CN1596117A - 松果提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

制备松果提取物的方法，和通过所述方法制备的松果提取物，其中所述松果提取物可用于提高核酸疫苗和药物的作用，并且可用于制备表型不成熟和/或成熟的树状细胞和/或纤维细胞。

Description

松果提取物及其应用

发明领域

本发明一般涉及松果提取物的制备，松果提取物自身及其应用，特别是作为佐剂在脊椎动物的接种或治疗中的应用，以及作为促进血细胞分化的活性剂的应用。

发明背景

随着研究人员对于脊椎动物免疫系统的了解不断增多，人们正在不断地寻找用以利用和具体采用免疫系统来预防和对抗疾病的方法。由于免疫系统超常的易变性，这类方法原则上提供了对于具有足够大小的任何物质起反应的可能性。因此，已作了很多尝试来建立癌症、细菌和病毒感染的接种和/或免疫治疗方法。

这样的治疗或接种方法通常是把欲治疗的生物体暴露于(体内治疗)抗原性物质的疫苗制剂，以产生免疫反应。特别是，使用抗原性物质(抗原)来引发能够探测到抗原性物质自身或其部分(表位)的免疫球蛋白和/或细胞毒性噬吞细胞的产生，由此它们变得可迅速被免疫系统识别。具有如此性质的抗原变得可被迅速识别，并且可以被灭活或破坏，例如被摄入到T细胞内，之后被分解，或者被包含抗原的细胞破坏。

类似的接种或治疗方法是从欲治疗的生物体中提取淋巴细胞，特别是淋巴干细胞，把提取的细胞暴露于抗原，由此诱导能够探测到抗原的免疫球蛋白的产生，然后把能产生免疫球蛋白的淋巴细胞再输入到欲治疗的生物内(体外治疗)。

术语“接种”是指通过产生、提高或维持免疫系统对与疾病或疾患有关的抗原起反应的能力，来治疗脊椎动物，以主要是预防疾病或病患。术语“治疗”是指在疾病或病患的首次发作之后，产生、提高或维持免疫系统对与疾病或疾患有关的抗原起反应的能力，因此在性质上是治疗的。接种治疗中的活性组分称为“疫苗”，而治疗性治疗中的活性组分称为“药物”。术语“接种”和“治疗”可互换使用，术语“疫苗”和“药物”亦是如此。

过去十年当中最重要的科学发现之一是确定了被人T细胞识别的肿瘤相关抗原(TAA)。关于其综述可参见例如Robbins和Kawakami“被T细胞识别的人肿瘤抗原”，Current 0pinion in Immunology 1996，8：628-636；Rosenberg SA，“基于编码癌抗原的基因的癌症免疫治疗的新纪元”，Immunity 1999，10：281-287；Van den Eynde BJ和van der Bruggen P，“T细胞确定的肿瘤抗原”，Current Opinion inImmunology 1997，9：684-693。广泛认为TAA的鉴定和分子特征确定能够提供产生癌疫苗的手段。

目前在发明这类疫苗方面的努力是基于核酸介导的免疫技术，即将一个或多个抗原编码序列(例如TAA编码序列)插入到合适的表达(宿主)载体中，这样的载体能够引起抗原编码序列直接在转染的细胞中表达。在下文中，术语“序列”是指特征在于其核苷酸序列的核酸，其中核酸是包含一个或多个选自下列的核苷酸的任何分子：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或其功能同等物例如肌苷和次黄嘌呤，其中每个核碱基连接在包含戊糖例如核糖和/或脱氧核糖，其它糖或氨基酸的骨架上，并且其中各个骨架通过例如磷酸二酯键、肽键或其它合适的连接/连结手段彼此连接/连结在一起。核酸的实例是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。常用的宿主载体是细菌和病毒或者细菌和病毒基因组。最近的研究已经表明，对于疫苗制剂，并不总是需要细胞或包囊的载体。用“裸”质粒DNA和/或用RNA，即用没有任何其它结构组分例如蛋白、脂质或糖类的核酸进行免疫接种，可引起强有力的细胞和抗体反应。因此，也称为重组疫苗的核酸疫苗是这样的疫苗，其中宿主载体的基因组整合—经常是异源的—编码免疫原(抗原)的核酸序列、

与基于细胞的疫苗或细胞裂解物相比，重组疫苗具有很多优点，最显著的优点可能是，它们可使免疫反应集中于抗单一、特异性抗原例如TAA，由此限制了释放出对抗存在于正常组织和肿瘤细胞中的迄今为止仍未知的抗原的失控自身免疫攻击的可能性。

目前接种和治疗成功在不同疾患之间，甚至对于相同疾患，在所治疗的患者之间具有很大差异。此外，接种不能总是长时间令人满意，但是可能在数周内逐渐减弱。对于可特别包括施用活体或灭活疫苗的多种其它接种方法，也存在这些缺陷。疫苗通常不能总是通过自身来产生合适且有效的免疫反应。

当与特异抗原一起施用时，一些物质将提高对该抗原的免疫反应。灭活或纯化的抗原疫苗中通常包括这样的物质(佐剂)。常用佐剂的实例有铝盐、脂质体和免疫刺激复合物(ISCOMS)、完全和不完全弗氏佐剂、胞壁酰二肽和细胞因子例如白介素(IL)2、IL-12和干扰素(IFN)γ。

虽然某些佐剂非常适于与特异抗原或疫苗联合使用，但是它们可能在其它组合中不起作用，或者它们自身对于脊椎动物例如人可能有毒性，促进不良的细胞介导的免疫性，不稳定，或者很昂贵和/或制备复杂。

