自身反应性所针对的表位。
34.根据权利要求33使用的组合物，其中选择所述治疗性T细胞表位基于其能够与所述内源性表位特异性结合相同的T细胞受体(TCR)。
35.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，所述治疗方法包括以致耐受性方式将所述组合物施用于所述受试者，从而诱导所述患者中针对所述T细胞表位的T细胞耐受性。
36.根据前述权利要求中任一项使用的组合物，所述治疗方法包括口服、粘膜、皮内、透皮或皮下施用所述组合物。
37.根据权利要求1或2或其任何从属权利要求使用的组合物，所述治疗方法包括将所述组合物体外施用于抗原呈递细胞，然后将所述抗原呈递细胞施用于所述患者。
38.根据权利要求2或其任何从属权利要求使用的组合物，其中所述核酸包括在载体中，可操作地与允许在抗原呈递细胞中表达的启动子偶联。
39.根据权利要求3或其任何从属权利要求使用的组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞(优选衍生自PBMC)或小胶质细胞。
40.用于确定测试受试者中多发性硬化症(MS)相关自身免疫的程度的方法，其包括：
a.提供包含活T细胞的源自所述测试受试者的测试样品；
b.体外定量响应于包含T细胞表位的测试抗原的所述测试样品的T细胞的抗原特异性激活，其中所述T细胞表位包含n个连续残基的氨基酸序列，所述n个连续残基的氨基酸序列：
i.与SEQ ID NO:5的亚序列相同；或
ii.与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入；
其中n是至少8，并且m是0、1或2；和
c.将所述定量的抗原特异性激活与相关参照进行比较，以确定所述测试受试者中MS相关自身免疫的程度。
41.根据权利要求40的方法，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1-166中。
42.根据权利要求40的方法，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基167-295中。
43.根据权利要求40的方法，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基296-1327中。
44.根据权利要求40的方法，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1328-2234中。
45.根据权利要求40的方法，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基2235-2250中。
46.根据权利要求40的方法，其中所述亚序列包含在SEQ ID NO:5的残基1-2234中。
47.根据权利要求40的方法，其中所述亚序列包含在表4中的任一个肽的序列中。
48.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中针对2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的T细胞表位定量抗原特异性激活，所述不同的T细胞表位各自满足权利要求40中所述的标准。
49.根据权利要求48的方法，其中所述不同的T细胞表位选自权利要求41-47中所述的序列区间的一个、两个、三个、四个、五个或六个。
50.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中针对至少两种、三种或四种测试抗原定量抗原特异性激活，所述至少两种、三种或四种测试抗原各自包含对应于选自下组的不同的MS抗原的特异性T细胞表位：FABP7(SEQ ID NO:1)、PROK2(SEQ ID NO:2)、RTN3(SEQ IDNO:3)和SNAP91(SEQ ID NO:4)。
51.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中n是至少11。
52.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中n是至少13。
53.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中n是至少15。
54.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中n是至少17。
55.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中n是至少19。
56.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中n是至少50、至少75，更优选至少100。
57.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中m是2。
58.根据权利要求40-56中任一项的方法，其中m是1。
59.根据权利要求40-56中任一项的方法，其中m是0。
60.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述T细胞表位与所述选择的MS抗原的亚序列相差不超过m个残基取代，并且与所述亚序列相比不包含取代或缺失。
61.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述包含特异性T细胞表位的抗原是与SEQ ID NO:1-4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的任一个具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％序列一致性的肽或肽模拟物。
62.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述受试者是诊断为MS的患者。
63.根据权利要求40-61中任一项的方法，其中所述受试者是怀疑患有MS的个体。
64.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述测试样品源自血液样品。
65.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中测试样品是PBMC样品。
66.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述测试样品进一步包含抗原呈递细胞。
67.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述方法进一步包括：
a.提供活的抗原呈递细胞；
b.使所述测试抗原与所述抗原呈递细胞接触；
c.在允许响应于通过抗原呈递细胞呈递的抗原对T细胞进行抗原特异性激活的条件下，使所述测试样品体外接触与所述测试抗原接触的所述抗原呈递细胞；和
