CN117338916A - 猪a型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

猪a型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗及其制备方法，属于动物二联灭活疫苗技术领域。解决了现有技术中缺少有效的防治猪A型塞内卡病毒病、猪水泡性口炎病毒病两种疾病联苗的问题。本发明的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，包括抗原，抗原为灭活的猪A型塞内卡病毒和灭活的猪水泡性口炎病毒，在灭活前，猪A型塞内卡病毒的含量≥106.0TCID50/ml，猪水泡性口炎病毒的含量≥106.0TCID50/ml。本发明的二联灭活疫苗经济实用，有效地降低防疫成本，为猪A型塞内卡病毒病、猪水泡性口炎病毒病的防治提供技术保障，具有广阔的应用场景。

Description

猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗及其制备 方法
技术领域
本发明属于动物二联灭活疫苗技术领域，具体涉及一种猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)，是微RNA病毒科，塞内卡病毒属中唯一代表性成员。SVA病毒会引起不同年龄阶段的猪感染，其临床症状与口蹄疫病毒、脑心肌炎病毒、猪传染性水疱病毒以及水疱性口炎病毒等病毒感染引发的症状相似，主要以猪的口鼻部、蹄冠部出现水疱、糜烂，新生仔猪急性死亡等症状为主要特征，对养猪业造成了一定影响。
猪水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)，又名鼻疮、烂舌疮，属于弹状病毒科水泡病毒属。临床症状与口蹄疫相似，主要为发烧、大量流涎、口腔粘膜、乳头皮肤以及蹄冠部皮肤出现水疱及糜烂。该病毒是人畜共患的疾病，易感动物较多，可以通过上皮和粘膜侵入机体。目前我国还没有猪水泡性口炎病发生的报道，但随着我国进口动物及动物产品贸易量不断增长，该病毒传入我国的风险不容忽视。
目前SVA、VSV的混合感染而引起的疾病是全球养猪业的一大问题，对养猪业造成很大的损失。猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒均属于rna病毒，这两种病毒引起的疾病在流行病学和病理剖检上都与口蹄疫病毒极为相似，难以区分，彼此又没有共同的抗原性，在免疫学和血清学上相互没有交叉反应。由此可见，同时防控两种疾病显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供了一种猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗及其制备方法，同时有效防治猪A型塞内卡病毒和猪水泡性口炎病毒的感染。
本发明实现上述问题，采取的技术方案如下。
本发明的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，包括抗原，抗原为灭活的猪A型塞内卡病毒和灭活的猪水泡性口炎病毒，在灭活前，猪A型塞内卡病毒的含量≥106.0TCID50/ml，猪水泡性口炎病毒的含量≥106.0TCID50/ml。
优选的是，所述二联灭活疫苗还包括MontanideTM GEL佐剂。
优选的是，所述二联灭活疫苗包括灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液，在灭活前，猪A型塞内卡病毒液中猪A型塞内卡病毒的含量≥106.0TCID50/ml，猪水泡性口炎病毒液中猪水泡性口炎病毒的含量≥106.0TCID50/ml。
更优选的是，所述灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液的体积比为1:1。
更优选的是，所述猪A型塞内卡病毒液的制备方法为：将猪A型塞内卡病毒以总体积的10％的量接种到单层BHK21细胞上，37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，加入含有2％新生牛血清的MEM维持液，在37℃5％CO2培养箱中培养，当单层BHK21细胞病变达到80％以上后，反复冻融，离心，收集猪A型塞内卡病毒液。
尤其优选的是，所述MEM维持液含有2％新生牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。
尤其优选的是，反复冻融3次。
尤其优选的是，所述离心的转速为2500r/min，离心的时间为20min。
更优选的是，所述猪A型塞内卡病毒液的灭活方法为：向猪A型塞内卡病毒液中加入4vol.‰的甲醛，在37℃条件下灭活48h。
