CN117045783A - 白头翁提取物在制备作为免疫佐剂的生物制品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了白头翁提取物在制备作为免疫佐剂的生物制品中的用途；所述白头翁提取物中白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5的总含量大于80wt.％，白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5含量的比例为(2.50‑4.50)：1。本发明由特定比例白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5构成的白头翁提取物作为疫苗佐剂，注射后无明显毒副作用，与病原微生物组合制成的疫苗可明显提高抗体水平、增强淋巴细胞繁殖及其细胞因子分泌，效果优于单独使用疫苗，有协同增效作用，将白头翁皂苷提取物作为疫苗佐剂有良好的应用前景。

Description

白头翁提取物在制备作为免疫佐剂的生物制品中的用途
技术领域
本发明具体涉及白头翁提取物在制备作为免疫佐剂的生物制品中的用途。
背景技术
免疫佐剂，是指能非特异性地增强或改变机体对匹配抗原的特异性免疫应答，增强抗原的免疫原性或者改变免疫的反应类型，但本身并无抗原性的物质。免疫佐剂可增加机体对于疫苗的反应，特别是增加抗体的产生，来增强疫苗接种人群对于特定疾病的抵御能力；改善由于年龄(包括婴儿和老人)、疾病(如HIV患者)或其他原因导致疫苗反应能力降低的问题；便于小剂量抗原的使用；减少疫苗的接种次数；增加初始免疫反应速率；用于研发治疗性的疫苗；减缓抗原的消耗速率等。佐剂作为疫苗研发的重要组成部分，随着新型疫苗研究的深入和市场应用需求的提高，新型佐剂的研发受到广泛重视。
目前最常用的佐剂为铝佐剂，主要包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾三种，其中最常用的为氢氧化铝和磷酸铝。铝佐剂是目前应用最广，且唯一被FDA批准可用于人类疫苗的佐剂。通过储存库效应、免疫效应(炎性反应)、促吞噬效应刺激增强免疫效应、促进抗原递呈细胞的活化和成熟等。目前，已上市且含铝佐剂的疫苗有狂犬病疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、白喉和破伤风疫苗、流感嗜血杆菌B疫苗和肺炎球菌缀合疫苗等。铝佐剂主要功能仅局限于疫苗蛋白的缓释作用，且对某些疫苗候选抗原缺少佐剂效应或仅有较弱的佐剂效应；不能诱导细胞免疫和细胞毒性T细胞应答，且还会诱导IgE介导的超敏反应，引起注射部位发生炎症反应，刺激局部产生红斑、疼痛、肉芽肿和皮下结节等；当铝佐剂剂量选择不当时，可能会对使用者产生较大的毒副作用，因此寻找一种佐剂效应强、刺激性小、毒副作用低的疫苗佐剂有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了白头翁提取物在制备作为免疫佐剂的生物制品中的用途。
进一步地，所述生物制品是疫苗用佐剂。
进一步地，所述疫苗为灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗或基因工程疫苗，优选为灭活疫苗或减毒活疫苗。
更进一步地，所述减毒活疫苗为联合犬瘟热和狂犬病二联弱毒苗。
本发明最后提供了一种预防犬瘟热和犬细小病毒病的联合用组合物，它含有用于同时或者分别给药的白头翁提取物，以及犬瘟热和狂犬病二联弱毒苗。
进一步地，所述白头翁提取物中白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5的总含量大于80wt.％，白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5含量的比例为(2.50-4.50)：1。
进一步地，所述白头翁提取物中白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5含量的比例为(2.76-4.33)：1。
更进一步地，所述白头翁提取物中白头翁皂苷B4的含量为65wt.％-70wt.％，白头翁皂苷B5的含量为15wt.％-25wt.％；，优选的，所述白头翁提取物中白头翁皂苷B4的含量为69wt.％，白头翁皂苷B5的含量为25wt.％。
进一步地，所述白头翁提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)取白头翁，加入醇类溶剂，提取，得提取液；
(2)将步骤(1)所得提取液经过极性树脂进行梯度洗脱，洗脱剂依次为水、20～95％乙醇，收集70％乙醇的洗脱液；
(3)将步骤(2)收集的液体经过中压制备液相色谱进行洗脱，洗脱剂为水和乙醇的混合溶液，收集洗脱液，浓缩干燥，即得。