因此，用于接种和治疗脊椎动物疾病和疾患的改进的方法将非常有用。

另一个方面是，对于科学目的，经常需要产生特定细胞类型，以例如用于组织培养。在研究所需的细胞类型当中，有树状细胞和最近发现的纤维细胞。

树状细胞是有效的抗原呈递细胞。据报道，它们还起混合淋巴细胞反应的刺激剂的作用，经由组织选择性地迁移，摄取、加工和呈递抗原，以及作为信使细胞引起移植组织的排斥反应。关于综述参见例如Hart DNJ“树状细胞：控制初次免疫反应的独特白细胞群体”，Blood，1997，90：3245-3287。显然，在希望正确识别抗原和产生免疫反应的任何领域，树状细胞的研究提供了可能的应用。这样的领域是例如移植用药物，接种，癌症以及与抗原呈递有关的其它疾病的治疗，自身免疫性疾病的预防和治疗等，参见例如Dallal RM和Lotze MT，“树状细胞和人癌症疫苗”，Current Opinion in Immunology，2000，12：583-588。然而，对树状细胞及其分化的了解尚不充分。因此希望有能制备树状细胞的方法。

目前生成树状细胞的方法依赖于从外周血液单核细胞、骨髓细胞或其它CD34⁺细胞分化，这是通过将这样的细胞暴露于包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、肿瘤坏死因子α(TNFa)、肿瘤生长因子β(TGFβ)和IL-4的多种细胞因子组合而实现的。关于综述可参见例如Strunk D等人，“从循环CD34⁺造血祖细胞生成人树状细胞/朗氏细胞”，Blood，1996，87：1292-1302和SoligoD等人，“在静态和连续灌注培养物中扩展衍生自人CD34⁺细胞的树状细胞”，British Journal of Hematology，1998，101：352-363。同样，已经从CD14⁺血液单核细胞中制备了树状细胞，并描述了不同的成熟阶段。关于综述参见Winzler C等人，“在依赖于生长因子的长期培养基中鼠树状细胞的成熟阶段”，Journal of Experimental Medicine，1997，185：317-328以及Crawford和Chester的US专利US6,194,204 B1。仍然，目前的方法依赖于昂贵且不稳定的细胞因子培养基组分。另外，目前制备树状细胞的方法的收率通常非常低而不能令人满意。

纤维细胞是最近描述的特征在于其不同表型(胶原+，CD34⁺)的细胞类型，其通常也是波形蛋白⁺(vimetin⁺)、CD13⁺和CD45⁺。据报道，它们迅速从血液中进入皮下移植的伤口室中。它们通常还存在于结缔组织疤痕中，并且可能在伤口修复和病理性纤维变性反应中起重要作用。关于综述可参见例如Bucala R等人，“循环的纤维细胞限定可介导组织修复的新的白细胞子群体”，Mol.Med.1994，1：71-81，以及ChesneyJ和Bucala R，“外周血液纤维细胞：呈递抗原和介导组织修复的新的成纤维细胞样细胞”，Biochemical SocietyTransactions，1997，25：520-4。象树状细胞一样，制备纤维细胞的方法依赖于昂贵且不稳定的细胞因子培养基组分，并且提供通常令人不满意的低收率。因此可以理解，一直存在着这样的需要，即治疗脊椎动物疾病和疾患的新方法，这样的治疗可利用和采用脊椎动物免疫系统来预防和对抗现有技术不能解决的疾病和疾患。此外，还需要产生科学使用所需的特定细胞类型。在这方面，本发明满足了该需要。

发明概述

因此，本发明的目的是提供用于接种和/或治疗，特别是改善和提高核酸疫苗和药物的效果的新方法和物质。本发明提供的方法和物质应当适用于广谱接种和治疗目的。对于接受治疗的脊椎动物或健康细胞，这样的脊椎动物的组织和器官，依据该本发明目的的物质和方法应当具有低的毒性或没有毒性。本发明物质应当易于制备、稳定且成本低。本发明接种和/或治疗方法还应当易于进行和不需要昂贵的额外设备。

本发明的另一个目的是提供用于制备具有树状细胞和/或纤维细胞样表型的细胞的物质和方法。本发明物质应当易于制备、稳定且成本低。本发明方法应当以高收率获得至少一种这些细胞类型。它们还应当易于进行和不需要昂贵的额外设备。

本发明者们已经发现，当与免疫治疗用疫苗或药物联合使用时，松果提取物具有优良的佐剂特性。本发明者们还已经发现，松果提取物可诱导多种细胞类型分化成具有不成熟和/或成熟树状细胞和/或纤维细胞表型的细胞。本发明者们还已经发现，松果提取物的级份可特别用于实现上述目的。

本发明的目的是提供用于制备松果提取物的方法。本发明的另一个目的是提供通过该方法制备的松果提取物。

本发明的另一个目的是提供用于脊椎动物接种和/或治疗的系统，其中包括具有疫苗与佐剂或者药物与佐剂的药盒；和提供用于给脊椎动物施以疫苗接种和/或治疗的方法。

本发明还有一个目的是提供用于制备表型不成熟和/或成熟的树状细胞和/或纤维细胞的方法。

作为本公开内容一部分的权利要求书指出了本发明的这些和其它目的，以及表明本发明新颖性的各种特征。为了更好地理解本发明、其使用优点以及通过其使用而达到的特定目的，应参见实施例和实质描述，它们举例说明了本发明的优选实施方案。

附图简述

当考虑下列详细描述时，本发明可得到更好的理解，并且除了上述目的之外的目的将变得显而易见。附图表示：

附图1：方法1的松果提取物的快速蛋白液相色谱法(FPLC)的图谱；

附图2：方法1的松果提取物的吸收光谱；

附图3：暴露于不同浓度的方法1的松果提取物的PBMC的相差显微镜检查；

附图4：暴露于细胞因子和方法1的松果提取物的PBMC的相差显微镜检查；

附图5：在源自两个不同血液供体的PBMC的培养物中，松果提取物引起的细胞因子生成；

附图6：通过将同种和自身CD3⁺细胞与已暴露于方法1松果提取物的不同浓度的CD14⁺细胞一起培养而生成的干扰素γ；和

附图7和7a：松果提取物对用DNA疫苗接种的动物的CD8⁺和CD4⁺脾细胞的细胞内IFN-γ生成的佐剂影响。

发明详述

植物作为药物化合物的主要来源已有数千年历史。已源自植物材料的化学组分和类似物现在构成了临床应用药物的主要部分。一个这样的植物产物源自不同松树的松果。

松果提取物以前是已知的。Sakagami H等人在“松果提取物的抗肿瘤、抗病毒和免疫增强活性：天然和合成木质素相关材料的可能医药疗效”，Anticancer Research，1991，11：2881-2888中报道，松果的水粗提物包含能够诱导人成髓细胞白血病ML-1细胞分化成巨噬细胞样细胞的物质。据报道，该诱导分化的物质在聚丙烯酰胺凝胶上非常快速地迁移，并且不能以有用量收集。