更优选的是，所述猪水泡性口炎病毒液的制备方法为：将猪水泡性口炎病毒以总体积的3％的量接种到单层的BHK21细胞上，37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，加入含有2％新生牛血清的MEM维持液，在37℃5％CO2培养箱中培养，当单层BHK21细胞病变达到80％以上后，反复冻融，离心，收集猪水泡性口炎病毒液。
尤其优选的是，所述MEM维持液含有2％新生牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。
尤其优选的是，反复冻融3次。
尤其优选的是，所述离心的转速为2500r/min，离心的时间为20min。
更优选的是，所述猪水泡性口炎病毒的灭活方法为：将猪水泡性口炎病毒液在58℃灭活30min。
更优选的是，还包括MontanideTM GEL佐剂，灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液的总质量与MontanideTM GEL佐剂的质量比例为1:1。
本发明的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤；
步骤一、取猪A型塞内卡病毒含量在106.0TCID50/ml以上且无菌的猪A型塞内卡病毒液，灭活，得到灭活的猪A型塞内卡病毒液；
步骤二、取猪水泡性口炎病毒含量在106.0TCID50/ml以上且无菌的猪水泡性口炎病毒液，得到灭活的猪水泡性口炎病毒液；
步骤三、将灭活的猪A型塞内卡病毒液、灭活的猪水泡性口炎病毒液和MontanideTM GEL佐剂混合均匀，得到猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗。
优选的是，采用磁力搅拌器混合均匀，转速为1500rpm，时间为5min。
优选的是，混合均匀后，还包括无菌分装。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过提供了一种猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗以及其制备方法，解决了目前市场上缺少有效的防治猪A型塞内卡病毒病、猪水泡性口炎病毒病两种疾病联苗的问题，尤其是解决了近些年新流行的猪A型塞内卡病毒没有疫苗的情况。
本发明提供的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，经济实用，免疫方法简单，有效地降低了防疫成本，为猪A型塞内卡病毒病、猪水泡性口炎病毒病的防治提供技术保障，具有广阔的应用场景。
本发明提供的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗的制备方法简单易操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1中猪A型塞内卡病毒接种到单层BHK21细胞上，单层BHK21细胞的病变图。图中，A为未接种的空白细胞对照，B为接种后的细胞病变。
图2为本发明实施例1中猪A型塞内卡病毒分离株的PCR检测结果。图中，M表示DNAMarker DL2000；1为阴性对照，2为样品。
图3为本发明实施例1中猪水泡性口炎病毒接种到单层BHK21细胞上，单层BHK21细胞的病变图。图中，A为未接种的空白细胞对照，B为接种后的细胞病变。
图4为本发明实施例1中猪水泡性口炎分离株的PCR检测结果。图中，M表示DNAMarker DL2000；1为阴性对照，2为样品。
图5为本发明实施例3中不同佐剂与猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒混合免疫小鼠后第28d所收血清进行特异性抗体检测的结果。图中，A为针对猪A型塞内卡病毒检测特异性抗体结果，B为针对猪水泡性口炎病毒检测特异性抗体结果。
图6为本发明实施例3中注射猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗后14d所收血清进行间接免疫荧光检测的结果。图中，A为在单层BH K21细胞接种猪A型塞内卡病毒结果，B为在单层BHK21细胞接种猪水泡性口炎病毒。
图7为本发明实施例3中灭活后猪A型塞内卡病毒液、猪水泡性口炎病毒液的PCR检测结果。图中，1为猪水泡性口炎病毒阳性对照；2为猪A型塞内卡病毒阳性对照，3为灭活猪水泡性口炎病毒液接种细胞盲传3代所收病毒液样品，4为灭活猪A型塞内卡病毒液接种细胞盲传3代所收病毒液样品。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，包括抗原，抗原为灭活的猪A型塞内卡病毒和灭活的猪水泡性口炎病毒，在灭活前，猪A型塞内卡病毒的含量≥106.0TCID50/ml，猪水泡性口炎病毒的含量≥106.0TCID50/ml。还可以包括MontanideTM GEL佐剂。