进一步地，步骤(1)中，所述白头翁为水分≤13.0％的白头翁饮片；所述醇类溶剂为60％～80％乙醇，优选为70％乙醇；所述白头翁与醇类溶剂的质量体积比为1：(8～12)g/mL，优选为1：10g/mL；所述提取方式为回流提取，提取次数为2～3次，提取时间为每次2～3小时；步骤(3)中，所述中压制备液相色谱的填料为ODSC-18；所述水和乙醇的混合溶液中水和乙醇的体积比为2:1；所述洗脱液为第3～5个柱体积的液体。
本发明所述“免疫佐剂”是指同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。
本发明白头翁提取物在制备用于预防接种的生物制品中的用途。经实验证明：由特定比例白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5构成的白头翁提取物作为疫苗佐剂，注射后无明显毒副作用，与疫苗联用可明显提高抗体水平、增强淋巴细胞繁殖及其细胞因子分泌，在持久免疫方面效果优于单独使用疫苗，有协同增效作用；同时白头翁提取物作为免疫佐剂与病原微生物及其代谢产物制成的疫苗在免疫效果上与弗氏佐剂相当，甚至略好，将白头翁皂苷提取物作为疫苗佐剂有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1空白溶剂、B4对照、B5对照品和供试品色谱图。
图2PSE对免疫器官指数的影响(A：PSE对脾脏指数的影响；B：PSE对胸腺指数的影响；结果以平均值±标准差(n＝4)表示；各组上方不同字母(a,b,c和d)表示差异有统计学意义p<0.05)。
图3PSE对脾淋巴细胞的影响(A：PSE对OVA抗原再刺激时脾淋巴细胞增殖的影响；B：PSE对ConA刺激时脾淋巴细胞增殖的影响；C：PSE对LPS刺激时脾淋巴细胞增殖的影响。结果以平均值±标准差(n＝4)表示；各组上方不同字母(a,b,c和d)表示差异有统计学意义p<0.05)。
图4PSE对OVA特异性抗体的影响(A：PSE对OVA特异性IgG抗体水平的影响；B：PSE对OVA特异性IgG1抗体水平的影响；C：PSE对OVA特异性IgG2a抗体水平的影响；D：PSE对OVA特异性IgG2b抗体水平的影响。结果以平均值±标准差(n＝4)表示；各组上方不同字母(a,b,c和d)表示差异有统计学意义p<0.05)。
图5PSE对血清细胞因子水平的影响(A：PSE对IFN-γ水平的影响；B：PSE对IL-2水平的影响；C：PSE对IL-4水平的影响；D：PSE对IL-10水平的影响。结果以平均值±标准差(n＝4)表示；各组上方不同字母(a,b,c和d)表示差异有统计学意义(p<0.05)。
图6PSE对脾脏T淋巴细胞表型的影响(A和B：流式细胞术检测脾脏内CD3+T细胞；C和D：CD3+百分比及CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值。结果以平均值±标准差(n＝4)表示。各组上方不同字母(a,b,c和d)表示差异有统计学意义p<0.05)。
图7PSE对引流淋巴结树突状细胞活化成熟的影响(A，B和C：流式细胞术检测引流淋巴结内CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD86+和CD11c+CD80+细胞；D，E和F：测定CD11c+DCs表面MHCⅡ+、CD86+、CD80+表达的百分比；结果以平均值±标准差(n＝4)表示；各组上方不同字母(a,b,c和d)表示差异有统计学意义p<0.05)。
具体实施方式
实施例1白头翁提取物的制备
1、药材前处理
取白头翁药材，除去杂质，洗净，切薄片，70℃干燥至水分≤13.0％，得白头翁饮片。
2、提取与纯化
(1)取白头翁饮片，加10倍量(质量体积比)70％乙醇回流提取2-3次，每次2-3小时，得提取液。
(2)取步骤(1)所得提取液，经过AB-8大孔树脂进行梯度洗脱，洗脱剂依次为水(2倍树脂体积)、20％乙醇(3倍树脂体积)、70％乙醇(3倍树脂体积)、95％乙醇(2倍树脂体积)，收集70％乙醇洗脱出的液体；
(3)将步骤(2)收集的液体减压回收乙醇，然后经过中压制备液相色谱，以ODSC-18为填料，以水和乙醇的混合溶液(其中水和乙醇体积比为2:1)为洗脱剂进行洗脱，收集4BV～5BV的液体，浓缩，干燥，即得本发明白头翁提取物。
3、所得白头翁提取物的含量检测：
①测试方法：利用高效液相色谱法，测试上述方法所得白头翁提取物中的组成成分。测试仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪、DAD检测器，色谱柱：Agilent 5HC-C18(2)250×4.6mm，流动相：甲醇：水＝64：36，检测波长：201nm，流速：1.0mL/min，进样量：20μL。以空白溶剂、白头翁皂苷B4对照品、白头翁皂苷B5对照品为对照。
②测试结果
如图1所示，可以看出本发明制得的白头翁提取物中含有大量白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5，经过计算，含69wt.％白头翁皂苷B4和25wt.％白头翁皂苷B5。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果。
