KR20190132448A - 다발성 경화증 연관된 자가항원 및 치료 및 진단에서의 이의 용도 - Google Patents

다발성 경화증 연관된 자가항원 및 치료 및 진단에서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본원에는, 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS 치료 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물로서, 조성물은 서열 번호: 5의 하위서열과 0-2개의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한 8개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 치료적 T-세포 에피토프를 포함하거나, 조성물은 상기 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 기재된다. 본원에는, 시험 피험체에서 다발성 경화증(MS) 관련된 자가면역의 정도를 결정하는 방법으로서, 생존가능 T-세포를 포함하는 시험 대상체로부터 유래되는 시험 샘플을 제공하는 단계; T-세포 에피토프를 포함하는 시험 항원에 반응하여 시험관내에서 시험 샘플의 T-세포의 항원 특이적 활성화를 정량화하는 단계로서, 상기 T-세포 에피토프는 상기 치료적 T-세포 에피토프와 같은 것인 단계; 및 정량화된 항원 특이적 활성화를 관련 참조와 비교하여 시험 피험체에서 MS 관련된 자가면역의 정도를 결정하는 단계를 포함하는 방법이 기재된다.

Description

다발성 경화증 연관된 자가항원 및 치료 및 진단에서의 이의 용도
본 발명은 다발성 경화증의 치료 및 진단에 관한 것이다.
다발성 경화증
다발성 경화증(MS, ICD 10 코드 G35)은 중추 신경계(CNS)의 면역 매개된 만성 질환이다. 현재 패러다임은 이것이 탈수초화 및 축삭 파괴를 초래하는 자가면역 염증 질환임을 제안한다. 주로 20세 내지 40세의 젊은 성인들이 걸리고 전세계적으로 총 250만명의 사람들이 걸린 MS는 선진국의 젊은이들의 주요 장애 원인 중 하나이며, 보살핌이 필요하여 사회 비용이 많이 들 뿐만 아니라 인구의 상당한 이환율에도 책임이 있다.
MS는 아마도 항원 제시 세포(APC)에 의해 활성화되는 자가반응성 T-세포를 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 CNS 내로 침윤시키는 것으로 특징화된다. 후속적으로, 이들 자가반응성 T-세포는 MS의 전형적인 특질인 신경염증, 탈수초화 및 축삭 파괴; 특징적인 조직병리적 홀마크인 플라크의 생성을 야기한다. 국소 파괴는 운동, 감각, 시각 및 자율신경 시스템을 수반하는 다양한 병리적 임상 증상으로 이어진다. 염증은 일반적으로 일시적이며 일부 재수초화가 염증 에피소드 사이에서 발생하여 증가된 신경계 기능이상의 뚜렷한 공격(재발로 불림)에 이어 부분 회복 에피소드가 초래된다. 그러나, 시간이 지남에 따라 회복이 부족해지고 지속적인 증상이 누적된다.
MS에서 T-세포 및 자가항원
CD4 + T-세포 및 MS
CD4+ T-세포의 주요 생리학적 역할은 MHC 부류 II 분자를 통해 APC에 의해 제시되는 외래 항원을 인식하고 이어서 활성화되고 시토카인을 방출하여 면역 반응을 조절하는 것이다. 각각의 CD4+ T-세포 클론은 하나의 특정 항원에 민감한 특정한 세포 표면 발현된 T-세포 수용체(TCR)를 갖는다. 종종 T 헬퍼 세포로 지칭되는 CD4+ T-세포는 기능 및 이들이 생산하는 시토카인에 기반하여 하위세트로 더 나눠질 수 있다. 간단히 말해서, 타입 1 헬퍼(Th1) T-세포의 주요 기능은 세포내 병원체에 대한 면역 반응, 기생충 감염 및 세포외 병원체에 대한 Th2-세포 및 곰팡이 및 세균 감염에 대한 Th17을 조정하는 것이다.
적응 면역 반응의 일부로서, CD4+ T-세포 및 이의 TCR의 효용은 외래 병원체에 대해 특이적이어야 한다. 그러나, 수용체는 코딩 유전자의 무작위 재배열에 의해 생성되기 때문에, 자가 구조에 대해 특이적인 TCR을 갖는 T-세포가 발생하여 자가반응성을 야기할 수 있다. 자가반응성 T-세포는 건강한 개체에서는 부정적으로 선택되고 제거되지만, 중심 및 말초 관용의 결함은 지속적인 자가반응성 T-세포를 야기할 수 있다. 이러한 CD4+ T-세포는 MS의 발병기전에서 중심적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. MHC 부류 II를 코딩하는 특정 유전자가 질환과 강력하게 연결되어 있다는 사실 및 MS 병변에서 다수의 CD4+ T-세포의 검출은 APC에 의한 항원 제시 및 후속 CD4+ T-세포 활성화가 질환에서 필수적인 역할을 한다는 것을 제시한다. 유사하게, CD8+ T-세포가 또한 MS 병변에 존재하며, 질환 병리생리학에서 이들의 정확한 역할은 불분명하지만, 이들도 역할을 수행할 가능성이 있다. MS를 모방하는 널리 사용되는 마우스 모델의 실험적 자가면역 뇌염(EAE)은 미엘린 유래된 펩티드로 마우스의 면역화를 통해 유도되며, 또한 자가반응성이 MS에서 일부 역할을 한다는 것을 나타낸다. 기관 특이적 자가면역 질환, 예컨대 MS는 일반적으로 Th1 매개인 것으로 여겨져 왔지만, 최근 연구에 따르면 Th17 세포가 유사하게 자가면역 반응을 유발할 수 있는 것으로 나타났다.
T-세포 및 APC는 모두 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로 명명된 세포 분획에 존재한다. PBMC는 T-세포, B-세포, 자연 살해 세포, 단핵구 및 수지상 세포를 함유하는 말초 혈액으로부터 유래되는 이질적 세포 그룹이다.
T-세포의 시토카인
APC에 의한 활성화 시, CD4+ T-세포의 상이한 하위세트는 매우 다양한 상이한 시토카인을 생성한다. 그들의 기능은 다른 세포의 증식 및 성숙을 유도하거나 염증의 전반적인 강도와 지속 시간을 조절하는 것이다.
인터페론 감마(IFNγ)는 Th1 세포에 의해 고도로 발현되고 이의 주요 생성물로서 작용하는 다능성 전염증성 시토카인이다. IFNγ는 다른 세포의 세포독성 활성을 촉진하고, 대식구를 활성화시키고, MHC 부류 I 및 II의 발현을 조절하고, 나이브 T-세포의 추가 Th1 세포 분화에 기여한다. 특정 상황 하에서 APC가 항원 특이적 CD4+ T-세포를 활성화시키는 경우, 많은 양의 IFNγ가 방출되어 T-세포를 Th1 분화로 유도한다. 인터루킨 17A(IL-17A)는 CD4+ T-세포 하위그룹 Th17의 주요 시토카인이며, 다른 세포의 전염증성 시토카인, 케모카인 및 메탈로프로테아제의 생성 및 분비를 상향 조절한다. IL-17A는 MS에 관여되는 것으로 밝혀졌으며, EAE의 마우스 모델 및 다른 자가면역 질환, 예컨대 RA, 건선 및 염증성 장 질환을 갖는 환자에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 인터루킨 22(IL-22)는 활성화된 T-세포에서 발견되며, 주로 메모리 CD4+ T-세포, Th17 세포 및 최근에 특성화된 Th22 세포에 의해 발현된다. 이는 IL-17A와 함께 BBB-붕괴 및 CNS 염증을 촉진시키는 것으로 밝혀졌으며, MS의 발병기전에서 중요한 시토카인인 것으로 여겨진다.
MS에서의 자가항원
CD4+ T-세포가 활성화되기 위해서는 APC에 의해 제시된 이의 특정 항원을 인식해야 한다. 자가반응성 T-세포의 경우, 항원은 자가 단백질, 소위 자가항원이다. MS에서 여러 상이한 자가항원이 제안되고 연구되었다(Elong Ngono A, Pettre S, Salou M, Bahbouhi B, Soulillou JP, Brouard S, et al. Frequency of circulating autoreactive T cells committed to myelin determinants in relapsing-remitting multiple sclerosis patients. Clin Immunol. 2012;144(2):117-26.). 가장 많이 연구된 항원은 미엘린-, 별아교세포- 및 뉴우런-유래된 항원이지만 다른 것들에 대한 제안이 있었다(Riedhammer C, Weissert R. Antigen Presentation, Autoantigens, and Immune Regulation in Multiple Sclerosis and Other Autoimmune Diseases. Front Immunol. 2015;6:322). 연구된 후보 자가항원에는 미엘린 염기성 단백질(MBP), 미엘린 올리고희소돌기아교세포 당단백질(MOG), 프로테오리피드 단백질(PLP), 미엘린 회합된 당단백질(MAG), 미엘린 희소돌기아교세포 염기성 단백질(MOBP), CNPase, S100β 및 트랜스알돌라제가 있으며, MBP가 가장 철저하게 조사되었다. 이들 후보의 경우, 일부 인간 연구 및 동물 모델에서 T-세포 자가반응성 또는 자가 항체가 발견되었다. 그러나, 결과는 결정적이지 않으며 데이터는 일관성이 결여된다. 증거를 찾는 데 어려움이 있음에도 불구하고, 자가 항원 및 이들의 CD4+ T-세포의 활성화는 여전히 MS의 발병기전에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 여겨진다(Hohlfeld R, Dornmair K, Meinl E, Wekerle H. The search for the target antigens of multiple sclerosis, part 1: autoreactive CD4+ T lymphocytes as pathogenic effectors and therapeutic targets. Lancet Neurol. 2015).
T-세포 에피토프
항원에 특이적인 T-세포는 항원의 전체 아미노산(aa) 서열을 인식하지 않고 항원의 어딘가에 함유된 훨씬 더 짧은 특정 T-세포 에피토프를 인식한다. 에피토프는 전형적으로 MHC 부류 I 분자에서 제시되는 경우 8-11개 aa 길이이고 MCH 부류 II 분자에서 제시되지 경우 13-17개 aa 길이이다. APC가 항원을 내재화하는 경우, 이는 더 짧은 펩티드 단편으로 분해되고 이어서 APC 표면 상의 MHC 분자를 통해 T-세포에 제시된다. 항원의 이들 분해된 단편이 잠재적인 특정 T-세포 에피토프이다.
항원 특이적 면역요법
항원 특이적 면역요법은 잠재적으로 효과적인 미래의 MS 치료로 여겨진다. 치료의 목표는 자가항원 특이적 질환 유도 T-세포의 고갈 또는 유리한 면역 반응(조절)의 유도에 의한 면역 관용을 유도하는 것이다. 이를 달성하기 위한 주요 방법에는, 자가항원, 예컨대 면역우세 펩티드 에피토프를 관용원성 방식으로 경구, 피부 또는 피하 주사 경로를 통해 적용하거나 조절 반응을 유도하기 위해 항원 특이적 T-세포 또는 이들의 수용체를 백신으로 사용하는 방법이 있다. 상이한 접근법에 대한 공통 주제는 사용되는 항원 표적이다. 이러한 치료 전략은 T-세포 관용이 다양한 접근법을 통해 유도될 수 있다는 것이 잘 확립되어 있다는 일반적인 관점에서 성공적이었다. MS의 마우스 모델, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서는 고무적인 결과가 보고되었지만, 지금까지 인간 시험에서는 성공이 제한되어 결과가 없거나 그다지 대단하지 않은 결과가 초래되었다. 이에 대한 주된 이유 중 하나는 EAE와 달리 MS의 표적 자가항원이 아직 완전히 알려지지 않았고 최적의 표적 또는 충분한 표적이 사용되지 않았기 때문이다. "항원 특이적 요법을 발견하고 개발하는 데 있어 주요 장애물 중 하나는 물론 다발성 경화증의 표적 항원에 대한 우리의 무지이다"((Hohlfeld R, Dornmair K, Meinl E, Wekerle H. The search for the target antigens of multiple sclerosis, part 1: autoreactive CD4+ T lymphocytes as pathogenic effectors and therapeutic targets. Lancet Neurol. 2015).
지식의 격차
요약하면, APC에 의한 CD4+ T-세포의 활성화 및 이들이 인식하는 자가항원은 MS의 발병기전에서 중요한 역할을하는 것으로 여겨진다. MHC 부류 II와 MS 사이의 연관성, T-세포를 표적하는 면역조정 요법(예: 나탈리주맙)의 효과, MS 병변에서 CD4+ T-세포의 발견 및 초기 연구에서 일부 자가반응성 T-세포의 발견은 모두 이 가설을 강화시킨다. 그러나, 어떤 자가항원이 자가반응성 T-세포를 촉발하고 염증을 유발하는지는 비록 여러 연구가 수행되었지만 미지로 남아 있다. 항원 특이적 면역요법의 전망을 고려할 때 자가항원의 식별이 점점 중요해지고 있다. 그러나, 지금까지의 발견은 결정적이지 않으며, MS 발병기전에 관여되는 추가 항원을 식별할 필요가 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 대상체에서 다발성 경화증 관련된 자가면역을 결정하기 위한 개선된 또는 대안적인 수단 및 방법 및 MS의 치료에 사용하기 위한 개선된 수단, 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
정의
퍼센트로 표현된 서열 동일성은 비교창에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값으로 정의되며, 비교창에서 서열의 일부는 두 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센트는 두 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교창에서의 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 산출함으로써 계산된다. 달리 지시되지 않는 한, 비교창은 참조되는 서열의 전체 길이이다. 이와 관련하여, 최적의 정렬은 미국 국립 생명공학 정보 센터(The NCBI Handbook [Internet], Chapter 16 참조)에서 하기의 입력 파라미터를 사용하여 온라인으로 구현한 BLASTP 알고리즘에 의해 생성된 정렬이다: Word length=3, Matrix=BLOSUM62, GaPcost=11, GaPextension cost=1.
본 발명의 맥락에서 용어 항원은 특정 T-세포 에피토프를 함유하는 분자(전형적으로 폴리펩티드)를 지칭한다.
용어 특정 T-세포 에피토프는 T-세포에 의해 인식되는 항원의 일부로 정의된다. 전형적으로, 특정 T-세포 에피토프는 MHC 부류 I 분자에서 제시되는 경우 8-11개 aa 길이이고 MCH 부류 II 분자에서 제시되는 경우 13-17개 aa 길이의 아미노산 서열이다.
용어 MS 항원은 다발성 경화증(MS)의 병리와 관련된 항원을 지칭한다.
내독소, 예컨대 리포폴리사카라이드(LPS)는 그람 음성 세균, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 외부 세포벽에서 발견되는 공유적으로 연결된 지질 및 폴리사카라이드 하위유닛을 포함한다.
CD4 + T-세포 또는 T-헬퍼 세포는 시토카인 분비를 통해 면역 반응을 조정하는 세포이다. 이들은 B 세포의 항체 클래스 스위칭, 세포 독성 T 세포의 확장 또는 식세포를 강화시키는 것과 같은 다른 면역 세포를 억제 또는 강화시킬 수 있다. 이들은 APC상의 MHC 부류 II를 통한 항원 제시에 의해 활성화되고, 특정 항원 내의 약 13-17개 아미노산(소위 T-세포 에피토프)의 스트레치에 특이적인 T-세포 수용체(TCR)를 발현한다.
CD8 + T-세포 또는 세포독성 T-세포는 종양 세포, 감염된 세포 또는 달리 손상된 세포를 사멸시키는 세포이다. CD4+ T-세포와 달리, 이들은 활성화를 위해 특수한 APC를 필요로 하지 않는다. 이들의 T-세포 수용체는 모든 유핵 세포에서 발현되는 단백질인 MHC 부류 I에 의해 제시되는 항원 유래된 펩티드(약 8-11개 아미노산 길이)를 인식한다.
항원 특이적 T-세포 활성화는 공동 자극과 함께 TCR과 MHC(HLA) 분자 상에 제시된 정의된 펩티드 사이에 상호 작용을 필요로 하는 과정이다.
항원 제시 세포(APC)는 전형적으로 세포외 유기체 또는 단백질, 즉 항원을 포식하거나 내재화하고 프로세싱 후 MHC 부류 II 상의 항원 유래된 펩티드를 CD4+ T-세포에 제시하는 세포인, 수지상 세포(DC), B-세포 또는 대식구이다. 혈액에서, 단핵구는 가장 풍부한 항원 제시 세포이다.
포식가능 입자는 면역계의 세포, 특히 단핵구에 의해 포식될 수 있는 입자로 정의된다.
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 전혈의 밀도 구배 원심 분리에 의해 제조된 인간 혈액의 분획이다. PBMC 분획은 주로 림프구(70-90%) 및 단핵구(10-30%)로 이루어지며, 적혈구, 과립구 및 혈장은 제거되었다.
단백질 에피토프 시그니처 태그(PrEST)는 인간 단백질의 독특한 부분을 나타내는 짧은 재조합 10-12 kDa 펩티드이다(Lindskog M, Rockberg J, Uhlen M, Sterky F. Selection of protein epitopes for antibody production. Biotechniques. 2005;38(5):723-7).
본 출원의 맥락에서 용어 펩티도미메틱(peptidomimetic)은 펩티드를 구조적으로 모방하도록 디자인되었지만 일부 측면에서 상이하거나 개선된 특성을 갖는 펩티드-유사 중합체 쇄로 정의된다.
본 맥락에서 용어 치료는 치유 뿐만 아니라 경미한 완화, 실질적인 완화, 주요 완화를 포함하는 임의의 정도의 완화를 포함하여 치료될 병태를 앓고 있는 대상체 또는 환자에게 유리한 효과를 초래하는 처치를 지칭한다. 바람직하게는, 완화 정도는 적어도 경미한 완화이다. MS는 발작적 재발 특성을 갖는 질환이므로, 본 맥락에서의 치료는 또한 재발의 예방 또는 재발의 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다.
본 맥락에서 용어 예방은 전체 예방 뿐만 아니라 병태의 발병 또는 재발병의 가능성의 경미한, 실질적인 또는 큰 감소를 포함하여 예방될 병태 또는 재발생 또는 재발하는 병태의 발병 가능성의 임의의 정도의 감소를 초래하는 예방적 조치를 지칭한다. 바람직하게는, 가능성 감소의 정도는 적어도 경미한 감소이다.
도 1. 125개의 단백질 라이브러리에 대한 다발성 경화증 환자의 자가항원 스크리닝. 1-2개의 구별되는 인간 단백질로부터의 PrEST를 함유하는 항원의 풀로 자극 시, MS 환자의 PBMC로부터의 T-세포 활성화와 건강 대조군으로부터의 PBMC의 T-세포 활성화의 비교. 패널 A, IFNγ-플루오로스폿(FluoroSpot)에 의한 활성화 결정. 패널 B, IL17-플루오로스폿에 의한 활성화 결정. 패널 C, IL22-플루오로스폿에 의한 활성화 결정. 환자의 T-세포는 라이브러리의 특정 단백질에 상당히 더 많이 반응한다. 개방 사각형 및 채워진 원은 각각 환자 및 대조군의 PBMC의 평균 활성화를 나타내며 스테이플은 평균 CI95%를 나타낸다. P 값은 이원 분산 분석(two-way ANOVA)을 이용하여 결정되었다. 별표는 P 값을 나타낸다.
도 2. MS에서 의심되는 자가항원으로 자극 시, 다발성 경화증(MS) 환자 및 건강 대조군에서의 T-세포 활성화를 비교하는 IFNγ/IL-22/IL-17 플루오로스폿 검정. 본 출원에 포함된 각각의 새로운 MS 마커를 나타내는, 도 1에서와 동일한 데이터에 기반한 결과. 16명의 환자 및 9명의 대조군이 포함되었다. 패널 A, FABP7(서열 번호: 1 및 6) 및 CYB561D2를 함유하는 항원 풀 18로 자극되는 경우의 활성화. 패널 B, PROK2(서열 번호: 2) 및 NOVA2를 함유하는 항원 풀 23으로 자극되는 경우의 활성화. 패널 C, RTN3(서열 번호: 3) 및 SDK2를 함유하는 항원 풀 26으로 자극되는 경우의 활성화. 패널 D, SNAP91(서열 번호: 4) 및 SNAP25를 함유하는 항원 풀 29로 자극되는 경우의 활성화. P 값은 만-휘트니(Mann-Whitney) U 시험으로 결정되고 발견되면 작성되었다. 스테이플은 평균 CI95%를 나타낸다.