除了基于水的粗提取物以外，Sakagami等人在相同出版物中描述了制备和分离松果提取物的方法。松果提取物是通过用热水反复提取Pinus parviflora Sieb.et Zucc的松果，然后用乙醇沉淀来获得的。他们还报道了由此制得的松果提取物的一些级份可延长用腹水肉瘤-180细胞移植的小鼠和用腹水Meth A纤维肉瘤移植的BALB/c小鼠的存活。Sakagami等人还报道了松果提取物的活性组分是木质素。此外，它们推断天然的和合成的木质素可具有免疫增强能力。Sakagami等人还提出，该免疫增强能力至少部分是经由T-细胞激活介导的，虽然也提及了除T-细胞之外的其它细胞群体的激活以及随后的T-细胞激活也是可能的激活途径。

美国专利US 4,985,249(Sakagami，Konno和Nonoyama)公开了松果提取物作为抗HIV剂的应用。中国专利摘要CN 1279107(XinYaolu)公开了由蓖麻、商陆根、甘草根和松果制得的用于治疗AIDS和癌症的药物，该药物是通过提取商陆毒素、商陆多糖、蓖麻毒蛋白、注射用甘草酸和松果酸性多糖，并将它们制成注射剂和缓释胶囊来获得的。中国专利摘要CN 1122206(Xiyun Sun和Yinglong Wang)公开了通过固态发酵制得的低盐酱油，其特征是将松仁制剂和香菇提取物制剂作为补充剂加到酱油中。据其中描述，这样制得的酱油具有一些癌症预防和保健作用。

上述参考文献没有公开松果提取物的免疫刺激作用，也没有公开制备不成熟和/或成熟的树状细胞和/或纤维细胞的方法。本发明的价值是确立了松果提取物在这样的应用中的实用性。

本发明所涉及的松果可以是任何种类和松属变种，尤其是表1中列出的那些，但不限制该表分类的正确性。优选的松果是火炬松(P.taeda)(火炬松)、湿地松(P.elliottii)(沼泽松)和长叶松(P.palustris)(长叶松)的松果。本发明者们已经发现，一般的松果和优选种类的松果特别含有可用于接种和/或治疗方法的物质和组成(活性组分)，同样也包含可用于制备树状细胞和/或纤维细胞的物质和组成。它们还已经发现，与Sakagami等人(上文)的意见相反，对于松果提取物的令人满意的佐剂特性，特别是在核酸接种和/或治疗方法中，松果提取物的木质素级份是必需的，但是不足够。

表1：产生可用于制备松果提取物的松果的松树

Subgenus Pinus
		Section Pinus，Subsection Pinus松属	高山松(P.densata)、赤松(P.densiflora)、巴尔干松(P.heldreichii)、P.hwangshanensis、卡西亚松(P.kesiya)、硫球松(P.luchuensis)马尾松(P.massoniana)、欧洲山松(P.mugo)、欧洲黑松(P.nigra)、多酯松(P.resinosa)、欧洲赤松(P.sylvestris)、油松(P.tabuliformis)、黑松(P.thunbergii)、热带松(P.tropicalis)、云南松(P.yunnanensis)
Section Pinea，Subsection PinasterLoudon	土耳其松(P.brutia)、加那利松(P.canariensis)、地中海松(P.halepensis)、南亚松(P.latteri)、苏门达腊松(P.merkusii)、海岸松(P.pinaster)、喜马拉雅长叶松(P.roxburghii)

Section Pinea，Subsection PineaeLittle&Critchfield	意大利伞松(P.pinea)
		Section Trifoliis，Subsection ContortaeLittle&Critchfield	短叶松(P.banksiana)、扭叶松(P.contorta)
Section Trifoliis，Subsection AustralesLoudon	加勒比松(P.caribaea)、美国沙松(P.clausa)P.cubensis、萌芽松(P.echinata)、湿地松(P.elliottii)、光松(P.glabra)、古巴松(P.occidentalis)长叶松(P.palustris)、辛松(P.pungens)刚松(P.rigida)、晚松(P.serotina)、火炬松(P.taeda)、矮松(P.virginiana)
		Section Trifoliis，SubsectionPonderosaeLoudon	′Sabinianae Group′：大果松(P.coulteri)、加州大子松(P.sabiniana)、P.torreyana′Ponderosa Group′：亚利桑那松(P.arizonica)、杜兰戈松(P.durangensis)、大叶松(P.engelmannii)黑材松(P.jeffreyi)、西黄松(P.ponderosa)华树松(P.washoensis)
′Montezumae Group′：P.devoniana、灰叶山松(P.hartwegii)、山松(P.montezumae)
	′Pseudostrobus Group′：道格拉斯松(P.douglasiana)、P.maximinoi、拟北美乔松(P.pseudostrobus)
Section Trifoliis，Subsection OocarpaeLittle&Critchfield			′Attenuata Group′：P.attenuata、加州沼松(P.muricata)、辐射松(P.radiata)
	′Oocarpa Group′：硬枝展松(P.greggii)、P.jaliscana、卵果松(P.oocarpa)展叶松(P.patula)、P、praetermissa曲枝松(P.pringlei)、P.tecunumanii
		′Teocote Group′：P.herrerae、劳森松(P.lawsonii)、卷叶松(P.teocote)