试验例1白头翁皂苷提取物(Pulsatilla saponins extract，PSE)联合英特威犬瘟热、犬细小二联弱毒苗对幼犬临床指标及免疫效果的影响
1.1试验材料
1.1.1试验动物
试验犬15只，年龄6～8周龄，雌雄各半，尚未免疫。隔离观察7d，期间按体重喂服阿苯达唑(30mg/kg)，间隔一周再驱虫一次。饲养环境及饮饲器具常规消毒，按体重饲喂常规试验犬粮，自由饮水。试验前经健康检测，体温、心率、精神状态及各项血液指标均正常，犬细小及犬瘟热试纸板检测均阴性，粪便检查无虫卵，用于本试验。
1.1.2试验试剂
主要试验试剂见表1。
表1主要试验试剂
1.1.3试验仪器
主要试验仪器见表2。
表2主要试验仪器
1.2试验方法
1.2.1动物分组及免疫程序
15只试验犬，随机分为5组，3只/组，具体分组如下：空白对照组(Ⅰ组)：仅注射无菌注射用水；疫苗组(Ⅱ组)：仅注射疫苗一头份/只；疫苗+PSE低、中、高试验组(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组)：注射疫苗一头份/只+PSE。根据小动物兽医协会(World Small Animal VeterinaryAssociation，WSAVA)给出的犬猫免疫建议方案，免疫三次，首免后每次间隔14d加免，2ml/只，皮下注射，具体免疫程序见表3。
通过试验证明PSE对于小鼠机体的免疫系统具有一定的调节作用，将小鼠注射PSE的剂量换算为犬注射的剂量。根据Meeh-Rubner氏公式，利用动物的体重计算出体表面积。
Meeh-Rubner氏公式：A＝K*(W2/3)/10000
其中A为体表面积，以m2计算；K为折算系数，随动物种类而不同(小白鼠9.1，犬11.2)；W为体重，以g计算；已知小白鼠及犬的体重和体表面积，可将小白鼠的给药剂量7.5、15及30mg/kg转化为82.42、164.84及329.67mg/m2的形式，代入犬(m2/kg)中，得到犬的用药剂量(mg/kg)。
表3分组及处理方法
1.2.2试验犬血液样本采集
试验犬首免当天记为第0天，分别在第0、7、14、21、28、35和42天从犬的前肢静脉采集血液样本。取一部分血液样本置于5mL含有EDTA-K+的真空采血管中；另一部分血液样本收集在普通采血管中以分离血清，-80℃保存。
1.2.3试验犬临床指标的测定
各试验犬从首免日开始，第0、7、14、21、28、35和42天早晨饲喂前测量其体温、心率、呼吸数及体重并记录，并观察其是否出现呕吐、腹泻及眼鼻分泌物增多的情况，对每组每条犬的临床指标进行记录。
1.2.4试验犬外周血淋巴细胞增殖试验
①：试验犬外周血淋巴细胞悬液的制备：将1.2.2采取新鲜的无菌抗凝血2mL用同等体积的样本稀释液稀释至4ml，小心沿离心管管壁叠加在4mL淋巴细胞分离液上，500g离心力下离心30min，离心后，此时离心管中由上至下分为四层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层，用移液枪小心吸取细胞层到另一15ml离心管中，往所得离心管中加入10ml清洗液，混匀细胞后，250g，离心10min，弃上清，用移液枪以5ml清洗液重悬所得细胞后，250g，离心10min，离心结束后弃上清，加入10ml RPMI 1640培养基洗涤一次，250g离心10min，倾倒上清液，加入适量RPMI 1640血清培养液(含有10％FBS+1×105U/L青霉素、链霉素的RPMI1640培养基混合液)，使用细胞计数板进行细胞计数，调整细胞浓度为2×106个/ml。
②：试验犬外周血淋巴细胞增殖测定：用96孔板，空白孔为200μL RPMI 1640血清培养液，对照孔添加2×106个/mL淋巴细胞悬液100μL及RPMI 1640血清培养液100μL，试验孔分别加入10μg/mL ConA稀释液100μL及2×106个/mL淋巴细胞悬液100μL，各重复5孔。于37℃恒温、5％ CO2培育箱中继续培养培养48h后，每孔加入20μL的MTS溶液，再继续培养4h。酶标仪上波长选570nm，试剂空白孔调零后测定其余各孔的吸光度。计算淋巴细胞刺激指数(SI)＝(试验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)。
1.2.5试验犬血清CDV及CPV特异性抗体含量测定
1.2.2采集的血清样本，按犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)特异性抗体ELISA分析试剂盒说明书，用酶标仪测定OD450nm的值，以空白孔调零，参照标准曲线(以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标进行绘制)进行样品浓度的计算，记录结果并对数据进行处理。
1.2.5统计学分析