도 3. 항원 스크리닝으로부터의 항원 풀의 분할. 환자와 대조군 사이에 유의한 활성화 차이가 검출된 스크리닝 실험으로부터의 항원 풀을 추가로 분할하였다. 이들 풀 각각은 도면에서 #1 및 #2로 명명된 2개의 상이한 인간 단백질로부터의 PrEST를 함유하였다. 스크리닝에서 높은 정도의 활성화로 반응한 4명의 환자를 IFNγ/IL-22/IL-17 플루오로스폿에서 개별 항원으로 다시 시험하였다. 모든 시험은 3중으로 수행되었다. P 값은 각각의 웰에서 활성화된 세포의 수를 비교하는 스튜던츠 T-시험으로 결정되었다(항원당 n = 12). 스테이플은 SD를 나타낸다. 양성 항원은 18#2 - FABP7. 23#2 - PROK2. 26#1 - RTN3. 29#2 - SNAP91이었다.
도 4. 환자들 사이의 반응성 프로파일. 환자들 사이에서 관측된 활성화 패턴. 각각의 라인은 한 환자의 데이터 점을 연결한다. 프로파일 1a, 1b 및 3의 경우 점선은 대조군 평균 + 2SD를 나타낸다. 프로파일 2의 경우, 점선은 3명의 환자 평균 IL-22 프로파일을 나타낸다. 단지 3명의 환자만이 항원 26(RTN3)에 대해 IFNγ 생성 세포의 활성화로만 유의하게 반응하여, 항원 26에 관한 이전 도면으로부터의 결과는 이들 특정 환자를 나타내기에 최적이 아니었다. 그러나, 도면은 본원에서 프로파일 2로 명명된 이 항원에 반응하는 구별되는 그룹의 환자를 명확하게 나타낸다. 건강 대조군에서는 이와 같은 패턴이 확인되지 않았다.
도 5. 진단 마커로 사용 시, 개별 항원의 민감도 및 특이도에 대한 ROC 곡선. 개별적으로, FABP7(풀 18로부터 유래)은 질환에 대한 마커로서 역할을 할 가능성이 가장 높았으며 각각 75% 및 85%의 민감도 및 특이도에 도달하였다. A-D는 단리에 사용된 각각의 항원에 대한 ROC 곡선을 나타낸다. 도 5e의 경우, PROK2 또는 SNAP91에 대한 활성화된 세포의 수를 사용하였으며, 어느 쪽이든 각각의 특정 개체 대해 더 높았다(환자 및 대조군에 대해 동일). 가장 높은 반응만을 선택하고 분석하는 이 방법은 이들을 개별적으로 분석하는 것보다 훨씬 나은 ROC 곡선을 산출하였다. (PROK2 및 SNAP91의) 평균을 사용하면 유사한 개선된 ROC 곡선을 초래하나 가장 높은 것만을 사용하는 것과 같이 좋지는 않았다. 도 5f는 전체 길이 재조합 버전의 항원 18, FABP7 이소형 2(서열 번호: 1)를 기반으로 한다.
도 6. 전체 길이 재조합 FABP7 이소형 2로 자극 시, 다발성 경화증(MS) 환자 및 건강 대조군에서의 T-세포 활성화를 비교하는 IFNγ/IL-22/IL-17 플루오로스폿 검정. 13명의 환자(이 중 7명은 이전에 포함된 환자의 최초 샘플링 후 1년에 새로운 샘플링으로 구성되었으며 6명은 이전에 시험되지 않음, 채워지지 않은 사각형) 및 7명의 대조군(이전 시험에 포함되지 않음)을 FABP7 이소형 2 단백질(서열 번호: 1)의 인-하우스 생성 재조합 버젼으로 추가로 시험하였다. P 값은 만-휘트니 검정을 이용하여 계산되었다. 스테이플은 평균 및 CI95%를 나타낸다.
도 7. 자가항원으로부터의 중복 펩티드로 환자 세포를 자극하는 IFNγ/IL-22/IL-17 플루오로스폿 검정. FABP7 이소형 2 및 PROK2의 전체에 걸친 중복 펩티드(15개 aa 길이, 10개 aa 중복)를 각각 5-7개 펩티드를 함유하는 풀로 모았다. 6명의 MS 환자로부터의 세포를 플루오로스폿 검정으로 이들에 대해 시험하였다. 패널 A, FABP7(서열 번호: 1)로부터의 중복 펩티드의 6개의 상이한 풀로 자극되는 경우의 활성화. 패널 B, PROK2(서열 번호: 2)로부터의 중복 펩티드의 3개의 상이한 풀로 자극되는 경우의 활성화. 상세한 펩티드 정보는 표 4에서 이용 가능함. 스테이플은 CI95%를 나타낸다. 그래프에서 활성화된 T-세포의 음수는 평균 반응이 음성 대조군보다 낮기 때문이다.
도 8. 전체 길이 재조합 항원(FABP7, PROK2, RTN3, SNAP91)으로 자극 시, 다발성 경화증(MS) 환자 및 건강 대조군에서의 T-세포 활성화를 비교하는 IFNγ/IL-22/IL-17 플루오로스폿 검정. 52명의 다발성 경화증 환자 및 24명의 건강 대조군을 플루오로스폿 검정으로 자가항원의 재조합 전체 길이 버전에 대한 T-세포 활성화에 대해 시험하였다. A: FABP7 이소형 2(서열 번호: 1). B: PROK2(서열 번호: 2). C: RTN3 서열 번호: 3. D: SNAP91 서열 번호: 4. P 값은 만-휘트니 시험을 이용하여 계산되었다. 스테이플은 평균 및 CI95%를 나타낸다.
도 9. 진단 마커로 사용 시 전체 길이 항원의 민감도 및 특이도에 대한 ROC 곡선. 개별적으로, 4개의 항원은 질환에 대한 진단 마커와 유사하게 작용하며, 모두 95%의 특이도로 ~50%의 민감도에 도달한다. A: FABP7 이소형 2. B: PROK2. C: RTN3. D: SNAP91. E: 진단 시험으로 4개의 항원 모두의 조합을 사용하면 더 높은 민감도 및 특이도가 달성된다. 구체적으로, 4개의 항원에 대한 평균 반응에 대한 IFNγ 반응의 제곱근으로 나눈 IL-17의 비를 활용하면 >95%의 특이도와 함께 70%의 민감도가 달성된다.
도 10. HLA DRB5 01:01에 대한 FABP7 및 PROK2 펩티드의 결합 친화도 정도의 예. FABP7(서열 번호: 1 및 6) 및 PROK2(서열 번호: 2) 전체에 걸친 중복 펩티드를 다발성 경화증 연관된 HLA DRB5 01:01에 대한 그들의 친화력에 대해 경쟁적 결합 검정으로 시험하였다. 친화도 정도는 4개의 범주로 나누어지고 대표적인 결합 곡선이 제시된다: A: - 결합 없음, B: + 약한 결합, C: ++ 중간 결합, D: +++ 강한 결합. 검은 점은 참조 H1N1 인플루엔자 펩티드 결합을 나타내며, 삼각형은 시험된 자가항원 펩티드를 나타낸다. 전체 결과는 표 4에 있다.
발명의 요지
본 발명은 PCT/EP2016/081141에서 본 발명자들에 의해 이전에 개시된 T-세포 반응성 플랫폼 상에서 수행된 스크리닝으로부터의 발견에 기반한다.
다발성 경화증(MS) 환자 및 대조군으로부터의 T-세포 샘플을 45개의 풀에서 125개 후보 항원의 라이브러리에 대해 스크리닝하였다(실시예 1). 양성 항원 풀 18, 23, 26 및 29를 개별 단백질로 분할하고 재시험하여 MS에서 새로운 자가항원으로 FABP7(서열 번호: 1), PROK2(서열 번호: 2), RTN3(서열 번호: 3) 및 SNAP91(서열 번호: 4)을 식별하였다(실시예 2). 또한, 개별 환자는 새로운 자가항원에 대해 여러 상이한 유형의 반응성 프로파일을 나타냄을 발견하였다(실시예 3).
새로운 자가항원의 진단 유용성은 수신자 조작 특성(receiver-operator-characteristic: ROC) 분석에 의해 입증되었다(실시예 4). 개별 항원 중에서, 민감도 및 특이도(항상 상충)는 75% 민감도 및 85% 특이도를 나타내는 FABP7에 대해 가장 유망하였다. 민감도 및 특이도는 70% 민감도 및 >95% 특이도를 갖는 4개 항원 모두의 조합에 대해 가장 유망하였다.
각각의 항원의 전체 길이 재조합 버전을 시험함으로써 자가항원을 더 검증하고(실시예 7), 특정 T-세포 에피토프의 식별 원리는 FABP7 및 PROK2의 전체 서열을 커버하는 중복 펩티드(15개 aa, 10개 aa 중복)를 사용하여 입증되었다(실시예 6). 또한, 상이한 펩티드 에피토프의 HLA 결합 특성도 입증되었다(실시예 6).
종래 기술이 질환 관련된 T-세포 에피토프를 포함하는 관용원성 조성물로 MS를 성공적으로 치료할 수 있음을 입증하였음을 고려하여, 본 발명자들은 자가항원의 발견이 추가로 MS에 대한 새로운 치료를 제공한다는 것을 인식하였다(실시예 8 참조).
배경 섹션에서 논의된 바와 같이, T-세포 관용을 유도하는 방법은 공지되어 있지만, T-세포 관용이 유도될 수 있는 적합한 항원의 결여로 인해 MS의 치료가 저지되었다. 본 발명의 MS 치료의 생물학적 메카니즘은 항원 특이적 T-세포 관용을 유도하는 것에 기초하며, 이는 당해 분야에서 잘 받아들여진다.
비록 초기 학술 연구는 (자연적 생물학적 맥락으로 인해) 별도의 실체로서의 4개의 새로운 자가항원의 개념을 기반으로 했지만, 이후에 진단과 치료 둘 다에 사용되는 T-세포 에피토프의 짧은 특성 및 4개의 자가항원 모두를 조합하면 진단 결과를 개선한다는 사실(ROC 분석)을 고려하여, 4개의 새로운 자가항원 모두의 풀링된 서열을 본 발명에서 사용하기 위한 특정 T-세포 에피토프의 단일 공급원(서열 번호: 5)으로 고려하는 것이 가능하고 유리함을 인식하였다. 서열 번호: 5의 서열은 FABP7 이소형 2(서열 번호: 1), PROK2(서열 번호: 2), RTN3(서열 번호: 3), SNAP91(서열 번호: 4) 및 FABP7 이소형 1의 독특한 부분(서열 번호: 6)의 서열의 조합이다.
본 발명은 구체적으로 하기 항목에 관한 것이다. 하기 항목에 개시된 주제는 주제가 특허청구범위에 개시된 것과 동일한 방식으로 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
1. 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS 치료 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물로서, 조성물은
a. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나; 또는
b. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 치료적 T-세포 에피토프를 포함하고,
n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 관용원성 조성물.
2. 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS 치료 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물로서, 조성물은
a. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나; 또는
b. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하고,
n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 관용원성 조성물.
3. 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS 치료 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물로서, 조성물은
a. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나; 또는
b. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 치료적 T-세포 에피토프에 대해 생체외에서 노출된 항원 제시 세포를 포함하고,
n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 관용원성 조성물.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 치료 방법이 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 T-세포 에피토프에 대한 환자의 T-세포 자가반응을 결정하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
5. 항목 4에 있어서, 결정이 항목 43 내지 110 중 어느 한 항목에 따른 방법으로 수행되는 것인 조성물.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-166에 포함되는 것인 조성물.
7. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 167-295에 포함되는 것인 조성물.
8. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 296-1327에 포함되는 것인 조성물.
9. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1328-2234에 포함되는 것인 조성물.
10. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 2235-2250에 포함되는 것인 조성물.
11. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-2234에 포함되는 것인 조성물.
12. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 하위서열이 표 4의 펩티드의 서열 중 어느 하나에 포함되는 것인 조성물.
13. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, n은 적어도 11인 조성물.
14. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목에 있어서, n은 적어도 13인 조성물.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 한 항목에 있어서, n은 적어도 15인 조성물.
16. 항목 1 내지 15 중 어느 한 항목에 있어서, n은 적어도 17인 조성물.
17. 항목 1 내지 16 중 어느 한 항목에 있어서, n은 적어도 19인 조성물.
18. 항목 1 내지 17 중 어느 한 항목에 있어서, n은 적어도 50, 적어도 75, 가장 바람직하게는 적어도 100인 조성물.
19. 항목 1 내지 18 중 어느 한 항목에 있어서, m이 2인 조성물.
20. 항목 1 내지 18 중 어느 한 항목에 있어서, m이 1인 조성물.
21. 항목 1 내지 18 중 어느 한 항목에 있어서, m이 0인 조성물.
22. 항목 1 내지 21 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 T-세포 에피토프가 m개 이하의 잔기의 치환에 의해 하위서열과 상이하고 하위서열과 비교하여 치환 또는 결실을 포함하지 않는 것인 조성물.
23. 항목 1, 항목 3 및 이들의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 치료적 T-세포 에피토프가 펩티드 또는 펩티도미메틱인 조성물.
24. 항목 23에 있어서, 치료적 T-세포 에피토프가 서열 번호: 5의 하위서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 조성물.
25. 항목 1 및 이의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이, 각각 항목 1에 규정된 기준을 충족시키는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 치료적 T-세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
26. 항목 2 및 이의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이, 각각 항목 2에 규정된 기준을 충족시키는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
27. 항목 3 및 이의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 제시 세포가, 각각 항목 3에 규정된 기준을 충족시키는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 치료적 T-세포 에피토프에 노출되는 것인 조성물.
28. 항목 25 내지 27 중 어느 한 항목에 있어서, 상이한 치료적 T-세포 에피토프가 항목 6 내지 11 중 어느 한 항목에서 구체화된 서열 구간 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 중에서 선택되는 것인 조성물.
29. 항목 1 및 이의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이 고체 캐리어, 예컨대 생체적합성 중합체, 입자 또는 세포에 커플링된 치료적 T-세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
30. 항목 29에 있어서, 커플링이 공유 결합을 통한 것인 조성물.
31. 항목 1 내지 30 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이 환자에서 상기 치료적 T-세포 에피토프에 대한 T-세포 관용을 유도하기 위해 제형화되는 것인 조성물.
32. 항목 1 및 이의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 T-세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
33. 항목 2 및 이의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
34. 항목 3 및 이의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 조성물이 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 T-세포 에피토프에 노출된 항원 제시 세포를 포함하는 것인 조성물.
35. 항목 1 내지 34 중 어느 한 항목에 있어서, 방법이, 치료적 T-세포 에피토프가 환자가 T-세포 자가반응을 나타내는 에피토프에 상응하도록, 치료적 T-세포 에피토프를 선별하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
36. 항목 35에 있어서, 치료적 T-세포 에피토프가 상기 내인성 에피토프와 동일한 TCR에 특이적으로 결합할 수 있는 것에 기반하여 선별되는 것인 조성물.
37. 항목 1 내지 36 중 어느 한 항목에 있어서, 치료 방법이 조성물을 대상체에게 관용원성 방식으로 투여하여 환자에서 상기 T-세포 에피토프에 대한 T-세포 관용을 유도하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
38. 항목 1 내지 37 중 어느 한 항목에 있어서, 치료 방법이 조성물을 경구로, 점막으로, 피내로, 경피로 또는 피하로 투여하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
39. 항목 1, 항목 2 및 이들의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 치료 방법이 조성물을 시험관내에서 항원 제시 세포에게 제공하고 이어서 상기 항원 제시 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
40. 항목 2 및 이의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 핵산이 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에서의 발현을 가능하게 하는 프로모터에 작동적으로 커플링된 벡터에 포함되는 것인 조성물.
41. 항목 40에 있어서, 상기 벡터가 유전자 치료 벡터 또는 바이러스 벡터인 조성물.
42. 항목 3 및 이의 종속 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포, 단핵구, 대식구, B-세포(바람직하게는 PBMC로부터 유래됨) 또는 미세아교세포인 조성물.
43. 시험 대상체에서 다발성 경화증(MS) 관련된 자가면역의 정도를 결정하는 방법으로서,
a. 생존가능 T-세포를 포함하는 시험 대상체로부터 유래되는 시험 샘플을 제공하는 단계;
b. T-세포 에피토프를 포함하는 시험 항원에 반응하여 시험관내에서 시험 샘플의 T-세포의 항원 특이적 활성화를 정량화하는 단계로서, 상기 T-세포 에피토프는
i. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나;
ii. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하고,
n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 단계; 및
c. 정량화된 항원 특이적 활성화를 관련 참조와 비교하여 시험 대상체에서 MS 관련된 자가면역의 정도를 결정하는 단계
를 포함하는 방법.
44. 항목 43에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-166에 포함되는 것인 방법.
45. 항목 43에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 167-295에 포함되는 것인 방법.
46. 항목 43에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 296-1327에 포함되는 것인 방법.
47. 항목 43에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1328-2234에 포함되는 것인 방법.
48. 항목 43에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 2235-2250에 포함되는 것인 방법.
49. 항목 43에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-2234에 포함되는 것인 방법.
50. 항목 43에 있어서, 하위서열이 표 4의 펩티드의 서열 중 어느 하나에 포함되는 것인 방법.
51. 항목 43 내지 50 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 특이적 활성화가, 각각 항목 43에 규정된 기준을 충족시키는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 치료적 T-세포 에피토프에 대해 정량화되는 것인 방법.
52. 항목 51에 있어서, 상이한 T-세포 에피토프가 항목 44 내지 49 중 어느 한 항목에서 구체화된 서열 구간 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 중에서 선택되는 것인 방법.
53. 항목 43 내지 52 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 특이적 활성화가, 각각 FABP7(서열 번호: 1), PROK2(서열 번호: 2), RTN3(서열 번호: 3) 및 SNAP91(서열 번호: 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 MS 항원에 상응하는 특정 T-세포 에피토프를 포함하는, 적어도 2, 3 또는 4개의 시험 항원에 대해 정량화되는 것인 방법.
54. 항목 43 내지 53 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 FABP7(서열 번호: 1) 잔기 1-82의 서열에 포함되는 것인 방법.
55. 항목 43 내지 54 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 FABP7(서열 번호: 1) 잔기 83-166의 서열에 포함되는 것인 방법.
56. 항목 43 내지 55 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 FABP7(서열 번호: 1) 잔기 105-166의 서열에 포함되는 것인 방법.
57. 항목 43 내지 56 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 PROK2(서열 번호: 2) 잔기 34-74의 서열에 포함되는 것인 방법.
58. 항목 43 내지 57 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 PROK2(서열 번호: 2) 잔기 106-128의 서열에 포함되는 것인 방법.
59. 항목 43 내지 58 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 RTN3(서열 번호: 3) 잔기 81-217의 서열에 포함되는 것인 방법.
60. 항목 43 내지 59 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 RTN3(서열 번호: 3) 잔기 345-483의 서열에 포함되는 것인 방법.
61. 항목 43 내지 60 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 SNAP91(서열 번호: 4) 잔기 378-480의 서열에 포함되는 것인 방법.
62. 항목 43 내지 61 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 SNAP91(서열 번호: 4) 잔기 481-572의 서열에 포함되는 것인 방법.
63. 항목 43 내지 62 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 하위서열이 SNAP91(서열 번호: 4) 잔기 584-691의 서열에 포함되는 것인 방법.
64. 항목 43 내지 63 중 어느 한 항목에 있어서, n이 적어도 11인 방법.
65. 항목 43 내지 64 중 어느 한 항목에 있어서, n이 적어도 13인 방법.
66. 항목 43 내지 65 중 어느 한 항목에 있어서, n이 적어도 15인 방법.
67. 항목 43 내지 66 중 어느 한 항목에 있어서, n이 적어도 17인 방법.
68. 항목 43 내지 67 중 어느 한 항목에 있어서, n이 적어도 19인 방법.