Section Trifoliis、SubsectionLeiophyllaeLoudon	光叶松(P.leiophylla)、垂枝松(P.lumholtzii)
		Subgenus Ducampopinus
SectionDucampopinus、SubsectionKrempfianaeLittle&Critchfield	越南松(P.krempfii)
		Section Gerardiana、SubsectionGerardianaeLoudon	白皮松(P.bungeana)、喜马拉雅白皮松(P.gerardiana)P.squamata
Section Parryana、Subsection NelsoniaeVan der Burgh	连叶松(P.nelsonii)
		Section Parryana、SubsectionRzedowskianaeCarvajal	P.maximartinezii、长枝松(P.pinceana)、P.rzedowskii
Section Parryana、SubsectionCembroidesEngelmann	墨西哥果松(P.cembroides)、高寒松(P.culminicola)、P.discolor、食松(P.edulis)P.johannis、P.juarezensis、单针松(P.monophylla)、P.orizabensis、P.remota
		Section Parryana、SubsectionBalfourianaeEngelmann	刺果松(P.aristata)、狐尾松(P.balfouriana)、P.longaeva
Subgenus Strobus

Section Strobus、Subsection StrobiLoudon	奄美岛松(P.amamiana)、华山松(P.armandii)、墨西哥白松(P.ayacahuite)、P.bhutanica、P.chiapensis、P.dalatensis、葵花松(P.fenzeliana)、柔松(P.flexilis)、糖松(P.lambertiana)、加州山松(P.monticola)、台湾五针松(P.morrisonicola)、日本五针松(P.parviflora)、扫帚松(P.peuce)、偃松(P.pumila)、类球果松(P.strobiformis)、北美乔松(P.strobus)、乔松(P.wallichiana)、毛枝五针松(P.wangii)
		Section Strobus、Subsection CembraeLoudon	美国白皮松(P.albicaulis)、瑞士炎松(P.ccmbra)、红松(P.koraiensis)、西伯利亚红松(P.sibirica)

本发明一个方面提供了制备松果提取物的方法。该方法可分成两个阶段，下文中称为方法1和方法2。

方法1需要用含有氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料进行热提取。一旦萃取了松果材料，即除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物。获取所得水溶液(上清液)，将其pH调节至6.0-8.0，以获得方法1的提取物。

方法2使用通过方法1获得的提取物(上清液)。在方法2中，将方法1的提取物(溶液)施以进一步过滤，以获得保留级份。通过离心过滤操作，除去了小于30kDa的颗粒物。保留在滤器上面的是大于30kDa的颗粒物，该保留级份是优选方法(方法2)的松果提取物。

对于上述方法的目的，松果可以呈松果材料碎片的形式。这样的松果材料是优选的，因为有助于随后的提取。其还可以商购获得，并在几批中保持足够稳定和一致的组成。

在使用上述本发明方法之前，可将松果洗净。这可优选通过用去离子水洗涤松果(或松果材料)来进行。

在水提取之前将松果(或松果材料)脱脂。脱脂优选通过用乙醇洗涤松果，然后将洗涤的松果或碎片干燥来实现。可将脱脂的松果在封闭的容器中于室温贮藏。

在提取步骤之前，优选将脱脂的松果研磨成小颗粒。该处理有助于释放出活性组分。粒径优选应当为80-120目。

用于热提取松果的溶剂是包含氢氧化钾(KOH)的水溶液。该溶液包含至少0.25％w/w氢氧化钾，优选包含0.5-2％w/w氢氧化钾，更优选包含1％w/w氢氧化钾。本发明者们已经发现，采用这些浓度的氢氧化钾，可获得特别有效的提取物。溶剂的pH优选为至少8，更优选为至少10，最优选为11-13。

松果材料的提取是这样进行的：将溶剂加到松果中，将该混合物加热，优选加热至80℃(176°F)或以上的温度。本发明者们已经发现，当让溶剂沸腾时，提取可适宜地快速并以足够的提取速度来进行。特别优选通过高压釜法，即在121℃提取松树材料。这样可实现特别迅速、温和和完全的活性组分提取。

提取后，方便起见，让该混合物冷却至，优选冷却至室温。如果需要的话，在进一步加工之前，可将该混合物在冰箱中贮藏12小时。

然后将平均粒径大于0.20μm的颗粒物从混合物中除去。这可通过任何颗粒分离方法来实现。本发明者们已经发现，特别适宜和有效的方法是两步法，其中在第一个步骤中通过过滤除去粗颗粒物，然后通过离心，优选在4℃±2℃离心来除去剩余的不需要的颗粒物。

然后处理所得除去颗粒的混合物，以将pH调节至6.0-8.0。这优选通过用1N HCl滴定直至混合物的pH为7.0来进行。然后可将该混合物分配到包装装置内。

调节pH后，可将该混合物灭菌。优选通过在121℃以液相循环高压釜处理20分钟来进行。还可以施用其它灭菌技术例如辐射等。

调节pH和任选灭菌后，可将该混合物(方法1的PCE)贮藏。通过在低温贮藏，优选在4℃或以下温度贮藏，甚至更优选以冷冻状态贮藏，最优选在-20℃贮藏，可最好地保证长期贮藏稳定性。然而，优选根本不贮藏该混合物，而是立即使用。

调节pH和任选灭菌后，使用Millipore Ultrafree Centrifugal浓缩器(Ultrafree-15，30,000mw截止分子量)对上述提取物施以进一步的过滤，以除去小于30kDa的物质。优选将其以2000×g离心60分钟以过滤溶液，并收集平均分子量不小于30kDa的保留级份。

然后使用pH为6.0-8.0的10mM氢氧化钾水溶液，将含有平均分子量大于30kDa的物质的保留级份调至其初始体积。特别优选在pH为7.0的10mM氢氧化钾水溶液中将保留级份调至其初始体积。可根据所需的保留级份的浓度来调节氢氧化钾溶液的体积。

最后可将溶液灭菌，优选通过经由0.2μm滤器过滤来灭菌。同样可施用其它灭菌技术。

经过进一步的过滤和任选灭菌浓缩后，所得方法2的松果提取物就可以使用了。

本发明的另一个方面提供了用于接种和/或治疗的系统。适于治疗或接种的脊椎动物是任何脊椎动物。优选的脊椎动物是哺乳动物，包括人、猿、狗、猫、兔子、山羊、豚鼠、仓鼠、牛、马、绵羊、小鼠和大鼠。这些脊椎动物的免疫系统的一般特性足够类似，这样在一个物种中的实验结果可以以合理的可信度推到其它物种。