实验数据采用SPSS(20.0)统计软件中单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Duncan法进行组间多重比较，实验结果表示为平均值士标准差(Mean4±S.D.)，P<0.05即判定为差异性显著，采用GraphPad Prism绘图工具进行绘图。
2结果与分析
2.1白头翁皂苷提取物对犬基本临床指标的影响
由表4～表7可知，接种疫苗及注射不同剂量的PSE对试验犬只体温，心率，呼吸数无明显影响，各组间差异不显著(P>0.05)。并在试验期间对所有犬只的体重进行持续记录，统计学结果分析表明：试验前各组间体重对比差异不显著(P>0.05)，试验期间(D7、D14、D21、D28、D35、42)各组间体重对比差异不显著(P>0.05)。本试验中的犬在用药前后，在基本临床指标(体温、心率、呼吸)、发育等情况中，除用药期间，体重在正常发育过程有所增大以外，其他外部状态无明显变化，可初步评价白头翁皂苷提取物在犬上应用是相对安全的。
表4不同剂量白头翁皂苷提取物对犬体温的影响(℃)
注：每组样本量n＝3；同行表注为同行比较，上标为同列比较；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。
表5不同剂量白头翁皂苷提取物对犬心率的影响(次/分)
表6不同剂量白头翁皂苷提取物对犬呼吸数的影响(次/分)
表7不同剂量白头翁皂苷提取物对犬体重的影响(kg)
2.2白头翁皂苷提取物对犬外周血淋巴细胞增殖的影响
由表8可知，在整个试验周期内，空白组的犬外周血淋巴细胞增殖指数各时间点间均差异不显著(P>0.05)。疫苗组淋巴细胞增殖指数随时间推移逐渐增加，且首免后D42淋巴细胞增殖指数较试验前期(D0、D7、D14)升高，差异显著(P<0.05)。PSE低剂量组在首免后D28增殖指数上升并与首免后D0和D7差异极显著(P<0.01)，与首免后D14和D21差异显著(P<0.05)；首免后D35较D28增殖指数显著增高(P<0.05)，首免后D42较D35增殖指数显著增高(P<0.05)，且D35与前期(D0、D7、D14、D21)相比增殖指数极显著上升(P<0.01)，D42较前期(D0、D7、D14、D21、D28)增殖指数极显著提高(P<0.01)。PSE中剂量组的变化趋势与PSE低剂量相同。PSE高剂量组的外周血淋巴细胞增殖指数在首免后D21与D0和D7差异显著(P<0.05)，而D28时较D0和D7时的增殖指数差异极显著(P<0.01)，在免疫后D35外周血淋巴细胞增殖指数与之前相比差异极显著(P<0.01)。
在首免后D0、D7、D21，各组间淋巴细胞增殖指数均差异不显著(P>0.05)，但在第21d时，疫苗组及PSE低、中、高剂量组均高于空白组，且PSE低、中、高剂量组的增值指数随着剂量增加而逐渐上升。首免后D14和D28，疫苗组增殖指数低于PSE低、中、高剂量组但差异不显著(P>0.05)，且高于空白组但差异不显著(P>0.05)；空白组与PSE低、中、高剂量组间差异显著(P<0.05)；PSE低剂量组、中剂量组、高剂量组间差异不显著(P>0.05)，但PSE组的增值指数与用药剂量呈正相关。首免后D35，空白组与疫苗组间增殖指数差异不显著(P>0.05)，与PSE低剂量组间显差异显著(P<0.05)，与PSE中、高剂量组差异极显著(P<0.01)；疫苗组的增值指数低于PSE低、中、高剂量组但差异不显著(P>0.05)，高于空白组但也差异不显著(P>0.05)；PSE低、中、高剂量组间外周血淋巴细胞增殖指数差异不显著(P>0.05)，但随PSE剂量增加而上升。首免后D42，疫苗组增殖指数高于空白组，低于PSE低、中、高剂量组但均差异不显著(P>0.05)；空白组增殖指数较PSE组低、中、高剂量组差异极显著(P<0.01)，PSE各组间呈剂量依赖性，但差异不显著(P>0.05)。
淋巴细胞受到抗原或促有丝分裂原等刺激，可转化为淋巴母细胞并进行有丝分裂，淋巴细胞转化能力反应了机体的免疫机能状态。实验结果表明白头翁皂苷低、中、高实验组患犬的淋巴细胞增殖指数的增长幅度高于疫苗组及空白组，且在试验结束时，接种了白头翁皂苷提取物的试验犬淋巴细胞增殖指数极显著高于空白组(P<0.01)，且高于疫苗组但差异不显著(P>0.05)，表明白头翁皂苷提取物可以提高试验犬机体淋巴细胞的性能。
表8不同剂量白头翁皂苷提取物对犬外周血淋巴细胞增殖指数的影响
2.3白头翁皂苷提取物对犬二联苗免疫效果的影响
2.3.1白头翁皂苷提取物对犬瘟热病毒(CDV)疫苗免疫效果的影响