69. 항목 43 내지 68 중 어느 한 항목에 있어서, n이 적어도 50, 적어도 75, 가장 바람직하게는 적어도 100인 방법.
70. 항목 43 내지 69 중 어느 한 항목에 있어서, m이 2인 방법.
71. 항목 43 내지 69 중 어느 한 항목에 있어서, m이 1인 방법.
72. 항목 43 내지 69 중 어느 한 항목에 있어서, m이 0인 방법.
73. 항목 43 내지 72 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 T-세포 에피토프가 m개 이하의 잔기의 치환에 의해 선택된 MS 항원의 하위서열과 상이하고 하위서열과 비교하여 치환 또는 결실을 포함하지 않는 것인 방법.
74. 항목 43 내지 73 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 T-세포 에피토프가 펩티드 또는 펩티도미메틱인 방법.
75. 항목 43 내지 74 중 어느 한 항목에 있어서, 특정 T-세포 에피토프를 포함하는 항원이 서열 번호: 1-4, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 방법.
76. 항목 43 내지 75 중 어느 한 항목에 있어서, 대상체가 진단된 MS 환자인 방법.
77. 항목 43 내지 75 중 어느 한 항목에 있어서, 대상체가 MS를 갖는 것으로 의심되는 개체인 방법.
78. 항목 43 내지 77 중 어느 한 항목에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
79. 항목 43 내지 78 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플이 혈액 샘플로부터 유래되는 것인 방법.
80. 항목 43 내지 79 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플이 PBMC 샘플인 방법.
81. 항목 43 내지 80 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플이 항원 제시 세포를 더 포함하는 것인 방법.
82. 항목 43 내지 81 중 어느 한 항목에 있어서, 방법이
a. 생존가능 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
b. 시험 항원을 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
c. 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T-세포의 항원 특이적 활성화를 가능하게 하는 조건 하에서 시험관내에서 시험 샘플을 시험 항원과 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
d. 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화를 정량화하는 단계
를 더 포함하는 것인 방법.
83. 항목 43 내지 82 중 어느 한 항목에 있어서, 방법이 포식가능 입자와 밀착되게 회합된 시험 항원을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
84. 항목 83에 있어서, 방법이 (a') 시험 항원을 포식가능 입자에 밀착되게 회합시키는 단계 및/또는 (a'') 입자와 회합된 시험 항원을 변성 세척하여 후속 단계를 방해하지 않기에 충분히 낮은 내독소 수준을 갖게 하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
85. 항목 83 또는 84에 있어서, 입자가 5.6 μm 미만, 바람직하게는 4 μm 미만, 보다 바람직하게는 3 μm 미만, 보다 더 바람직하게는 0.5-2 μm의 구간 또는 가장 바람직하게는 약 1 μm의 최대 치수를 갖는 것인 방법.
86. 항목 85에 있어서, 입자가 실질적으로 구형인 방법.
87. 항목 84 내지 86 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척이 회합된 시험 항원을 갖는 입자를 높은 pH, 예컨대 적어도 pH 13, 보다 바람직하게는 적어도 pH 14, 가장 바람직하게는 적어도 pH 14.3에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
88. 항목 84 내지 87 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척이 회합된 시험 항원을 갖는 입자를 낮은 pH에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
89. 항목 84 내지 88 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척이 회합된 시험 항원을 갖는 입자를 높은 온도, 예컨대 적어도 90℃, 보다 바람직하게는 적어도 92℃, 가장 바람직하게는 적어도 95℃에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
90. 항목 84 내지 89 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척이 회합된 시험 항원을 갖는 입자를 충분한 농도, 예컨대 적어도 5 M, 6 M, 7 M 또는 8 M의 변성제, 예컨대 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
91. 항목 84 내지 90 중 어느 한 항목에 있어서, 변성 세척으로 시험 항원 중의 내독소의 양이 방법에서 내독소의 최종 농도가 100 pg/ml 미만, 바람직하게는 50 pg/ml 미만, 보다 바람직하게는 25 pg/ml 미만 및 가장 바람직하게는 10 pg/ml 미만이게 되는 것인 방법.
92. 항목 83 내지 91 중 어느 한 항목에 있어서, 입자가 상자성 특성을 갖는 것인 방법.
93. 항목 83 내지 92 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 항원이 입자에 공유적으로 연결되거나 금속 킬레이트를 통해 입자에 연결되는 것인 방법.
94. 항목 43 내지 93 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화가 엘리스폿(ELISpot) 또는 플루오로스폿-기술을 이용하거나 T-세포 증식을 측정함으로서 수행되는 것인 방법.
95. 항목 43 내지 94 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화가 IFN-γ의 분비를 측정함으로써 T-세포 반응을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
96. 항목 43 내지 95 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화가 IL-17의 분비를 측정함으로써 T-세포 반응을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
97. 항목 43 내지 96 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화가 IL-22의 분비를 측정함으로써 T-세포 반응을 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
98. 항목 43 내지 97 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 세포 샘플에서 T-세포 활성화의 정량화가 샘플 중의 활성화된 T-세포의 분획을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
99. 항목 43 내지 98 중 어느 한 항목에 있어서, 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화가
a. 시험 항원이 밀착되게 회합된 포식가능 입자를 제공하는 단계로서, 회합된 시험 항원을 갖는 입자는 변성 세척되어 내독소 수준이 후속 단계를 방해하지 않기에 충분히 낮은 것인 단계;
b. 생존가능 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
c. 항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 가능하게 하는 조건 하에서 세척된 입자를 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
d. 생존가능 T-세포를 포함하는 검정될 시험 샘플을 제공하는 단계;
e. 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T-세포의 항원 특이적 활성화를 가능하게 하는 조건 하에서 시험관내에서 시험 샘플을 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
f. 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화를 정량화하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
100. 항목 43 내지 99 중 어느 한 항목에 있어서, 참조가 병리적 MS 관련된 자가면역이 없는 참조 대상체로부터의 참조 샘플에서 동등하게(comparably) 정량화된 항원 특이적 활성화인 방법.
101. 항목 43 내지 99 중 어느 한 항목에 있어서, 참조가 병리적 MS 관련된 자가면역이 없는 일 세트의 참조 대상체로부터의 일 세트의 참조 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화의 평균 값인 방법.
102. 항목 101에 있어서, 세트가 적어도 10명의 참조 대상체를 포함하는 것인 방법.
103. 항목 43 내지 99 중 어느 한 항목에 있어서, 참조가 상이한 시점에서 취한 동일한 대상체로부터의 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화인 방법.
104. 항목 43 내지 103 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 참조와 비교하여 적어도 2배, 바람직하게는 3배, 보다 바람직하게는 5배, 가장 바람직하게는 10배 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어지는 것인 방법.
105. 항목 43 내지 104 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 병리적 MS 관련된 자가면역이 없는 일 세트의 참조 대상체로부터의 일 세트의 동등하게 정량화된 참조 샘플의 평균보다 참조 샘플의 세트의 표준 편차의 2배만큼 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어지는 것인 방법.
106. 항목 43 내지 105 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 스튜던츠 T-시험으로 계산된 P 값이 0.05 미만인 참조보다 통계적으로 유의하게 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어지는 것인 방법.
107. 항목 43 내지 106 중 어느 한 항목에 있어서, 시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 만-휘트니 U 시험으로 계산된 P 값이 0.05 미만인 참조보다 통계적으로 유의하게 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어지는 것인 방법.
108. 항목 43 내지 107 중 어느 한 항목에 있어서,
a. 방법이 대상체에서 MS를 진단하기 위한 것이고;
b. 참조가 병리적 다발성 경화증 관련된 자가면역이 없는 참조 대상체에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
c. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 다발성 경화증을 나타내는 것인 방법.
109. 항목 43 내지 108 중 어느 한 항목에 있어서,
a. 방법이 대상체에서 MS의 과정을 추적하기 위한 것이고;
b. 참조가 동일한 대상체로부터 상이한 시점에 취한 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
c. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 더 높은 다발성 경화증 질환 활성을 나타내고, 그 반대도 마찬가지인 방법.
110. 항목 43 내지 109 중 어느 한 항목에 있어서,
a. 방법이 대상체에서 MS 과정의 예후를 만들기 위한 것이고;
b. 참조가 동일한 대상체로부터 상이한 시점에 취한 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
c. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 증가하는 다발성 경화증 질환 활성을 나타내고, 그 반대도 마찬가지인 방법.
111. 항목 43 내지 110 중 어느 한 항목에 있어서,
a. 방법이 치료적 처치에 대한 대상체의 반응을 평가하기 위한 것이고;
b. 참조가 평가될 치료적 처치의 제공 전에 동일한 대상체로부터 취한 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
c. 시험 샘플이 치료적 처치의 개시 후 동일한 대상체로부터의 것이고;
d. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 낮은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 다발성 경화증 질환 활성에 대한 치료 효능을 나타내고, 변화되지 않거나 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화는 시험 대상체에서 다발성 경화증 질환 활성에 대한 치료 효능의 결여를 나타내는 것인 방법.
112. MS의 진단 또는 치료에서 펩티드 또는 펩티도미메틱의 용도로서, 펩티드 또는 펩티도미메틱은 MS 항원에 상응하는 특정 T-세포 에피토프를 포함하고, 상기 T-세포 에피토프는 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한 n개의 연속적인 잔기의 아미노산 서열을 포함하고, m은 0, 1 또는 2인 용도.
113. 항목 112에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-166, 서열 번호: 5의 잔기 167-295, 서열 번호: 5의 잔기 296-1327, 서열 번호: 5의 잔기 1328-2234, 서열 번호: 5의 잔기 2235-2250 또는 서열 번호: 5의 잔기 1-2234 중에서 선택되는 것인 용도.
114. 항목 112 또는 113에 있어서, n이 적어도 11인 용도.
115. 항목 112 또는 113에 있어서, n이 적어도 13인 용도.
116. 항목 112 또는 113에 있어서, n이 적어도 15인 용도.
117. 항목 112 또는 113에 있어서, n이 적어도 17인 용도.
118. 항목 112 또는 113에 있어서, n이 적어도 19인 용도.
119. 항목 112 내지 118 중 어느 한 항목에 있어서, m이 1인 용도.
120. 항목 112 내지 118 중 어느 한 항목에 있어서, m이 0인 용도.
상세한 설명
다발성 경화증 치료에 사용하기 위한 관용원성 조성물
제1 측면에서, 본 발명은 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS를 치료하는 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물로서, 조성물은
a. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나; 또는
b. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 치료적 T-세포 에피토프를 포함하고,
n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 관용원성 조성물을 제공한다.
제2 측면에서, 제1 측면에서 정의된 바와 같은 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는, 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS를 치료하는 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물이 제공된다.
제3 측면에서, 제1 측면에서 정의된 바와 같은 치료적 T-세포 에피토프에 대해 생체외 에서 노출된 항원 제시 세포를 포함하는, 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS를 치료하는 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물이 제공된다.
치료 방법은 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다는 것을 암시하는 것으로 이해되어야 한다.
치료 방법은, 조성물을 투여하기 전에, 바람직하게는 하기에서 본 발명의 제4 측면으로 개시되는 방법에 의해, 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 대한 환자의 T-세포 자가반응을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
환자의 항원 제시 세포(APC)가 더 큰 것을 분해하여 단편을 T-세포에 제시할 것이라는 것을 고려하면, 치료적 T-세포 에피토프는 (예컨대, 유전자 조작 또는 화학적 펩티드 합성에 의해) 실질적으로 임의의 더 큰 폴리펩티드의 일부로서 포함될 수 있다는 것에 주목해야 한다. 즉, APC에 의한 분해에 의해, 치료적 T-세포 에피토프가 발견되는 서열 상황은 거의 또는 전혀 차이가 없다.
제1 측면의 조성물은, 각각 상기 제시된 기준을 충족시키는, 하나 초과의 치료적 T-세포 에피토프, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 100개 이상을 포함한다. 상기 및 배경 섹션에서 논의된 바와 같이, 항원 제시 세포는 항원 제시될 임의의 단백질을 작은 단편으로 분해시킬 것이므로, 하나 이상의 치료적 T-세포 에피토프를 동일한 치료 패러다임에서 사용될 더 큰 폴리펩티드 또는 펩티도미메틱에 포함시키는 것이 가능하거나 심지어 바람직하다. 임의의 불확실성을 피하기 위해, 치료적 T-세포 에피토프는 또한 별개의 화학적 실체일 수 있음이 명백하다.
조성물이, 각각의 에피토프가 상기 제시된 기준을 충족시키는, 하나 초과의 치료적 T-세포 에피토프, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 100개 이상을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 변형과 함께, 제2 측면의 조성물에도 동일하게 적용된다. 세포는 상기 논의된 바와 같이 항원 디스플레이될 임의의 발현된 단백질을 작은 단편으로 분해하므로, 핵산은 하나 초과의 치료적 T-세포 에피토프를 코딩할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 전술된 이유로, 특정 T-세포 에피토프가 아닌 서열을 포함하는 더 긴 서열의 일부로서 치료적 T-세포 에피토프를 포함할 수 있다.
제3 조성물의 항원 제시 세포는, 각각 상기 제시된 기준을 충족시키는, 하나 초과의 치료적 T-세포 에피토프, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 100개 이상에 노출될 수 있었다. 이전에 논의된 바와 같이, T-세포 에피토프는 이 경우에도 더 큰 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들에 포함될 수 있다.
제3 측면의 맥락에서 "노출"은 항원 제시 세포를 치료적 T-세포 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 펩티도미메틱과 접촉시키는 것 뿐만 아니라 항원 제시 세포를 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산으로 형질감염시켜 세포가 치료적 T-세포 에피토프를 발현하게 함으로써 세포를 노출시키는 것을 지칭할 수 있음을 이해해야 한다.
하위서열
제1, 제2 또는 제3의 측면의 하위서열은 i) 서열 번호: 5의 잔기 1-166, ii) 서열 번호: 5의 잔기 167-295, iii) 서열 번호: 5의 잔기 296-1327, iv) 서열 번호: 5의 잔기 1328-2234 또는 v) 서열 번호: 5의 잔기 2235-2250에 포함될 수 있다. 바람직하게는, 하위서열은 vi) 서열 번호: 5의 잔기 1-2234 포함된다.
제1 측면의 조성물은 상기 정의된 바와 같은 하나 초과의 상이한 치료적 T-세포 에피토프를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 하나 초과의 상이한 치료적 T-세포 에피토프는 상기에서 i)-vi)로 제시된 별개의 구간 중 2, 3, 4, 5 또는 6개 중에서 선택된다.
동일한 원리가 필요한 변경을 가하여 제2 측면의 핵산에도 적용된다. 바람직하게는, 핵산은 상기 정의된 바와 같은 하나 초과의 상이한 치료적 T-세포 에피토프를 코딩한다. 바람직하게는, 하나 초과의 상이한 코딩된 T-세포 에피토프는 상기에서 i)-vi)로 제시된 별개의 구간 중 2, 3, 4, 5 또는 6개 중에서 선택된다.
유사하게, 제3 측면의 세포는 상기 정의된 바와 같은 하나 초과의 상이한 치료적 T-세포 에피토프에 노출될 수 있었다. 바람직하게는, 하나 초과의 상이한 치료적 T-세포 에피토프는 상기에서 i)-vi)로 제시된 별개의 구간 중 2, 3, 4, 5 또는 6개 중에서 선택된다.
하위서열은 표 4의 펩티드의 서열 중 어느 하나에 포함될 수 있다. 바람직하게는, 하위서열은 표 4의 펩티드의 서열 중 어느 하나에 포함되고, 여기서 HLA 결합은 "++" 또는 "+++", 가장 바람직하게는 "+++"로 표시된다.
바람직하게는, n은 적어도 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22이다. n은 적어도 50, 적어도 75, 보다 더 바람직하게는 적어도 100일 수 있다. n은 전술된 수로부터 형성된 임의의 구간, 예컨대 8-22, 9-21, 8-17, 8-15, 8-12 또는 8-100일 수 있다. 가장 바람직하게는 m=0일 때 n은 8-19 또는 8-17이다. 바람직하게는, m은 2이고, 보다 바람직하게는 m은 1이며, 가장 바람직하게는 m은 0이다.
바람직하게는, 치료적 T-세포 에피토프는 하위서열과와 동일하다(m = 0). 그러나, 아마도 대부분의 경우에서 서열을 약간 변화시키고 서열 번호: 5의 하위서열과 서열 동일성을 갖는 것과 비교하여 여전히 기능적으로 완전히 또는 실질적으로 동등한 치료적 T-세포 에피토프를 갖는 것이 가능할 수 있다. 예컨대, 아미노산을 극성, 하전 또는 소수성 측면에서 유사한 특성을 갖는 또 다른 것으로 치환하는 것이 허용될 수 있다. 치료적 T-세포 에피토프 내에서의 작은 삽입 또는 결실도 서열 번호: 5의 하위서열과 서열 동일성을 갖는 것과 비교하여 기능적으로 완전히 또는 실질적으로 동등한 치료적 T-세포 에피토프를 제공하는 한 허용될 수 있다. 바람직하게는, m은 2이고, 보다 바람직하게는 m은 1이며, 가장 바람직하게는 m은 0이다.
바람직하게는, 상기 치료적 T-세포 에피토프는 m개 이하의 잔기의 치환에 의해 하위서열과 상이할 수 있고, 하위서열과 비교하여 치환 또는 결실을 포함하지 않는다.
제1 또는 제3 측면의 치료적 T-세포 에피토프는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 제1 또는 제3 측면의 치료적 T-세포 에피토프는 서열 번호: 5의 하위서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다.
제2 측면의 핵산은 DNA, PNA 또는 포유동물 세포에서 발현을 위한 단백질을 코딩할 수 있는 임의의 다른 핵산일 수 있다.
조성물 제형
조성물은 인간 또는 비-인간 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있는 환자에서 상기 치료적 T-세포 에피토프에 대한 T-세포 관용을 유도하기 위해 제형화된다.
제1 측면의 조성물은 고체 캐리어, 예컨대 생체적합성 중합체(예컨대 PLGA), 리포좀, 고체 입자 또는 세포에 커플링된 치료적 T-세포 에피토프를 포함할 수 있다.
커플링은 바람직하게는 공유 결합을 통하나, 금속 킬레이트 결합, 소수성 상호작용 또는 이온성 상호작용을 포함하는 다른 커플링도 가능하다. 항원성 펩티드를 세포에 커플링하는 데 적합한 커플링 프로토콜은 EP2205273에 개시되어 있다. 항원성 펩티드의 PLGA-마이크로입자에의 커플링에 적합한 커플링 프로토콜은 콜람자드(Gholamzad) 및 동료들에 의해 개시되어 있다(Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology 2017. 16(3):271-281). 항원 펩티드의 중합체성 캐리어에 대한 커플링에 적한한 프로토콜은 피어슨(Person) 및 동료들에 의해 개시되어 있다(Mol Ther. 2017 Jul 5;25(7):1655-1664. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.04.015).
제1 측면에 따른 조성물은 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 T-세포 에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 특이적 결합은 시험관내 또는 생체내에서의 생물학적 설정에서 T-세포 활성화를 이끌기에 충분히 높은 결합을 의미한다.
본 발명에 따른 조성물은 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
제3 측면의 항원 제시 세포는 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 T-세포 에피토프에 노출될 수 있었다.
치료적 T-세포 에피토프를 선별
제1, 제2 또는 제3 측면의 치료 방법은 환자가 T-세포 자가반응을 나타내는 내인성 T-세포 에피토프에 상응하도록 치료적 T-세포 에피토프를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
치료적 T-세포 에피토프는 상기 내인성 에피토프와 동일한 TCR에 특이적으로 결합할 수 있다는 것에 기반하여 선별될 수 있다.
제1, 제2 또는 제3 측면의 치료적 T-세포 에피토프(들)는 치료될 환자 또는 대상체에서의 자가반응과 일치되도록 개별적으로 테일러링되거나 선별될 수 있다. 그러나, 많은 경우에, 조성물을 테일러링하는 것은 시간 소모적이고 비용이 들며 많은 관할 구역에서 규제 문제를 제공할 수 있으므로, 가장 일반적인 내인성 T-세포 에피토프에 상응하는 여러 치료적 T-세포 에피토프를 포함하는 조성물을 투여하는 것이 더 실용적일 수 있다.