d.定量所述测试样品中的抗原特异性T细胞激活。
68.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述方法包括提供与可吞噬(phagocytable)颗粒紧密缔合的所述测试抗原。
69.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中定量所述测试样品中的所述抗原特异性T细胞激活包括通过测量IFN-γ的分泌来确定T细胞应答。
70.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中定量所述测试样品中的所述抗原特异性T细胞激活包括通过测量IL-17的分泌来确定T细胞应答。
71.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中定量所述测试样品中的所述抗原特异性T细胞激活包括通过测量IL-22的分泌来确定T细胞应答。
72.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中抗原特异性T细胞激活的定量包括以下步骤：
a.提供具有与其紧密缔合的所述测试抗原的可吞噬颗粒，其中具有缔合的测试抗原的所述颗粒已经受变性洗涤，导致内毒素水平低到足以不干扰后续步骤；
b.提供活的抗原呈递细胞；
c.在允许所述抗原呈递细胞对所述颗粒的吞噬作用的条件下使所述经洗涤的颗粒与所述抗原呈递细胞接触；
d.提供包含活T细胞的待测定的所述测试样品；
e.在允许响应于通过抗原呈递细胞呈递的抗原对T细胞进行抗原特异性激活的条件下，使所述测试样品体外接触与所述颗粒接触的所述抗原呈递细胞；和
f.定量所述测试样品中的抗原特异性T细胞激活。
73.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中所述参照是来自没有病理性MS相关自身免疫的参照受试者的参照样品中的同等定量的抗原特异性激活。
74.根据权利要求40-72中任一项的方法，其中所述参照是来自一组没有病理性MS相关自身免疫的参照受试者的一组参照样品中的同等定量的抗原特异性激活的平均值。
75.根据权利要求74的方法，其中所述组包含至少10个参照受试者。
76.根据权利要求40-72中任一项的方法，其中所述参照是在不同时间点取得的来自相同受试者的样品中的同等定量的抗原特异性激活。
77.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中如果与所述参照相比所述测试样品中所述定量的抗原特异性激活高至少2倍，优选3倍，更优选5倍，最优选10倍，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
78.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中如果所述测试样品中所述定量的抗原特异性激活比来自一组没有病理性MS相关自身免疫的参照受试者的一组同等定量的参照样品的平均值高2倍的所述参照样品组的标准偏差，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
79.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中如果所述测试样品中所述定量的抗原特异性激活在用Student’s T检验计算的p值小于0.05的情况下统计学上显著高于所述参照，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
80.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中如果所述测试样品中所述定量的抗原特异性激活在用曼-惠特尼U检验计算的p值小于0.05的情况下统计学上显著高于所述参照，则得出MS相关自身免疫的程度增加的结论。
81.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中：
a.所述方法用于诊断所述受试者中的MS；
b.所述参照代表没有病理性多发性硬化症相关自身免疫的参照受试者中的同等定量的抗原特异性激活；和
c.与所述参照相比，所述测试样品中更高程度的定量的抗原特异性激活指示所述测试受试者中的多发性硬化症。
82.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中：
a.所述方法用于跟踪所述受试者中MS的病程；
b.所述参照代表来自相同受试者的在不同时间点取得的样品中的同等定量的抗原特异性激活；和
c.与所述参照相比，所述测试样品中更高程度的定量的抗原特异性激活指示所述测试受试者中更高的多发性硬化症疾病活性，并且反之亦然。
83.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中：
a.所述方法用于在所述受试者中进行MS病程的预后；
b.所述参照代表来自相同受试者的在不同时间点取得的样品中的同等定量的抗原特异性激活；和
c.与所述参照相比，所述测试样品中更高程度的定量的抗原特异性激活指示所述测试受试者中增加的多发性硬化症疾病活性，并且反之亦然。
84.根据前述方法权利要求中任一项的方法，其中：
a.所述方法用于评估所述受试者对治疗性处理的反应；
b.所述参照代表在施用待评估的所述治疗性处理之前取自相同受试者的样品中的同等定量的抗原特异性激活；
c.所述测试样品来自所述治疗性处理开始后的相同的受试者；和
d.与所述参照相比，所述测试样品中更低程度的定量的抗原特异性激活指示所述测试受试者中针对多发性硬化症疾病活性的治疗功效，并且未改变的或更高程度的定量的抗原特异性激活指示所述测试受试者中缺乏针对多发性硬化症疾病活性的治疗功效。
85.肽或肽模拟物在诊断或治疗MS中的用途，其中所述肽或肽模拟物包含对应于MS抗原的特异性T细胞表位，所述T细胞表位包含与SEQ ID NO:5的亚序列相差不超过m个残基取代、缺失和/或插入的n个连续残基的氨基酸序列，其中m是0、1或2。
86.根据权利要求85的用途，其中所述亚序列选自SEQ ID NO:5的残基1-166、SEQ IDNO:5的残基167-295、SEQ ID NO:5的残基296-1327、SEQ ID NO:5的残基1328-2234、SEQ IDNO:5的残基2235-2250或SEQ ID NO:5的残基1-2234。
87.根据权利要求85或86的用途，其中n是至少11。
88.根据权利要求85或86的用途，其中n是至少15。
89.根据权利要求85或86的用途，其中n是至少19。
90.根据权利要求85-89中任一项的用途，其中m是1。
91.根据权利要求85-89中任一项的用途，其中m是0。
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