上述技术方案中，猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗优选包括灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液，在灭活前，猪A型塞内卡病毒液中猪A型塞内卡病毒的含量≥106.0TCID50/ml，猪水泡性口炎病毒液中猪水泡性口炎病毒的含量≥106.0TCID50/ml。优选灭活的猪A型塞内卡病毒液、灭活的猪水泡性口炎病毒液的体积比为1:1。还可以包括MontanideTM GEL佐剂，灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液的总质量与MontanideTM GEL佐剂的质量比为1:1。
上述技术方案中，猪A型塞内卡病毒液的制备方法为：将猪A型塞内卡病毒以总体积10％的量接种到单层BHK21细胞上，37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，加入含有2％新生牛血清的MEM维持液，在37℃5％CO2培养箱中培养，当单层BHK21细胞病变达到80％以上后，反复冻融，离心(优选离心的转速为2500r/min，离心的时间为20min)，收集猪A型塞内卡病毒液，可保存于-80℃。MEM维持液优选含有2％新生牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。冻融次数没有特殊限制，优选为3次。
上述技术方案中，猪A型塞内卡病毒液的灭活方法为：向猪A型塞内卡病毒液中加入4vol.‰的甲醛，在37℃条件下灭活48h。
上述技术方案中，猪水泡性口炎病毒液制备方法为：将猪水泡性口炎病毒以总体积3％的量接种到单层的BHK21细胞上，37℃5％CO2培养箱中吸附1h，加入含有2％新生牛血清的MEM维持液，在37℃5％CO2培养箱中培养，当单层BHK21细胞病变达到80％以上后，反复冻融，离心(优选离心的转速为2500r/min，离心的时间为20min)，收集猪水泡性口炎病毒液，可保存于-80℃。MEM维持液优选含有2％新生牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。冻融次数没有特殊限制，优选为3次。
上述技术方案中，猪水泡性口炎病毒的灭活方法为：将猪水泡性口炎病毒液在58℃灭活30min，通常可以选择在58℃水浴锅灭活30min。
本发明的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤；
步骤一、取病毒含量在106.0TCID50/ml以上且无菌的猪A型塞内卡病毒液，灭活，得到灭活的猪A型塞内卡病毒液；
步骤二、取病毒含量在106.0TCID50/ml以上且无菌的猪水泡性口炎病毒液，得到灭活的猪水泡性口炎病毒液；
步骤三、将灭活的猪A型塞内卡病毒液、灭活的猪水泡性口炎病毒液和MontanideTM GEL佐剂混合均匀，得到猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗。
上述技术方案中，步骤一的猪A型塞内卡病毒液和步骤二的猪A型塞内卡病毒液均无菌，无菌指按现行《中国兽药典》附录对第5代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。
上述技术方案中，优选采用磁力搅拌器混合均匀，转速为1500rpm，时间为5min。
上述技术方案中，混合均匀后，还可以包括无菌分装。
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1毒株的来源
猪A型塞内卡病毒SVA CH/JL/2022株
将吉林某猪场采集、经RT-PCR检测为猪A型塞内卡病毒病抗原阳性的病料，按照1:10的比例(g:mL)加入PBS缓冲液，反复冻融3次后，离心取上清，经过0.22μm滤膜过滤2次，过滤液即病毒液，于-80℃保存备用。将长满致密单层的BHK21细胞，按总体积10％剂量接种病毒液，置于37℃CO2培养箱吸附1h后，加入6-7mlMEM维持液(含有2％新生牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml的链霉素)，同时设置空白细胞作为阴性对照。如图1所示，传至3代时出现明显细胞病变，第5代后病变基本稳定。
应用Primer Premier 5.0基因分析软件，参照Genbank中SVA的全基因设计检测引物对：上游引物SVA-F：5’-CACACTGCCAACGTCCCTTA-3’；下游引物SVA-R：5’-CCAAGGAGAAAGCCAGGATG-3’。PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃30s、57℃30s、72℃1min进行34个循环后，72℃5min延伸。SVA扩增片段为452bp。结果见图2所示。
按现行《中国兽药典》附录对第5代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。