조성물을 투여
제1 내지 제3 측면의 치료 방법은 바람직하게는 조성물을 대상체에게 관용원성 방식으로 투여하여 환자에서 치료적 T-세포 에피토프에 대해 T-세포 관용을 유도하는 단계를 포함한다.
치료 방법은 조성물을 경구로, 점막으로, 피내로, 경피로 또는 피하로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 투여는 주사에 의한 것일 수 있다.
제1 또는 제2 측면의 치료 방법은 조성물을 생체외에서 항원 제시 세포에게 제공하고 이어서 상기 항원 제시 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
치료 용량은 바람직하게는 몇 주/개월의 기간 동안 저용량에서 고용량으로 적정된다. 치료는 바람직하게는 낮은 제1 용량으로 시작한 후, 각각의 후속 투여에서 용량을 증가(예컨대, 배가)시킨다. 몇 주/개월의 적정 기간 후, 시작 용량보다 10-100배 높을 수 있는 유지 수준에 도달하고 일정 기간 동안 유지될 수 있다.
문헌은, 단지 관용이 유도되는 T-세포 항원을 본원에 기재된 치료적 T-세포 에피토프로 대체함으로써, 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는, MS 및 다른 병태에서 T-세포 관용을 유도하기 위한 여러 프로토콜을 기재한다.
카타웨이(Cathaway) 및 동료들(Cathaway J, Martin K, Barrell K, Sharrack B, Stolt P, Wraith DC. Effects of ATX-MS-1467 immunotherapy over 16 weeks in relapsing multiple sclerosis. Neurology 2018)은 재발성 다발성 경화증을 갖는 환자에서 항원에 대한 관용을 유도하기 위한 상이한 치료 프로토콜을 사용하여 항원 특이적 면역요법의 안전성, 관용성 및 효능을 평가하기 위한 공개 라벨 연구를 수행하였다.
발자크 및 동료들(Walczak A, Siger M, Szczepanik M, Selmaj K. Transdermal application of myelin peptides in multiple sclerosis treatment. JAMA Neurol. 2013)은 이중 맹검, 위약 대조 코호트 연구로 인간 환자에서 미엘린 펩티드의 경피 적용을 사용하여 다발성 경화증에서 효과적인 항원 특이적 요법을 입증하였다.
루테로티(Lutterotti) 및 동료들은 7개의 미엘린 펩티드와 화학적으로 커플링된 자가 말초 혈액 단핵 세포의 단일 주입을 사용하는 MS 환자에서 관용 요법을 발표하였다(Sci Transl Med. 2013 Jun 5;5(188):188ra75). 동일한 팀은 또한 특허 공보에서 펩티드가 적혈구에 커플링된 유사한 요법을 개시하였다(EP2205273).
골람자드 및 동료들(Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology 2017. 16(3):271-281)은 MS에 대한 질병 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염에서 관용원성 효과를 갖는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)-코팅된 PLGA 마이크로입자의 정맥 주사를 포함하는 요법을 개시하고 있다.
푸졸-오토넬(Pujol-Autonell) 및 동료들(Nanomedicine (Lond). 2017 Jun;12(11):1231-1242. Doi: 10.2217/nnm-2016-0410)은, 항원으로서 MOG-펩티드를사용하는, 다발성 경화증 질환 모델에 대해 치료 효과를 갖는 포스파티딜세린-리포좀-기반 면역요법을 사용한 요법을 개시한다.
피어슨 및 동료들(Mol Ther. 2017 Jul 5;25(7):1655-1664. Doi: 10.1016/j.ymthe.2017.04.015)은 다발성 경화증의 뮤린 모델인 재발-완화 실험적 자가면역 뇌척수염(R-EAE)에서 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)에 컨쥬게이션된 항원성 MOG 펩티드를 사용하는 실험 프로토콜을 보고하였다. 중합체 컨쥬게이션된 펩티드는 질환 억제에 효과적이었다.
상기 논의된 임의의 요법 및 프로토콜은 항원성 펩티드를 제1 측면에 따르도록 변형시킴으로써 제1 측면의 조성물과 함께 이용될 수 있다.
유전자 치료
일반적으로 말해서, 제2 측면의 핵산은 바람직하게는 환자의 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포에서 발현을 허용하는 프로모터에 작동적으로 커플링된 벡터에 포함된다. 벡터는 유전자 전달 벡터, 또는 당해 분야에 공지된 바이러스 벡터, 예컨대 레트로 바이러스 벡터, 아데노 연관된 바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 네이키드 DNA 유전자 전달 벡터는 전기천공, 유전자 총, 초음파천공, 자기주입 또는 유체역학적 전달을 포함하여 당해 분야에 공지된 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 사용될 수 있는 벡터 전달을 증진시키기 위한 화학적 방법은 리포좀, 리포플렉스, 폴리머좀, 폴리플렉스, 덴드리머, 무기 또는 유기 나노입자 또는 세포 침투 펩티드를 포함한다.
치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 서열의 발현이 요구되는 조직에 따라 적합한 프로모터가 당해 분야에 공지되어 있다.
킬러(Keeler) 및 동료들(Mol Ther. 2018 Jan 3;26(1):173-183)은 유전자 요법 유도된 항원 특이적 조절 T-세포(Treg)가 간세포에서 전체 길이 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)을 발현하는 간 표적화 유전자 전달 벡터를 사용하여 MS에서 신경 염증을 억제하고 질환을 반전시킬 수 있음을 입증하였다. 사용된 물질 및 방법은 발현되는 핵산 서열이 제2 측면에 대해 본원에 정의된 바와 같은 치료적 T-세포 에피토프로 대체되는 변형과 함께 제2 측면에 따른 치료 방법에 적용될 수 있다.
항원 제시 세포를 사용하는 치료
제3 측면의 항원 제시 세포는 바람직하게는 말초 혈액 단핵 세포로부터 유래될 수 있는 수지상 세포, 단핵구, 대식구 또는 B-세포일 수 있다. 대안적으로, 항원 제시 세포는 CNS 유래될 수 있는 미세아교세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 환자에게 자가이지만, MHC 수용체와 관련하여 공여자 일치되는 상이한 개체로부터 유래될 수도 있다. 추가로, MHC 수용체가 환자와 일치되도록 조작되는, 상이한 개체 또는 심지어 상이한 종으로부터의 유전자 조작된 APC 세포주의 사용이 또한 고려된다.
세포는, 세포가 에피토프를 흡수하여 환자에게 투여된 후 환자의 면역계에 이들을 제시하도록, 생체외에서 제3 측면의 조성물(치료적 T-세포 에피토프)에 노출된다. 세포는 표면에 폴리펩티드를 디스플레이하기 전에 프로세싱되고 임의의 폴리펩티드를 분해하므로, 에피토프(들)는 더 큰 단백질 또는 여러 상이한 단백질의 일부로서 세포에 제공될 수 있다. 에피토프가 세포에서 발현되도록 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산 작제물로 세포를 형질감염시키는 것도 동일하게 적용 가능할 것이다.
필립스(Phillips) 등(Front Immunol. 2017; 8: 1279)은 검토 논문에서 MS 및 다른 자가면역 질환에 대해 관용원성 수지상 세포를 사용하는 계획 및 진행중인 임상 연구를 논의한다.
존스(Jones) 및 하위그(Hawiger)(Front Immunol. 2017 May 9;8:532. doi: 10.3389/fimmu.2017.00532)는 관련 뉴우런 항원에 대한 관용원성 반응 동안 말초 면역계에서 체외적으로 형성된 항원 특이적 Treg 세포(pTreg 세포)에 의해 신경 염증이 개선되거나 심지어 완전히 예방될 수 있음을 보여주는 실험 및 MS의 치료를 위한 이러한 발견의 관련성을 논의한다.
이베르그(Iberg) 등((Trends Immunol. 2017 Nov;38(11):793-804. doi: 10.1016/j.it.2017.07.007)은 T 세포 항원의 특정 전달에 의해 강화된 수지상 세포 기능이 임상 설정에서 관용 유도를 위해 이용될 수 있는 방법을 논의한다.
후앙(Huang) 등은 자가항원 펄싱된 수지상 세포가 루이스(Lewis) 래트에서 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)에 대해 관용을 유도한다고 보고한다(Clin Exp Immunol (2000) 122(3):437-44. doi:10.1046/j.1365-2249. 2000.01398.x).
멘게스(Menges) 등은 종양 괴사 인자 알파로 성숙된 수지상 세포의 반복 주사가 자가면역으로부터 마우스의 항원 특이적 보호를 유도한다고 보고한다(J Exp Med (2002) 195(1):15-21. Doi:10.1084/jem.20011341).
상기 최초의 연구 및 검토(그에 인용된 최초의 연구 포함)에서 논의된 수단 및 방법은 본 발명의 치료적 T-세포 에피토프의 조성물과 함께 사용되도록 적응될 수 있다.
다발성 경화증(MS) 관련된 자가면역의 정도를 측정하는 방법
제4 측면에서, 본 발명은 시험 대상체에서 다발성 경화증(MS) 관련된 자가면역의 정도를 결정하는 방법으로서,
a. 생존가능 T-세포를 포함하는 시험 대상체로부터 유래되는 시험 샘플을 제공하는 단계;
b. MS 항원에 상응하는 특정 T-세포 에피토프를 포함하는 시험 항원에 반응하여 시험관내에서 시험 샘플의 T-세포의 항원 특이적 활성화를 정량화하는 단계로서, 상기 T-세포 에피토프는
i. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나;
ii. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하고,
n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 단계; 및
c. 정량화된 항원 특이적 활성화를 관련 참조와 비교하여 시험 대상체에서 MS 관련된 자가면역의 정도를 결정하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
제4 측면의 시험 대상체에서 다발성 경화증(MS) 관련된 자가면역의 정도를 측정하는 방법은
a. 생존가능 T-세포를 포함하는 시험 대상체로부터 유래되는 시험 샘플을 제공하는 단계;
b. MS 항원에 상응하는 특정 T-세포 에피토프를 포함하는 시험 항원에 반응하여 시험관내에서 시험 샘플의 T-세포의 항원 특이적 활성화를 정량화하는 단계; 및
c. 정량화된 항원 특이적 활성화를 관련 참조와 비교하여 시험 대상체에서 MS 관련된 자가면역의 정도를 결정하는 단계
를 포함할 수 있고;
MS 항원은 FABP7(서열 번호: 1), PROK2(서열 번호: 2), RTN3(서열 번호: 3) 및 SNAP91(서열 번호: 4)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 T-세포 에피토프는
i. 선택된 MS 항원의 하위서열과 동일하거나; 또는
ii. 선택된 MS 항원의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하고; 및
n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2이다.
항원 제시 세포(APC)가 시험 항원을 분해할 것이라는 점을 고려하면, T-세포 에피토프는 (예컨대, 유전자 조작에 의해) 실질적으로 임의의 더 큰 폴리펩티드 시험 항원에 포함될 수 있다는 것에 주목해야 한다. 시험 항원이 분해될 것이므로, 특정 T-세포 에피토프가 시험 항원에서 발견되는 상황은 차이가 없다. 따라서, 시험 항원이 이의 서열의 일부로서 새로운 MS 항원 FABP7, PROK2, RTN3 및 SNAP91(모두 서열 번호: 5에 포함됨) 중 하나에 상응하는 특정 T-세포 에피토프를 포함한다면, 임의의 시험 항원이 사용될 수 있다.
배경 섹션에서 논의된 바와 같이, 가장 짧은 에피토프는 전형적으로 8개 aa이지만 개별 경우에 따라 더 길 수 있다. 따라서, 본 발명은 T-세포 에피토프가 적어도 n개의 아미노산의 연속적인 스트레치에 대해 유사성을 공유하는 서열 번호: 5(즉, 새로운 MS 항원 중 하나)와 서열 동일성 또는 유사성을 가질 것을 요구한다.
n의 값은 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 수 있다. 바람직하게는, n은 적어도 11이고, 보다 바람직하게는 n은 적어도 13이고, 더욱 바람직하게는 n은 적어도 15이고, 더욱더 바람직하게는 n은 적어도 17이고, 보다 더 바람직하게는 n은 적어도 19이다. 대안적으로, n은 적어도 50이고, 바람직하게는 적어도 75이고, 또는 가장 바람직하게는 적어도 100일 수 있다. n은 전술한 수로부터 형성되는 임의의 구간, 예컨대 8-22, 9-21, 8-17, 8-15, 8-12 또는 8-100일 수 있다. 가장 바람직하게는, m이 0 인 경우, n은 8-19 또는 8-17이다.
바람직하게는, T-세포 에피토프는 하위서열과 동일하다(m = 0). 그러나, 대부분의 경우, 서열을 약간 변화시키고 여전히 MS 항원에 상응하는 기능적으로 완전히 또는 실질적으로 동등한 특정 T-세포 에피토프를 가질 수 있다. 예컨대, 아미노산을 극성, 하전 또는 소수성 측면에서 유사한 특성을 갖는 또 다른 것으로 치환하는 것이 허용될 수 있다. 특정 T-세포 에피토프 내에서 작은 삽입 또는 결실도 이들이 선택된 MS 항원에 상응하는 기능적으로 완전히 또는 실질적으로 동등한 특정 T-세포 에피토프를 제공하는 한 허용될 수 있다.
바람직하게는, 차이는 단지 치환이고, 즉 결실 또는 삽입이 아니다. 보다 바람직하게는, 차이는 단지 아미노산을 극성, 하전 및/또는 소수성 측면에서 유사한 특성을 갖는 또 다른 것으로 대체하는 것을 수반하는 치환이다. 바람직하게는, m은 2이고, 보다 바람직하게는 m은 1이며, 가장 바람직하게는 m은 0이다.
바람직하게는, 항원 특이적 활성화는 각각 FABP7(서열 번호: 1), PROK2(서열 번호: 2), RTN3(서열 번호: 3) 및 SNAP91(서열 번호: 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 MS 항원에 상응하는 특정 T-세포 에피토프를 포함하는 적어도 2, 3 또는 4 개의 시험 항원에 대해 정량화된다. 실시예 2에 나타난 바와 같이, 모든 MS 환자가 새로운 MS 항원 모두에 대해 T-세포 관련된 자가면역을 나타내는 것은 아니다. 따라서, 특히 스크리닝 설정에서, 동시에 상이한 MS 항원으로부터 유래되는 하나 초과의 특정 T-세포 에피토프에 대해 시험 대상에서 MS 관련된 자가면역을 시험하는 것이 유리하다. 새로운 MS 마커에 대한 자가면역의 결정은 유리하게는 다른 공지된 MS 마커의 결정과 조합될 수 있다는 것이 또한 고려된다.
특정 T-세포 에피토프를 포함하는 시험 항원은 서열 번호: 1-4, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다.
진단 방법에서 하위서열
제4 측면의 하위서열은 i) 서열 번호: 5의 잔기 1-166, ii) 서열 번호: 5의 잔기 167-295, iii) 서열 번호: 5의 잔기 296-1327, iv) 서열 번호: 5의 잔기 1328-2234 또는 v) 서열 번호: 5의 잔기 2235-2250에 포함될 수 있다. 바람직하게는, 하위서열은 vi) 서열 번호: 5의 잔기 1-2234에 포함된다.
제4 측면의 방법은 상기에서 정의된 바와 같은 하나 초과의 상이한 T-세포 에피토프에 반응하여 항원 특이적 활성화를 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 하나 초과의 상이한 T-세포 에피토프는 상기에서 i)-vi)로 제시된 별개의 구간 중 2, 3, 4, 5 또는 6개로부터 선택된다.
제4 측면의 방법은, 각각 상기 제시된 기준을 충족시키는, 하나 초과의 치료적 T-세포 에피토프, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 100개 이상에 반응하여 항원 특이적 활성화를 정량화하는 단계를 포함할 수 있는 것이 바람직하다.
하위서열은 표 4의 펩티드 서열 중 어느 하나에 포함될 수 있다. 바람직하게는, 하위서열은 HLA 결합이 "++" 또는 "+++", 가장 바람직하게는 "+++"로 표시되는 표 4의 펩티드의 서열 중 어느 하나에 포함된다.
하위서열은 바람직하게는 실시예에서 사용된 특정 항원 단백질에 상응하는 본원에 기재된 MS 항원의 특정 부분으로부터 유래될 수 있다.
상기 하위서열은 FABP7(서열 번호: 1) 잔기 1-82, 잔기 83-166 또는 잔기 105-166의 서열에 포함될 수 있다.
상기 하위서열은 ROK2(서열 번호: 2) 잔기 34-74 또는 잔기 106-128의 서열에 포함될 수 있다.
상기 하위서열은 RTN3(서열 번호: 3) 잔기 81-217 또는 잔기 345-483의 서열에 포함될 수 있다.
상기 하위서열은 SNAP91(서열 번호: 4) 잔기 378-480, 잔기 481-572 또는 잔기 584-691의 서열에 포함될 수 있다.
시험 대상체
대상체는 진단된 MS 환자 또는 MS를 갖는 것으로 의심되는 개체일 수 있다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
시험 샘플
시험 샘플은 바람직하게는 혈액 샘플로부터 유래되고, 더욱 바람직하게는 PBMC 샘플이다.
가장 바람직하게는, 시험 샘플은 시험 항원을 샘플의 T-세포에 제시하는 데 사용될 수 있는 항원 제시 세포(APC)를 더 포함한다. 정량화에서 동일한 개체로부터의 APC를 사용하면(하기에서 더욱 상세히 기재됨) APC 상의 MCH 수용체에서 개별 유전자 변이로부터 생기는 임의의 불확실성을 제거한다.
특정 T-세포 활성화를 결정하기 위한 바람직한 방법에 대한 세부 사항
MS 관련 자가면역을 결정하는 데 유용한 T-세포 반응성 플랫폼은 PCT/EP2016/081141에서 본 발명자들에 의해 이전에 개시되었다.
본 발명의 방법은
a. 생존가능 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
b. 시험 항원을 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
c. 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T-세포의 항원 특이적 활성화를 가능하게 하는 조건 하에서 시험관내에서 시험 샘플을 시험 항원과 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
d. 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화를 정량화하는 단계
를 더 포함할 수 있다.
항원 제시 세포는 시험 대상으로부터 유래되는 것이 바람직하다.
상기 방법은 포식가능 입자와 밀착되게 회합된 시험 항원을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 입자는 시험 항원과 함께 항원 제시 세포에 의해 포식된다. 시험 항원은 APC에 의해 효소적으로 분해되고, 분해된 항원 에피토프는 T-세포에 제시된다.
포식가능 입자와 밀착되게 회합된 시험 항원을 갖는 것의 특별한 이점은 임의의 오염성 내독소가 변성 세척에 의해 제거될 수 있다는 것이다. 불행하게도, T-세포 활성화를 결정하는 검정의 일반적인 문제점은 T-세포와 접촉하게 되는 낮은 수준의 내독소도 정상적으로는 매우 낮은 수준의 항원 특이적 활성화를 마스킹하는 활성화를 초래한다는 것이다. 시험될 T-세포 집단의 작은 분획만이 주어진 항원에 대해 항원 특이적 방식으로 반응하는 반면(최근에 항원을 마주친 대상체의 혈액에서 약 1/10000), 세포의 큰 분획이 높은 수준의 배경을 생성하는 내독소에 반응할 것이다. 도처에 존재하는 내독소 오염을 고려할 때, 이것은 실제적인 측면에서 실질적인 문제가 될 수 있다.
따라서, 방법은 (a') 시험 항원을 포식가능한 입자에 밀착되게 회합시키는 단계 및/또는 (a'') 입자와 회합된 시험 항원을 변성 세척하여 후속 단계를 방해하지 않기에 충분히 낮은 내독소 수준을 갖게 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
입자는 바람직하게는 5.6 μm 미만, 바람직하게는 4 μm 미만, 더욱 바람직하게는 3 μm 미만, 더욱더 바람직하게는 0.5-2 μm의 구간 또는 가장 바람직하게는 약 1 μm의 가장 큰 치수를 갖는다. 입자는 바람직하게는 실질적으로 구형이다.