用于接种和/或治疗的系统包括组合物或药盒，所述组合物或药盒包含a)疫苗或药物，和b)佐剂，其中所述佐剂包含松果提取物。

在认识到松果提取物作为佐剂的用途后，本发明者们还发现，松果提取物的有益佐剂效果不依赖于同时施用疫苗和松果提取物。可在施用疫苗或药物之前、期间、同时或之后，将松果提取物施用给脊椎动物。因此，本发明用于接种和/或治疗的系统不限于包含疫苗和松果提取物的组合物，还可以是这样的药盒，其包含作为分隔实体的疫苗—任选地还包含松果提取物—与松果提取物。包含疫苗和/或药物与松果提取物的组合物可特别用于将这两种组分同时施用给欲治疗的脊椎动物。药盒容许独立地施用疫苗(或药物)和松果提取物。因此，如果在施用疫苗之前将松果提取物施用给脊椎动物，药盒是特别合适的。

疫苗或药物优选是核酸疫苗或药物。本发明者们已经发现，松果提取物在核酸接种或治疗方法中是特别有效的佐剂。当把核酸疫苗和/或药物与松果提取物佐剂一起使用时，可实现特别高程度的免疫系统的激活免疫。

在另一个优选的本发明方法中，松果提取物包括通过方法1(上文)制备的松果提取物，即这样制得的松果提取物：用含有氢氧化钾的水性溶剂将脱脂研磨的松果材料进行热提取，然后除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，最后将所得溶液的pH调节至6.0-8.0。

以该方法制备的松果提取物在接种和治疗应用中具有特别强的作用。优选将这些松果提取物在佐剂中与核酸疫苗或药物一起使用，这样松果提取物可提供强的免疫激活性质，和提供增强疫苗或药物所致的免疫反应的优点。制备这样的松果提取物的优选方式见上文。

本发明药盒或组合物的特别优选的实施方案是这样的，其中松果提取物包括通过方法2制备的松果提取物。结果是，这样的松果提取物实际上是通过方法1获得的松果提取物的具30kDa或更大的分子的级份，其包含刺激免疫系统所需的基本上所有免疫活性组分，或者在体外或体内应用中，介导对疫苗或药物的抗原的免疫反应所需的细胞。

本发明还提供了接种或治疗脊椎动物的方法，其中是给脊椎动物施用疫苗或药物。在施用疫苗或药物后，给脊椎动物施用松果提取物。

这样的方法提供了如上所述的在接种和/或治疗上施用松果提取物的优点。

疫苗和松果提取物的给药可通过多种方法来进行。这些方法当中有经口和经肛门给药、经皮涂敷、皮下注射、肌内注射和静脉内注射。注射可用注射器系统或通常称为“粒子枪”的装置来进行。根据疫苗或药物的性质来选择疫苗或药物的给药方式。虽然某些疫苗通过肌内注射来实现高度免疫，但是其它疫苗优选经口给药。

优选经口或通过肌内注射来施用松果提取物。这两种给药方式都提供了松果提取物的特别显著的免疫刺激作用，增强了其佐剂性质。

出于上述原因，在优选的实施方案中，疫苗或药物包括核酸疫苗或药物。

此外，与疫苗或药物一起施用给脊椎动物的松果提取物优选为通过方法1获得的松果提取物。

这样的给药，特别是与核酸疫苗或药物联合给药有效地利用了上述特定松果提取物的优点。

松果提取物特别优选包括通过方法2获得的松果提取物。上文已描述了这种松果提取物的优点。在与核酸疫苗和/或药物联合使用时，这样的松果提取物可提供特别长期的、持续的、强的接种和/或快速或迅速的疾病/疾患缓解。

依据另一个方面，本发明提供了用于制备表型不成熟和/或成熟的树状细胞和/或纤维细胞的方法，所述方法包括将选自下列的细胞暴露于有效量的松果提取物：血液单核细胞、胸腺细胞、脾细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、CD34⁺-细胞、CD14⁺-细胞或其混合物。

本发明者们已经发现，松果提取物对于免疫系统细胞的分化过程具有显著影响。特别是，它们确立了松果提取物可诱导分化成表型不成熟和/或成熟的树状细胞和/或纤维细胞。本发明使得能够以特别高的收率让细胞分化成不成熟和/或成熟的树状细胞。以前通过常用的分化诱导方法例如施用细胞因子不能实现这样的高收率。

通过将所选细胞或所选混合物进一步暴露于CD3⁺细胞，可有利地提高分化。

用于以高收率获得不成熟和/或成熟的树状细胞和/或纤维细胞的松果提取物优选为通过方法1制得的松果提取物。这样的松果提取物在诱导所希望的分化成表型不成熟或成熟的树状细胞和/或成纤维细胞方面特别有效。有利地是，可将该分化方法与暴露于CD3⁺-细胞联合使用来实现和保持高的分化收率。

松果提取物特别优选为通过方法2获得的松果提取物。这样的方法发挥了如上所述的松果提取物的固有优点。

实施例1：制备依据方法1的松果提取物

该实施例举例说明了依据方法1的松果提取物(PCE)的制备。

使用购自International Forest Company的松果材料碎片例如火炬松(loblolly pine)、湿地松(slash pine)和长叶松(long leafpine)的松果材料碎片。将5kg松果材料碎片在约10L去离子水中洗涤2次。然后将洗涤的松果材料在10L 95％乙醇中于搅拌下短暂洗涤以脱脂。将松果材料风干过夜，并且如果不立即使用的话，可以在室温(18-25℃)贮藏。

在混合机中将洗涤和脱脂的松果材料研磨至粒径为约80-120目。将600g该研磨的材料置于20L旋转烧瓶中。加入4.5L 1％w/w氢氧化钾水溶液。用包裹着干酪包布的棉球将烧瓶的开口塞住。然后将烧瓶在液相循环条件下于121℃高压釜处理(缓慢地排气)1小时。高压釜处理后，让烧瓶冷却。如果其中的内容物不立即进一步加工，可将烧瓶在冰箱中于4℃贮藏。