由表9可知，空白组犬只抗体滴度随时间推移逐渐减少，首免后D14前抗体滴度减少速率较大，之后减少的相对缓慢，由最开始的(51.70±8.17)ng/ml减少至(17.99±5.85)ng/ml。参加免疫的疫苗组及PSE低、中、高剂量组，抗体滴度均有不同水平的升高，其中PSE高剂量组幼犬体内CDV抗体滴度达到最高的(309.77±22.52)ng/ml。疫苗组CDV抗体水平在首免后D7与D0差异显著(P<0.05)；在D21时抗体滴度较D14差异显著(P<0.05)，但较D7时差异极显著(P<0.01)；D28、D35、D42抗体水平较前期(D0、D7、D14、D21)均差异极显著(P<0.01)，且三个时间点间抗体水平也逐渐极显著升高(P<0.01)。PSE低剂量组、中剂量组变化趋势与疫苗组相同。PSE高剂量组抗体滴度在首免后D14出现显著性上升(P<0.05)；D21与首免后D0、D7相比差异极显著(P<0.01)，较D14也出现显著性差异(P<0.05)；D28、D35、D42抗体水平较前期(D0、D7、D14、D21)均差异极显著(P<0.01)，且三个时间点间抗体水平也逐渐极显著升高(P<0.01)。
参与免疫各组(疫苗组及PSE低、中、高剂量组)的抗体水平从免疫后D7开始到D42均高于空白组，差异极显著(P<0.01)。首免后D7和D14，参与免疫组间差异不显著(P>0.05)。D21和D28 PSE低、中、高剂量组间抗体滴度高于疫苗组，但差异不显著(P>0.05)。D35及D42PSE低、中、高剂量抗体水平显著高于疫苗组(P<0.05)，且PSE低、中、高剂量组间，抗体滴度与PSE剂量正相关，但差异不显著(P>0.05)。
空白组试验犬，由于其未接种疫苗，故体内含有的抗体水平随时间推移逐渐降低，而参与免疫各组的试验犬抗体滴度有不同水平的提升，疫苗组与白头翁皂苷提取物低、中、高剂量组的抗体水平变化趋势基本相似，随着疫苗接种的进行，体内抗体滴度不断升高，且注射了白头翁皂苷提取物的试验犬在试验后期能明显观察到抗体滴度显著高于疫苗组(P<0.05)，且与白头翁皂苷提取物的剂量呈正相关。表明白头翁皂苷提取物能有效的增加在接种犬瘟热病毒疫苗后受种犬只体内的抗体滴度。
表9不同剂量白头翁皂苷提取物对犬瘟热病毒疫苗血清抗体水平的影响(ng/ml)
2.3.2白头翁皂苷提取物对犬细小病毒(CPV)疫苗免疫效果的影响由表10可知，空白组犬只抗体滴度随时间推移逐渐减少，由最开始的(118.11±14.06)ng/ml减少至(47.65±13.35)ng/ml。参加免疫的疫苗组及PSE低、中、高剂量组，抗体滴度随时间推移均有不同水平的升高，其中PSE高剂量组幼犬体内CPV抗体滴度达到最高的(292.07±30.40)ng/ml。疫苗组在首免后D14的抗体滴度较D0差异显著(P<0.05)；D21时，较前期(D0和D7)抗体滴度差异极显著(P<0.01)，与D14差异显著(P<0.05)；D28抗体滴度与D0、D7及D14差异极显著(P<0.01)，与D21差异显著(P<0.05)；D35和D42时抗体水平均高于D0、D7、D14、D21、D28，差异极显著(P<0.01)，但D35的抗体滴度低于D42但差异不显著(P>0.05)。PSE低剂量组的抗体滴度，首免后D7较免疫前有升高，但差异不显著(P>0.05)；首免后D14显著高于D7和D0(P<0.05)；D21时抗体滴度极显著高于D0和D7(P<0.01)，显著高于D14(P<0.05)；D28抗体滴度极显著高于D0、D7及D14(P<0.01)，显著高于D21；D35和D42抗体滴度极显著高于D0、D7、D14、D21及D28(P<0.01)，D42抗体滴度高于D35但差异不显著(P>0.05)。
参与免疫各组(疫苗组及PSE低、中、高剂量组)的抗体水平免疫后D0、D7与空白组差异不显著(P>0.05)，但D7时略高于空白组。D14参与免疫各组抗体滴度显著高于空白组(P<0.05)，疫苗组与PSE低、中、高剂量组间差异不显著(P>0.05)。首免后D21抗体滴度，参与免疫各组均极显著高于空白组(P<0.01)，PSE低、中、高剂量组及免疫组间差异不显著(P>0.05)。首免后D28和D35抗体滴度，参与免疫各组均极显著高于空白组(P<0.01)，PSE低、中、高剂量组高于疫苗组但差异不显著(P>0.05)。D42时抗体滴度，参与免疫各组均极显著高于空白组(P<0.01)，PSE低、中、高剂量组均显著高于疫苗组(P<0.05)，且PSE低、中、高剂量组抗体滴度呈剂量依赖性，但差异不显著(P>0.05)。
幼犬体内的母源抗体90％是从初乳中获得的，5％通过胎盘获得，这很好地解释了为什么在研究初期，幼犬显示出较高的CPV抗体效价。而由于空白组的幼犬后期未受到任何CPV抗原刺激，故机体内CPV特异性抗体滴度逐渐下降。结果表明白头翁皂苷提取物低、中、高剂量均能刺激试验犬机体的抗体滴度较疫苗组显著上升，故白头翁皂苷提取物或有成为犬细小病毒疫苗佐剂的潜力。
表10不同剂量白头翁皂苷提取物对犬细小病毒疫苗血清抗体水平的影响(ng/ml)
实验结果证明，使用白头翁提取物与犬瘟热和狂犬病二联弱毒苗联合使用，可以有效提高犬瘟热和狂犬病二联弱毒苗的免疫效果，具体是可以提高机体淋巴细胞的性能，提升机体产生的抗体的滴度水平，
试验例2白头翁皂苷提取物对卵清白蛋白(OVA)免疫小鼠免疫反应的影响
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物