猪水泡性口炎病毒
猪水泡性口炎病毒液由吉林大学动物医学学院病理解剖实验室分离并保存。
将长满致密单层的BHK21细胞，按总体积3％剂量接种病毒液，置37℃5％CO2培养箱吸附1h后加入6-7mlMEM维持液(含有2％新生牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml的链霉素)，同时设置空白细胞作为阴性对照。如图3所示，传至1代时出现明显细胞病变，第3代后病变基本稳定。
应用Primer Premier 5.0基因分析软件，参照Genbank中VSV的NC蛋白基因设计检测引物对：上游引物VSV-F：5’-AGCGGTCTGTGAAAGCTCAAA-3’；下游引物VSV-R：5’-TGCTCTCTTTGAGGTCAGTTGG-3’。PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃30s、62℃30s、72℃30s进行35个循环后，72℃7min延伸。VSV扩增片段为250bp。结果见图4所示。
按现行《中国兽药典》附录对第8代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。
实施例2毒株的特性
1、特异性
将猪A型塞内卡病毒和猪水泡性口炎病毒两种病毒液，分别用不含新生牛血清的MEM维持液稀释为100TCID50/100μl，分别与相对应等量的SVV、VSV特异性阳性血清混合，置37℃5％CO2培养箱中和1h，接种已长成良好单层的BHK细胞的96孔细胞培养板，分别接种4孔，100μl/孔，同时设置阴性对照，正常血清对照孔以及只加细胞的正常对照孔，100μl/孔，设置阳性对照，只加病毒液，100μl/孔，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养7日，逐日观察并记录，细胞病变阳性血清中和组和正常细胞对照组均不出现细胞病变；未中和血清对照组全部出现细胞病变。
2、毒力
用21日龄健康易感仔猪(猪A型塞内卡病毒和猪水泡性口炎病毒的抗原抗体均为阴性)共9头，分为3组。第1组各经滴鼻接种猪A型塞内卡病毒液5.0ml(病毒含量为106.0TCID50/ml)，第2组各经口服接种猪水泡性口炎病毒液5.0ml(病毒含量为106.5TCID50/ml)，第3组各经滴鼻接种生理盐水5.0ml。连续观察8日，第1组和第2组的试验猪均至少有2头发病。
3、免疫原性
用7日龄健康易感仔猪(猪A型塞内卡病毒和猪水泡性口炎病毒两种病毒的抗原抗体均为阴性)12头，分为4组，第1、3组为免疫组，第2、4组对照组。第1、3组分别经肌肉注射按照本发明方法单独制备的猪A型塞内卡病毒灭活疫苗、猪水泡性口炎病毒灭活疫苗各2.0ml。免疫后14日，第1、2组各经滴鼻接种猪A型塞内卡病毒液5.0ml(病毒含量为106.0TCID50/ml)，第3、4组各经滴鼻接种猪水泡性口炎病毒液5.0ml(病毒含量为106.5TCID50/ml)。连续观察8日。第2、4组对照猪均至少2头发病，1、3组免疫猪均全部健活。
实施例3猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗的制备及检验
1、材料与方法
1.1细胞
BHK21细胞均购自中国兽医药品监察所。
1.2制苗用病毒液的制备
猪A型塞内卡病毒液的制备：用传代细胞培养法制备病毒。将长满致密单层的BHK21细胞，按总体积10％剂量接种检验合格的猪A型塞内卡病毒种毒，加入6-7mlMEM维持液(含2％新生牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，37℃5％CO2培养箱培养48～72h，当细胞病变达80％以上时，收获病毒液，冻融3次后，置-80℃以下备用。
猪水泡性口炎病毒液的制备：用传代细胞培养法制备病毒。将长满致密单层的BHK21细胞，按总体积3％剂量接种检验合格的猪水泡性口炎病毒种毒，加入6-7mlMEM维持液(含2％新生牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，37℃5％CO2培养箱培养48～72h，当细胞病变达80％以上时，收获病毒液，冻融3次后，置-80℃以下备用。
1.2制苗用病毒液的检验
1.2.1纯净性检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。
1.2.2病毒含量测定
猪A型塞内卡病毒含量测定，将病毒用无血清的MEM维持液作10倍系列稀释，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-1010个稀释度，分别接种已长成良好单层的BHK21细胞96孔细胞的培养板，每个稀释度接种8孔，100μl/孔，置37℃作用1h，弃液，加入MEM维持液(含2％新生牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素)100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养7日，逐日观察并记录细胞病变，按Spearman-Karber法计算TCID50。每毫升病毒含量应≥106.0TCID50/ml。