用在与吸滤瓶(其上施以真空)连接的布氏漏斗上的尼龙网滤器将大颗粒从高压釜处理的悬浮液中过滤出来。通过在使用JA-10转鼓和相应瓶的Beckman中速离心机中将滤液以8000rpm于4℃离心10分钟来除去细小颗粒。取出上清液并进一步加工。

通过加入1N盐酸水溶液将离心上清液(提取物)的pH调节至7.0。保存10ml该中和的上清液的对照样本。

将该中和的提取物分配到500ml玻璃瓶(约400ml/瓶)中。如果不立即使用，将提取物在冰箱中保存。通过在液相循环条件下于121℃高压釜处理20分钟来将提取物灭菌。冷却后，该高压釜处理的提取物(依据方法1的提取物)可以使用了。可将其在冰箱中贮藏。

实施例2：由实施例1的松果提取物制备依据方法2的松果提取物

该实施例举例说明了依据方法2的松果提取物的制备。

将15ml实施例1的松果提取物置于无菌50ml聚丙烯锥形离心瓶(Millipore Ultrafree-15离心浓缩器，Fisher cat.no.UFV2 BTK10)中，以2000×g(Eppendorf型5810R离心机)(室温-4℃)离心1小时。取出保留级份并保存。将含有小于30kDa的分子的滤液弃去。

将保留级份悬浮在pH7.0的10mM氢氧化钾水溶液缓冲液中，至最终的提取物体积为15ml。

通过用0.2μm滤器(Nalgene PES membrane，cat.no.124-0020)真空过滤来将悬浮的保留级份(方法2的提取物)灭菌。

灭菌的方法2的松果提取物可以使用了。可将其在冰箱中贮藏。

实施例3：实施例1和2的松果提取物的性质

该实施例举例说明了依据方法1和2的松果提取物的性质。

方法1和2的松果提取物是棕色液体。它们可以与水、水和乙醇的混合物以及与丙酮混溶。它们包含多糖和polyphenylpropenoids。主要组分的分子量如表2所示。方法1的松果提取物的快速蛋白液相色谱法(FPLC)的图谱如附图1所示。方法1的松果提取物的UV/VIS吸收光谱如附图2所示。

表2：松果提取物主要组分的分子量

组分	方法1的提取物1[kDa]	方法2的提取物2[kDa]
			1	＞30	＞30
2	21.0	-
			3	13.5	-
4	3.6	-
			5	2.1	-

实施例4：制备外周血液单核细胞

该实施例举例说明了外周血液单核细胞(PBMC)的制备。

从血沉棕黄层分离外周血液单核细胞。血沉棕黄层是将所献血单位的全血离心后获得的白细胞层。经密度梯度收获PBMC(Histopaque1.077，Sigma Chemical Company)。从该梯度收集PBMC，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，参见Sambrook JC等人，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)，pH7.4洗涤。洗涤后，将细胞悬浮在增强的RPMI 1640完全培养基中，所述培养基含有如在Moore，GE，Gerner，RE，和Franklin，HA(1967)A.M.A.Vol.199，p.519中所定义的标准RPMI 1640培养基，并且还含有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和50μM 2-巯基乙醇。将最终的细胞浓度调节至2×10⁶个细胞/ml。依据生产商的说明，使用CD14或CD3微珠(Miltenyi Biotech，Auburn，California)从这些细胞中分别分离出CD14⁺和CD3⁺细胞。通过免疫荧光染色法测定分离出的细胞中分别含有95％以上的CD14⁺和CD3⁺。

实施例5：将PBMC暴露于松果提取物

该实施例举例说明了通过将PBMC暴露于松果提取物而引起的形态改变。

将在增强的RPMI 1640培养基(培养基定义如实施例4所述)中的细胞浓度为2×10⁶个细胞/ml的实施例4的PBMC以每个孔100μl细胞悬浮液的量分配到96孔平底微量滴定板(Nunc)的孔中。将方法1和2的松果提取物(分别是实施例1和2的松果提取物)加到各孔中，至最终的浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100和300μg/ml。

将细胞在包含5％CO₂的气氛下于37℃培养最长达8天。附图3显示了暴露于不同浓度的方法1的松果提取物的PMBC的典型相差显微镜照片。可清楚地看见与松果提取物浓度大约成正比的细胞数目的显著增加。此外，暴露于松果提取物后，细胞形态从圆盘形状的PBMC形态转变为树状细胞形态；在较高浓度(12.5-100μg/ml)和8天的暴露时间该作用最明显，但是以这些浓度在第2天就已经可以看见。在暴露于方法1的松果提取物的PBMC与暴露于方法2的松果提取物的PBMC(照片未显示)之间没有明显不同。

实施例6：细胞因子与松果提取物对PBMC的影响

该实施例举例说明了暴露于细胞因子和松果提取物对PBMC的影响。

将500μl实施例4的PBMC(细胞浓度：2×10⁶个细胞/ml)分配到第一个24孔组织培养平板(Nunc)中。然后向每个孔中加入500μl增强的RPMI 1640培养基(见实施例4)，其中所加入的培养基样本包含(＝在所加入的培养基中的浓度而不是终浓度！)无额外物质、200μg/ml GM-CSF、20ng/ml IL-4、20ng/ml TNFα或200μg/ml方法1的PCE。72小时(初始培养)后，收获非粘着细胞，置于第二个24孔平板中。向这些孔中加入500μl增强的RPMI 1640培养基(见实施例4)，该培养基中含有浓度为200μg/ml PCE(终浓度100μg/ml PCE)的方法1松果提取物。培养48小时(第二次培养)后，除去非粘着细胞。将粘着细胞用PBS(见实施例4)洗涤，在相差显微镜下拍照。

附图4显示了暴露于细胞因子和方法1的松果提取物的PBMC的相差显微镜照片。A栏照片表示的是暴露于细胞因子或PCE 72小时后的粘着细胞。B栏照片表示的是通过第二次培养由初始培养后获得的非粘着细胞级份产生的粘着细胞。这些照片表明，将PBMC暴露于任一种所试验的细胞因子后，通过暴露于PCE，粘着细胞仍然能够显著增加。它们还表明，将PBMC暴露于松果提取物的影响与将PBMC暴露于已知能诱导分化成树状细胞的细胞因子组合的影响类似。在方法1的松果提取物与方法2的松果提取物的作用之间没有观察到任何不同。