120只4～6周龄雌性清洁级ICR小鼠，体重20±2g，购自成都达硕实验动物公司。小鼠在独立送风隔离笼具中饲养7天以适应环境。温度控制在24±1℃，湿度50±10％，光照条件为12h白昼(09:00AM～09:00PM)/12h黑夜(09:00PM～09:00AM)，无特异性病原体。饲料、垫料均经辐照灭菌，供应新鲜、充足水粮供小鼠自由采食。实验设计遵循体内实验指导方针。
1.1.2试验材料
主要试验试剂见表11。
表11主要试验试剂
1.1.3试验仪器
主要试验仪器见表12。
表12主要试验仪器
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1.2试验方法
1.2.1动物分组及免疫程序
120只小鼠随机分为6组，20只/组，具体为空白对照组(Naive组)：PBS缓冲液；阴性对照组(NC组)：OVA溶液+PBS缓冲液；阳性对照组(PC组)：弗氏佐剂+OVA溶液(首免用完全弗氏佐剂，二免用不完全弗氏佐剂)；PSE+OVA低、中、高剂量组(A1、A2、A3组)：PSE+OVA。所有实验组OVA剂量均为100μg；免疫两次，首免后14d进行二免，0.2ml/只，皮下注射，具体免疫程序见表13。
表13分组及处理方法
注：弗氏佐剂用量按体积计算，每0.1ml的OVA溶液(100ug/0.1ml)配0.1ml的弗氏佐剂。
1.2.2试验小鼠免疫器官指数测定
在首免后14d及28d每组随机选择4只小鼠进行安乐死，之后将其浸入75％的乙醇中浸泡1-2min。在超净台中用大头针固定，小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏和胸腺，计算其免疫器官指数。小鼠免疫器官指数计算公式为：
免疫器官指数(mg/g)＝免疫器官质量(mg)/体重(g)。
1.2.3脾脏淋巴细胞悬液的制备
采集到D14及D28的脾脏组织，在60mm培养皿中放入4～5mL淋巴细胞分离液，用镊子把70μm Biosharp细胞滤膜固定在培养皿上，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏(研磨时间小于5min)，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL离心管中，覆盖1ml的RPMI 1640培养基(保持液面分界明显)。然后室温，800g离心力下离心30min，离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在RPMI1640覆盖层下面聚集。离心结束后吸出淋巴细胞层，加入10ml RPMI 1640培养基洗涤一次，250g离心10min，倾倒上清液，加入3-5mL RPMI1640培养液(含有10％ FBS+1×105U/L青霉素、链霉素混合液)，使用细胞计数板进行细胞计数，调整细胞浓度为2×106个/ml。
1.2.4脾脏淋巴细胞增殖测定
用96孔板，除试剂空白孔(只加培养液，无细胞)外，在每个孔里添加2×106个/mL脾细胞悬液100μL，空白组孔只加100μL RPMI 1640完全培养液，实验孔分别加入10μg/mLConA稀释液、10μg/mL LPS稀释液、10μg/mL OVA稀释液各100μL，各重复5孔。于37℃恒温、5％ CO2培育箱中继续培养培养48h后，每孔加入20μL的MTS溶液，再继续培养4h。酶标仪上波长选490nm，试剂空白孔调零后测定其余各孔的吸光度。
淋巴细胞刺激指数(SI)＝((OD刺激-OD未刺激)/OD未刺激)。
1.2.5试验小鼠血清特异性抗体及其亚类含量测定
首免后14d及28d各组随机选择4只小鼠进行眼球采血，采血后室温静置2h，1500g/min离心10min，收集血清，-80℃保存。用ELISA试剂盒检测特异性抗体OVA-sIgG及其亚类(IgG1、IgG2a、IgG2b)含量。
1.2.6试验小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分析
通过1.2.2、1.2.3及1.2.4选取白头翁皂苷提取物在小鼠上的最佳计量Xmg/kg，在首免后14d及28d Naive、NC、PC组及A组的最佳剂量组，分别随机选择3只小鼠进行安乐死并采集其脾脏，将一半的脾脏组织用机械法剪碎，300目滤布过滤后重悬于PBS液中，300g离心5min，弃上清。用PBS液洗涤后并重悬于PBS液中，取100μL细胞悬液，加入CD3、CD4、CD8抗体各1μg，混匀后4℃避光染色30min。加400μL的PBS重悬细胞，立即上机检测。Cytoflex流式细胞仪上机检测，采用Kaluza Analysis软件对数据进行分析。
1.2.7试验小鼠血清细胞因子测定
在1.2.5小鼠安乐死时进行眼球采血，室温静置2h，1500g/min离心10min，收集血清，-80℃保存。用ELISA试剂盒检测血清细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ)含量。
1.2.8试验小鼠淋巴结树突状细胞表型分析