猪水泡性口炎病毒含量测定，将病毒用无血清的MEM维持液作10倍系列稀释，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-1010个稀释度，分别接种已长成良好单层的BHK21细胞96孔细胞的培养板，每个稀释度接种8孔，100μl/孔，置37℃作用1h，弃液，加入MEM维持液(含2％新生牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素)100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养7日，逐日观察并记录细胞病变，按Spearman-Karber法计算TCID50。每毫升病毒含量应≥106.0TCID50/ml。
1.3灭活及其检验
将检验合格的猪A型塞内卡病毒液加入4vol.‰的甲醛，在37℃条件下灭活48h；将检验合格的猪水泡性口炎病毒液放入58℃水浴锅灭活30min。灭活后的病毒液按照体积比例为1:1进行混合，置于-80℃保存。
将灭活后的两种病毒液分别接种已长成良好单层的BHK21细胞，每组接种3皿，置37℃5％CO2培养箱中作用1h后，弃液，加入6-7mlMEM维持液(含2％新生牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，同时设正常细胞对照和未灭活病毒对照，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养7日，逐日观察并记录细胞病变。灭活病毒组和正常细胞对照组均不出现细胞病变，未灭活病毒对照组全部出现细胞病变，盲传3次后收取病毒液，提取RNA进行PCR检测，PCR结果均为阴性则判为病毒灭活完全。
1.4不同佐剂的筛选
将灭活后猪A型塞内卡病毒液、猪水泡性口炎病毒液分别与MontanideTM ISA佐剂、MontanideTM IMS佐剂、MontanideTMGEL佐剂、氢氧化铝佐剂，按灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液的总质量与佐剂的质量比例为1:1，分装并加盖密封后，得到不同佐剂疫苗，放置于4℃左右备用。
1.4.1特异性抗体检测
用3周龄健康Balb/c小鼠15只(分为5组，每组3只)，其中四组各经皮下多点注射不同佐剂疫苗300μl，另外一组各经皮下多点注射PBS 300μl，首免后14d进行加强免疫，加强免疫14d后，连同对照小鼠3只一并采血，分离血清。用间接酶联免疫吸附试验检测免疫小鼠血清中免疫原特异性抗体水平。用棋盘法确定了猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒包被的最佳浓度。将猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒分别与pH 9.6的碳酸盐缓冲液1:1稀释，在96孔板中每孔加100μl。将靶板在4℃下包被过夜，去掉液体，加入5％脱脂奶粉，200μl/孔，封闭37℃1h，去掉液体，用PbS-T缓冲液洗涤3次，5min，拍干。待测血清按1:80稀释，每份标本重复3次，100μl/孔，空白对照1孔，阳性对照(免疫后血清)，37℃作用1h，弃液，用PbS-T缓冲液洗板3次，每次5min，拍干。将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig G抗体用PBS-T缓冲液稀释后，每孔加入100μl稀释液，37℃孵育1h。弃液，用PBS-T缓冲液清洗3次，每次5min，拍干。每孔加入显色液，在黑暗中显色5-15min后加入停止液，在450nm处读取OD值。
1.5二联疫苗的乳化与分装
取相同重量的灭活病毒液和1.4.1所筛选出的MontanideTMGEL佐剂，按照灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液的总质量与佐剂的质量比例为1:1混匀，放入小瓶，在磁力搅拌器上1500rpm混合5min后无菌分装，放置于4℃左右备用。
1.6疫苗成品检验
外观：为均匀乳剂。
稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应不超过0.5ml。
黏度：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