实施例7：通过常规方法产生树状细胞

该实施例举例说明了通过暴露于细胞因子来诱导PBMC分化成树状细胞的常规方法。

将实施例4的PBMC在加入下列组分的增强的RMPI 1640培养基(培养基定义如实施例4所述)中培养5天：100ng/ml人GM-CSF(R&DSystems，Minneapolis，cat.no.215 GM-005)和10ng/ml IL-4(R&D Systems，Minneapolis，cat.no.204-IL-005)。然后将细胞在加入10ng/ml TNFα(R&D Systems，Minneapolis，cat.no.210-TA-010)的如上所述的RMPI 1640培养基中培养至少3天。

实施例8：测定通过将PBMC暴露于松果提取物的细胞因子生成

该实施例举例说明了通过将PBMC暴露于方法1的松果提取物而引起的细胞因子生成的改变。

按照实施例5所述方法，将PBMC暴露于递增浓度的方法1和松果提取物。然后通过ELISA分析细胞因子的生成。使用得自已用递增剂量的PCE处理的PBMC的48小时培养物的上清液进行ELISA。依据生产商的说明(R&D Systems，Minneapolis，MN)，进行检测下列细胞因子的ELISA：GM-CSR(cat#DGM00)、IL-1β(cat#DLB50)、IL-6(cat#D6050)和TNFα(cat#DTA50)。具体来说，将100μl培养物上清液加到在ELISA试剂盒中提供的96孔平板的合适的孔中，在室温培养2小时。用所提供的洗涤缓冲液将孔洗涤，然后吸干。向孔中加入对细胞因子有特异性的生物素化的抗体，在室温培养2小时。洗涤这些孔，并吸干。向每个孔中加入链霉抗生物素蛋白缀合的辣根过氧化物酶，培养20分钟，然后使用在过氧化氢中的四甲基联苯胺作为底物进行检测。30分钟后，通过加入酸性溶液来终止该反应，使用平板分光光度计(Molecular Devices，Mountainview，CA)测定该混合物在450nm的吸收度。

附图5显示了在源自两个不同血液供体的PBMC的培养物中，松果提取物引起的细胞因子生成。一个供体的细胞因子生成数据始终在黑色棒形图中给出，而其它供体的数据在白色棒形图中给出。这些图表明了松果诱导产生的GM-CSF(上面左侧图)、IL-1β(上面右侧图)、IL-6(下面左侧图)和TNFα(下面右侧图)。松果提取物在培养基中的终浓度以μg/ml给出。这些图表明，在暴露期间，细胞因于生成的增加与松果提取物浓度大致成正比。本发明者们不能在培养基中检测到IL-4或IL-10(数据未显示)。在暴露于方法1的松果提取物的细胞与暴露于方法2的松果提取物的细胞之间，没有观察到细胞因子表达的差异。

实施例9：通过暴露于松果提取物的CD14 ⁺ 细胞激活原初同种T细胞

该实施例举例说明了已暴露于方法1的松果提取物的CD14⁺细胞激活原初同种CD3⁺细胞的能力。

通过例如依据生产商的说明，用磁珠(CD14⁺ Miltenyi Biotech，Auburn California，cat# 502-01)从PBMC获得纯的表型树状细胞群体。

将由此分离的CD14⁺细胞分配到6孔组织培养平板(Nunc)的孔中，暴露于含有终浓度为100μg/ml的方法1的松果提取物的如实施例4所定义的增强的RPMI 1640培养基8天。如实施例5所述，细胞分化成表型树状细胞。

除去剩余的非粘着细胞。收获表型树状细胞(见实施例5)，转移到新鲜的如实施例4所定义的增强的RPMI 1640培养基中，以100μl的体积分配到96孔圆底组织培养板(Nunc)中，使每个孔中有不同终浓度的表型树状细胞。

依据生产商的说明，使用CD3⁺微珠(Miltenyi Biotech)获得原初同种和自身CD3⁺细胞。

收获CD3⁺细胞，在如实施例4所定义的增强的RPMI 1640培养基中以100μl的体积分配到第二个组织培养板上，使表型树状细胞的终浓度为每个孔10⁵个CD3⁺细胞。将混合的细胞共培养3天。3天后，依据生产商的说明，通过ELISA(R&D Systems，Minneapolis，cat.no.DIF50)测定IFN-γ的浓度。

附图6显示了通过将同种和自身CD3⁺细胞共培养而生成的IFN-γ。三角形表示将CD3⁺细胞与如实施例7所述获得的树状细胞共培养后的IFN-γ浓度。正方形表示与如上所述的表型树状细胞(在PCE存在下制得的)共培养后的IFN-γ浓度。菱形表示与仅暴露于培养基的PBMC培养的CD3⁺细胞的IFN-γ浓度。通过实施例7中描述的方法获得的树状细胞在刺激IFN-γ生成方面最有效。通过上述方法获得的表型树状细胞在刺激IFN-γ生成方面比单独的培养基显著更有效，但是不如通过实施例7的方法获得的树状细胞有效。在使用方法1与2的松果提取物之间没有观察到作用方面的任何显著不同(数据未显示)。

看上去通过暴露于松果提取物所获得的细胞是表型树状细胞，不成熟和不完全成熟的树状细胞。

实施例10：松果提取物在HIV DNA(gag)疫苗模型中的佐剂活性

该实施例举例说明了在DNA接种操作中施用松果提取物的作用。

在各个四头肌中给Balb/c小鼠肌内注射50μg疫苗DNA，所述疫苗DNA悬浮在50μl PBS中或者悬浮在50μl 40μg/ml方法1的松果提取物组合物中(共注射)。疫苗DNA是表达HIV gag作为免疫原的质粒载体，viz pCIgag。对照DNA是表达CAT的质粒载体，vizpCICAT。在另一个治疗组中，在实验期间给Balb/c小鼠在其饮用水中补充200μg/ml松果提取物。还给这些小鼠接种如上所述的质粒载体。