변성 세척은 회합된 시험 항원을 갖는 입자를 높은 pH, 예컨대 적어도 pH 13, 보다 바람직하게는 적어도 pH 14, 가장 바람직하게는 적어도 pH 14.3에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 변성 세척은 회합된 시험 항원을 갖는 입자를 낮은 pH로 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 변성 세척은 회합된 시험 항원을 갖는 입자를 높은 온도, 예컨대 적어도 90℃, 보다 바람직하게는 적어도 92℃, 가장 바람직하게는 적어도 95℃에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 변성 세척은 회합된 시험 항원을 갖는 입자를 충분한 농도, 예컨대 5 M, 6 M, 7 M 또는 8 M의 변성제, 예컨대 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드에 노출시키는 것을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 변성 세척으로 시험 항원 중의 내독소의 양이 방법에서 내독소의 최종 농도가 100 pg/ml 미만, 바람직하게는 50 pg/ml 미만, 보다 바람직하게는 25 pg/ml 미만 및 가장 바람직하게는 10 pg/ml 미만이 된다.
입자가 상자성 특성을 갖는 경우 유리하여 자성 보유에 의한 용이한 취급이 가능하다
바람직하게는, 시험 항원은 입자에 공유적으로 연결되거나 금속 킬레이트를 통해 입자에 연결된다.
항원 제시 세포(APC) 및 T-세포 샘플
본 발명의 맥락에서, APC는 전문 항원 제시 세포, 예컨대 단핵구/대식구 또는 수지상 세포이다. APC는 일차 세포 또는 불멸화된 세포일 수 있다.
APC는 T-세포가 반응할 수 있는 항원 특이적 맥락(MHC 제한됨)으로 T-세포에 항원을 제시할 수 있도록 T-세포 샘플의 T-세포와 맞아야 한다. APC 및 T-세포 샘플은 바람직하게는 동일한 종으로부터 수득되고 MHC 수용체와 관련하여 공여자와 일치된다. 그러나, 상이한 종으로부터의 유전자 조작된 APC의 사용도 고려된다.
항원 제시 세포 및 T-세포 샘플이 동일한 개체로부터 유래되는 경우, APC와 T-세포 사이의 어떠한 불일치 가능성도 회피된다.
항원 제시 세포 및 T-세포 샘플은 동일한 혈액 샘플로부터 유래될 수 있으며, 이는 실제적인 관점에서 유리하다. 항원 제시 세포 및 T-세포 샘플은 동일한 개체로부터의 PBMC-샘플로부터 유래될 수 있다. 말초 혈액 샘플로부터 PBMC를 수득하는 것은 일반적인 프로토콜이며, 이는 APC 및 T-세포 둘 다에 대해 동시에 동일한 개체로부터 편리한 공급원을 제공한다.
PBMC 샘플은 신선하게 사용되거나 동결될 수 있다. 냉동된 세포를 사용할 가능성은 물류 관점에서 실질적인 이점이 있다.
T-세포 샘플은 종양, 바람직하게는 종양의 림프관으로부터 유래될 수 있다.
T-세포 샘플은 또한 복수로부터 유래될 수 있다.
T-세포 샘플은 CD4+ 및 CD8+ T-세포 둘 다를 포함하는 전체 PBMC, 정제된 T-세포 집단, 또는 특정 T-세포 집단(들)이 고갈된 PBMC를 포함할 수 있다.
항원 특이적 T-세포 활성화를 정량화
항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화는
a. 시험 항원이 밀착되게 회합된 포식가능 입자를 제공하는 단계로서, 회합된 시험 항원을 갖는 입자는 변성 세척되어 내독소 수준이 후속 단계를 방해하지 않기에 충분히 낮은 것인 단계;
b. 생존가능 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
c. 항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 가능하게 하는 조건 하에서 세척된 입자를 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
d. 생존가능 T-세포를 포함하는 검정될 시험 샘플을 제공하는 단계;
e. 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T-세포의 항원 특이적 활성화를 가능하게 하는 조건 하에서 시험관내에서 시험 샘플을 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
f. 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화를 정량화하는 단계
를 포함할 수 있다.
시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화를 정량화하는 것은 엘리스폿 또는 플루오로스폿 기술을 사용하거나 T-세포 증식을 측정함으로써 수행될 수 있다. 본 실시예는 판독으로서 특정 시토카인의 발현을 사용하지만, 사용될 수 있는 항원 특이적 T-세포 활성화를 결정하는 많은 추가적인 방법이 존재한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 예컨대, 판독값으로 T-세포 증식의 이용(앞서 PCT/EP2016/081141에서 활용이 입증됨)은 임의의 특정 시토카인을 측정할 필요성을 제거하는 데 이용될 수 있다.
시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화는 바람직하게는 IFN-γ, IL-17 및/또는 IL-22의 분비를 측정함으로써 T-세포 반응을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이 중 IL-17 및 IL-22는 가장 강력한 결과를 제공하므로 특히 바람직하다(표 3 참조).
바람직하게는, 시험 세포 샘플에서 T-세포 활성화의 정량화는 샘플에서 활성화된 T-세포의 분율을 결정하는 것을 포함한다. 시험 세포 샘플에서 T-세포 활성화의 정량화는 2개의 상이한 측정을 사용하여 검출된 샘플에서 활성화된 T-세포의 비율을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 숫자는 숫자 연산에 의해, 예컨대 대수 또는 제곱근을 취해 정규화될 수 있다. 하나의 특히 바람직한 정량화는 IFN-γ 양성 세포의 수의 제곱근으로부터 IL-17 양성 세포의 수를 나눔으로써 수득된 측정치를 결정하는 것을 포함한다.
관련 참조
바람직하게는, 정량화된 항원 특이적 활성화가 비교되는 관련 참조는 병리적 MS 관련된 자가면역이 없는 참조 대상체로부터의 참조 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화이다.
참조는 병리적 MS 관련된 자가면역이 없는 일 세트의 참조 대상체로부터의 일 세트의 참조 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화의 평균값일 수 있다. 상기 세트는 적어도 10명의 참조 대상체를 포함할 수 있다.
참조는 상이한 시점에서 취한 동일한 대상체로부터의 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화일 수 있다.
진단 적용
방법의 진단 활용은 실시예 3-7에 나타나 있다. 수신자 조작 특성(ROC) 분석에 의해 입증되는 바와 같이, 민감도와 특이도 사이에는 항상 상충이 있다. 병리의 존재를 결론짓기 위한 임계값을 낮게 설정하는 경우, 민감도는 증가하지만(즉, 거짓 음성의 수가 감소), 선택도는 낮아진다(즉, 거짓 양성의 수가 증가). 대신 임계값을 올리는 경우, 민감도가 감소하고 선택도가 증가한다. 설정에 따라, 거짓 음성 및 거짓 양성에 대한 허용 오차가 달라진다. 예컨대, 수백만 명의 사람들이 시험되는 인구 전체의 스크리닝에서 거짓 양성의 수는 매우 낮아야 하며, 그렇지 않으면 후속 조치가 필요한 환자의 수가 압도적일 것이다. 반면, 진단 시험이 단일 환자에 대한 전문 평가의 일부로 사용되고, 진단에 도달하기 전에 여러 다른 인자들이 고려되는 경우, 훨씬 큰 비율의 거짓 양성이 허용될 수 있다. 따라서, 결론을 내리기 위한 임계값은 대부분의 경우 분석이 이루어지는 설정을 고려하여 설정되어야 하며, 일반적으로 적용할 수 있는 임계값을 결정하는 것은 적절하지도 필요하지 않다.
시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 참조과 비교하여 적어도 2배, 바람직하게는 3배, 보다 바람직하게는 5배, 가장 바람직하게는 10배 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어질 수 있다.
시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 병리적 MS 관련된 자가면역이 없는 일 세트의 참조 대상체로부터의 일 세트의 동등하게 정량화된 참조 샘플의 평균보다 참조 샘플의 세트의 표준 편차의 2배만큼 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어질 수 있다.
시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 스튜던츠 T-시험으로 계산된 P 값이 0.05 미만인 참조보다 통계적으로 유의하게 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어질 수 있다.
시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 만-휘트니 U 시험으로 계산된 P 값이 0.05 미만인 참조보다 통계적으로 유의하게 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어질 수 있다.
특정 설정에서의 적용
a. 방법이 대상체에서 MS를 진단하기 위한 것이고;
b. 참조가 병리적 다발성 경화증 관련된 자가면역이 없는 참조 대상체에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
c. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 다발성 경화증을 나타내는 것인 제4 측면에 따른 방법이 제공된다.
상기 방법은 환자에서 MS의 존재를 검출하는 데 특히 적합하다.
a. 방법이 대상체에서 MS의 과정을 추적하기 위한 것이고;
b. 참조가 동일한 대상체로부터 상이한 시점(바람직하게는 더 이른 시점)에 취한 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
c. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 더 높은 다발성 경화증 질환 활성을 나타내고, 그 반대도 마찬가지인 것인 제4 측면에 따른 방법이 제공된다.
상기 방법은 MS를 앓고 있는 것으로 이미 공지된 대상체에서 MS의 과정을 추적하는 데 특히 적합하다.
a. 방법이 대상체에서 MS 과정의 예후를 만들기 위한 것이고;
b. 참조가 동일한 대상체로부터 상이한 시점에 취한 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
c. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 증가하는 다발성 경화증 질환 활성을 나타내고, 그 반대도 마찬가지인 것
인 제4 측면에 따른 방법이 제공된다.
상기 방법은 이미 MS를 앓는 것으로 공지된 대상에서 MS 과정의 예후를 만드는 데 특히 적합하다. MS가 간헐적 회복을 갖는 재발로 특징화되는 것을 고려할 때, 다가오는 재발을 미리 검출하고 치료를 미리 제공하게 하는 것은 가치가 있다.
a. 방법이 치료적 처치에 대한 대상체의 반응을 평가하기 위한 것이고;
b. 참조가 평가될 치료적 처치의 제공 전에 동일한 대상체로부터 취한 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
c. 시험 샘플이 치료적 처치의 개시 후 동일한 대상체로부터의 것이고;
d. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 낮은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 다발성 경화증 질환 활성에 대한 치료 효능을 나타내고, 변화되지 않거나 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 다발성 경화증 질환 활성에 대한 치료 효능의 결여를 나타내는 것
인 제4 측면에 따른 방법이 제공된다.
상기 방법은 치료적 처치에 대한 대상체의 반응을 평가하는 데 특히 적합하다. 특히, 방법은 개별 환자에 대해 정확한 약물을 선택하고 개별 환자에 대한 용량을 찾기 위해 임상 시험을 수행하는 데 유용하다.
펩티드 또는 펩티도미메틱의 용도
제5 측면에서, MS의 진단 또는 치료에서 펩티드 또는 펩티도미메틱의 용도가 제공되며, 펩티드 또는 펩티도미메틱은 서열 번호: 5에 포함된 특정 T-세포 에피토프를 포함하고, 상기 T-세포 에피토프는 0, 1 또는 2개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 선택된 MS 항원의 하위서열과 상이한 n개의 연속적인 잔기의 아미노산 서열을 포함한다. 용도는 시험관내에서, 특히 진단 용도를 위한 것일 수 있다.
하위서열은 서열 번호: 5의 잔기 1-166, 서열 번호: 5의 잔기 167-295, 서열 번호: 5의 잔기 296-1327, 서열 번호; 5의 잔기 1328-2234, 서열 번호: 5의 잔기 2235-2250 또는 서열 번호: 5의 잔기 1-2234로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, T-세포 에피토프는 FABP7 이소형 2(서열 번호: 1), PROK2(서열 번호: 2), RTN3(서열 번호: 3), SNAP91(서열 번호: 4) 및 FABP7 이소형 1(서열 번호: 6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 MS 항원에 상응할 수 있다.
n의 값은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 수 있다. 바람직하게는 n은 적어도 11, 더욱 바람직하게는 n은 적어도 13, 더욱더 바람직하게는 n은 적어도 15, 더더욱 바람직하게는 n 이상 적어도 17, 보다 더 바람직하게는 n 이상 적어도 19이다. 바람직하게는 m은 1이고, 보다 바람직하게는 m은 0이다.
제5 측면의 T-세포 에피토프는 제1 측면의 치료적 T-세포 에피토프에 대해 정의된 바와 같을 수 있다.
본 개시와 관련된 일반적 측면
용어 "포함하는"은 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본 개시를 제목과 부제목이 있는 섹션으로 배열하는 것은 단지 가독성을 향상시키기 위한 것일 뿐 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 특히 분리는 어떤 식으로든 다른 제목과 부제목 하의 특질을 서로 조합하는 것을 배제하거나 제한하지 않는다.
모든 참조는 참조로 본원에 포함된다.
실시예
하기 실시예는 제한적인 것으로 간주되지 않아야 한다. 실험 세부 사항에 대한 추가 정보를 위해, 숙련된 독자는 재료 및 방법이라는 제목의 별도의 섹션으로 이동한다.
실시예 1: 플루오로스폿 자가항원 스크리닝에 의해 다발성 경화증에서 자가항원의 식별
본 발명자들은 T-세포 활성화에 대한 검정으로서 IFNγ/IL-22/IL-17A 플루오로스폿을 사용하여 45개의 풀로 분할되고 비드에 커플링된 125개의 PrEST 라이브러리에 대한 반응으로 T-세포 활성화를 측정하였다. 스크리닝은 건강 대조군과 비교하여 MS 환자로부터의 PBMC에서 더 높은 T-세포 반응을 자극하는 항원 풀을 검출함으로써 가능한 자가항원을 식별하였다. 도 1에 도시되는 바와 같이, 16명의 환자와 9개의 건강 대조군의 스크리닝에서, 이원 분산 분석을 사용하여 분석 시, 환자의 활성화된 세포의 평균수와 대조군의 활성화된 세포의 평균수 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 볼 수 있었다. IL-22 분비 활성화된 T-세포의 경우, 5개의 항원 풀, 항원 #6(P<0.0001), 항원 #18(P<0.0001), 항원 #23(P<0.0001), 항원 #29(P<0.0001) 및 항원 #33(P<0.05)에 대해 차이가 보였다(패널 a). IL-17 분비 T-세포의 경우, 동일한 5개의 항원, 항원 #6(P<0.05), 항원 #18(P<0.0001), 항원 #23(P<0.01), 항원 #29(P<0.0001) 및 항원 #33(P<0.05)에 대해 환자와 대조군 사이에서 차이를 볼 수 있었다(패널 b). IFNγ의 경우, 항원 #18(P<0.0001)에 대해서만 차이를 볼 수 있었다(패널 c).
도 2는 상기 항원 풀에 대한 개별 환자 및 대조군의 활성화로서 제시된 동일한 데이터를 도시한다.
실시예 2: 항원 풀에 함유된 면역원성 항원의 결정
실시예 1에 기재된 항원 풀 18, 23, 26 및 29를 그에 포함된 개별 단백질로 분할하였다. 실시예 1에서 이들 특정 항원 풀에 대해 높은 정도의 T-세포 활성화를 나타내는 4명의 환자로부터의 PBMC를 개별 단백질에 대한 활성화에 대해 다시 시험하였다. 사용된 방법 및 프로토콜은 실시예 1에서와 동일하였다. 각각의 풀에서, 하나의 특정 단백질이 T-세포 활성화의 명백한 대다수를 유도하였다. 시험된 단백질은, 항원 풀 18, #1 CYB561D2 및 #2 FABP7(서열 번호: 1); #1 NOVA2 및 #2 PROK2(서열 번호: 2)를 함유하는 항원 풀 23; #1 RTN3(서열 번호: 3) 및 #2 SDK2를 함유하는 항원 풀 26; 및 #1 SNAP25 및 #2 SNAP91(서열 번호: 4)을 함유하는 항원 풀 29였다. 결과가 도 3에 제시되었다.
실시예 3: 반응성 프로파일에 기반한 환자 그룹화
개별 대상체의 수준에서 4개의 후보 자가항원에 대한 T-세포 활성화 분석 시, 환자들 사이에서 4개의 구별되는 반응성 프로파일이 관찰되었다. 4명의 환자는 #26을 제외한 모든 후보 항원으로 자극될 때 모든 시토카인을 생성하는 상당한 세포 활성화로 반응하였으며, "프로파일 1a"로 명명된다. 5명의 환자는 #18 및 1 또는 2개 이상의 항원에 대해 모든 시토카인을 생산하는 상당한 세포 활성화로 반응하였으며, "프로파일 1b"로 명명된다. 3명의 환자는 #26에 대해 독점적으로 활성화된 IFNγ-생성 세포로 반응하였으며, "프로파일 2"로 명명된다. 4명의 환자는 비반응자였으며, "프로파일 3"으로 명명된다. 프로파일이 도 4에 제시되어 있다.
프로파일 2의 환자는 환자의 평균 활성화와 대조군의 평균 활성화 사이의 명확한 통계적 차이를 생성하기에는 너무 적었지만(도 1 및 2C 참조), 건강 대조군 중 어느 것에서도 발견되지 않는 현저하게 독특한 프로파일을 가졌다.
실시예 4: 진단 용도의 입증
이들 항원에 대한 T-세포 활성화는 다발성 경화증에 대한 진단 도구 및 바이오마커로서 사용될 수 있다. T-세포 활성화가 진단 도구로서 사용되는 경우의 민감도 및 특이도를 추정하기 위해, 실시예 1의 데이터에 기반하여, 수신자 조작 특성(ROC) 곡선이 생성되었다. 이들 그래프는 도 5 A-F 및 표 1 및 3의 데이터에 제시되어 있다. 항원 #18(FABP7 PrEST 함유) 또는 전체 길이 FABP7 이소형 2(서열 번호: 1)로 자극될 때 IL22 및 IL17 생성 T 세포의 활성화가 특히 유망하여 각각 약 80%의 민감도 및 특이도에 도달한다. 환자 및 대조군 PBMC를 이들 항원 모두의 혼합에 대해 시험하면 이들 수치는 더 높아질 것이다. 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 항원 23 및 29의 조합은 각각의 항원에 비해 보다 민감한 시험을 제공한다.
전체 길이 단백질도 유사한 방식으로 사용될 수 있다(도 9A-D 참조). 4개의 항원에 대한 각각의 개별 평균 반응을 이용하여, 4개의 전체 길이 항원 모두를 활용하면 민감도와 특이도가 더 높아진다(도 9E). 상이한 판독값을 조합하면, 예컨대 IL-17과 IFNγ 사이의 비율을 분석하면 시험의 민감도가 더 높아질 수 있다(도 9E, 표 2)
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 5: 전체 길이 재조합 버젼을 사용하는 MS 항원으로서의 FABP7의 검증
재조합 형태의 인간 FABP7 이소형 2(서열 번호: 1)가 이. 콜라이에서 생성되었다. 단백질은 하우스에서 표준 이. 콜라이 재조합 단백질 프로토콜에 따라 생성되었다. 이를 his-태그 정제를 통해 정제하고, 상자성 비드에 커플링하고 이전에 기재된 프로토콜에 따라 세척하였다. 13명의 환자(이 중 7명은 이전에 포함된 환자의 새로운 샘플링으로 구성되었고 6명은 이전에 시험되지 않음) 및 7명의 대조군(이전 시험에 포함되지 않음)이 이전에 기재된 플루오로스폿 검정으로 T-세포 활성화에 대해 시험되었다.
결과가 도 6에 제시되어 있다. 실시예 1 및 3의 FABP7 PrEST 및 이 실시예에서 사용된 전체 길이 재조합 버전의 결과는 서로 매우 유사하다.