无菌检验：无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。用硫乙醇酸盐培养基(T.G)50ml，接种待检样品1ml，置37℃培养，3日后自小瓶中吸取培养物分别接种(T.G)小管和酪胨琼脂(G.A)斜面各2支，每支0.2ml，1支置37℃，1支置25℃，另取0.2ml，接种1支葡萄糖蛋白胨汤(G.P)小管置25℃，培养5日后判定。
甲醛残留量检验：对每批抽检的待检样品按照《中国兽药典》进行甲醛残留量测定，结果甲醛含量应符合兽用生物制品通则的规定。
1.7安全检验用7日龄健康易感仔猪(猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒的抗原抗体均为阴性)3头，各经颈部肌肉注射疫苗2.0ml，连续观察14日。试验猪应不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。
1.8效力检验
1.8.1间接免疫荧光检测用7日龄健康易感仔猪(猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒的抗原抗体均为阴性)3头，各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，接种14日后，连同对照猪3头一并采血，分离血清。将BHK21细胞传置于铺好细胞爬片的12孔板中，将长致70％单层的BHK21细胞，分别按总体积10％剂量接种猪A型塞内卡病毒液，和按总体积3％剂量接种猪水泡性口炎病毒液置37℃CO2培养箱吸附1h后加入2mlMEM维持液(含2％新生牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，24h后用预冷的PBS缓冲液洗一次，再在室温条件下用4％多聚甲醛固定15min，用PBS缓冲液清洗后，将5％脱脂奶粉与0.05％Triton-x-100配置成封闭液，对固定好的细胞进行封闭，置37℃1h，将所收血清按1:50与封闭液混匀作为一抗滴加于细胞爬片，置4℃过夜，将荧光二抗与PBS缓冲液按1:300混合滴加于细胞爬片，置37℃1h，最后用抗荧光猝灭封片剂进行封片，在荧光显微镜下观察。测定被接种猪是否产生相应的特异性抗体。免疫组应产生绿色荧光信号，对照组不应产生绿色荧光信号。结果见图6所示。
1.8.2中和抗体测定用1.7.1所收血清，测定猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒中和抗体。免疫组猪中和抗体均应不低于1:32，对照组猪中和抗体均应不高于1:4。
1.8.3攻读保护性实验用7日龄健康易感仔猪(猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒的抗原抗体均为阴性)6头(分为1组、2组，每组3头)，各经颈部肌肉注射疫苗2.0ml，另外10头(分为3组、4组，每组3头)颈部肌肉注射同剂量PBS，免疫后14日，第1、3组各经滴鼻接种猪A型塞内卡病毒液5.0ml(病毒含量为106.0TCID50/ml)，第2、4组各经滴鼻接种猪水泡性口炎病毒液5.0ml(病毒含量为106.5TCID50/ml)。连续观察10日。第3、4组对照猪应至少2头发病，1、2组免疫猪应全部健活。
2.结果
2.1抗原含量结果
猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒分别培养三批，批号为230324-1、230324-2和230324-3，抗原的含量见表1，其病毒液含量均符合要求。
表1抗原含量测定
2.2抗原的灭活效果测定将培养三批的猪A型塞内卡病毒液、猪水泡性口炎病毒液分别进行灭活，灭活是彻底的(结果见图7)。
2.3特异性抗体检测结果
结果表明，所有佐剂免疫组均能产生特异性抗体，MontanideTMGEL佐剂免疫组的血清特异性抗体水平显著高于其他三组免疫组，而PBS免疫组未检测到有效抗体(结果如图5所示)。以上结果表明，所有免疫策略均能诱导出较强的体液免疫应答，其中MontanideTMGEL佐剂免疫效果较好。
2.4稳定性检验结果
吸取3批次的疫苗各10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相均不超过0.5ml。3批次疫苗稳定性测定结果均符合规定。
2.5无菌检验结果
按照《(中国兽药典》附录的方法对3批疫苗进行无菌检验，结果均无菌生长，结果见表2。
表2 3批疫苗的无菌检验结果
2.6甲醛残留量检验结果
用乙酰丙酮法对每批抽检的待检样品基于分光光度法进行甲醛含量测定，结果甲醛含量均符合兽用生物制品通则的规定。
2.7安全性检验结果
将3批次疫苗分别以大剂量免疫7日龄健康仔猪，各免疫3头，免疫后14天内，3批次疫苗免疫猪采食、饮水、精神状况均正常，均无不良临床反应，疫苗吸收良好，注射部位均无炎症反应。结果表明(见表3)，3批次疫苗免疫仔猪均安全。
表3 3批疫苗的安全性检验结果
2.8效力检验结果
2.8.1中和抗体检测结果