接种3周后，给接种的小鼠静脉内注射3×10⁶pfu表达HIV gag的疫苗表达载体，注射后3天将小鼠杀死，收获其脾，通过常用技术分离出其脾细胞，参见Bradley，W.G.，Ogata，N.，Good，R.A.，和N.K.Day；“AlteratiO of in ViVo cytokine gene expressionin mice infected with a molecular clone of the defective MAIDSvirus”，1994，J.Acquired Immune Deficiency Syndromes.7：1-9。

将脾细胞用PBS(见实施例5)洗涤，通过低速离心让其沉淀，然后悬浮在含有2％w/w热灭活胎牛血清的冰冷的PBS中，在冰上放置15分钟。将识别CD4⁺或CD8⁺的适当抗体和IFN-γ加到细胞中。将细胞和抗体在冰上于黑暗中培养30分钟以标记细胞。然后用冰冷的PBS洗涤细胞。将洗涤的细胞在1ml新制的1％w/w低聚甲醛水溶液中固定。对于抗原表达，使用Becton Dickinson FACS Caliber流式细胞计数器分析标记和固定的细胞。收集最少10,000个细胞用于分析。

附图7和7a显示了通过鼠CD8⁺和CD4⁺脾细胞的INF-γ生成来测定的施用松果对疫苗接种作用的影响。HIV的肽部分p7g是T细胞，具体来说CD8⁺T细胞识别的刺激剂。重组p24＝gag＝完整的gag蛋白是刺激剂，并且被CD4⁺T细胞识别。CD4⁺T细胞对p24的反应最佳。数据表明，在接种核酸疫苗期间或之后立即口服和肌内施用松果提取物都提高了CD8⁺细胞的激活(组“pCIGag/PCE fed”和“pCIGag/PCEcoinj”)。该提高的作用显著强于施用疫苗(pCIGag)但不施用松果提取物佐剂(组“单独的pCIGag”)和对照“接种”DNA(组“pCICAT/PCEfed”)。同样，在依据方法1和方法2获得的松果提取物之间也没有观察到任何显著不同。

因此，上面仅举例说明了本发明的原理。这并不是详尽或将本发明限制于所公开的具体形式。根据上面的教导，明显的改变或变型是可能的。当依据所附权利要求的范围对其进行公平、合法、公正的解释时，所有这样的改变和变型都在如权利要求书所确定的本发明范围内。

Claims (16)

1.制备松果提取物的方法，所述方法包括下列步骤：

a)用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；

b)除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，获得了上清液；

c)将所得上清液的pH调节至6.0-8.0，其特征在于，所述方法还包括下列步骤：

d)将上清液过滤以获得保留级份；

e)排放出保留级份，除去平均分子量小于30kDa的颗粒；和

f)将保留级份悬浮在pH为6.0-8.0的包含氢氧化钾的水溶剂中。

2.通过权利要求1的方法制备的松果提取物。

3.用于接种和/或治疗的系统，其中包括组合物或药盒，所述组合物或药盒包含a)疫苗或药物，和b)佐剂，其中所述佐剂包含松果提取物。

4.权利要求3的系统，其中所述疫苗或药物是核酸疫苗或药物。

5.权利要求3的系统，其中所述松果提取物包括通过包括下列步骤的方法制备的松果提取物：

a)用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；

b)除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，获得了上清液；和

c)将所得水溶液的pH调节至6.0-8.0。

6.权利要求5的系统，其中所述松果提取物包括通过包括下列步骤的方法制备的松果提取物：

e)用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；

f)除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，获得了上清液；

g)将所得上清液的pH调节至6.0-8.0，

其特征在于，所述方法还包括下列步骤：

h)将上清液过滤以获得保留级份；

e)排放出保留级份，除去平均分子量小于30kDa的颗粒；和

f)将保留级份悬浮在pH为6.0-8.0的包含氢氧化钾的水溶剂中。

7.接种或治疗脊椎动物的方法，所述方法包括下列步骤：

a)给脊椎动物施用疫苗或药物；和

b)给脊椎动物施用松果提取物。

8.权利要求7的方法，其中所述疫苗或药物包括核酸疫苗或药物。

9.权利要求7的方法，其中所述松果提取物包括通过包括下列步骤的方法制备的松果提取物：

d)用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；

e)除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，获得了上清液；和

f)将所得上清液的pH调节至6.0-8.0。

10.权利要求7的方法，其中所述松果提取物包括权利要求2的松果提取物。

11.权利要求7的方法，其中所述松果提取物是经口给药、通过肌内注射给药、通过吸入给药或通过施加在皮肤粘膜上来给药。

12.权利要求7的方法，其中接种或治疗所述脊椎动物以抗癌症和/或病毒感染。

13.制备不成熟和/或成熟的树状细胞和/或纤维细胞的方法，所述方法包括将选自下列的细胞暴露于有效量的松果提取物：血液单核细胞、胸腺细胞、脾细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、CD34⁺-细胞、CD14⁺-细胞或其混合物。

14.权利要求13的方法，其中还进一步包括将所选细胞或所选混合物暴露于CD3⁺-细胞。

15.权利要求13的方法，其中所述松果提取物包括通过包括下列步骤的方法制备的松果提取物：

a)用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；

b)除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，获得了上清液；

c)将所得水溶液的pH调节至6.0-8.0。

16.权利要求15的方法，其中所述松果提取物包括通过包括下列步骤的方法制备的松果提取物：

i)用包含氢氧化钾的水溶剂将脱脂研磨的松果材料热提取；

j)除去平均粒径大于0.2μm的颗粒物，获得了上清液；

k)将所得上清液的pH调节至6.0-8.0，

其特征在于，所述方法还包括下列步骤：

l)将上清液过滤以获得保留级份；

e)排放出保留级份，除去平均分子量小于30kDa的颗粒；和

f)将保留级份悬浮在pH为6.0-8.0的包含氢氧化钾的水溶剂中。

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