실시예 6: 특정 T-세포 에피토프의 식별
FABP7(크게 겹치는 이소형 2 및 1(각각 서열 번호: 1 및 서열 번호: 6)) 및 PROK2(서열 번호: 2)의 전체 범위를 커버하는 중복 펩티드(15개 aa 길이, 10개 aa 중복)를 FABP7의 경우 6개 분획 및 PROK2의 경우 3개 분획으로 모으고, 플루오로스폿 검정으로 PBMC를 자극하는 데 사용하였다. 6명의 환자로부터의 PBMC를 이들 풀에 대해 시험하였다. 도 7A 및 7B에 나타난 바와 같이, 환자는 각각의 항원에 대한 단일 풀(FABP7에 대해 풀 5, PROK2에 대해 풀 1)에 대해 더 높게 반응하였다. 더 긴 단백질을 사용한 이전의 실시예와 비교하여, 이 실시예는 특정 T-세포 에피토프를 함유하는 아미노산 서열을 갖는 짧은 펩티드가 또한 MS 환자에서 자가반응성 T-세포를 확인하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
양성 펩티드 풀을 추가로 분할하고 실험을 되풀이하여 반복하면 각각의 MS 항원 내의 특정 T-세포 에피토프를 더욱 자세하게 식별할 수 있을 것이다. 15개 aa 보다 짧은 펩티드가 특정 T-세포 에피토프를 완전히 밝히기 위해 디자인되고 시험될 수 있다.
가능한 T-세포 에피토프를 발견하는 또 다른 보완적인 방법은 HLA 결합 실험을 수행하는 것이다. 동일한 중복 펩티드를 경쟁 결합 검정으로 다발성 경화증 연관된 HLA DRB5 01:01 분자에 대한 이들의 결합 친화성에 대해 시험하였다. 이어서, 결합 친화성을 H1N1 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 공지된 강력한 결합제 펩티드의 것과 비교하였다. FABP7 및 PROK2 둘 다에 대해, 환자가 반응한 동일한 펩티드 풀에서 가장 강력한 결합 펩티드가 발견되었으며, 이는 이것이 T-세포 에피토프 후보임을 나타낸다. 결과가 표 4에 제시되어 있다. 상이한 결합 친화도의 대표적인 예가 도 10a-e에 도시되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 7: 재조합의 전체 길이 항원을 사용하는 자가항원 스크리닝의 검증
항원 FABP7(서열 번호: 1), PROK2(서열 번호: 2), RTN3(서열 번호: 3), SNAP91(서열 번호: 4)의 재조합 전체 길이 버전을 하우스에서 표준 재조합 단백질 생성 프로토콜에 따라 이. 콜라이에서 생성하고 his-태그 정제를 통해 정제하였다. 52명의 환자 및 24명의 대조군을 IFNγ/IL17/IL22 플루오로스폿 검정으로 항원에 대한 반응성에 대해 시험하였다. 이전에 시험된 PrEST와 유사하게, SNAP91에 대한 IFNγ를 제외하고는, 분석된 모든 시토카인에 대해 다발성 경화증 환자 PBMC는 모든 4개의 항원에 대해 상당히 높은 반응성이 있었다(도 8A-D 참조).
실시예 8: 항원 특이적 면역요법
항원 특이적 면역요법에서 이전에 공지된 다발성 경화증 자가항원 펩티드 에피토프의 피하, 피내 또는 경피 투여를 이용하는 잘 설명된 이전 연구들이 있다. 예컨대, 발자크 등(Walczak A, Siger M, Szczepanik M, Selmaj K. Transdermal application of myelin peptides in multiple sclerosis treatment. JAMA Neurol. 2013)은, 1년 기간에 걸쳐 경피적으로 투여된, 공지된 자가항원 미엘린 염기성 단백질(MBP), 프로테오리피드 단백질(PLP) 및 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)로부터의 공지된 펩티드의 혼합물을 사용하였으며, 질환 활성은 유의하지만 약간 감소하였다. 카타웨이 등(Cathaway J, Martin K, Barrell K, Sharrack B, Stolt P, Wraith DC. Effects of ATX-MS-1467 immunotherapy over 16 weeks in relapsing multiple sclerosis. Neurology 2018)은, 4주에 걸친 증가되는 용량에 이어 16주에 걸친 최고 용량의 격주 용량으로 피하 주사된, 미엘린 염기성 단백질(MBP)로부터의 4개의 펩티드 에피토프의 혼합물을 사용하였다. 유사하게, 유의하게 긍정적이지만 높지 않은 효과가 나타났다. 이것은 자가 항원에 대한 T-세포 관용의 유도를 통한 항원 특이적 면역요법의 방법이 효과가 있는 접근법임을 나타낸다.
본원에 이전에 기재된 실시예 및 공지된 에피토프 매핑 방법을 기반으로, 본 발명자들은 먼저 FABP7, PROK2, RTN3 및 SNAP91의 특정 펩티드 에피토프를 식별할 것이다. 이어서, 환자는 이전에 기재된 바와 같이 이들 자가항원에 대한 T-세포 반응성에 대해 스크리닝될 것이다. 스크리닝에 기반하여, 펩티드 에피토프의 환자-기반 혼합물을 선별하고, 항원 특이적 면역요법를 위한 확립된 프로토콜에 따라 치료에 사용될 것이다. 이전에 사용된 것보다 더 많은 자가항원으로부터의 펩티드 에피토프로 처리하면, 개별화된 접근법(및 따라서 환자와 관련이 없는 펩티드 에피토프를 포함하지 않음)이 동일하게 유지되므로, 효능은 관용성과 함께 더 클 것으로 예상될 수 있다.
재료 및 방법
유리 카복실산 기를 함유하는 상자성 비드에 단백질의 공유 커플링
직경 1μm의 Dynabeads® MyOne™ 카복실산(ThermoFischer Scientific)을 사용하고, 제조자의 프로토콜 (NHS(N-히드록시숙신이미드) 및 EDC(에틸 카보디이미드)을 사용하는 2단계 절차)에 따라 커플링 절차를 수행하였다.
비드를 MES 완충액(25 mM MES(2-(N-모르폴리노)에탄술폰산), pH 6)으로 2 회 세척하였다. 이어서, MES 완충액 중의 50 mg/ml NHS(N-히드록시숙신이미드) 및 50 mg/ml EDC(N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드)를 비드에 첨가하여 카복실산 기를 활성화시키고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 비드를 자석으로 수집하고, 상청액을 제거하고, 비드를 MES 완충액으로 2회 세척하였다. 단백질을 MES 완충액에서 1 mg/ml, 총 100 ug의 농도로 희석하고, 비드에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비드를 자석으로 수집하고, 상청액을 제거하고, 단백질 농도 측정을 위해 저장하였다. 미반응의 활성화된 카복실산 기를 15분 동안 50 mM Tris pH 7.4로 퀀칭하였다. 이어서, 비드를 PBS pH 7.4로 세척하고 이어서 -80℃에서 저장하였다
비드에 커플링된 단백질의 양을 측정하기 위해, BCA 단백질 검정 키트(Pierce BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific)를 사용하여 커플링 전 및 커플링 후 상청액에서 단백질의 단백질 농도를 측정하였다. BCA 검정은 제조자의 프로토콜에 따라 이용되었다.
변성 세척에 의한 내독소 제거
비드는 이. 콜라이에서 생성된 재조합 단백질과 커플링되었다. 단백질 커플링된 비드를 여러 상이한 변성 조건에서 세척하여 내독소의 제거를 보장하였다. 내독소 제거를 위해, 비드를 RT에서 멸균수 중의 3개의 상이한 세척 완충액, 2M NaOH pH 14.3, 0.5 M L-아르기닌 및 0.1% 트리톤 X100으로 세척하였다. 비드를 완충액에 현탁시키고, 4분 동안 진탕시키고, 자석으로 수집하고, 상청액을 제거하였다. 이것을 5회 반복하였다. 이어서, 비드를 멸균 PBS로 5회 세척하여 임의의 남아있는 세척 완충액을 제거하였다. 남아 있는 내독소를 단핵구 반응성 검정(IL1B/IL6 플루오로스폿 검정, MABTECH, 스웨덴)을 이용하여 측정하였다.
환자
신경과 클리닉 카롤린스카 대학 병원(Solna 및 Huddige)에서 나탈리주맙 치료를 받는 MS를 갖는 총 24명의 환자에게 그들의 일반적인 치료 방문 시 80 ml의 정맥혈 기증에 대해 요청하였다. 이들 환자 중 6명은 추가 실험에 사용하기 위해 최초 샘플링 후 6-12개월에 다시 샘플링되었다(실시예 5).
Figure pct00006
나이 및 성별이 일치된 건강 대조군은 기관 및 클리닉 직원들 사이에서 모집되었다. 대조군은 환자와 동일한 혈액 샘플링 절차를 거쳤다.
PBMC를 표준 프로토콜에 따라 Ficoll-Paque(GE Healthcare, 스웨덴 웁살라) 구배 원심 분리에 의해 정맥혈 샘플(BD 진공채혈관 EDTA-튜브에 채혈)로부터 단리하였다. 세포를 동결 배지(45% FCS, 45% RPMI, 10% DMSO) 중에서 동결시키고, -150℃에서 저장하였다.
전체 길이 항원을 시험하기 위해 두 번째로 큰 코호트를 수집하였다. 이 코호트에는 52명의 환자 및 24명의 건강 대조군이 포함되었다. 포함/제외 기준(표 5), 샘플링 및 PBMC 단리는 동일하였다.
후보 항원 라이브러리
사용된 항원은 왕립 기술연구소(KTH, 스웨덴)로부터 스웨덴 인간 단백질 아틀라스 프로젝트를 위해 입수되었다(Uhlen M, Fagerberg L, Hallstrom BM, Lindskog C, Oksvold P, Mardinoglu A, et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 2015;347(6220):1260419). 이들은, 인간 단백질의 독특한 부분을 나타내는 짧은 재조합 10-12kDa 펩티드인, 단백질 에피토프 시그니처 태그(PrEST)로 이루어진다. PrEST는 에스케리키아 콜라이에서 생성되었으며, 태그를 통해 정제되었다. 이 프로젝트를 위한 PrEST는 하기 기준에 의해 선별되었다 : 1) 공개된 데이터에 따라 MS에 관여되는 것으로 추정된 단백질. 2) 미엘린 시트의 주요 구조 단백질. 3) 당해 분야의 전문가와의 소통에 의해 선택된 관심 단백질. 4) 이전에 질환과 연관되지 않은 고도로 발현되는 CNS 특이적 단백질. 70개의 상이한 단백질로부터의 125개의 PrEST가 모두 이 시험에 사용되었다.
전체 길이 항원의 생성
실시예 1 및 2에 기재된 PrEST의 스크리닝으로부터 선택된 항원(FABP7, PROK2, RTN3 및 SNAP91)을 단백질의 전체 길이 버전에 대한 추가 시험을 위해 선택하였다. 항원 및 히스타민 태그를 코딩하는 플라스미드를 에스케리키아 콜라이로 형질전환시켜 전체 길이 항원을 생성하였다. 성장시킨 후, 세균을 용해시키고, 단백질을 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 칼럼 상에서 6x 히스티딘-태그 정제를 통해 세균 용해물의 상청액으로부터 정제하였다. 이어서, 항원을 비드에 커플링시키고 이전에 기재된 바와 같이 내독소를 세척하였다.
플루오로스폿 T-세포 활성화 검정
플루오로스폿 검정은 세포 배양 후드에서 멸균 조건 하에서 수행되었다. 세포를 37℃에서 수조에서 해동시키고, cRPMI(10% 우태 혈청, 1% 200 mM L-글루타민, 1% 10,000 U/ml 페니실린-10 mg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지, Sigma Aldrich)로 세척하였다. 세포를 광학 현미경(Nikon TMS-F, Nikon, 일본)을 사용하여 수동으로 계수하고, 이어서 cRPMI에 2,5x106개 세포/ml의 농도로 희석시켰다. 플루오로스폿 플레이트(인간 IFNγ/IL-22/IL-17A 플루오로스폿 키트, 사전 코팅됨, Mabtech, 스웨덴)를 PBS로 세척한 다음, cRPMI로 30분 동안 실온에서 차단하였다. 이어서, 차단 cRPMI를 버리고, 100 μl의 새로운 cRPMI를 플루오로스폿 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 항원(3x10^6개 비드)을 특정 레이아웃에 따라 각각의 웰에 이중으로 첨가하였다. 제조자의 프로토콜에 따라, 항-CD3을 양성 대조군으로 사용하였다. 커플링되지 않은 비드 및 자극이 없는 배지 둘 다를 음성 대조군으로 사용하였다. 100 μl cRPMI 중의 PBMC(250,000개 세포)를 각각의 웰에 첨가하였다(항-CD3의 경우 125,000개 세포). 플레이트를 인큐베이터(37℃ 가습됨, 5% CO2)에 44시간 동안 두었다. 스폿의 발생은 제조자의 프로토콜에 따라 제조되었다.
중복 펩티드
FABP7 이소형 1 및 2 및 PROK2의 전체에 걸친 연속적인 중복 펩티드(15개 아미노산 길이, 10개 아미노산 중복)는 상업적 판매자로부터 동결건조된 형태로 구입하고, 이어서 100% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 50-100 mg/ml의 농도로 현탁시켰다. 이어서, 이들을 멸균 PBS 중에 5 mg/ml의 농도로 추가로 희석시켰다. 이들을, 각각 5-7개의 펩티드를 함유하는, FABP7에 대한 6개의 분획 및 PROK2에 대한 3개의 분획으로 모았다. 각각의 풀은 전체 길이 단백질에서 서로 옆에 위치된다. 6명의 MS 환자로부터의 세포를 이전에 기재된 프로토콜에 따라 플루오로스폿 검정으로 이들에 대해 시험하였다. 세포 배양 웰에서 각각의 펩티드의 최종 농도는 5 μg/ml였다.
항원 특이적 면역요법
식별된 자가항원 FABP7, PROK2, RTN3 및 SNAP91을 표적으로 하는 항원 특이적 면역요법의 안전성, 관용성 및 효능을 평가하기 위한 임상 시험이 수행될 것이다. 먼저, 각각의 항원으로부터의 면역우세 에피토프는 실시예 6에서 이전에 기재된 바와 같이 식별될 것이다. 두 번째로, 연구 참여자(다발성 경화증 환자)는 실시예 7에 기재된 방법을 사용하여 자가항원에 대한 T-세포 활성에 대해 스크리닝될 것이다. 자가항원에 대해 반응성을 갖는 환자는 시험에 포함될 자격이 주어질 것이다. 치료는 각각의 자가항원으로부터의 하나 또는 여러 개의 면역우세 펩티드 에피토프의 혼합물 또는 환자가 사전-포함 스크리닝에서 반응한 자가항원만으로부터의 하나 또는 여러 개의 면역우세 펩티드 에피토프의 혼합물로 이루어질 수 있다.