3批疫苗分别按1.8.2中的方法进行效力检验，结果3批疫苗的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒中和抗体效价检验均合格，见表4。
表4 3批疫苗免疫后的中和抗体检测结果
2.8.2免疫仔猪攻毒保护结果
3批疫苗分别按1.8.3中的方法进行效力检验，结果3批疫苗的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒攻毒保护检验均合格，见表5。
表5 3批疫苗免疫后的攻毒保护结果
显然，上述实施方式仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施例予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，其特征在于，包括抗原，抗原为灭活的猪A型塞内卡病毒和灭活的猪水泡性口炎病毒，在灭活前，猪A型塞内卡病毒的含量≥106.0TCID50/ml，猪水泡性口炎病毒的含量≥106.0TCID50/ml。
2.根据权利要求1所述的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗还包括MontanideTM GEL佐剂。
3.根据权利要求1所述的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗包括灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液，在灭活前，猪A型塞内卡病毒液中猪A型塞内卡病毒的含量≥106.0TCID50/ml，猪水泡性口炎病毒液中猪水泡性口炎病毒的含量≥106.0TCID50/ml。
4.根据权利要求3所述的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液的体积比为1:1。
5.根据权利要求3所述的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述猪A型塞内卡病毒液的制备方法为：将猪A型塞内卡病毒以总体积的10％的量接种到单层BHK21细胞上，37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，加入含有2％新生牛血清的MEM维持液，在37℃5％CO2培养箱中培养，当单层BHK21细胞病变达到80％以上后，反复冻融，离心，收集猪A型塞内卡病毒液；
所述猪水泡性口炎病毒液的制备方法为：将猪水泡性口炎病毒以总体积的3％的量接种到单层的BHK21细胞上，37℃5％CO2培养箱中吸附1h，加入含有2％新生牛血清的MEM维持液，在37℃5％CO2培养箱中培养，当单层BH K21细胞病变达到80％以上后，反复冻融，离心，收集猪水泡性口炎病毒液。
6.根据权利要求5所述的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述MEM维持液含有2％新生牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。
7.根据权利要求3所述的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述猪A型塞内卡病毒液的灭活方法为：向猪A型塞内卡病毒液中加入4vol.‰的甲醛，在37℃条件下灭活48h；
所述猪水泡性口炎病毒的灭活方法为：将猪水泡性口炎病毒液在58℃灭活30min。
8.根据权利要求3所述的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗，其特征在于，还包括MontanideTM GEL佐剂，灭活的猪A型塞内卡病毒液和灭活的猪水泡性口炎病毒液的总质量与MontanideTM GEL佐剂的质量比例为1:1。
9.根据权利要求1-8任何一项所述的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
步骤一、取猪A型塞内卡病毒含量在106.0TCID50/ml以上且无菌的猪A型塞内卡病毒液，灭活，得到灭活的猪A型塞内卡病毒液；
步骤二、取猪水泡性口炎病毒含量在106.0TCID50/ml以上且无菌的猪水泡性口炎病毒液，得到灭活的猪水泡性口炎病毒液；
步骤三、将灭活的猪A型塞内卡病毒液、灭活的猪水泡性口炎病毒液和Mo ntanideTMGEL佐剂混合均匀，得到猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗。
10.根据权利要求9所述的猪A型塞内卡病毒、猪水泡性口炎病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，采用磁力搅拌器混合均匀，转速为1500rpm，时间为5min。
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