首免后24h及48h，Naive、NC、PC组及A组的最佳计量组，小鼠随机抽取3只，采集各试验组小鼠的引流淋巴结，包括颌下淋巴结、腋下淋巴结、腹股沟淋巴结等。将取到的淋巴结用机械法剪碎，300目滤布过滤后重悬于PBS液中，300g离心5min，弃上清。用PBS液洗涤后并将细胞重悬于PBS液中，取100μL细胞悬液，分别加入CD11c、CD80、MCHII、CD86抗体(用量以试剂商说明书推荐量)，混匀后4℃避光染色20min。样品中分别加入live/dead试剂，混匀后室温避光染色10min。加1000μL的PBS重悬细胞，300g离心5min，弃上清，加入400ul PBS重悬细胞，立即上机检测。采样ZE5流式细胞仪上机检测，Kaluza Analysis软件对数据进行分析。
1.2.9统计学分析
实验数据采用SPSS(26.0)统计软件中单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Duncan法进行组间多重比较，实验结果表示为平均值士标准差(Mean±S.D.)，p<0.05即判定为差异性显著，采用GraphPad Prism绘图工具进行绘图。
2结果与分析
2.1白头翁皂苷提取物对于免疫器官指数的影响
D14各组间脾脏指数(图2A)及胸腺指数(图2B)均无显著性差异(p>0.05)。D28时NC、PC、A1、A2、A3组小鼠脾脏指数显著高于Naive组(p<0.05)，A2、A3组小鼠脾脏指数显著高于其他组(p<0.05)。除NC组外，其余各组胸腺指数均显著高于Naive组(p<0.05)，A2、A3组胸腺指数显著高于Naive组和NC组。结果表明，PSE具有潜在的佐剂作用，能够促进机体产生适当的免疫应答。
2.2白头翁皂苷提取物对于淋巴细胞增殖的影响
首次免疫后14天和28天进行体外脾细胞增殖实验，评价注OVA抗原(图3A)、ConA(图3B)和LPS(图3C)刺激下不同剂量PSE对小鼠脾细胞增殖反应的影响。刺激指数(SI)表示淋巴细胞增殖程度。如图3所示，D14各组间差异不显著(p>0.05)。D28时，在OVA再次刺激下，与PBS单独免疫(p<0.05)组相比，弗氏佐剂或不同剂量PSE混合抗原免疫的小鼠脾细胞增殖效率更高，A1、A2、A3组SI水平显著高于PC(p<0.05)组。为了进一步研究小鼠脾细胞的增殖情况，使用有丝分裂原Con A和LPS分别刺激T和B淋巴细胞。数据显示，在D28时注射不同剂量PSE联合抗原刺激的小鼠T、B淋巴细胞增殖效果优于其他组(p<0.05)。结果表明，不同剂量的PSE均能显著促进机体的抗原特异性免疫应答。
2.3白头翁皂苷提取物对OVA特异性抗体的影响
为探讨PSE对抗体应答的影响，分别用PBS(Naive组)、OVA(NC组)、OVA与弗氏佐剂混合(PC组)和不同剂量的PSE与OVA(A1、A2、A3组)混合皮下免疫小鼠，随时间变化收集血清。ELISA检测血清中OVA特异性IgG(图4A)、IgG1(图4B)、IgG2a(图4C)和IgG2b(图4D)的水平。在初次免疫(p<0.05)后14和28d，PSE混合抗原免疫诱导的OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b均显著高于OVA或PBS单独免疫小鼠。第28天，PSE对抗体应答的影响呈剂量依赖性，A3组效果最好。A2、A3组血清OVA特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b水平与PC(p>0.05)组相似。这些结果表明，PSE诱导的血清抗原特异性抗体水平与弗氏佐剂相似，且30mg/kg的PSE对抗体应答效果最佳。
2.4白头翁皂苷提取物对血清细胞因子的影响
ELISA法检测小鼠血清中IFN-γ(图5A)、IL-2(图5B)、IL-4(图5C)和IL-10(图5D)水平。PSE诱导IFN-γ和IL-2的增加趋势相似。第14-28天，A3组IFN-γ和IL-2水平升高，至第28天显著高于Naive组和NC组(p<0.05)。D28时，A3组血清IL-2水平显著高于PC组。首免后第14、28天，A3组血清IL-4浓度显著高于其它三组(p<0.05)。同样，D14和D28，A3组IL-10水平显著高于Naive组和NC组(p<0.05)，而PC组和A3组无显著差异(p>0.05)。综上所述，PSE能够诱导机体产生高水平的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10，促进机体产生更强的免疫应答。
2.5白头翁皂苷提取物对脾脏T淋巴细胞表型的影响