치료 프로토콜은 이전에 발표된 성공적인 항원 특이적 면역요법 프로토콜에 기반할 것이다(Cathaway J, Martin K, Barrell K, Sharrack B, Stolt P, Wraith DC. Effects of ATX-MS-1467 immunotherapy over 16 weeks in relapsing multiple sclerosis. Neurology 2018)(Walczak A, Siger M, Szczepanik M, Selmaj K. Transdermal application of myelin peptides in multiple sclerosis treatment. JAMA Neurol. 2013). 하나의 대안적인 프로토콜에서, 치료는 펩티드 에피토프 혼합물의 매주/격주 피하 또는 피내 주사로 이루어지며, 저용량으로 시작하여 원하는 고용량에 도달할 때까지 상향-투여 기간이 뒤따를 것이다. 이어서, 제한된 기간 동안 고용량의 매주/격주 주사 기간이 뒤따를 것이다. 대안적으로, 펩티드 에피토프는 유사한 방식으로, 단 피부, 설하 또는 경구로 투여될 것이다. 안전성 및 관용성은 지속적으로 평가되고, 효능은 완전한 치료 후 평가될 것이다. 종점은 효능 파라미터, 예컨대 병변의 수 및 부피의 자기 공명 이미징-기반 평가 및 확장된 장애 상태 점수(EDSS) 및 최초 재발 시간 또는 재발 빈도를 포함하는 임상 변수의 조합으로 이루어질 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> TCER AB <120> MULTIPLE SCLEROSIS ASSOCIATED AUTOANTIGENS, AND USE THEREOF IN THERAPY AND DIAGNOSIS <130> NP0262WO <150> SE 1750372-3 <151> 2017-03-29 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Glu Ala Phe Cys Ala Thr Trp Lys Leu Thr Asn Ser Gln Asn 1 5 10 15 Phe Asp Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe Ala Thr Arg Gln 20 25 30 Val Gly Asn Val Thr Lys Pro Thr Val Ile Ile Ser Gln Glu Gly Asp 35 40 45 Lys Val Val Ile Arg Thr Leu Ser Thr Phe Lys Asn Thr Glu Ile Ser 50 55 60 Phe Gln Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Thr Thr Ala Asp Asp Arg Asn 65 70 75 80 Cys Lys Ser Val Val Ser Leu Asp Gly Asp Lys Leu Val His Ile Gln 85 90 95 Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Asn Phe Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly 100 105 110 Lys Met Val Met Val Ser Asn Asp Asn Ser Pro Phe Phe Leu Val Phe 115 120 125 Phe Ser Ser Pro His Thr Ser His Leu Leu Pro Ser Ser Ser Leu Leu 130 135 140 Leu Pro Phe Phe Leu Leu Pro Ser Phe Phe Asn Asn Thr Ser Leu Ala 145 150 155 160 Arg Phe Phe Asn Tyr Met 165 <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ser Leu Cys Cys Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro 1 5 10 15 Pro Leu Leu Leu Thr Pro Arg Ala Gly Asp Ala Ala Val Ile Thr Gly 20 25 30 Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gln Cys Gly Gly Gly Met Cys Cys Ala Val 35 40 45 Ser Ile Trp Val Lys Ser Ile Arg Ile Cys Thr Pro Met Gly Lys Leu 50 55 60 Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Asn Asn Phe Gly Asn Gly 65 70 75 80 Arg Gln Glu Arg Arg Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Glu Val 85 90 95 Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly 100 105 110 Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe Ile Cys Leu Ala Gln 115 120 125 Lys <210> 3 <211> 1032 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Glu Pro Ser Ala Ala Thr Gln Ser His Ser Ile Ser Ser Ser 1 5 10 15 Ser Phe Gly Ala Glu Pro Ser Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly 20 25 30 Ala Cys Pro Ala Leu Gly Thr Lys Ser Cys Ser Ser Ser Cys Ala Asp 35 40 45 Ser Phe Val Ser Ser Ser Ser Ser 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Glu Ser Thr Asp Asp Phe 260 265 270 Gly Ser Trp Ser Val His Thr Asp Lys Glu Ser Ser Glu Asp Ile Ser 275 280 285 Glu Thr Asn Asp Lys Leu Phe Pro Leu Arg Asn Lys Glu Ala Gly Arg 290 295 300 Tyr Pro Met Ser Ala Leu Leu Ser Arg Gln Phe Ser His Thr Asn Ala 305 310 315 320 Ala Leu Glu Glu Val Ser Arg Cys Val Asn Asp Met His Asn Phe Thr 325 330 335 Asn Glu Ile Leu Thr Trp Asp Leu Val Pro Gln Val Lys Gln Gln Thr 340 345 350 Asp Lys Ser Ser Asp Cys Ile Thr Lys Thr Thr Gly Leu Asp Met Ser 355 360 365 Glu Tyr Asn Ser Glu Ile Pro Val Val Asn Leu Lys Thr Ser Thr His 370 375 380 Gln Lys Thr Pro Val Cys Ser Ile Asp Gly Ser Thr Pro Ile Thr Lys 385 390 395 400 Ser Thr Gly Asp Trp Ala Glu Ala Ser Leu Gln Gln Glu Asn Ala Ile 405 410 415 Thr Gly Lys Pro Val Pro Asp Ser Leu Asn Ser Thr Lys Glu Phe Ser 420 425 430 Ile Lys Gly Val Gln Gly Asn Met Gln Lys Gln Asp Asp Thr Leu Ala 435 440 445 Glu Leu Pro Gly Ser Pro Pro Glu Lys Cys Asp Ser Leu Gly Ser Gly 450 455 460 Val Ala Thr Val Lys Val Val Leu Pro Asp Asp 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Ser Phe Arg Ile Tyr 885 890 895 Lys Ser Val Ile Gln Ala Val Gln Lys Ser Glu Glu Gly His Pro Phe 900 905 910 Lys Ala Tyr Leu Asp Val Asp Ile Thr Leu Ser Ser Glu Ala Phe His 915 920 925 Asn Tyr Met Asn Ala Ala Met Val His Ile Asn Arg Ala Leu Lys Leu 930 935 940 Ile Ile Arg Leu Phe Leu Val Glu Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys Leu 945 950 955 960 Ala Val Phe Met Trp Leu Met Thr Tyr Val Gly Ala Val Phe Asn Gly 965 970 975 Ile Thr Leu Leu Ile Leu Ala Glu Leu Leu Ile Phe Ser Val Pro Ile 980 985 990 Val Tyr Glu Lys Tyr Lys Thr Gln Ile Asp His Tyr Val Gly Ile Ala 995 1000 1005 Arg Asp Gln Thr Lys Ser Ile Val Glu Lys Ile Gln Ala Lys Leu 1010 1015 1020 Pro Gly Ile Ala Lys Lys Lys Ala Glu 1025 1030 <210> 4 <211> 907 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Gly Gln Thr Leu Thr Asp Arg Ile Ala Ala Ala Gln Tyr Ser 1 5 10 15 Val Thr Gly Ser Ala Val Ala Arg Ala Val Cys Lys Ala Thr Thr His 20 25 30 Glu Val Met Gly Pro Lys Lys Lys His Leu Asp Tyr Leu Ile Gln Ala 35 40 45 Thr Asn Glu Thr Asn Val Asn Ile Pro Gln Met Ala Asp Thr Leu Phe 50 55 60 Glu Arg Ala Thr Asn Ser Ser Trp Val Val Val Phe Lys Ala Leu Val 65 70 75 80 Thr Thr His His Leu Met Val His Gly Asn Glu Arg Phe Ile Gln Tyr 85 90 95 Leu Ala Ser Arg Asn Thr Leu Phe Asn Leu Ser Asn Phe Leu Asp Lys 100 105 110 Ser Gly Ser His Gly Tyr Asp Met Ser Thr Phe Ile Arg Arg Tyr Ser 115 120 125 Arg Tyr Leu Asn Glu Lys Ala Phe Ser Tyr Arg Gln Met Ala Phe Asp 130 135 140 Phe Ala Arg Val Lys Lys Gly Ala Asp Gly Val Met Arg Thr Met Ala 145 150 155 160 Pro Glu Lys Leu Leu Lys Ser Met Pro Ile Leu Gln Gly Gln Ile Asp 165 170 175 Ala Leu Leu Glu Phe Asp Val His Pro Asn Glu Leu Thr Asn Gly Val 180 185 190 Ile Asn Ala Ala Phe Met Leu Leu Phe Lys Asp Leu Ile Lys Leu Phe 195 200 205 Ala Cys Tyr Asn Asp Gly Val Ile Asn Leu Leu Glu Lys Phe Phe Glu 210 215 220 Met Lys Lys Gly Gln Cys Lys Asp Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Arg Phe 225 230 235 240 Leu Thr Arg Met Thr Arg Val Ser Glu Phe Leu Lys Val Ala Glu Gln 245 250 255 Val Gly Ile Asp Lys Gly Asp Ile Pro Asp Leu Thr Gln Ala Pro Ser 260 265 270 Ser Leu Met Glu Thr Leu Glu Gln His Leu Asn Thr Leu Glu Gly Lys 275 280 285 Lys Pro Gly Asn Asn Glu Gly Ser Gly Ala Pro Ser Pro Leu Ser Lys 290 295 300 Ser Ser Pro Ala Thr Thr Val Thr Ser Pro Asn Ser Thr Pro Ala Lys 305 310 315 320 Thr Ile Asp Thr Ser Pro Pro Val Asp Leu Phe Ala Thr Ala Ser Ala 325 330 335 Ala Val Pro Val Ser Thr Ser Lys Pro Ser Ser Asp Leu Leu Asp Leu 340 345 350 Gln Pro Asp Phe Ser Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala 355 360 365 Pro Pro Pro Pro Ala Gly Gly Ala Thr Ala Trp Gly Asp Leu Leu Gly 370 375 380 Glu Asp Ser Leu Ala Ala Leu Ser Ser Val Pro Ser Glu Ala Gln Ile 385 390 395 400 Ser Asp Pro Phe Ala Pro Glu Pro Thr Pro Pro Thr Thr Thr Ala Glu 405 410 415 Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ser Ala Ser Thr Thr Thr Thr Val Thr Ala 420 425 430 Val Thr Ala Glu Val Asp Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ala Ala Ser Pro 435 440 445 Gly Glu Ala Pro Ala Ala Ser Glu Gly Ala Ala Ala Pro Ala Thr Pro 450 455 460 Thr Pro Val Ala Ala Ala Leu Asp Ala Cys Ser Gly Asn Asp Pro Phe 465 470 475 480 Ala Pro Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ala Ala Pro Glu Leu Asp Leu Phe 485 490 495 Ala Met Lys Pro Pro Glu Thr Ser Val Pro Val Val Thr Pro Thr Ala 500 505 510 Ser Thr Ala Pro Pro Val Pro Ala Thr Ala Pro Ser Pro Ala Pro Ala 515 520 525 Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr 530 535 540 Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ala Ala Thr Ala Thr Thr Ala Pro Pro Ala 545 550 555 560 Leu Asp Ile Phe Gly Asp Leu Phe Glu Ser Thr Pro Glu Val Ala Ala 565 570 575 Ala Pro Lys Pro Asp Ala Ala Pro Ser Ile Asp Leu Phe Ser Thr Asp 580 585 590 Ala Phe Ser Ser Pro Pro Gln Gly Ala Ser Pro Val Pro Glu Ser Ser 595 600 605 Leu Thr Ala Asp Leu Leu Ser Val Asp Ala Phe Ala Ala Pro Ser Pro 610 615 620 Ala Thr Thr Ala Ser Pro Ala Lys Val Asp Ser Ser Gly Val Ile Asp 625 630 635 640 Leu Phe Gly Asp Ala Phe Gly Ser Ser Ala Ser Glu Pro Gln Pro Ala 645 650 655 Ser Gln Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ala Asp Leu Leu Ala Gly 660 665 670 Phe Gly Gly Ser Phe Met Ala Pro Ser Pro Ser Pro Val Thr Pro Ala 675 680 685 Gln Asn Asn Leu Leu Gln Pro Asn Phe Glu Ala Ala Phe Gly Thr Thr 690 695 700 Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Phe Asp Pro Ser Val Phe Asp Gly 705 710 715 720 Leu Gly Asp Leu Leu Met Pro Thr Met Ala Pro Ala Gly Gln Pro Ala 725 730 735 Pro Val Ser Met Val Pro Pro Ser Pro Ala Met Ala Ala Ser Lys Ala 740 745 750 Leu Gly Ser Asp Leu Asp Ser Ser Leu Ala Ser Leu Val Gly Asn Leu 755 760 765 Gly Ile Ser Gly Thr Thr Thr Lys Lys Gly Asp Leu Gln Trp Asn Ala 770 775 780 Gly Glu Lys Lys Leu Thr Gly Gly Ala Asn Trp Gln Pro Lys Val Ala 785 790 795 800 Pro Ala Thr Trp Ser Ala Gly Val Pro Pro Ser Ala Pro Leu Gln Gly 805 810 815 Ala Val Pro Pro Thr Ser Ser Val Pro Pro Val Ala Gly Ala Pro Ser 820 825 830 Val Gly Gln Pro Gly Ala Gly Phe Gly Met Pro Pro Ala Gly Thr Gly 835 840 845 Met Pro Met Met Pro Gln Gln Pro Val Met Phe Ala Gln Pro Met Met 850 855 860 Arg Pro Pro Phe Gly Ala Ala Ala Val Pro Gly Thr Gln Leu Ser Pro 865 870 875 880 Ser Pro Thr Pro Ala Ser Gln Ser Pro Lys Lys Pro Pro Ala Lys Asp 885 890 895 Pro Leu Ala Asp Leu Asn Ile Lys Asp Phe Leu 900 905 <210> 5 <211> 2250 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Combined sequence of human proteins FABP7, PROK2, RTN3 and SNAP91. <400> 5 Met Val Glu Ala Phe Cys Ala Thr Trp Lys Leu Thr Asn Ser Gln Asn 1 5 10 15 Phe Asp Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe Ala Thr Arg Gln 20 25 30 Val Gly Asn Val Thr Lys Pro Thr Val Ile Ile Ser Gln Glu Gly Asp 35 40 45 Lys Val Val Ile Arg Thr Leu Ser Thr Phe Lys Asn Thr Glu Ile Ser 50 55 60 Phe Gln Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Thr Thr Ala Asp Asp Arg Asn 65 70 75 80 Cys Lys Ser Val Val Ser Leu Asp Gly Asp Lys Leu Val His Ile Gln 85 90 95 Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Asn Phe Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly 100 105 110 Lys Met Val Met Val Ser Asn Asp Asn Ser Pro Phe Phe Leu Val Phe 115 120 125 Phe Ser Ser Pro His Thr Ser His Leu Leu Pro Ser Ser Ser Leu Leu 130 135 140 Leu Pro Phe Phe Leu Leu Pro Ser Phe Phe Asn Asn Thr Ser Leu Ala 145 150 155 160 Arg Phe Phe Asn Tyr Met Met Arg Ser Leu Cys Cys Ala Pro Leu Leu 165 170 175 Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Thr Pro Arg Ala Gly Asp 180 185 190 Ala Ala Val Ile Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gln Cys Gly Gly 195 200 205 Gly Met Cys Cys Ala Val Ser Ile Trp Val Lys Ser Ile Arg Ile Cys 210 215 220 Thr Pro Met Gly Lys Leu Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys 225 230 235 240 Asn Asn Phe Gly Asn Gly Arg Gln Glu Arg Arg Lys Arg Lys Arg Ser 245 250 255 Lys Arg Lys Lys Glu Val Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr 260 265 270 Cys Pro Cys Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg 275 280 285 Phe Ile Cys Leu Ala Gln Lys Met Ala Glu Pro Ser Ala Ala Thr Gln 290 295 300 Ser His Ser Ile Ser Ser Ser Ser Phe Gly Ala Glu Pro Ser Ala Pro 305 310 315 320 Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Ala Cys Pro Ala Leu Gly Thr Lys Ser 325 330 335 Cys Ser Ser Ser Cys Ala Asp Ser Phe Val Ser Ser Ser Ser Ser Gln 340 345 350 Pro Val Ser Leu Phe Ser Thr Ser Gln Glu Gly Leu Ser Ser Leu Cys 355 360 365 Ser Asp Glu Pro Ser Ser Glu Ile Met Thr Ser Ser Phe Leu Ser Ser 370 375 380 Ser Glu Ile His Asn Thr Gly Leu Thr Ile Leu His Gly Glu Lys Ser 385 390 395 400 His Val Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Ala Lys Glu Gly Lys Asp His 405 410 415 Leu Asp Leu Leu Asp Met Lys Lys Met Glu Lys Pro Gln Gly Thr Ser 420 425 430 Asn Asn Val Ser Asp Ser Ser Val Ser Leu Ala Ala Gly Val His Cys 435 440 445 Asp Arg Pro Ser Ile Pro Ala Ser Phe Pro Glu His Pro Ala Phe Leu 450 455 460 Ser Lys Lys Ile Gly Gln Val Glu Glu Gln Ile Asp Lys Glu Thr Lys 465 470 475 480 Asn Pro Asn Gly Val Ser Ser Arg Glu Ala Lys Thr Ala Leu Asp Ala 485 490 495 Asp Asp Arg Phe Thr Leu Leu Thr Ala Gln Lys Pro Pro Thr Glu Tyr 500 505 510 Ser Lys Val Glu Gly Ile Tyr Thr Tyr Ser Leu Ser Pro Ser Lys Val 515 520 525 Ser Gly Asp Asp Val Ile Glu Lys Asp Ser Pro Glu Ser Pro Phe Glu 530 535 540 Val Ile Ile Asp Lys Ala Ala Phe Asp Lys Glu Phe Lys Asp Ser Tyr 545 550 555 560 Lys Glu Ser Thr Asp Asp Phe Gly Ser Trp Ser Val His Thr Asp Lys 565 570 575 Glu Ser Ser Glu Asp Ile Ser Glu Thr Asn Asp Lys Leu Phe Pro Leu 580 585 590 Arg Asn Lys Glu Ala Gly Arg Tyr Pro Met Ser Ala Leu Leu Ser Arg 595 600 605 Gln Phe Ser His Thr Asn Ala Ala Leu Glu Glu Val Ser Arg Cys Val 610 615 620 Asn Asp Met His Asn Phe Thr Asn Glu Ile Leu Thr Trp Asp Leu Val 625 630 635 640 Pro Gln Val Lys Gln Gln Thr Asp Lys Ser Ser Asp Cys Ile Thr Lys 645 650 655 Thr Thr Gly Leu Asp Met Ser Glu Tyr Asn Ser Glu Ile Pro Val Val 660 665 670 Asn Leu Lys Thr Ser Thr His Gln Lys Thr Pro Val Cys Ser Ile Asp 675 680 685 Gly Ser Thr Pro Ile Thr Lys Ser Thr Gly Asp Trp Ala Glu Ala Ser 690 695 700 Leu Gln Gln Glu Asn Ala Ile Thr Gly Lys Pro Val Pro Asp Ser Leu 705 710 715 720 Asn Ser Thr Lys Glu Phe Ser Ile Lys Gly Val Gln Gly Asn Met Gln 725 730 735 Lys Gln Asp Asp Thr Leu Ala Glu Leu Pro Gly Ser Pro Pro Glu Lys 740 745 750 Cys Asp Ser Leu Gly Ser Gly Val Ala Thr Val Lys Val Val Leu Pro 755 760 765 Asp Asp His Leu Lys Asp Glu Met Asp Trp Gln Ser Ser Ala Leu Gly 770 775 780 Glu Ile Thr Glu Ala Asp Ser Ser Gly Glu Ser Asp Asp Thr Val Ile 785 790 795 800 Glu Asp Ile Thr Ala Asp Thr Ser Phe Glu Asn Asn Lys Ile Gln Ala 805 810 815 Glu Lys Pro Val Ser Ile Pro Ser Ala Val Val Lys Thr Gly Glu Arg 820 825 830 Glu Ile Lys Glu Ile Pro Ser Cys Glu Arg Glu Glu Lys Thr Ser Lys 835 840 845 Asn Phe Glu Glu Leu Val Ser Asp Ser Glu Leu His Gln Asp Gln Pro 850 855 860 Asp Ile Leu Gly Arg Ser Pro Ala Ser Glu Ala Ala Cys Ser Lys Val 865 870 875 880 Pro Asp Thr Asn Val Ser Leu Glu Asp Val Ser Glu Val Ala Pro Glu 885 890 895 Lys Pro Ile Thr Thr Glu Asn Pro Lys Leu Pro Ser Thr Val Ser Pro 900 905 910 Asn Val Phe Asn Glu Thr Glu Phe Ser Leu Asn Val Thr Thr Ser Ala 915 920 925 Tyr Leu Glu Ser Leu His Gly Lys Asn Val Lys His Ile Asp Asp Ser 930 935 940 Ser Pro Glu Asp Leu Ile Ala Ala Phe Thr Glu Thr Arg Asp Lys Gly 945 950 955 960 Ile Val Asp Ser Glu Arg Asn Ala Phe Lys Ala Ile Ser Glu Lys Met 965 970 975 Thr Asp Phe Lys Thr Thr Pro Pro Val Glu Val Leu His Glu Asn Glu 980 985 990 Ser Gly Gly Ser Glu Ile Lys Asp Ile Gly Ser Lys Tyr Ser Glu Gln 995 1000 1005 Ser Lys Glu Thr Asn Gly Ser Glu Pro Leu Gly Val Phe Pro Thr 1010 1015 1020 Gln Gly Thr Pro Val Ala Ser Leu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Leu 1025 1030 1035 Thr Ile Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gly Glu Arg Gln Val Glu Lys 1040 1045 1050 Ser Thr Ser Ala Gln Arg Asp Ala Glu Leu Pro Ser Glu Glu Val 1055 1060 1065 Leu Lys Gln Thr Phe Thr Phe Ala Pro Glu Ser Trp Pro Gln Arg 1070 1075 1080 Ser Tyr Asp Ile Leu Glu Arg Asn Val Lys Asn Gly Ser Asp Leu 1085 1090 1095 Gly Ile Ser Gln Lys Pro Ile Thr Ile Arg Glu Thr Thr Arg Val 1100 1105 1110 Asp Ala Val Ser Ser Leu Ser Lys Thr Glu Leu Val Lys Lys His 1115 1120 1125 Val Leu Ala Arg Leu Leu Thr Asp Phe Ser Val His Asp Leu Ile 1130 1135 1140 Phe Trp Arg Asp Val Lys Lys Thr Gly Phe Val Phe Gly Thr Thr 1145 1150 1155 Leu Ile Met Leu Leu Ser Leu Ala Ala Phe Ser Val Ile Ser Val 1160 1165 1170 Val Ser Tyr Leu Ile Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe 1175 1180 1185 Arg Ile Tyr Lys Ser Val Ile Gln Ala Val Gln Lys Ser Glu Glu 1190 1195 1200 Gly His Pro Phe Lys Ala Tyr Leu Asp Val Asp Ile Thr Leu Ser 1205 1210 1215 Ser Glu Ala Phe His Asn Tyr Met Asn Ala Ala Met Val His Ile 1220 1225 1230 Asn Arg Ala Leu Lys Leu Ile Ile Arg Leu Phe Leu Val Glu Asp 1235 1240 1245 Leu Val Asp Ser Leu Lys Leu Ala Val Phe Met Trp Leu Met Thr 1250 1255 1260 Tyr Val Gly Ala Val Phe Asn Gly Ile Thr Leu Leu Ile Leu Ala 1265 1270 1275 Glu Leu Leu Ile Phe Ser Val Pro Ile Val Tyr Glu Lys Tyr Lys 1280 1285 1290 Thr Gln Ile Asp His Tyr Val Gly Ile Ala Arg Asp Gln Thr Lys 1295 1300 1305 Ser Ile Val Glu Lys Ile Gln Ala Lys Leu Pro Gly Ile Ala Lys 1310 1315 1320 Lys Lys Ala Glu Met Ser Gly Gln Thr Leu Thr Asp Arg Ile Ala 1325 1330 1335 Ala Ala Gln Tyr Ser Val Thr Gly Ser Ala Val Ala Arg Ala Val 1340 1345 1350 Cys Lys Ala Thr Thr His Glu Val Met Gly Pro Lys Lys Lys His 1355 1360 1365 Leu Asp Tyr Leu Ile Gln Ala Thr Asn Glu Thr Asn Val Asn Ile 1370 1375 1380 Pro Gln Met Ala Asp Thr Leu Phe Glu Arg Ala Thr Asn Ser Ser 1385 1390 1395 Trp Val Val Val Phe Lys Ala Leu Val Thr Thr His His Leu Met 1400 1405 1410 Val His Gly Asn Glu Arg Phe Ile Gln Tyr Leu Ala Ser Arg Asn 1415 1420 1425 Thr Leu Phe Asn Leu Ser Asn Phe Leu Asp Lys Ser Gly Ser His 1430 1435 1440 Gly Tyr Asp Met Ser Thr Phe Ile Arg Arg Tyr Ser Arg Tyr Leu 1445 1450 1455 Asn Glu Lys Ala Phe Ser Tyr Arg Gln Met Ala Phe Asp Phe Ala 1460 1465 1470 Arg Val Lys Lys Gly Ala Asp Gly Val Met Arg Thr Met Ala Pro 1475 1480 1485 Glu Lys Leu Leu Lys Ser Met Pro Ile Leu Gln Gly Gln Ile Asp 1490 1495 1500 Ala Leu Leu Glu Phe Asp Val His Pro Asn Glu Leu Thr Asn Gly 1505 1510 1515 Val Ile Asn Ala Ala Phe Met Leu Leu Phe Lys Asp Leu Ile Lys 1520 1525 1530 Leu Phe Ala Cys Tyr Asn Asp Gly Val Ile Asn Leu Leu Glu Lys 1535 1540 1545 Phe Phe Glu Met Lys Lys Gly Gln Cys Lys Asp Ala Leu Glu Ile 1550 1555 1560 Tyr Lys Arg Phe Leu Thr Arg Met Thr Arg Val Ser Glu Phe Leu 1565 1570 1575 Lys Val Ala Glu Gln Val Gly Ile Asp Lys Gly Asp Ile Pro Asp 1580 1585 1590 Leu Thr Gln Ala Pro Ser Ser Leu Met Glu Thr Leu Glu Gln His 1595 1600 1605 Leu Asn Thr Leu Glu Gly Lys Lys Pro Gly Asn Asn Glu Gly Ser 1610 1615 1620 Gly Ala Pro Ser Pro Leu Ser Lys Ser Ser Pro Ala Thr Thr Val 1625 1630 1635 Thr Ser Pro Asn Ser Thr Pro Ala Lys Thr Ile Asp Thr Ser Pro 1640 1645 1650 Pro Val Asp Leu Phe Ala Thr Ala Ser Ala Ala Val Pro Val Ser 1655 1660 1665 Thr Ser Lys Pro Ser Ser Asp Leu Leu Asp Leu Gln Pro Asp Phe 1670 1675 1680 Ser Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Pro Pro 1685 1690 1695 Pro Ala Gly Gly Ala Thr Ala Trp Gly Asp Leu Leu Gly Glu Asp 1700 1705 1710 Ser Leu Ala Ala Leu Ser Ser Val Pro Ser Glu Ala Gln Ile Ser 1715 1720 1725 Asp Pro Phe Ala Pro Glu Pro Thr Pro Pro Thr Thr Thr Ala Glu 1730 1735 1740 Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ser Ala Ser Thr Thr Thr Thr Val Thr 1745 1750 1755 Ala Val Thr Ala Glu Val Asp Leu Phe Gly Asp Ala Phe Ala Ala 1760 1765 1770 Ser Pro Gly Glu Ala Pro Ala Ala Ser Glu Gly Ala Ala Ala Pro 1775 1780 1785 Ala Thr Pro Thr Pro Val Ala Ala Ala Leu Asp Ala Cys Ser Gly 1790 1795 1800 Asn Asp Pro Phe Ala Pro Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ala Ala Pro 1805 1810 1815 Glu Leu Asp Leu Phe Ala Met Lys Pro Pro Glu Thr Ser Val Pro 1820 1825 1830 Val Val Thr Pro Thr Ala Ser Thr Ala Pro Pro Val Pro Ala Thr 1835 1840 1845 Ala Pro Ser Pro Ala Pro Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr 1850 1855 1860 Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ala 1865 1870 1875 Ala Thr Ala Thr Thr Ala Pro Pro Ala Leu Asp Ile Phe Gly Asp 1880 1885 1890 Leu Phe Glu Ser Thr Pro Glu Val Ala Ala Ala Pro Lys Pro Asp 1895 1900 1905 Ala Ala Pro Ser Ile Asp Leu Phe Ser Thr Asp Ala Phe Ser Ser 1910 1915 1920 Pro Pro Gln Gly Ala Ser Pro Val Pro Glu Ser Ser Leu Thr Ala 1925 1930 1935 Asp Leu Leu Ser Val Asp Ala Phe Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr 1940 1945 1950 Thr Ala Ser Pro Ala Lys Val Asp Ser Ser Gly Val Ile Asp Leu 1955 1960 1965 Phe Gly Asp Ala Phe Gly Ser Ser Ala Ser Glu Pro Gln Pro Ala 1970 1975 1980 Ser Gln Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ala Asp Leu Leu Ala 1985 1990 1995 Gly Phe Gly Gly Ser Phe Met Ala Pro Ser Pro Ser Pro Val Thr 2000 2005 2010 Pro Ala Gln Asn Asn Leu Leu Gln Pro Asn Phe Glu Ala Ala Phe 2015 2020 2025 Gly Thr Thr Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Phe Asp Pro Ser 2030 2035 2040 Val Phe Asp Gly Leu Gly Asp Leu Leu Met Pro Thr Met Ala Pro 2045 2050 2055 Ala Gly Gln Pro Ala Pro Val Ser Met Val Pro Pro Ser Pro Ala 2060 2065 2070 Met Ala Ala Ser Lys Ala Leu Gly Ser Asp Leu Asp Ser Ser Leu 2075 2080 2085 Ala Ser Leu Val Gly Asn Leu Gly Ile Ser Gly Thr Thr Thr Lys 2090 2095 2100 Lys Gly Asp Leu Gln Trp Asn Ala Gly Glu Lys Lys Leu Thr Gly 2105 2110 2115 Gly Ala Asn Trp Gln Pro Lys Val Ala Pro Ala Thr Trp Ser Ala 2120 2125 2130 Gly Val Pro Pro Ser Ala Pro Leu Gln Gly Ala Val Pro Pro Thr 2135 2140 2145 Ser Ser Val Pro Pro Val Ala Gly Ala Pro Ser Val Gly Gln Pro 2150 2155 2160 Gly Ala Gly Phe Gly Met Pro Pro Ala Gly Thr Gly Met Pro Met 2165 2170 2175 Met Pro Gln Gln Pro Val Met Phe Ala Gln Pro Met Met Arg Pro 2180 2185 2190 Pro Phe Gly Ala Ala Ala Val Pro Gly Thr Gln Leu Ser Pro Ser 2195 2200 2205 Pro Thr Pro Ala Ser Gln Ser Pro Lys Lys Pro Pro Ala Lys Asp 2210 2215 2220 Pro Leu Ala Asp Leu Asn Ile Lys Asp Phe Leu Thr Leu Thr Phe 2225 2230 2235 Gly Asp Val Val Ala Val Arg His Tyr Glu Lys Ala 2240 2245 2250 <210> 6 <211> 132 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 6 Met Val Glu Ala Phe Cys Ala Thr Trp Lys Leu Thr Asn Ser Gln Asn 1 5 10 15 Phe Asp Glu Tyr Met Lys Ala Leu Gly Val Gly Phe Ala Thr Arg Gln 20 25 30 Val Gly Asn Val Thr Lys Pro Thr Val Ile Ile Ser Gln Glu Gly Asp 35 40 45 Lys Val Val Ile Arg Thr Leu Ser Thr Phe Lys Asn Thr Glu Ile Ser 50 55 60 Phe Gln Leu Gly Glu Glu Phe Asp Glu Thr Thr Ala Asp Asp Arg Asn 65 70 75 80 Cys Lys Ser Val Val Ser Leu Asp Gly Asp Lys Leu Val His Ile Gln 85 90 95 Lys Trp Asp Gly Lys Glu Thr Asn Phe Val Arg Glu Ile Lys Asp Gly 100 105 110 Lys Met Val Met Thr Leu Thr Phe Gly Asp Val Val Ala Val Arg His 115 120 125 Tyr Glu Lys Ala 130

Claims (91)

  1. 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS 치료 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물로서, 조성물은
    a. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나; 또는
    b. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
    n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 치료적 T-세포 에피토프를 포함하고,
    n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 관용원성 조성물.
  2. 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS 치료 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물로서, 조성물은
    a. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나; 또는
    b. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
    n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하고,
    n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 관용원성 조성물.
  3. 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 특정 T-세포 에피토프에 상응하는 내인성 에피토프에 대해 T-세포 자가반응을 나타내는 다발성 경화증(MS) 환자에서 MS 치료 방법에 사용하기 위한 관용원성 조성물로서, 조성물은
    a. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나; 또는
    b. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
    n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 치료적 T-세포 에피토프에 대해 생체외에서 노출된 항원 제시 세포를 포함하고,
    n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 관용원성 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 방법이 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 포함된 T-세포 에피토프에 대한 환자의 T-세포 자가반응을 결정하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 결정이 제40항 내지 제84항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수행되는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-166에 포함되는 것인 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 167-295에 포함되는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 296-1327에 포함되는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1328-2234에 포함되는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 2235-2250에 포함되는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-2234에 포함되는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하위서열이 표 4의 펩티드의 서열 중 어느 하나에 포함되는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, n이 11 이상인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, n이 13 이상인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, n이 15 이상인 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, n이 17 이상인 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, n이 19 이상인 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, n이 50 이상, 75 이상, 가장 바람직하게는 100 이상인 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m이 2인 조성물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m이 1인 조성물.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m이 0인 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-세포 에피토프가 m개 이하의 잔기의 치환에 의해 하위서열과 상이하고, 하위서열과 비교하여 치환 또는 결실을 포함하지 않는 것인 조성물.
  23. 제1항, 제3항 및 이들의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 T-세포 에피토프가 펩티드 또는 펩티도미메틱인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 치료적 T-세포 에피토프가 서열 번호: 5의 하위서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 조성물.
  25. 제1항 및 이의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이, 각각 제1항에 규정된 기준을 충족시키는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 치료적 T-세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
  26. 제2항 및 이의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이, 각각 제2항에 규정된 기준을 충족시키는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
  27. 제3항 및 이의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가, 각각 제3항에 규정된 기준을 충족시키는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 치료적 T-세포 에피토프에 노출되는 것인 조성물.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 치료적 T-세포 에피토프가 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 구체화된 서열 구간 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 중에서 선택되는 것인 조성물.
  29. 제1항 및 이의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 고체 캐리어, 예컨대 생체적합성 중합체, 입자 또는 세포에 커플링된 치료적 T-세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
  30. 제1항 및 이의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 T-세포 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
  31. 제2항 및 이의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 T-세포 에피토프를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 조성물.
  32. 제3항 및 이의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 치료적 T-세포 에피토프에 노출된 항원 제시 세포를 포함하는 것인 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, 치료적 T-세포 에피토프가, 환자가 T-세포 자가반응을 나타내는 에피토프에 상응하도록, 치료적 T-세포 에피토프를 선별하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 치료적 T-세포 에피토프가 상기 내인성 에피토프와 동일한 T-세포 수용체(TCR)에 특이적으로 결합할 수 있는 것에 기반하여 선별되는 것인 조성물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 방법이 조성물을 대상체에게 관용원성 방식으로 투여하여 환자에서 상기 T-세포 에피토프에 대한 T-세포 관용을 유도하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 방법이 조성물을 경구로, 점막으로, 피내로, 경피로 또는 피하로 투여하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
  37. 제1항, 제2항 및 이들의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 방법이 조성물을 시험관내에서 항원 제시 세포에게 제공하고 이어서 상기 항원 제시 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 조성물.
  38. 제2항 및 이의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 항원 제시 세포에서의 발현을 가능하게 하는 프로모터에 작동적으로 커플링된 벡터에 포함되는 것인 조성물.
  39. 제3항 및 이의 종속항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포, 단핵구, 대식구, B-세포(바람직하게는 PBMC로부터 유래됨) 또는 미세아교세포인 조성물.
  40. 시험 대상체에서 다발성 경화증(MS) 관련된 자가면역의 정도의 결정 방법으로서,
    a. 생존가능 T-세포를 포함하는 시험 대상체로부터 유래되는 시험 샘플을 제공하는 단계;
    b. T-세포 에피토프를 포함하는 시험 항원에 반응하여 시험관내에서 시험 샘플의 T-세포의 항원 특이적 활성화를 정량화하는 단계로서, 상기 T-세포 에피토프는,
    i. 서열 번호: 5의 하위서열과 동일하거나; 또는
    ii. 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한,
    n개의 연속적인 아미노산 잔기의 서열을 포함하고,
    n은 8 이상이고, m은 0, 1 또는 2인 단계; 및
    c. 정량화된 항원 특이적 활성화를 관련 참조와 비교하여 시험 대상체에서 MS 관련된 자가면역의 정도를 결정하는 단계
    를 포함하는 시험 대상체에서 다발성 경화증(MS) 관련된 자가면역의 정도의 결정 방법.
  41. 제40항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-166에 포함되는 것인 결정 방법.
  42. 제40항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 167-295에 포함되는 것인 결정 방법.
  43. 제40항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 296-1327에 포함되는 것인 결정 방법.
  44. 제40항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1328-2234에 포함되는 것인 결정 방법.
  45. 제40항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 2235-2250에 포함되는 것인 결정 방법.
  46. 제40항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-2234에 포함되는 것인 결정 방법.
  47. 제40항에 있어서, 하위서열이 표 4의 펩티드의 서열 중 어느 하나에 포함되는 것인 결정 방법.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 특이적 활성화가, 각각 제40항에 규정된 기준을 충족시키는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 T-세포 에피토프에 대해 정량화되는 것인 결정 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상이한 T-세포 에피토프가 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에서 구체화된 서열 구간 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 중에서 선택되는 것인 결정 방법.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 특이적 활성화가, 각각 FABP7(서열 번호: 1), PROK2(서열 번호: 2), RTN3(서열 번호: 3) 및 SNAP91(서열 번호: 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 MS 항원에 상응하는 특정 T-세포 에피토프를 포함하는, 적어도 2, 3 또는 4개의 시험 항원에 대해 정량화되는 것인 결정 방법.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, n이 11 이상인 결정 방법.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, n이 13 이상인 결정 방법.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, n이 15 이상인 결정 방법.
  54. 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, n이 17 이상인 결정 방법.
  55. 제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, n이 19 이상인 결정 방법.
  56. 제40항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, n이 50 이상, 75 이상, 가장 바람직하게는 100 이상인 결정 방법.
  57. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, m이 2인 결정 방법.
  58. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, m이 1인 결정 방법.
  59. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, m이 0인 결정 방법.
  60. 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T-세포 에피토프가 m개 이하의 잔기의 치환에 의해 선택된 MS 항원의 하위서열과 상이하고, 하위서열과 비교하여 치환 또는 결실을 포함하지 않는 것인 결정 방법.
  61. 제40항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 T-세포 에피토프를 포함하는 항원이 서열 번호: 1-4, 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6 중 임의의 것에 대해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 결정 방법.
  62. 제40항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 진단된 MS 환자인 결정 방법.
  63. 제40항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 MS를 갖는 것으로 의심되는 개체인 결정 방법.
  64. 제40항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플이 혈액 샘플로부터 유래되는 것인 결정 방법.
  65. 제40항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플이 PBMC 샘플인 결정 방법.
  66. 제40항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플이 항원 제시 세포를 더 포함하는 것인 결정 방법.
  67. 제40항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이
    a. 생존가능 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
    b. 시험 항원을 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
    c. 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T-세포의 항원 특이적 활성화를 가능하게 하는 조건 하에서 시험관내에서 시험 샘플을 시험 항원과 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
    d. 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화를 정량화하는 단계
    를 더 포함하는 것인 결정 방법.
  68. 제40항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 포식가능 입자와 밀착되게 회합된 시험 항원을 제공하는 단계를 포함하는 것인 결정 방법.
  69. 제40항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화가 IFN-γ의 분비를 측정함으로써 T-세포 반응을 측정하는 것을 포함하는 것인 결정 방법.
  70. 제40항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화가 IL-17의 분비를 측정함으로써 T-세포 반응을 측정하는 것을 포함하는 것인 결정 방법.
  71. 제40항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화가 IL-22의 분비를 측정함으로써 T-세포 반응을 측정하는 것을 포함하는 것인 결정 방법.
  72. 제40항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 특이적 T-세포 활성화의 정량화가,
    a. 시험 항원이 밀착되게 회합된 포식가능 입자를 제공하는 단계로서, 회합된 시험 항원을 갖는 입자는 변성 세척되어 내독소 수준이 후속 단계를 방해하지 않기에 충분히 낮은 것인 단계;
    b. 생존가능 항원 제시 세포를 제공하는 단계;
    c. 항원 제시 세포에 의한 입자의 포식작용을 가능하게 하는 조건 하에서 세척된 입자를 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계;
    d. 생존가능 T-세포를 포함하는 검정될 시험 샘플을 제공하는 단계;
    e. 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원에 반응하여 T-세포의 항원 특이적 활성화를 가능하게 하는 조건 하에서 시험관내에서 시험 샘플을 입자와 접촉된 항원 제시 세포와 접촉시키는 단계; 및
    f. 시험 샘플에서 항원 특이적 T-세포 활성화를 정량화하는 단계
    를 포함하는 것인 결정 방법.
  73. 제40항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 참조가 병리적 MS 관련된 자가면역이 없는 참조 대상체로부터의 참조 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화인 결정 방법.
  74. 제40항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 참조가 병리적 MS 관련된 자가면역이 없는 일 세트의 참조 대상체로부터의 일 세트의 참조 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화의 평균 값인 결정 방법.
  75. 제74항에 있어서, 세트가 10 이상의 참조 대상체를 포함하는 것인 결정 방법.
  76. 제40항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 참조가 상이한 시점에서 취한 동일한 대상체로부터의 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화인 결정 방법.
  77. 제40항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 참조와 비교하여 적어도 2배, 바람직하게는 3배, 보다 바람직하게는 5배, 가장 바람직하게는 10배 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어지는 것인 방법.
  78. 제40항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 병리적 MS 관련된 자가면역이 없는 일 세트의 참조 대상체로부터의 일 세트의 동등하게 정량화된 참조 샘플의 평균보다 참조 샘플의 세트의 표준 편차의 2배만큼 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어지는 것인 결정 방법.
  79. 제40항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 스튜던츠 T-시험으로 계산된 P 값이 0.05 미만인 참조보다 통계적으로 유의하게 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어지는 것인 결정 방법.
  80. 제40항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 샘플에서 정량화된 항원 특이적 활성화가 만-휘트니 U 시험으로 계산된 P 값이 0.05 미만인 참조보다 통계적으로 유의하게 높은 경우, MS 관련된 자가면역의 정도가 증가된 것으로 결론지어지는 것인 결정 방법.
  81. 제40항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 방법이 대상체에서 MS를 진단하기 위한 것이고;
    b. 참조가 병리적 다발성 경화증 관련된 자가면역이 없는 참조 대상체에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
    c. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 다발성 경화증을 나타내는 것인 결정 방법.
  82. 제40항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 방법이 대상체에서 MS의 과정을 추적하기 위한 것이고;
    b. 참조가 동일한 대상체로부터 상이한 시점에 취한 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
    c. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 더 높은 다발성 경화증 질환 활성을 나타내고, 그 반대도 마찬가지인 결정 방법.
  83. 제40항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 방법이 대상체에서 MS 과정의 예후를 만들기 위한 것이고;
    b. 참조가 동일한 대상체로부터 상이한 시점에 취한 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
    c. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 증가하는 다발성 경화증 질환 활성을 나타내고, 그 반대도 마찬가지인 결정 방법.
  84. 제40항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 방법이 치료적 처치에 대한 대상체의 반응을 평가하기 위한 것이고;
    b. 참조가 평가될 치료적 처치의 제공 전에 동일한 대상체로부터 취한 샘플에서 동등하게 정량화된 항원 특이적 활성화를 나타내고;
    c. 시험 샘플이 치료적 처치의 개시 후 동일한 대상체로부터의 것이고;
    d. 참조와 비교하여 시험 샘플에서 더 낮은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화가 시험 대상체에서 다발성 경화증 질환 활성에 대한 치료 효능을 나타내고, 변화되지 않거나 더 높은 정도의 정량화된 항원 특이적 활성화는 시험 대상체에서 다발성 경화증 질환 활성에 대한 치료 효능의 결여를 나타내는 것인 결정 방법.
  85. MS의 진단 또는 치료에서 펩티드 또는 펩티도미메틱의 용도로서, 펩티드 또는 펩티도미메틱은 MS 항원에 상응하는 특정 T-세포 에피토프를 포함하고, 상기 T-세포 에피토프는 서열 번호: 5의 하위서열과 m개 이하의 잔기의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 상이한 n개의 연속적인 잔기의 아미노산 서열을 포함하고, m은 0, 1 또는 2인 용도.
  86. 제85항에 있어서, 하위서열이 서열 번호: 5의 잔기 1-166, 서열 번호: 5의 잔기 167-295, 서열 번호: 5의 잔기 296-1327, 서열 번호: 5의 잔기 1328-2234, 서열 번호: 5의 잔기 2235-2250 또는 서열 번호: 5의 잔기 1-2234 중에서 선택되는 것인 용도.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, n이 11 이상인 용도.
  88. 제85항 또는 제86항에 있어서, n이 15 이상인 용도.
  89. 제85항 또는 제86항에 있어서, n이 19 이상인 용도.
  90. 제85항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, m이 1인 용도.
  91. 제85항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, m이 0인 용도.
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