通过流式细胞术，我们分析了第一次免疫后14天和28天脾脏中免疫细胞的变化，包括脾脏内CD3+T细胞(图6A、图6B)，CD3+百分(图6C)比及CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值(图6D)。第14、28天，各组间CD3+细胞数无显著差异(p>0.05)，而A3组CD3+高于Naive组、NC组和PC组。重要的是，在D14天，CFA(PC组)的CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值最高，但各组之间没有显著差异(p>0.05)。D28时，与PBS(组)免疫小鼠相比，PSE免疫组(A3组)小鼠CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值显著升高(p<0.05)，且A3组略高于PC组，但差异不显著(p>0.05)。结果表明，PSE能够上调CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞的比例，从而调节免疫应答类型。
2.6白头翁皂苷提取物对引流淋巴结树突状细胞活化成熟的影响
在确认了佐剂潜力后，还评估了PSE刺激淋巴结树突状细胞的效果,包括引流淋巴结内CD11c+MHCⅡ+(图7A)、CD11c+CD86+(图7B)和CD11c+CD80+细胞(图7C)；CD11c+DCs表面MHCⅡ+(图7D)、CD86+(图7E)、CD80+表达的百分比(图7F)。皮下免疫24h或48h后取样，检测引流淋巴结中DC活化标志物的上调情况。结果显示，与Naive组相比，引流淋巴结中DC活化的CD11c+MHCⅡ+频率显著增加(p<0.05)，且A3组始终优于CFA免疫小鼠(PC组)，但差异不显著(p>0.05)。注射后24h，四组的CD80+和CD86+表达频率无明显差异(p>0.05)。但初次免疫后48h，A3组树突状细胞CD11c+CD86+频率明显高于NC组(p<0.05)，略高于PC组(p>0.05)。CD11c+CD80+表达在各组中无显著差异(p>0.05)，但在A3组中相对较高。这些结果表明，PSE能够促进DCs更持久的活化，增强其抗原加工和递呈能力。

Claims (10)

1.白头翁提取物在制备作为免疫佐剂的生物制品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述生物制品是疫苗用佐剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述疫苗为灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗或基因工程疫苗，优选为灭活疫苗或减毒活疫苗。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述减毒活疫苗为联合犬瘟热和狂犬病二联弱毒苗。
5.一种预防犬瘟热和犬细小病毒病的联合用组合物，它含有用于同时或者分别给药的白头翁提取物，以及犬瘟热和狂犬病二联弱毒苗。
6.根据权利要求1～5任一项所述的用途，其特征在于：所述白头翁提取物中白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5的总含量大于80wt.％，白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5含量的比例为(2.50-4.50)：1。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述白头翁提取物中白头翁皂苷B4和白头翁皂苷B5含量的比例为(2.76-4.33)：1。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述白头翁提取物中白头翁皂苷B4的含量为65wt.％-70wt.％，白头翁皂苷B5的含量为15wt.％-25wt.％；，优选的，所述白头翁提取物中白头翁皂苷B4的含量为69wt.％，白头翁皂苷B5的含量为25wt.％。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述白头翁提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)取白头翁，加入醇类溶剂，提取，得提取液；
(2)将步骤(1)所得提取液经过极性树脂进行梯度洗脱，洗脱剂依次为水、20～95％乙醇，收集70％乙醇的洗脱液；
(3)将步骤(2)收集的液体经过中压制备液相色谱进行洗脱，洗脱剂为水和乙醇的混合溶液，收集洗脱液，浓缩干燥，即得。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：步骤(1)中，所述白头翁为水分≤13.0％的白头翁饮片；所述醇类溶剂为60％～80％乙醇，优选为70％乙醇；所述白头翁与醇类溶剂的质量体积比为1：(8～12)g/mL，优选为1：10g/mL；所述提取方式为回流提取，提取次数为2～3次，提取时间为每次2～3小时；步骤(3)中，所述中压制备液相色谱的填料为ODSC-18；所述水和乙醇的混合溶液中水和乙醇的体积比为2:1；所述洗脱液为第3～5个柱体积的液体。
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